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Developmental Biology

Eine Einführung in die Molekulare Entwicklungsbiologie

An Introduction to Molecular Developmental Biology

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Developmental Biology

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JoVE Science Education Developmental Biology

An Introduction to Molecular Developmental Biology

2.3: Genetic Engineering of Model Organisms

2.5: Explant Culture for Developmental Studies

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09:27 min

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April 30, 2023

Overview

Molekulare Signale Rolle eine wichtige in der komplexen Prozesse, die während der Embryonalentwicklung. Diese Signale regulieren Aktivitäten wie Zelldifferenzierung und Migration, die zur Bildung von bestimmten Zelltypen und Strukturen beitragen. Die Verwendung von molekularen Ansätze kann Forscher diese physikalischen und chemischen Mechanismen im Detail zu untersuchen.

Dieses Video wird eine kurze Geschichte der Erforschung der molekularen Ereignisse während der Entwicklung überprüfen. Nächste, wichtige Fragen der molekularen Entwicklungsbiologie Biologen heute überprüft werden, gefolgt von einer Diskussion über mehrere prominente Methoden verwendet, um Antworten auf diese Fragen, wie Verfärbungen, explant Kultur und live-Cell-Imaging. Schließlich betrachten wir einige aktuelle Anwendungen dieser Techniken zur Erforschung der Entwicklungsbiologie.

Procedure

Studien auf dem Gebiet der molekularen Entwicklungsbiologie Aufschluss über die Veränderungen auf zellulärer Ebene während der Differenzierung und Entwicklung. Forscher untersuchen die physikalischen und chemischen Mechanismen, die Zellfunktionen regulieren. Dadurch verstehen, wie Zellen spezialisierte Gewebe innerhalb der reifenden Embryo hervorrufen, und wie Defekte auf molekularer Ebene zu Krankheiten führen können.

Dieses Video präsentiert eine kurze Geschichte der molekularen Entwicklungsbiologie, stellt wichtige Fragen, die die Wissenschaftler in diesem Bereich beschreibt einige Tools zur Verfügung, um diese Fragen zu beantworten und ein paar aktuelle Laboranwendungen diskutiert.

Zunächst einige Wahrzeichen Studien in der Geschichte der molekularen Entwicklungsbiologie Forschung zu überprüfen.

Im Jahre 1957 veröffentlicht Conrad Waddington ein Buch mit dem Titel “Die Strategie der Gene” in dem er versuchte zu erklären, wie die Zelle Schicksal entschieden ist. Basierend auf zuvor durchgeführten Gewebe Transplantation Studien, präsentierte er ein konzeptionelles Modell beschreiben, die eine Zelle wie eine Murmel rollt einen Hang hinunter, und der Weg, den es braucht, um den Boden erreichen wird seine differenzierte Endzustand bestimmen. Diese Idee, dass unterschiedliche Zelltypen aus undifferenzierten Zellen unterschiedliche Signale während der Entwicklung entstehen wurde bekannt als die “epigenetische Landschaft.”

Etwa zur gleichen Zeit beobachtet Rita Levi-Montalcini und Stanley Cohen, dass Tumoren in Küken Embryonen Verpflanzung zu schnellen Neuron Wachstum geführt. Sie vermutet, dass eine Substanz von den Tumoren verursacht dieses Wachstum abgesondert, und das Protein als Nervenwachstumsfaktor oder NGF identifiziert. Bald darauf entdeckte Cohen ein weiteres Wachstum-Faktor, der wurde durch Maus Speicheldrüse abgesondert und förderte das Wachstum der Epithelzellen. Er identifizierte dieses Protein als epidermalen Wachstumsfaktor EGF.

Später, im Jahr 1969 schlug Lewis Wolpert eine Theorie über, wie eine bestimmte Klasse von Signalisierung, dass Moleküle, sogenannte Morphogens, direkt auf Zellen, konkrete Antworten in unterschiedlichen Konzentrationen induzieren handeln. Er benutzte Farben der französischen Flagge Modell Zelle Staaten, rote dienenden den Standardstatus, wenn kein Signal vorhanden ist. Von dort aus könnte niedrig Morphogen Konzentrationen, gezeigt in weiß, ein Gen, aktivieren, während hohe Morphogen Konzentrationen, blau, ein anderes gen aktivieren könnte.

Aufbauend auf dieser Arbeit, 1988 identifiziert Christiane Nüsslein-Volhard durch Durchführung von genetischen Bildschirme auf fliegen die ersten bekannten Morphogen. Sie pflegte Antikörper um zu zeigen, dass eine Protein, bekannt als Bicoid, ein Konzentrationsgradient entlang der anterior-posterioren Achse des sich entwickelnden Embryos bildet und die Expression von Genen, die steuert für die Organisation der Kopf und Thorax Regionen wichtig.

In den frühen 1990er Jahren verwendet Peter Lawrence und Ginés Morata ihre eigene Arbeit in fliegen, um die Theorie der gestaltbildenden Gradienten zu erweitern. Sie vermutet, dass eine Reihe von Zellen verantwortlich für die Organisation ein bestimmtes Fach des Organismus ist. Während Entwicklung voranschreitet, weisen molekulare Signale diese Zellen zu teilen und zu konstruieren mehr Fächer, fort, bis der gesamte Organismus gebildet wird.

Jetzt, wo wir einige historische Highlights überprüft haben, betrachten wir ein paar grundlegende Fragen der aktuellen Entwicklungs Biologen.

Um zu beginnen, konzentrieren einige Forscher auf die Ermittlung der Moleküle, die Entwicklung zu regulieren. Zum Beispiel könnten sie einzelne oder Kombinationen von, Wachstumsfaktoren gezeigt, dass eine bestimmte Zelle Antwort wie Differenzierung oder Migration verursachen untersuchen.

Andere Entwicklungsstörungen Biologen untersuchen, wie diese Moleküle regulieren den Entwicklungsprozess. Sie können studieren, wie die Konzentration eines molekularen Signals mitteilen kann, eine Zelle zu differenzieren oder zu migrieren. Sie auch Fragen wie die Zellen mit anderen nahe gelegenen Zellen kommunizieren und Signalmoleküle, die über eine kurze Distanz zu verbreiten und handeln lokal, bekannt als parakrine Faktoren betrachten.

Abschließend noch einige Entwicklungen Biologen zu verstehen, wie Zellen auf äußere Signale reagieren. Sie können Änderungen im Inneren der Zelle selbst, z. B. erhöht oder verringert in der Expression von bestimmten Genen, studieren, durch einen Blick auf ihre kodierten Proteine. Andere konzentrieren sich auf äußere Veränderungen, wie z. B. Veränderungen in der Zelle Form oder Größe.

Jetzt haben Sie ein Gespür für wichtige Fragen der molekularen Entwicklungsbiologie Biologen betrachten einige Techniken, die sie verwenden, um Antworten auf diese Fragen zu finden.

Färbung ist eines der am weitesten verbreitete Ansätze gen Expressionsmuster zu untersuchen, und die Moleküle zu identifizieren, die Entwicklung zu regulieren.

Immunohistochemistry ist eine Färbung Technik, die Antikörper konjugiert zu chemischen oder fluoreszierende Reportern an Label Proteine verwendet. Visualisierung der Proteine durch Fluoreszenz-Mikroskopie bietet Einblicke in ihre Lokalisierung in Gewebeschnitten und auch ihren möglichen Beitrag zur Zellstrukturen. Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung ist eine Alternative Methode, die beschrifteten DNA oder RNA-Oligonukleotide verwendet, um Muster der Genexpression in dreidimensionale Gewebe betrachten Färbung.

Explant Kultur ist ein weiteres häufig verwendete Ansatz in diesem Bereich, die Mechanismen zu studieren, durch die äußere Reize handeln. Bei dieser Technik ist eine Gewebe aus der natürliche Ort des Wachstums entfernt und in Kultur gezüchtet. Bestimmte Wachstumsbedingungen, wie das Substrat auf die Kultur Platten oder hinzugefügt, um die Nährmedien, Wachstumsfaktoren können dann auf ihre Auswirkungen auf die Entwicklung von Zellen und Geweben untersucht werden.

Live Cell Imaging wird verwendet, um Zell-Reaktionen auf Entwicklungsstörungen Reize zu analysieren. In-vitro- Kulturen eignen sich gut für die Erfassung von Zellbewegungen und Lokalisierung Muster in Echtzeit. Gebeizt oder Fluoreszent markierte Zellen werden auch verfolgte in Vivo mit Zeitraffer-Mikroskopie.

Zellen aus einem Gewebe von Interesse sind häufig von einem Spender transplantiert, um einen Wirtsorganismus und dann im Laufe der Entwicklung überwacht.

Nun, da Sie mit einigen allgemeinen Labormethoden vertraut sind, sehen wir uns einige Anwendungen der molekularen Entwicklungsbiologie Forschung.

Ein Ansatz zur Bestimmung der Rolle bestimmte Gen-Produkte in der Entwicklung spielen ist, ihren Ausdruck durch äußere Mittel zu ändern. In diesem Experiment wurden antisense Oligonukleotide genannt Morpholinos Knockdown zwei Zebrafisch Genen wichtig für die Entwicklung der richtigen Innenohr injiziert. Immunostaining von Strukturproteinen zeigte, dass Embryonen mit reduzierten Genexpression weniger Neuronen und Haarzellen im Innenohr, im Vergleich zu den Kontrollen zeigen.

Eine weitere Anwendung der molekularen Entwicklungsbiologie ist, herauszufinden, wann und wo Gene exprimiert werden, um besser zu verstehen, wie ihre kodierten Proteine funktionieren können. Forscher in diesem Experiment verwendet Eindringmittel beschriftete RNA-Sonden ergänzen zwei Ziel Transkripte um Zellen, die Transkription eines oder beide Gene von Interesse zu identifizieren.

Einige Wissenschaftler verwenden Explant Kulturen, um Zell-Reaktionen unter verschiedenen Bedingungen zu analysieren. In diesem Experiment Ermittler sensorische Neuronen aus dem Innenohr Küken Embryonen seziert und für mehrere Stunden kultiviert. Als nächstes wurden Kulturen auf Medien mit Protein Perlen umgestellt. Time-Lapse confocal Bilder nach Inkubation mit markierten Antikörpern ergab, dass Proteine an den Perlen Projektionen aus Neurons Zellkörper gefördert.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Molekulare Entwicklungsbiologie beobachtet. In diesem Video haben wir überprüft die Geschichte der molekularen Entwicklungsbiologie Forschung und wichtige Fragen, die die Entwicklungs Biologen eingeführt. Wir auch prominente Forschungsstrategien erforscht und diskutiert einige ihrer aktuellen Anwendungen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Transcript

Studies in the field of molecular developmental biology provide insight about the changes that occur at the cellular level during differentiation and development. Researchers examine the physical and chemical mechanisms that regulate cell functions. This helps in understanding how cells give rise to specialized tissues within the maturing embryo, and how defects at the molecular level can lead to disease states.

This video presents a brief history of molecular developmental biology, introduces key questions asked by scientists in this field, describes some tools available to answer those questions, and discusses a few current lab applications.

Let’s start by reviewing some landmark studies in the history of molecular developmental biology research.

In 1957, Conrad Waddington published a book entitled “The Strategy of the Genes” in which he tried to explain how cell fate is decided. Based on previously conducted tissue transplantation studies, he presented a conceptual model describing that a cell is like a marble rolling down a hill, and the path it takes to reach the bottom will determine its final differentiated state. This idea that distinct cell types arise from undifferentiated cells receiving different signals during development became known as the “epigenetic landscape.”

Around the same time, Rita Levi-Montalcini and Stanley Cohen observed that transplanting tumors into chick embryos led to rapid neuron growth. They hypothesized that a substance secreted by the tumors caused this growth, and identified the protein as nerve growth factor, or NGF. Soon after that, Cohen discovered another growth factor that was secreted by mouse salivary gland and promoted the growth of epithelial cells. He identified this protein as epidermal growth factor, or EGF.

Later, in 1969, Lewis Wolpert proposed a theory about how a certain class of signaling molecules, known as morphogens, act directly on cells to induce specific responses at varying concentrations. He used colors of the French flag to model cell states, red serving as the default state when no signal is present. From there, low morphogen concentrations, shown in white, might activate one gene, while high morphogen concentrations, shown in blue, might activate a different gene.

Expanding on this work, in 1988 Christiane Nusslein-Volhard identified the first known morphogen by conducting genetic screens on flies. She used antibodies to show that a protein, known as Bicoid, forms a concentration gradient along the anterior-posterior axis of the developing embryo, and controls the expression of genes important for organizing the head and thorax regions.

During the early 1990s, Peter Lawrence and Ginés Morata used their own work in flies to expand the theory of morphogen gradients. They hypothesized that one set of cells is responsible for organizing one particular compartment of the organism. As development proceeds, molecular signals instruct those cells to divide and construct more compartments, continuing until the whole organism is formed.

Now that we have reviewed some historical highlights, let’s examine a few fundamental questions asked by current developmental biologists.

To begin, some researchers focus on identifying the molecules that regulate development. For example, they might study individual, or combinations of, growth factors shown to cause a specific cell response, such as differentiation or migration.

Other developmental biologists investigate how these molecules regulate the developmental process. They might study how the concentration of a molecular signal can instruct a cell to differentiate or migrate. They also ask about how cells communicate with other nearby cells, and look at signaling molecules which diffuse over a short distance and act locally, known as paracrine factors.

Finally, some developmental biologists want to understand about how cells respond to external signals. They may study changes inside the cell itself, such as increases or decreases in the expression of particular genes, by looking at levels of their encoded proteins. Others focus on external changes, such as alterations in cell shape or size.

Now that you have a feel for key questions asked by molecular developmental biologists, let’s look at some of the techniques they use to find answers to these questions.

Staining is one of the most widely used approaches to investigate gene expression patterns, and to identify the molecules that regulate development.

Immunohistochemistry is a staining technique that uses antibodies conjugated to chemical or fluorescent reporters to label proteins. Visualization of proteins by fluorescence microscopy offers insights about their localization in tissue sections, and also their potential contributions to cellular structures. Whole-mount in situ hybridization is an alternative staining method, which uses labeled DNA or RNA oligonucleotides to look at patterns of gene expression in three-dimensional tissues.

Explant culture is another commonly used approach in this field to study the mechanisms by which external stimuli act. In this technique, a tissue is removed from the natural site of growth and grown in culture. Specific growth conditions, such as the substrate on the culture plates or growth factors added to the culture media, can then be examined for their effects on developing cells and tissues.

Live cell imaging is used to analyze cell responses to developmental stimuli. In vitro cultures are well-suited for capturing cell movements and localization patterns in real time. Stained or fluorescently labeled cells can also be tracked in vivo using time-lapse microscopy.

Frequently, cells from a tissue of interest are transplanted from a donor to a host organism, and then monitored over the course of development.

Now that you’re familiar with some general laboratory methods, let’s look at some applications of molecular developmental biology research.

One approach to determining the role specific gene products play in development is to alter their expression by external means. In this experiment, antisense oligonucleotides called morpholinos were injected to knockdown two zebrafish genes important for proper inner ear development. Immunostaining of structural proteins showed that embryos with reduced gene expression exhibit fewer neurons and hair cells within the inner ear compared to the controls.

Another application of molecular developmental biology is to figure out when and where genes are expressed, to better understand how their encoded proteins may function. Researchers in this experiment used fluorescently labeled RNA probes complementary to two target transcripts in order to identify cells transcribing one or both genes of interest.

Some scientists use explant cultures to analyze cell responses under various conditions. In this experiment, investigators dissected sensory neurons from the inner ear of chick embryos and cultured them for several hours. Next, cultures were switched to media containing protein beads. Time-lapse confocal images following incubation with labeled antibodies revealed that proteins on the beads promoted the growth of projections from neuron cell bodies.

You’ve just watched JoVE’s introduction to molecular developmental biology. In this video, we have reviewed the history of molecular developmental biology research, and introduced key questions asked by developmental biologists. We also explored prominent research strategies, and discussed some of their current applications. As always, thanks for watching!

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