Name: Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung genetisch veränderter organotypischer Hautkulturen mit devitalisierter menschlicher Dermis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen in der Dermatologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit war supportedby der American Cancer Society Forschung Gelehrte Grant (RSG-12-148-01-DDC) und dem CIRM Grund Biologie Award (RB4-05779).

Die menschliche Haut-Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of California, Forschungsethikkommission von San Diego durchgeführt. Die menschliche Haut kann aus gebrauchten chirurgischen Proben erhalten oder von Hautbanken kauften (Hautbank in der Material / Ausrüstung Tabelle aufgeführt sind) werden. Der Ort, wo die Haut vor oder Alter des Spenders abgeleitet ist nicht kritisch für das Experiment, solange die Basalmembran-Proteinen (Kollagen / Laminin) in der Dermis nicht verschlechtert werden. 1. Herstellung von devitalisierten Menschen Dermis <ol><li> Auf der menschlichen Haut empfangen, legen Sie das Gewebe in der Gewebekultur Haube zu tauen (~ 3-5 min). Abhängig von der Größe der Haut die aufgetauten Gewebe in einem sterilen Wegwerf 50 ml konischen Röhrchen oder 125 ml Flasche. Die typische Größe der Haut von der Haut Bank 0,75 Quadratmetern. </li><li> Füllen Sie den Behälter zu 75% voll mit 4x Penicillin und Streptomycin (Pen / Strep) in 1x PBS. Kräftig schütteln5 Minuten und entsorgen Sie die Flüssigkeit. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 weitere Male. </li><li> Nach dem letzten Wasch, übertragen das Gewebe in ein neues Röhrchen / Flasche und fügen frische 4x Pen / Strep / PBS auf 75% des Behälters zu füllen. Inkubieren dieser Mischung in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C für 2 Wochen, um die Trennung der Dermis von der Epidermis zu ermöglichen. </li><li> Unter sterilen Bedingungen verwenden Pinzette von der Dermis abziehen die Epidermis. Die Dermis vollständig weiß ist, während die Epidermis wird Färbung in Abhängigkeit von der Rasse des Spenders (1A) haben. Entsorgen Sie die Haut gemäß dem Protokoll des Instituts für den Umgang mit menschlichem Gewebe. </li><li> Legen Sie die Dermis in einer Tube oder Flasche und waschen Sie ihn in 4x Pen / Strep in 1x PBS unter kräftigem Schütteln verdünnt (5 min wäscht 4 mal). Nach dem letzten Wasch, übertragen Sie die Dermis in ein neues Röhrchen / Flasche in 4x Pen / Strep in 1x PBS verdünnt und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Dermis können bei 4 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden. </li></ol&gt; 2. genetische Modifizierung primären humanen Keratinozyten HINWEIS: Verwenden Sie amphotrope phoenix Zellen in vollständigem DMEM media [DMEM + 10% fötalem Rinderserum (FBS) + Pen / Strep] gewachsen, um Viren zu produzieren, um primäre menschliche Keratinozyten zu infizieren. Virale Verpackungs Gene, die Proteine ​​wie gag-pol und Umschlag kodieren, stabil in das Zellgenom Phoenix die für die Virusproduktion ermöglicht, wenn sie mit einem retroviralen Vektor transfiziert integriert. Phoenix-Zellen mit hoher Effizienz unter Berücksichtigung hoher Virustiter Produktions transfiziert werden. Virus von dieser Verpackungslinie produziert kann auch infizieren eine Vielzahl von Säugetierzellen einschließlich menschlicher. <ol><li> Tag 1: Am Tag vor der Transfektion seed Phoenix-Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 800.000 Zellen pro Vertiefung in komplettem DMEM Medium. </li><li> Tag 2: Tag der Transfektion, verwenden Sie 3 ug von retroviralen Vektoren pro Vertiefung. Aliquot 3 ug retroviralen Vektor in einem 1,5-ml-Röhrchen. Verwenden Sie eine Mischung von 100 μ; l DMEM plus 6 ul Transfektionsreagenz für jeweils 3 ug Vektor. MIX 6 ul Transfektionsreagenz mit 100 ul DMEM in einem 1,5-ml-Röhrchen. (Die retroviralen Vektoren, die verwendet werden, sind in der Geräte / Materialien Tabelle aufgeführt). <ol><li> Inkubation für 5 min und fügen Sie die 106 &amp; mgr; l-Gemisch in die Pre-aliquotierten Röhrchen mit dem 3 ug retroviralen Vektor. Mischen und Inkubation bei RT für 30 min. Fügen Sie diese gesamte Mischung tropfenweise zu jeder Vertiefung der Phoenix-Zellen. </li></ol></li><li> 3. Tag: Der Tag nach der Transfektion, entfernen Sie die Medien aus den Phoenix-Zellen und 2 ml frisches vollständiges DMEM-Medium. Am selben Tag, Samen primärer menschlicher Keratinozyten in 6-Well-Platten in einer Dichte von 75.000 Zellen pro Vertiefung. Pflegen Sie die Keratinozyten in einer Keratinozyten-serumfreiem Medium (KCSFM) mit Antibiotika (Pen / Strep). HINWEIS: Primäre menschliche Keratinozyten wurden gekauft. Zellen können aus einer Vielzahl von Anbietern (in der Material / Ausrüstung Tabelle aufgeführt) erworben werden. </li><li> Tag 4: HarWeste das Medium aus den transfizierten phoenix-Zellen, die jetzt enthält Viruspartikel. Führen Sie das Material durch ein 0,45 um-Filter mit einer Spritze (um alle verunreinigenden phoenix Zellen zu entfernen) und legen Sie 2 ml auf die Keratinozyten (bei 75.000 Zellen / gut am Vortag: siehe Schritt 2.3). In Hexadimethrinbromid (5 ug / ml) zu den Medien zu helfen, vermitteln die Infektionsprozess. Virustiter sind ~ 1 x 10 &amp; sup7; TU / ml. <ol><li> Drehen die Platten mit 6 Vertiefungen in einer Zentrifuge bei 200 × g für 1 h bei RT. Nach dem Spin, entfernen Sie die Medien-Virus enthält, und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS vor der Zugabe KCSFM. </li></ol></li><li> Tag 5: Infizieren derselben Charge von Keratinozyten wieder wie in Schritt 2.4. HINWEIS: Wählen Sie die Keratinozyten mit einem Medikament, wenn es einen selektierbaren Marker auf dem retroviralen Vektor und erweitern für den Einsatz in nachgelagerten Analyse oder Anwendungen wie organotypischen Kulturen. </li></ol> 3. Einrichten Organotypische Hautkulturen <ol><li> Bauen Sie dieorganotypischen Kassette aus gängigen Materialien im Labor festgestellt oder die Kassetten können benutzerdefinierte durch einen Metall Stanzerei gemacht werden (2A - F). Um diese Kassetten von einem 3,5 cm-Gewebekulturplatte zu machen, verwenden Sie ein Brenneisen, ein 1,0 cm x 1,0 cm im Quadrat aus der Mitte des Deckels aus einem 3,5 cm-Schale (2A-B) zu entfernen. Tun Sie dies unter sterilen Bedingungen. <ol><li> Bringen quadratischen Zapfen an der Unterseite der Kassette (Deckel 3,5 cm Schale) mit klarem Nagellack (2C). Lassen Sie 5 Minuten für den Nagellack zu trocknen und drehen Sie die Kassette auf, so dass es auf den quadratischen Zapfen (2D) ruht. Setzen Sie die Kassette in einen 6 cm Schale. HINWEIS: Square Pegs können aus einer Vielzahl von Kunsthandwerk-Läden gekauft werden. </li></ol></li><li> Vorbereitung Keratinozyten-Wachstumsmedium (KGM) von 66% DMEM, 22% Ham-F12, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10% FBS, 2,67 ug / ml Adenin, 40 n bestehtg / ml Hydrocortison, 10 ng / ml Cholera-Toxin, 4,94 &amp; mgr; g / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin, 1,36 ng / ml Triiod-L-thyronin, 10 ng / ml EGF und 10 ug / ml Ciprofloxacin-Hydrochlorid. Filtern Sie die Medien durch ein 0,22 um-Filter und bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Nehmen die Dermis aus dem 4x Pen / Strep + PBS-Lösung und wäscht 2 mal in KGM und dann in KGM bei 37 ° C für zwei Tage vor der Verwendung. </li><li> Schneiden Sie die Lederhaut mit einem Skalpell bis 1,5 cm x 1,5 cm große Stücke schneiden und dann auf den organotypischen Kassette zu platzieren. Platzieren der Dermis mit der Oberseite der Dermis nach oben zeigt. Der obere Teil der Dermis wird die Seite, die in Kontakt mit den Keratinozyten (1B) kommt. </li><li> Legen Sie die vorgeschnittenen Lederhaut auf die quadratische Öffnung des organotypischen Kassette mit der Oberseite der Dermis nach oben (3A). </li><li> Klappen Sie den gesamten organotypischen Kassette, die die Lederhaut mehr als mit einer Pinzette (3B). Tauen die extrazelluläre Matrix-Lösung auf Eis. Verwenden Sie eine Nadel und Spritze zu ziehen 100 ul der extrazellulären Matrix-Lösung pro Kassette. 5 Tropfen auf den Boden der Dermis (glänzende Seite) und schütteln Sie leicht, um eine gleichmäßige Verteilung in der gesamten Dermis (3B) zu gewährleisten. </li><li> Lassen Sie 5 Minuten für die kommerzielle extrazellulären Matrix-Lösung vollständig zu verfestigen (3C). Nach dem Erstarren verwenden Pinzette, um die Kassette wieder umdrehen. 4 ml KGM an die 6 cm Schale. </li><li> Platzieren ,5-1.000.000 gentechnisch veränderten Keratinozyten auf die organotypische Kassetten, die die Lederhaut (Figur 3D). <ol><li> Trypsinize Keratinozyten, indem 4 ml von 0,05% Trypsin auf 10 cm-Platten für 5 min und schrecke mit 4 ml vollständigem DMEM-Medium. </li><li> Zählen Sie die Keratinozyten mit einer Zählkammer und dann drehen bei 200 xg für 5 min nach unten. Resuspendieren 0.5-1 Millionen Zellen (in Abhängigkeit von der Anzahl der verfügbaren Zellen) in 90 μl KGM und legen Sie alle Zellen auf der Dermis. Hinweis: Es ist wichtig, dieselbe Anzahl von Zellen auf die Lederhaut in dem gleichen Experiment zu platzieren, um sicherzustellen, daß die Unterschiede in der Dicke der regenerierten Epidermis gesehen nicht aufgrund von Unterschieden im Ausgangszellzahl. Platzieren von weniger als 0,5 Millionen Zellen auf Dermis kann zu schlechter Schichtung und Differenzierung führen. </li></ol></li><li> Ändern KGM Medien auf die organotypische Kulturen jeden zweiten Tag. Erntegewebe 1-14 Tage nach der Platzierung der Keratinozyten auf der Dermis. Voll Schichtung und Differenzierung der Epidermis tritt in der Regel nach Tag 5. </li></ol>

<ol><li>Tadeu, A. M., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells+in+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells in adult skin.</a> Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).</li>
<li>Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remembering+one%27s+identity%3A+the+epigenetic+basis+of+stem+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions.</a> FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).</li>
<li>Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+barrier+formation+and+recovery+in+skin+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders.</a> J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).</li>
<li>Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase+function+in+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase function in epidermis.</a> J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).</li>
<li>Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+pathways+in+disorders+of+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation.</a> Trends Genet. 29, 31-40 (2013).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+differentiation%3A+the+bare+essentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal differentiation: the bare essentials.</a> J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).</li>
<li>Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cancer+in+human+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling cancer in human skin tissue.</a> Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).</li>
<li>Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organotypic+culture+of+human+skin+keratinocytes+and+fibroblasts+to+achieve+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function.</a> Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).</li>
<li>Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Organotypic skin culture.</a> J Invest Dermatol. 133, e14(2013).</li>
<li>Sen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF750+Is+a+p63+Target+Gene+that+Induces+KLF4+to+Drive+Terminal+Epidermal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation.</a> Dev Cell. 22, 669-677 (2012).</li>
<li>Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+differentiation+in+a+self-renewing+mammalian+tissue+by+the+histone+demethylase+JMJD3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3.</a> Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAI2+controls+the+undifferentiated+state+of+human+epidermal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells.</a> Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).</li>
<li>Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+proliferation+and+differentiation+of+developmentally+mature+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes.</a> Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493, 231-235 (2013).</li>
<li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+function+in+self-renewing+human+epidermis+is+maintained+by+the+exosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome.</a> Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+progenitor+differentiation+requires+the+long+noncoding+RNA+ANCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR.</a> Genes Dev. 26, 338-343 (2012).</li>
<li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).</li>
<li>Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF750+interacts+with+KLF4+and+RCOR1%2C+KDM1A%2C+and+CTBP1%2F2+chromatin+regulators+to+repress+epidermal+progenitor+genes+and+induce+differentiation+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes.</a> Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).</li>
<li>Jameson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IQGAP1+scaffold-kinase+interaction+blockade+selectively+targets+RAS-MAP+kinase-driven+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors.</a> Nat Med. 19, 626-630 (2013).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+SNAI2+regulated+genes+in+primary+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+data%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes.</a> Genomics data. 4, 43-46 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Doebis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vitro+transduction+of+epithelial+cells+and+keratinocytes+with+improved+adenoviral+gene+transfer+for+the+application+in+skin+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering.</a> Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).</li>
<li>Melo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+correction+of+junctional+epidermolysis+bullosa+by+a+highly+recombinogenic+AAV+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant.</a> Mol Ther. 22, 725-733 (2014).</li>
<li>Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+expansion+of+human+keratinocyte+stem%2Fprogenitor+cells+carrying+a+transgene+with+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res+ther%22%5BJournal%5D)">Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector.</a> Stem cell res ther. 4, 127(2013).</li>
<li>Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+maintains+progenitor+function+in+self-renewing+somatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue.</a> Nature. 463, 563-567 (2010).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).</li>
<li>Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+skin%3A+fibroblasts+facilitate+keratinocyte+growth+and+differentiation+on+acellular+reticular+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis.</a> J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).</li>
<li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+skin+models+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">The use of skin models in drug development.</a> Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).</li>
</ol>

Wir haben nichts offenzulegen.

Genmanipulation in der menschlichen Haut organotypischen Kulturen bieten viele Vorteile häufig gelernten 2D kultivierten Zellen als auch Mausmodellen. 2D Kulturen fehlen die drei Zell-Zell und Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen dimensional in intakten Geweben und Organen gefunden. Jüngste Studien haben auch festgestellt, enorme Unterschiede zwischen 2D- und 3D-kultivierten Hautkrebszellen mit den 3D-kultivierten Zellen, die viel mehr Genexpression Ähnlichkeiten mit primären humanen Tumoren der Haut 16....

Die menschliche Epidermis ist eine geschichtete Epithel, die zu der darunter liegenden Dermis durch eine extrazelluläre Matrix, wie die Basalmembran Zone Epidermis nicht nur als Barriere, um den Verlust von Feuchtigkeit zu verhindern, sondern auch als erste Verteidigungslinie, um die zu schützen dient bekannt verbindet Körper vor fremden und toxische Stoffe 1. Die basale Schicht, die der tiefsten Schicht der Epidermis ist, enthält die epidermalen Stammzellen und Vorläuferzellen, die zu dem differenzierten Nachkommen, die den Rest der Oberhaut 2 zu bilden ergeben. Der epidermale Stammzellen differenzieren sie sich nach oben zu wandern, um die erste Schicht von differenzierten Zellen wie spinosus Schicht 3 bekannt ist. Im Stratum spinosum, drehen Zellen auf die Expression der Keratine 1 und 10, die dann liefern die Kraft, körperliche Belastung für den differenzierten Schichten der Epidermis zu widerstehen. Da die Dornfortsätze Schicht-Zellen weiter zu differenzieren, nach oben in der Epidermis, um sie zu bewegenm die Körnerschicht, die durch die Bildung von Keratohyalin und lamellarem Granulate sowie Strukturproteine, die unterhalb der Plasmamembran montiert sind charakterisiert ist. Da die Zellen in dem Differenzierungsprozess fortzufahren, die Proteine ​​unter der Plasmamembran sind Quer miteinander verbunden, während die plättchenförmigen Körnchen werden aus den Zellen extrudiert, um eine lipidreiche Barriere genannt Stratum corneum 4 bilden. Erkrankungen, die Störungen der epidermalen Wachstums und der Differenzierung Schlag ~ 20% der Bevölkerung 5 einzubeziehen. Somit Verständnis der Mechanismen bei diesem Verfahren ist von großer Bedeutung. Da Manifestation viele dieser Krankheiten abhängig Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Kontakt haben organotypischen Kulturen, in denen die menschliche Epidermis in einer 3D Umgebung rekonstituiert 6-10 erstellt. Diese Verfahren beinhalten typischerweise die Verwendung von primären oder transformierte Keratinozyten auf der extrazellulären Matrix ausgesät wie devitalisierten menschlichenDermis, Matrigel oder Kollagen. Gen-Regulationsmechanismen, die in den epidermalen Wachstums und der Differenzierung wichtig zu verstehen, können Keratinozyten genetisch durch retrovirale Vektoren manipuliert den Zuschlag oder überexprimieren Gene in 2D-Kultur und dann in 3D rekonstituiert. Diese Methoden sind sehr häufig benutzt worden, um Gene in epidermalen Stammzellen und Progenitorzellen Selbsterneuerung und Differenzierung sowie Progression Neoplasie 11-21 beteiligt charakterisieren. Hier eine eingehende Protokoll, wie die Genexpression in der Epidermis organotypischen Kulturen durch den Einsatz von Retroviren zu ändern ist.

<table><tbody><tr><td>Menschliche Haut</td><td>New York Firefighters Skin Bank</td><td><a href="http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html">http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html</a></td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>amphotrope Phönix-Zelllinien</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 Transfektion Reagenz</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Media (KCSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Adenin</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin Hydrochlorid</td><td>Serologicals</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>Kauter</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 1 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>quadratische Stifte</td><td>Kunst und Kunsthandwerk Läden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mensch Keratinozyten für Neugeborene</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>Keratinozyten für humane Neugeborene</td><td>Zellanwendungen</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV retroviraler Vektor</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS retroviraler Vektor</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro Retroviraler Vektor</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hexadimethrinbromid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von genetisch veränderten organotypische hautkulturen mit devitalisierten menschen dermis

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypischen Kulturen erlauben die Rekonstruktion eines 3D-Umgebung kritisch für Zell-Zell-Kontakt und Zell-Matrix-Wechselwirkungen, die die Funktion und Physiologie ihrer in vivo Gewebegegen nachahmt. Dies wird durch organotypische Hautkulturen, die treu rekapituliert die epidermale Differenzierung und Stratifizierung Programm veranschaulicht. Primären humanen epidermalen Keratinozyten sind genetisch manipulierbar durch Retroviren, wo Gene lassen sich überexprimiert oder abgerissen werden. Diese genetisch veränderte Keratinozyten kann dann verwendet werden, um die menschliche Epidermis in organotypischen Hautkulturen Bereitstellung einer leistungsfähiges Modell zu genetischen Signalwege zu untersuchen aufprall epidermalen Wachstums, Differenzierung und Fortschreiten der Krankheit zu regenerieren. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben Verfahren zur devitalized menschlichen Dermis vorzubereiten sowie genetisch zu manipulieren primären humanen Keratinozyten, um organotypischen Hautkulturen zu erzeugen. Regeneriert die menschliche Haut kann in downstr verwendet werdeneam Anwendungen wie Genexpressionsanalysen, Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation, gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung. So wird Generation dieser gentechnisch veränderten organotypischen Hautkulturen der Bestimmung von Genen, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Haut sind zu ermöglichen.

Der erste Schritt bei der Erzeugung von organotypischen menschliche Haut, um die Epidermis von der Dermis zu entfernen. Der zweiwöchigen Inkubation der Haut bei 37 ° C in 4 x Pen / Strep / PBS sollte die Trennung der Dermis von der Epidermis (1A) zu erlauben. Wenn die Trennung der Epidermis und Dermis ist schwierig, dann das Gewebe bei 37 ° C in 4x Pen / Strep / PBS für eine Woche und dann noch einmal versuchen Peeling mit einer Pinzette. Einer der Schlüssel zum Regenerieren...

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein umfassendes und detailliertes Protokoll darüber bereitzustellen, wie genetisch veränderte menschliche organotypische Haut aus epidermalen Keratinozyten und devitalisierter menschlicher Dermis erzeugt werden kann.

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, genetisch modifizierte, organotypische Hautkulturen mithilfe revitalisierten menschlichen Dermis zu erzeugen, um den Einfluss veränderter Genexpression auf das epidermale Wachstum und die Differenzierung zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Dermatologie zu beantworten, beispielsweise welche Gene für das epidermale Wachstum, die Differenzierung und den Fortschritt hin zur Erkrankung verantwortlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass innerhalb weniger Tage genetisch veränderte menschliche Haut erzeugt werden kann, wodurch die Untersuchung menschlicher Proben ermöglicht wird, die potenziell klinische Relevanz besitzen. Den Vorgang wird jingly aus meinem Labor demonstrieren. Falls gefrorene menschliche Haut empfangen wird, legen Sie das Gewebe zum Auftauen für drei bis fünf Minuten in die Gewebekulturhaube. Sobald das Gewebe aufgetaut ist, überführen Sie es in einen sterilen 50-Milliliter-Konischkolben oder eine 125-Milliliter-Flasche, je nach Größe. Fügen Sie anschließend viermal Penicillin und Streptomycin in ein XPBS hinzu, bis der Behälter zu 75 % gefüllt ist. Verschließ

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video beschreibt das detaillierte Protokoll zur Erstellung von in vitro 3D-Organotyp-Hautrekonstruktionen zur Untersuchung des Melanomverlaufs. Dieses Hautmodell ahmt sowohl die Architektur als auch die multizelluläre Komplexität von Organen in vivo nach.

Generierung organotypischer Vollhautrekonstruktionen: Ein Verfahren zur Erstellung eines 3D-Hautmodells anhand menschlicher Hautproben

Dieses Video beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von genetisch veränderten primären humanen Keratinozyten rekombinanten Retroviren. Diese Methode kann verwendet werden, um die Genexpression in Keratinozyten zu manipulieren.

Genetische Modifikation primärer humaner Keratinozyten: Eine Methode zur genetischen Manipulation von Keratinozyten mit rekombinanten Retroviren

Dieses Videoprotokoll beschreibt eine kassettenbasierte In-vitro-Kulturtechnik zur Erzeugung menschlicher organotypischer Haut unter Verwendung von epidermalen Keratinozyten und devitalisierter menschlicher Dermis. Sie ahmen die Funktion und Physiologie ihrer in vivo Gewebe-Pendants nach.

Organotypische 3D-Hautkultur: Eine kassettenbasierte In-vitro-Kulturtechnik zur Regeneration der menschlichen Epidermis auf azellulärer Dermis

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein dreidimensionales Hautäquivalent in voller Dicke aufzubauen, das der natürlichen Haut ähnelt. Mit einer eigens konstruierten automatisierten Aufwickelvorrichtung können präzise und reproduzierbare Wunden unter Beibehaltung der Sterilität erzeugt werden.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

Wir stellen eine Protokoll-Zellen abgeleiteten Matrices reich an extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, unter Verwendung von hochmolekularen Crowders (MMC). Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll, das MMC in 3D organotypischen Haut Co-Kultur-Generation enthält, die Kulturzeit reduziert, während Laufzeit von Konstrukt beibehalten wird.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

Die menschliche Haut wirkt als eine erste Verteidigungslinie gegen die Außenumgebung. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Diese isolierten Keratinozyten eignen sich zahlreiche Versuchsaufbauten und sind ein sehr geeignetes Modell für die Untersuchung der molekularer Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-.

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell zu generieren, die sowohl die Architektur rekapituliert und mehrzelligen Komplexität einer Orgel/Tumor in Vivo aber gleichzeitig bietet Platz für systematische experimentelle Intervention.

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Wir schlagen eine Protokoll, die zeigt, wie man differenzieren induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Keratinozyten und Fibroblasten und generieren eine organoide 3D Haut mit diesen Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll enthält einen zusätzlichen Schritt einem humanisierten Mäuse-Modell zu erzeugen. Die hier vorgestellten Technik verbessert die dermatologische Forschung.

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Erzeugung und volumetrische Analyse von vaskularisierten menschlichen Hautäquivalenten unter Verwendung zugänglicher und einfacher Techniken für die Langzeitkultur zu beschreiben. Soweit möglich, wird die Begründung für die Schritte beschrieben, um den Forschern die Möglichkeit zu geben, sich an ihre Forschungsbedürfnisse anzupassen.

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Hier beschreiben wir Protokolle für drei Arten von embryonalen Hautexplantatkulturen von Vögeln, die zur Untersuchung von Gewebeinteraktionen, 4D-Bildgebungs-Zeitrafferfilmen (3D plus Zeit), globalen oder lokalen Störungen der molekularen Funktion und systembiologischer Charakterisierung verwendet werden können.

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Hautorganoiden, die Haarfollikel aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen enthalten, unter Verwendung eines planaren, physiologisch relevanten Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultursystems, um die Hautarchitektur und -funktion zu replizieren.

Erzeugung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten planaren haartragenden Hautorganoiden unter Verwendung eines Luft-Flüssig-Grenzflächenkultursystems

Erfahren Sie die Herstellung genetisch veränderter organotypischer Hautkulturen mit devitalisierter menschlicher Dermis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen in der Dermatologie.

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Weitere Videos entdecken