Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, genetisch veränderte organotypische Hautkulturen unter Verwendung revitalisierter menschlicher Dermis zu erzeugen, um den Einfluss einer veränderten Genexpression auf das epidermale Wachstum und die Differenzierung zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Dermatologie zu beantworten, z. B. die Bestimmung, welche Gene für das Epiwachstum, die Differenzierung und das Fortschreiten der Krankheit verantwortlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass innerhalb weniger Tage genetisch veränderte menschliche Haut erzeugt wird, was die Untersuchung von menschlichen Proben ermöglicht, die potenziell klinisch relevant sind.

Die Demonstration des Verfahrens wird aus meinem Labor kommen. Wenn Sie gefrorene menschliche Haut erhalten, legen Sie das Gewebe zum Auftauen drei bis fünf Minuten lang in die Gewebekulturhaube. Nach dem Auftauen füllen Sie das Gewebe je nach Größe in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen oder eine 125-Milliliter-Flasche.

Als nächstes fügen Sie vier x Penicillin und Streptomycin in ein XPBS hinzu, bis der Behälter zu 75% gefüllt ist. Verschließen Sie den Behälter und schütteln Sie ihn fünf Minuten lang kräftig. Entfernen Sie die Antibiotikalösung und wiederholen Sie diesen Vorgang.

Gehen Sie nach der letzten Wäsche noch dreimal vor, geben Sie das Tuch in einen neuen Behälter und fügen Sie frische Antibiotikalösung hinzu. Inkubieren Sie diese Mischung in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei Wochen, um die Trennung der Dermis von der Epidermis zu ermöglichen. Wenn zwei Wochen vergangen sind, verwenden Sie eine Pinzette, um die Epidermis von der Dermis zu entfernen.

Entsorgen Sie die Epidermis gemäß dem Protokoll der Institution für den Umgang mit menschlichem Gewebe. Legen Sie die Dermis in einen Behälter mit antibiotischer Lösung und waschen Sie sie wie zuvor unter kräftigem Schütteln. Nach der letzten Wäsche wird die Dermis in einen neuen Behälter mit Antibiotikalösung umgefüllt und bei vier Grad Celsius gelagert, bis sie am Tag vor der Transfektion verwendet werden kann. Phönixzellen werden in einem vollständigen Medium in eine Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von 800.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät.

Mischen Sie am Tag der Transfektion sechs Mikroliter Transfektionsreagenz mit 100 Mikrolitern dmm. Für jede zu transfizierende Vertiefung und Inkubation bei Raumtemperatur Fünf Minuten lang die Mischung in ein Röhrchen mit drei Mikrogramm retroviralem Vektor für jede zu transfizierende Vertiefung geben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, diese gesamte Mischung tropfenweise in jede Vertiefung der Phönixzellen geben und die Zellen am Tag nach der Transfektion über Nacht inkubieren. Entfernen Sie das Medium aus den Phönixzellen und fügen Sie am selben Tag zwei Milliliter frisches vollständiges Medium hinzu.

Resuspendieren Sie primäre humane Keratinozyten in keratinozytenserumfreiem Medium mit Antibiotika und säen Sie es in sechs Wandplatten mit einer Dichte von 75.000 Zellen pro Well. Ernten Sie am nächsten Tag das Medium, das nun Viruspartikel aus den transfizierten Phoenix-Zellen enthält. Führen Sie das Medium mit einer Spritze durch einen 0,45-Mikron-Filter, um alle kontaminierenden Zellen zu entfernen.

Geben Sie fünf Mikrogramm pro Milliliter Hexadimethylbromid zu dem gefilterten virushaltigen Medium, um den Infektionsprozess zu unterstützen. Pipettieren Sie dann zwei Milliliter des Virus auf die am Vortag plattierten Keratinozyten. Als nächstes drehen Sie die sechs Wandplatten in einer Zentrifuge bei 200 G für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Entfernen und entsorgen Sie nach dem Schleudern die Virenmedien. Waschen Sie die Zellen einmal mit einem XPBS und fügen Sie dann am nächsten Tag frisches K-C-S-F-M hinzu. Infizieren Sie dieselbe Charge von Keratinozyten mit dem Virus, indem Sie das gerade gezeigte Verfahren anwenden.

Um organotypische Kassetten herzustellen. Entferne mit einem Kauter ein Quadrat von einem Zentimeter mal einem Zentimeter aus der Mitte des Deckels einer 3,5 Zentimeter großen Gewebekulturschale. Befestigen Sie quadratische Stifte mit klarem Nagellack an der Unterseite der Kassette und lassen Sie den Nagellack fünf Minuten trocknen.

Drehen Sie zum Schluss die Kassette um und legen Sie die Kassette in eine sechs Zentimeter große Schale, in der eine Kassette auf den Wirbeln ruht. Nehmen Sie die Dermis aus einem vier Grad Celsius warmen Lager und überführen Sie sie in einen Behälter mit Keratinozytenwachstum. Mittel zu waschen.

Nach Wiederholung des Waschvorgangs die Dermis in frisches KGM legen und zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Schneiden Sie nach der Inkubation die Dermis mit einem Skalpell in 1,5 Zentimeter x 1,5 Zentimeter große Stücke. Setzen Sie dann das Organotypische mit der Oberseite der Dermis nach oben auf das quadratische Loch auf.

Drehen Sie mit einer Pinzette die gesamte organotypische Kassette um, in der sich die Dermis befindet. Geben Sie fünf Tropfen der frisch gewaschenen extrazellulären Matrix auf den Boden der Dermis und schütteln Sie sie leicht, um eine gleichmäßige Verteilung auf der Dermis zu gewährleisten. Nachdem Sie die extrazelluläre Matrix fünf Minuten lang verfestigt haben, drehen Sie die Kassette mit einer Pinzette wieder um und geben Sie dann vier Milliliter KGM in die sechs Zentimeter große Schale.

Nach der Ernte und Zählung der genetisch veränderten Keratinozyten suspendiert Resus 0,5 bis 1 Million Zellen in 90 Mikrolitern KGM und gibt die Zellen auf die Dermis ab. Inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 Grad Celsius. Wechseln Sie jeden zweiten Tag die Medien über die Kulturen.

Die vollständige Schichtung und Differenzierung der Epidermis erfolgt in der Regel nach dem fünften Tag. Gewebe kann bis zu 14 Tage nach der Beschichtung entnommen werden. Dieses Bild zeigt die Hämatin- und Eosinfärbung von organotypischen.

Hautkulturen: Die regenerierte menschliche Haut enthält sowohl die Epidermis als auch die Dermis. Die Epidermis ist vollständig geschichtet und differenziert mit vier verschiedenen Schichten, einschließlich der undifferenzierten Basalschicht und der drei differenzierten Schichten, einschließlich Stratum, Spinosum, Ranum und Cornium. Diese Immunfluoreszenzbilder zeigen, dass die Überexpression von SNA i two, wie rechts gezeigt, die epidermale Differenzierung hemmt, verglichen mit dem auf der linken Seite gezeigten Kontrollgewebe, das für die Differenzierung färbt.

Das Protein Keratin eins oder K eins ist grün dargestellt und die Zellkerne sind blau markiert. Die RTQ-PCR-R-Analyse zur Messung der mRNA-Spiegel von SNAI zwei in kontrolliertem LAC Z und S NNA I zwei über exprimierendem Gewebe zeigt eine mehr als 50-fache Expression von SNAI zwei im Vergleich zur Kontrolle. Schließlich zeigt diese RTQ-PCR-R-Analyse, dass die Überexpression von SNA I zwei zum Verlust der Expression von differenzierungsinduzierten Strukturgenen wie TGM eins und SPRR eins A führt.

Andere Methoden wie Chipsy, Immunfluoreszenz, RN, ae oder Western Blot können durchgeführt werden, um die Mechanismen des epiduralen Wachstums und der Differenzierung zu bestimmen. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Dermatologie den Weg, um zu untersuchen, wie sich eine veränderte Genfunktion auf die Homöostase der Haut auswirkt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man genetisch veränderte organische menschliche Hautkulturen mit Keratinozyten erzeugt und menschliche Dermis entwickelt.