Umschriebene Capsular Infarkt Modellierung einer Photothrombotic unter Verwendung der Technik
2. Juni 2016
Dieses Manuskript beschreibt eine Modellierungstechnik der Kapsel Infarkt. Hier verwendeten wir eine modifizierte photothrombotic Technik mit geringer Intensität des Lichts nach Vorchirurgischer Ziel-Mapping. Mit dieser Technik haben wir einen umschriebenen Kapselinfarktmodell mit persistierendem motorischen Beeinträchtigungen.
Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, ein umschriebenes Kapselinfarktmodell mit einer persistierenden motorischen Beeinträchtigung mittels photothrombotischer Technik zu erstellen. Vor der Entstehung des Kapselinfarkts ist es notwendig, den Bereich der Vordergliedmaßen in der inneren Kapsel zu identifizieren, indem ein Adeno-assoziiertes Virus, das GFP exprimiert, in den Bereich der vorderen Gliedmaßen des motorischen Kortex eingeführt wird. Beginnen Sie damit, eine anästhesierte Ratte in einen stereotaktischen Rahmen zu setzen.
Rasieren Sie dann den Kopf der Ratte und sterilisieren Sie die Kopfhaut mit 70%igem Alkohol und Povidon- und Jodlösung. Injizieren Sie 2%Lidocainhydrochlorid unter die Kopfhaut im Bereich des vorgesehenen Kopfhautschnitts, um intraoperative Schmerzen zu reduzieren. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
Und legen Sie ein steriles Tuch über das Tier. Nachdem Sie einen Schnitt von zwei Zentimetern in der Mittellinie in der Kopfhaut gemacht haben, positionieren Sie den stereotaktischen Arm, um den Bereich der vorderen Gliedmaßen des motorischen Kortex gemäß den stereotaktischen Koordinaten zu identifizieren. Bohren Sie an dieser Stelle ein Einführungsloch.
Bewegen Sie die Nadel zum Bohrloch und senken Sie die Nadel einen Millimeter durch die Dura in den motorischen Kortex. Verwenden Sie eine hochpräzise Mikropumpe, um langsam einen Mikroliter Virus zu injizieren. Lassen Sie die Nadel weitere 10 Minuten an Ort und Stelle, um einen Rückfluss in den Nadeltrakt zu verhindern.
Nach Ablauf von 10 Minuten ziehen Sie die Nadel langsam zurück. Nach der Reinigung der Operationsstelle mit Kochsalzlösung sichern Sie die Wunde mit einer 3-0-Nylonnaht. Lösen Sie dann die Ratte aus dem stereotaktischen Rahmen und bringen Sie sie zur Überwachung in eine Auffangkammer.
Verabreichen Sie ein Analgetikum zur postoperativen Schmerzkontrolle. Nach zwei bis drei Wochen töten Sie die Ratte nach zugelassenen Methoden und schneiden Sie das kryogeschützte Gehirn. Beobachten Sie nach der Färbung für GFP die AAV-GFP-transduzierten Axone in der inneren Kapsel mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Vergleichen Sie die Positionen der transduzierten Axone, wie sie auf dem Fluoreszenzbild zu sehen sind, mit dem Rattenhirnatlas, um die stereotaktischen Koordinaten der transduzierten Axone genau zu bestimmen. Um die optische neuronale Schnittstelle vorzubereiten, schneiden Sie zunächst mit einem Schneidbohrer etwa vier Zentimeter einer 27-Gauge-Spinalnadel mit einem Mandrin im Inneren. Ziehen Sie dann 10 Zentimeter des Mantels von einer optischen Faser ab.
Führen Sie das unummantelte Stück der optischen Faser in ein Metallrohr ein. Und klemmen Sie den Schlauch um die Faser. Klemmen Sie dann mit einem Drücker das untere 1/2 des Metallrohrs zweimal fest.
Das Metallrohr füllt den Raum zwischen der optischen Faser und der Nabe der Spinalnadel aus. Tragen Sie wärmehärtendes Epoxidharz auf die optische Faser auf. Tragen Sie zusätzliches Epoxidharz auf die leere Stelle in der Nabe auf.
Und führen Sie die optische Faser in die Spinalnadel ein. Härten Sie das Epoxidharz 20 Minuten lang bei 100 Grad Celsius aus, um eine stabile Fixierung zu gewährleisten. Nach dem Aushärten spalten Sie die optische Faser, die aus der Spinalnadel herausragt, und polieren Sie die optische Faser an der Spitze der Spinalnadel mit Diamantläppblechen.
Verbinden Sie abschließend den FCPC-Steckerteil des Patchkabels mit dem Koppler des grünen Lasersystems. Verwenden Sie dann ein digitales optisches Leistungs- und Energiemessgerät, um die Lichtintensität von der Spitze der optischen Faser zu messen und eine genaue Lichtemission zu gewährleisten. Legen Sie ein Wärmekissen unter den Körper des Tieres, um die Körpertemperatur bei 37,5 Grad Celsius zu halten.
Beginnen Sie damit, die Ratte wie zuvor zu betäuben und auf die Operation vorzubereiten. Nachdem Sie einen Schnitt von zwei Zentimetern in der Mittellinie vorgenommen haben, passen Sie die Höhe der Nasenklemme an, bis Bregma und Lambda auf gleicher Höhe ausgerichtet sind. Die richtige Ausrichtung ist entscheidend, um die innere Kapsel richtig auszurichten.
Positionieren Sie den stereotaktischen Arm, um die Stelle für die Photothrombose zu lokalisieren. Bohren Sie dann an dieser Stelle ein zwei Millimeter großes Loch. Polieren und reinigen Sie anschließend die Glasfaserspitze des ONI und befestigen Sie sie dann ohne Verbiegen am stereotaktischen Rahmen.
Überprüfen Sie die Spitze des ONI, um sicherzustellen, dass sie sauber und intakt ist. Messen Sie die Laserintensität von der Spitze der optischen Faser vor dem Einsetzen der optischen Schnittstelle an die Zielstelle des Rattengehirns. Stellen Sie die Laserintensität an der Spitze der optischen Faser auf 3,5 Milliwatt ein.
Senken Sie nun die ONI unter Verwendung der im ersten Abschnitt des Protokolls ermittelten dorsoventralen Koordinate in den Zielbereich der internen Kapsel ab. Injizieren Sie dann zwei Milligramm pro Kilogramm Rosenbengalen durch die Schwanzvene und starten Sie dann einen Countdown-Timer, der auf eine Minute eingestellt ist. Wenn die Minute abgelaufen ist, schalten Sie den grünen Laser mit einer Größe von 532 Nanometern 90 Sekunden lang ein, um den Infarkt zu erzeugen.
Entfernen Sie nach einer Bestrahlung das ONI vorsichtig aus dem Gehirn. Nach der Reinigung der Operationsstelle die Wunde mit einer 3-0 Nylonnaht sichern. Nehmen Sie dann die Ratte aus dem stereotaktischen Rahmen und bringen Sie sie in eine Aufwachkammer.
Dieses Bild zeigt das Ausmaß der Infarktläsionen über unterschiedliche Intensitäten des Laserlichts von zwei Milliwatt bis fünf Milliwatt zwei Wochen nach der photothrombotischen Läsionierung. Pfeile zeigen die Infarktläsion an. Die optische Lichtintensität wird in dieser Versuchsanordnung mit drei Milliwatt bis vier Milliwatt angegeben.
Die nächsten beiden Bilder zeigen das mikroskopische Erscheinungsbild des Kapselinfarkts drei Wochen nach der Photothrombose. In diesem koronalen Schnitt des Rattengehirns zeigen die Pfeilspitzen den Trakt der Nadel an, der die optische Faser im Thalamus und bis zur inneren Kapsel enthält. Diese seriell verschachtelten gefärbten Schnitte zeigen das Ausmaß der Infarktläsion in der inneren Kapsel.
Die Pfeile zeigen die Infarktläsion an.
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Übersicht
Dieses Manuskript beschreibt eine Modellierungstechnik des kapsulären Infarkts unter Verwendung einer modifizierten photothrombotischen Technik. Dieser Ansatz ermöglicht die Erstellung eines umschriebenen kapsulären Infarktmodells, das zu einer anhaltenden motorischen Beeinträchtigung führt.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Neurobiologie
- Motorische Beeinträchtigung
Hintergrund
- Kapselinfarkte sind mit motorischen Defiziten verbunden.
- Photothrombotische Techniken werden verwendet, um lokale Hirnverletzungen hervorzurufen.
- Das Verständnis der Mechanismen motorischer Beeinträchtigungen ist entscheidend für die Entwicklung therapeutischer Strategien.
- Target-Mapping ist für die genaue Modellerstellung unerlässlich.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Modells des kapsulären Infarkts.
- Untersuchung der Auswirkungen von kapsulären Infarkten auf die motorische Funktion.
- Verwendung einer modifizierten photothrombotischen Technik für präzises Targeting.
Verwendete Methoden
- Identifikation des Vordergliedmaßenbereichs in der inneren Kapsel unter Verwendung von adenoassoziiertem Virus, das GFP exprimiert.
- Vorbereitung der Ratte durch Anästhesie und Platzierung des stereotaktischen Rahmens.
- Sterilisation der Kopfhaut und Vorbereitung des Einschnitts.
- Injektion von Lidocain zur Minimierung der intraoperativen Schmerzen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erstellung eines umschriebenen kapsulären Infarktmodells.
- Nachweis einer anhaltenden motorischen Beeinträchtigung nach dem Infarkt.
- Validierung der modifizierten photothrombotischen Technik.
- Etablierung einer reproduzierbaren Methode für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Die modifizierte photothrombotische Technik ist effektiv für die Modellierung kapsulärer Infarkte.
- Dieses Modell kann zur Untersuchung motorischer Beeinträchtigungen und potenzieller Interventionen verwendet werden.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um die zugrunde liegenden Mechanismen von motorischen Defiziten zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to white matter stroke pathophysiology.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation in motor circuitry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking infarct location to persistent motor impairment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lesion volumes via optical intensity titration for dose-response assessment.
- Operational Value: Delivers highly replicable infarct models with consistent motor deficit readouts.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening in neuroprotection or neurorepair.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models white matter stroke at behavioral, circuit, and cellular levels for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on lesion specificity and functional outcome correlation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of infarct extent with motor deficit severity for predictive biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of white matter vulnerability and circuit-specific motor pathway disruption.
- Screening: Enables assay standardization through precise lesion control and quantitative motor deficit scoring.
- Analytics: Provides volumetric infarct measurements and behavioral readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via persistent motor deficit phenotyping.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective and rehabilitative compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through selective white matter infarct modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser intensity calibration and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of white matter pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on ability to mitigate persistent motor deficits in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector delivery, stereotaxic surgery, and optical neural interface fabrication.
- Depends on precision instrumentation including stereotaxic frames, microinjectors, and calibrated laser systems.
- Necessitates cross-team standardization for viral titer consistency, optical fiber preparation, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include species-specific stereotaxic coordinates and optical properties of gray versus white matter.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for postoperative validation via histology and behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
