Umschriebene Capsular Infarkt Modellierung einer Photothrombotic unter Verwendung der Technik
2. Juni 2016
Dieses Manuskript beschreibt eine Modellierungstechnik der Kapsel Infarkt. Hier verwendeten wir eine modifizierte photothrombotic Technik mit geringer Intensität des Lichts nach Vorchirurgischer Ziel-Mapping. Mit dieser Technik haben wir einen umschriebenen Kapselinfarktmodell mit persistierendem motorischen Beeinträchtigungen.
Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, mithilfe der Photothrombose-Technik ein umschriebenes kapselförmiges Infarktmodell mit anhaltender motorischer Beeinträchtigung zu erzeugen. Vor der Erzeugung des kapselförmigen Infarkts ist es notwendig, den Vordergliedmaßenbereich in der Capsula interna zu identifizieren, indem ein adeno-assoziierter Virus, der GFP exprimiert, in den Vordergliedmaßenbereich der motorischen Rinde injiziert wird. Beginnen Sie damit, eine anästhesierte Ratte in einen stereotaktischen Halter zu legen.
Dann rasieren Sie den Kopf der Ratte und desinfizieren Sie die Kopfhaut mit 70 %igem Alkohol und Povidon-Iodin-Lösung. Injizieren Sie 2 % Lidocain-Hydrochlorid unter die Kopfhaut im Bereich des geplanten Hautschnitts, um intraoperative Schmerzen zu reduzieren. Tragen Sie ein Augensalbe auf, um das Austrocknen der Augen zu verhindern.
Und legen Sie ein steriles Tuch über das Tier. Nachdem Sie einen zwei Zentimeter langen medianen Schnitt in der Kopfhaut gemacht haben, positionieren Sie den stereotaktischen Arm, um die Extremitätenregion der motorischen Rinde gemäß den stereotaktischen Koordinaten zu identifizieren. Bohren Sie an dieser Stelle ein Eintrittsloch.
Bewegen Sie die Nadel zur gebohrten Öffnung und senken Sie die Nadel um einen Millimeter durch die Dura in den motorischen Kortex ab. Injizieren Sie langsam mit einer hochpräzisen Mikropumpe ein Mikroliter Virus. Lassen Sie die Nadel weitere 10 Minuten an Ort und Stelle, um einen Rückfluss entlang der Nadelbahn zu verhindern.
Nachdem 10 Minuten verstrichen sind, entziehen Sie die Nadel langsam. Reinigen Sie die Operationsstelle mit einer Spülung aus Kochsalzlösung und verschließen Sie die Wunde mit einer 3-0-Nylonnaht. Danach befreien Sie die Ratte aus dem stereotaktischen Rahmen und überführen sie in eine Rekuperationskammer zur Überwachung.
Verabreichen Sie ein Analgetikum zur postoperativen Schmerzkontrolle. Opfern Sie die Ratte nach zwei bis drei Wochen gemäß zugelassenen Methoden und schneiden Sie das kryogeschützte Gehirn. Nach der Färbung für GFP beobachten Sie die mit AAV-GFP transduzierten Axone im Capsulum internum mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Vergleichen Sie die Positionen der transduzierten Axone, wie sie auf dem Fluoreszenzbild zu sehen sind, mit dem Rattenhirnatlas, um die stereotaktischen Koordinaten der transduzierten Axone genau zu bestimmen. Um die optische neuronale Schnittstelle vorzubereiten, schneiden Sie zunächst mit einem Schneidbohrer etwa vier Zentimeter einer 27-Gauge-Spinalnadel mit eingeschobenem Stylet ab. Anschließend entfernen Sie die Umhüllung von zehn Zentimetern einer optischen Faser.
Führen Sie das unumhüllte Stück der Glasfaser in ein Metallröhrchen ein und klemmen Sie das Röhrchen um die Faser fest. Anschließend verwenden Sie eine Zange, um die untere Hälfte des Metallröhrchens zweimal zu verschließen.
Die Metallhülse füllt den Raum zwischen der Glasfaser und der Nabe der Spinalkanüle aus. Tragen Sie hitzehärtenden Epoxidharz auf die Glasfaser auf. Geben Sie zusätzlichen Epoxidharz in den freien Raum der Nabe.
Und führen Sie die optische Faser in die Spinalnadel ein. Härten Sie das Epoxidharz 20 Minuten lang bei 100 Grad Celsius zur stabilen Fixierung aus. Nach der Aushärtung schneiden Sie das aus der Spinalnadel herausragende Ende der optischen Faser ab und polieren Sie die optische Faser an der Spitze der Spinalnadel mit Diamant-Läppfolien.
Schließen Sie abschließend das FCPC-Verbindungsstück des Patchkabels an den Kuppler des grünen Lasersystems an. Verwenden Sie dann ein digitales optisches Leistungs- und Energiemessgerät, um die Lichtintensität an der Spitze der optischen Faser zu messen, um eine genaue Lichtemission sicherzustellen. Legen Sie eine Wärmeprobe unter den Körper des Tieres, um die Körpertemperatur während der Operation bei 37,5 Grad Celsius zu halten.
Beginnen Sie damit, die Ratte wie zuvor für die Operation zu narkotisieren und vorzubereiten. Nach einer medianen zwei Zentimeter langen Inzision stellen Sie die Höhe der Nasenklemme so ein, dass Bregma und Lambda auf gleicher Höhe ausgerichtet sind. Die korrekte Ausrichtung ist entscheidend, um die Capsula interna gezielt anzusteuern.
Positionieren Sie den stereotaktischen Arm, um die Stelle für die Photothrombose zu lokalisieren. Bohren Sie anschließend ein zwei Millimeter großes Loch an dieser Stelle. Danach polieren und reinigen Sie die optische Faser des ONI und befestigen Sie sie dann ohne Biegung am stereotaktischen Rahmen.
Überprüfen Sie die Spitze des ONI, um sicherzustellen, dass sie sauber und intakt ist. Messen Sie die Laserintensität an der Spitze der optischen Faser, bevor die optische Schnittstelle in die Zielregion des Rattenhirns eingeführt wird. Stellen Sie die Laserintensität an der Spitze der optischen Faser auf 3,5 Milliwatt ein.
Senken Sie nun das ONI mithilfe der dorsoventralen Koordinate, die im ersten Abschnitt des Protokolls ermittelt wurde, in den Zielbereich der Capsula interna ab. Injizieren Sie anschließend zwei Milligramm pro Kilogramm Rose Bengal über die Schwanzvene und starten Sie dann eine Countdown-Uhr, die auf eine Minute eingestellt ist. Sobald die Minute abgelaufen ist, schalten Sie den 532 Nanometer grünen Laser für 90 Sekunden ein, um den Infarkt zu erzeugen.
Nach der Bestrahlung vorsichtig die ONI aus dem Gehirn entfernen. Nach der Reinigung der Operationsstelle die Wunde mit einer 3-0-Nylonnaht verschließen. Anschließend die Ratte vom stereotaktischen Rahmen lösen und in eine Erholungskammer bringen.
Diese Aufnahme zeigt das Ausmaß der Infarktionsläsionen bei unterschiedlichen Intensitäten von Laserlicht von zwei Milliwatt bis fünf Milliwatt zwei Wochen nach der photothrombotischen Läsion. Pfeile zeigen die Infarktionsläsion an. In diesem experimentellen Ansatz wird eine optische Lichtintensität zwischen drei und vier Milliwatt angenommen.
Die nächsten beiden Bilder zeigen das mikroskopische Erscheinungsbild des kapsulären Infarkts drei Wochen nach der Photothrombose. In diesem koronalen Schnitt des Rattenhirns zeigen die Pfeilspitzen die Bahn der Nadel, die die optische Faser im Thalamus und bis zur inneren Kapsel enthält. Diese seriellen, ineinanderliegenden gefärbten Schnitte zeigen das Ausmaß der Infarktläsion in der inneren Kapsel.
Die Pfeile zeigen die Infarktläsion an.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Modellierungstechnik für einen kapsulären Infarkt unter Verwendung einer modifizierten phototrombotischen Technik. Dieser Ansatz ermöglicht die Erzeugung eines begrenzten Modells eines kapsulären Infarkts, das zu einer anhaltenden motorischen Beeinträchtigung führt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Neurobiologie
- Motorische Beeinträchtigung
Hintergrund
- Kapsuläre Infarkte sind mit motorischen Defiziten assoziiert.
- Mithilfe photothrombotischer Techniken werden lokalisierte Hirnschädigungen induziert.
- Das Verständnis der Mechanismen motorischer Beeinträchtigungen ist entscheidend für die Entwicklung therapeutischer Strategien.
- Die Zielabbildung ist für die präzise Erstellung von Modellen unerlässlich.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Modells eines kapsulären Infarkts.
- Untersuchung der Auswirkungen kapsulärer Infarkte auf die motorische Funktion.
- Anwendung einer modifizierten phototrombotischen Technik zur präzisen Zielsteuerung.
Verwendete Methoden
- Identifizierung des Vordergliedmaßenareals in der Capsula interna mithilfe eines adeno-assoziierten Virus, das GFP exprimiert.
- Vorbereitung der Ratte durch Anästhesie und Fixierung im stereotaktischen Rahmen.
- Sterilisation der Kopfhaut und Vorbereitung des Hautschnitts.
- Injektion von Lidocain zur Minimierung intraoperativer Schmerzen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erstellung eines umschriebenen kapsulären Infarktmodells.
- Nachweis einer persistierenden motorischen Beeinträchtigung nach dem Infarkt.
- Validierung der modifizierten phototrombotischen Technik.
- Einrichtung einer reproduzierbaren Methode für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Die modifizierte photothrombotische Technik eignet sich zur Modellierung von kapsulären Infarkten.
- Dieses Modell kann verwendet werden, um motorische Beeinträchtigungen und mögliche therapeutische Ansätze zu untersuchen.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um die zugrundeliegenden Mechanismen motorischer Defizite zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese photothrombotische Technik ermöglicht eine präzise Modellierung eines weißen-Materie-Infarkts, indem gezielt auf die Capsula interna abgezielt wird, während benachbartes graues Gewebe geschont wird. Der resultierende begrenzte kapsuläre Infarkt verursacht anhaltende motorische Defizite und bietet somit ein krankheitsrelevantes System zur mechanistischen Entschärfung von neurotherapeutischen Kandidaten. Das Modell unterstützt die Target-Validierung und die präklinische Bewertung von Interventionen, die auf die Pathologie des weißen Gewebes abzielen, und schließt damit eine entscheidende Lücke in der Schlaganforschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen im Zusammenhang mit der Pathophysiologie von Weißmatter-Infarkten.
- Operationaler Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur funktionellen Validierung von Zielstrukturen in motorischen Schaltkreisen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem er den Infarktort mit anhaltenden motorischen Beeinträchtigungen verknüpft.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare Läsionsvolumina mittels optischer Intensitätstitration zur Dosis-Wirkungs-Bewertung.
- Operativer Wert: Liefert hochreproduzierbare Infarktmodelle mit konsistenten motorischen Defizit-Auslesungen.
- Eignung für Assays: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoffscreening-Untersuchung in Neuroprotektion oder Neuroregeneration vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Modelliert weiße Substanz-Infarkte auf Verhaltens-, Schaltkreis- und zellulärer Ebene zur präklinischen Validierung.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch basierend auf Läsionsspezifität und Korrelation funktioneller Ergebnisse.
- Biomarker-Abstimmung: Ermöglicht die Korrelation des Infarktausmaßes mit der Schwere motorischer Defizite zur Entwicklung prädiktiver Biomarker.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Zielidentifizierung bis zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung und ermöglicht eine iterative Verbesserung neurotherapeutischer Strategien.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Anfälligkeit der weißen Substanz und der unterbrochenen, schaltkreisspezifischen motorischen Bahnen.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch präzise Läsionskontrolle und quantitative Bewertung motorischer Defizite.
- Analytik: Bietet volumetrische Infarktbestimmungen und verhaltensbasierte Messgrößen zur vergleichenden Analyse von Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckungsergebnisse mit der präklinischen Kontinuität durch die phänotypische Charakterisierung persistierender motorischer Defizite.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die iterative Prüfung neuroprotektiver und rehabilitativer Wirkstoffe.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Sicherheit bezüglich der Zielstrukturen durch selektive Modellierung von Marklager-Infarkten.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch Kalibrierung der Laserintensität und stereotaktische Zielgenauigkeit.
- Strategischer Wert: Vermindertes biologisches Risiko in späteren Entwicklungsstadien durch frühzeitige mechanistische Absicherung von Markbahnungen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf der Fähigkeit, persistierende motorische Defizite in einem validierten Modell zu reduzieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Vektor-vermittelten Virusabgabe, stereotaktischen Chirurgie und der Herstellung optischer neuronaler Schnittstellen.
- Basiert auf Präzisionsinstrumenten wie stereotaktischen Rahmen, Mikroinjektoren und kalibrierten Lasersystemen.
- Erfordert eine Standardisierung über Teamgrenzen hinweg hinsichtlich der Virustiter, der Vorbereitung optischer Fasern und der postoperativen Überwachung.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind artenspezifische stereotaktische Koordinaten sowie die optischen Eigenschaften von grauer und weißer Substanz.
- Praktische Einschränkungen umfassen die chirurgische Komplexität und die Notwendigkeit einer postoperativen Validierung mittels Histologie und Verhaltenstests.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
