Name: Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie die stabile genetische Modifikation von Neuralen Stammzellen in der erwachsenen Maus mittels lentiviraler Partikel. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellautonomer und nischenabhängiger Effekte für die Stammzellforschung.

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Wir erkennen die Hilfe von MJ Palop und die technische Unterstützung der SCSIE der Universidad de Valencia. Wir danken auch Antonia Follenzi für hilfreiche Kommentare und Diskussion des Manuskripts. IF von der Fundación Botín unterstützt wird, von der Banco Santander durch die Santander Universities Global Division und durch Zuschüsse aus Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP und ISIC) und Ministerio de Economía y Competitividad (Mineco: SAF2011-23331, CIBERNED und RETIC TERCEL) . Diese Arbeit wurde auch durch BFU2010-21823 und RETIC TERCEL Zuschüsse aus Mineco und des European Research Council (ERC) 2012-StG (260511- unterstützt PD-HUMMODEL) bis AC BM-P. ist der Empfänger von einem spanischen FPI Gemeinschaft des Mineco.

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<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).</li>
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<li>Kokovay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM1+is+essential+to+maintain+the+structure+of+the+SVZ+niche+and+acts+as+an+environmental+sensor+to+regulate+SVZ+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).</li>
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<li>Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+neural+stem+cells+in+the+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone.</a> Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).</li>
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<li>Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+ex%2Fin+vivo+assay+to+detect+effects+of+exogenously+added+factors+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells.</a> Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).</li>
<li>Consiglio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).</li>
<li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Third-Generation+Lentivirus+Vector+with+a+Conditional+Packaging+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System.</a> J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
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</ol>

Alle Manipulationen wurden in einer biologischen Sicherheitsstufe 2 Zimmer gemacht. Tier Protokolle wurden von der Ethikkommission der Universität von Valencia und waren alle in Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinie 2010/63 / EU zugelassen.

LVs bieten wichtige Vorteile gegenüber anderen viralen Systemen für die genetische Veränderung von erwachsenen NSC 16,18. Stereotaktische Lieferung von Lentiviren in die V-SVZ Nische stellt ein effizientes Verfahren zur Markierung und Spuren selten B1-NSC Aufteilen der Grenzen der anderen üblicherweise verwendeten Methoden wie BrdU zu überwinden, die nach mehreren Zellteilungen verdünnt wird, oder Retrovirus, das Zellen, die nur Ziel dass zum Zeitpunkt der Anwendung wuchern. LVs zusammen mit Adenoviren können...

Die Maus-ventrikulären-Subventrikularzone (V-SVZ), in den Wänden des lateralen Ventrikel des Striatum zugewandt ist, ist eine sehr aktive Keimbereich, in dem ein kontinuierlicher Prozess der Vorläuferzellreplikation und Differenzierung ergibt sich die anhaltende Produktion von Riechkolben (OB ) Inter und Corpus callosum Oligodendrozyten 1. Die lebenslange Erzeugung dieser Zellen wird durch die Anwesenheit in diesem Bereich von neuralen Stammzellen (NSC; auch als B1-Zellen) unterstützt werden, die die astrozytären Antigen glial fibrillary acidic protein (GFAP) und Stammzellmarker wie Nestin, Id1 auszudrücken und Sox2 2. GFAP-exprimierenden B1 Zellen erzeugen Transit Verstärken Vorläufer (TAP) Zellen (C-Zellen), die die Transkription DLX2 auszudrücken Faktoren (distal losen homeobox 2) und ASCL1 (mammalian Achaete-Schute homolog 1) und schnell zu einem mehrmals teilen, bevor sie Anlaß geben zu migrieren Neuroblasten (A-Zellen) oder oligodendroblasts 3. Neu generierten prolifoperativen Neuroblasten Migration nach vorn, die rostralen Migrationsstrom (RMS) an den OB bildet, wo sie in dem körnigen und glomeruläre Schichten wie differenziert inhibitorischen Inter integrieren. Migrieren von jungen oligodendroblasts zur CC bewegen, wo sie unreif NG2-positive Zellen werden, die lokal oder differenzieren zu reifen myelinisierenden Oligodendrozyten 1,4 weiter zu unterteilen. B1-Zellen, die aus fötalen radialen Gliazellen ableiten, behalten die langgestreckte und polarisierte Morphologie ihrer Vorgänger und weisen eine hoch spezialisierte Beziehung zu ihrer Nische. Sie erstrecken sich zwischen dem Ependyms welche Linien der Herzkammer und dem Netzwerk von Blutgefäßen, die die V-SVZ Nische bewässern. Die kleine apikale Prozess der B1-Zellen lagert sich unter multiciliated ependymocytes und endet in einem unbeweglichen primären Zilien, während ihre basalen Prozess lange Strecken erweitert die planare Gefäßplexus zu nähern, die diese Nische Ende in der b bewässertasal Lamina des Plexus Kapillaren 2,5-8. Der zuverlässigste Weg B1-NSC aus nicht-neurogenen Astrozyten, die auch GFAP +, in der intakten V-SVZ Nische zu unterscheiden, basiert auf ganze Montage Zubereitungen der Ventrikel Seitenwand und deren Analyse durch 3-D konfokale Mikroskopie nach für GFAP Immunfärbung des dünnen B1-NSC apikalen Verfahren, β-Catenin zu beschriften Zellmembranen abzugrenzen, und entweder γ-Tubulin als Marker für cilial Basalkörpern oder acetyliertes α-Tubulin die Ausdehnung jeder cilium 5,8 zu beschriften. Beobachtungen dieser Ganz Halterungen von der ventrikulären Oberfläche haben gezeigt, dass B1 und Ependymzellen in &quot;pinwheels&quot; 5 angeordnet sind, in denen die uniciliated apikale Prozesse eines oder mehrerer GFAP + B1-Zellen von einer Rosette aus multiciliated Ependymzellen umgeben sind. Die charakteristische Morphologie von B1-Zellen korreliert mit experimentellen Beweis iRückenmarksflüssigkeit (CSF) bilden geregelt Quellen von löslichen Signale ndicating die Blutgefäße / Endothelzellen und ventrikuläre auf NSCs wirkenden 2,6,9-11. An der ventrikulären Oberfläche, homotypische und hetero apikal-lateralen Wechselwirkungen zwischen ependymal und B1-Zellen gehören tight junctions und Adhärenzverbindungen 5,12. Außerdem impliziert Adhäsionsmolekülen in den junctional Komplexen zwischen B1 und Ependymzellen, wie N-Cadherin und V-CAM, wurden in der V-SVZ Nische, sondern auch ihre Ruhe 12 die hoch organisierten Positionierung von B1 nicht nur gezeigt, zu regulieren , 13. Die ependymalen-B1 Zellmonoschicht erscheint als eine Diffusionsbarriere zu wirken, um den geregelten Fluss von Wasser und kleinen Molekülen aus der CSF erlaubt, aber den Durchgang von großen interzellulären Proteinen 10,11 einzuschränken. Experimentelle Daten zeigen, dass die einzigartig positioniert, B1 Zelle apikal Zilien eine Rolle als Sensor von Signalisierungs Polypeptide 2 in der CSF spielen könnte,7.5. Ependymzellen sind an sich auch eine Quelle von löslichen und membrangebundenen Signale mit einer Rolle bei der Regulation von NSC Verhalten 14,15. Rückverfolgbar Nucleoside, wie Brom-desoxyuridin (BrdU) oder Retroviren sind weit zu beschriften Vorläuferzellen, einschließlich NSC, in vivo verwendet. Jedoch sind diese Methoden nicht optimal für die Rückverfolgung langfristige Schicksal weil BrdU Signale durch wiederholte Zellteilungen und Retroviren verdünnen erscheinen vorzugsweise vorübergehend an Zielzellen aufgrund ihrer Erfordernis der Zellproliferation zur Transduktion 16,17 verstärken. NSC Physiologie in vivo, auch der Wechselwirkungen mit Nischen Komponenten zu untersuchen, ist es entscheidend, ein Verfahren zu etablieren selten teilende Zellen zu kennzeichnen und Spuren, als B1-NSCs weitgehend ruhig sind und deren Nachbar Ependymzellen nie 3 unter physiologischen Bedingungen unterteilen. Hier zeigen wir, dass lentivirale Vektoren (LVs) ermöglichen eine hocheffiziente Gen ZeichenIng und langfristige Änderung der Erwachsenen NSC und nicht teil Ependymzellen aufgrund meisten angemessen ihrer Fähigkeit zu transduzieren und in das Genom der Zielzellen in einer Zellzyklus-unabhängigen Weise zu integrieren. Darüber hinaus zeigen wir, wie die Route der Lieferung und virale Titer Hilfe speziell Ependymzellen transduzieren, aber nicht B1-Zellen wodurch die Analyse der Nische abhängig, ependymal Auswirkungen auf NSCs.

<table><tbody><tr><td>Teil 1: Erzeugung von LV für die In-vivo-Verabreichung.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XL-100K</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW-28</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW-55</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugen-Röhrchen&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>358126</td><td>25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td>13 mm x 51 mm</td></tr><tr><td>Ultrazentrifugen-Adapter</td><td>Beckman Coulter</td><td>358156</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>SPL</td><td>PLC-30006</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>SPL</td><td>PLC-30024</td><td></td></tr><tr><td>10-cm-Schale</td><td>SPL</td><td>PLC-20101</td><td>100 x 20</td></tr><tr><td>FACS Röhrchen</td><td>Afora</td><td>DE400800</td><td>12 mm x 75 mm, 5 ml</td></tr><tr><td>Becher steriler FACS-Filter</td><td>BD</td><td>340626 30</td><td>&micro; m</td></tr><tr><td>Nitrozellulosefilter</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>0,22 &mu; M&nbsp;</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>Blauer Laser 488 nm</td></tr><tr><td>Steritop Filter</td><td>Biofil</td><td>FPE-204-500&nbsp;</td><td>0,22 &Mikro; </td></tr><tr><td>mReagenzien:</td>pMDLg/pRRE-Plasmid<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Addgen</td><td>#12251</td><td>Kernverpackung Plasmid</td></tr><tr><td>pRSV.REV Plasmid&nbsp;</td><td>Addgen</td><td>#12253</td><td>Kernverpackung Plasmid</td></tr><tr><td>pMD2G Plasmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>Hüllplasmid</td></tr><tr><td>pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre Plasmid&nbsp;</td><td>Addgen</td><td>#12252</td><td>Transfervektor-Plasmid</td></tr><tr><td>Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>L0101-500</td><td>für HeLa-Zellkulturen</td></tr><tr><td>Iscove's modifiziertes Dulbecco's Medium&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>12440-053</td><td>Für 293T Zellkultur</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td></td><td></td><td>Tris-HCl (sigma, T5941), 0,1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7,6,&nbsp; DNAse/RNAse-frei, 0,2 &Mikro; m sterilfiltriert</td></tr><tr><td>2x HBS</td><td></td><td></td><td>0,28 M NaCl (Sigma, S7653), 0,05 M HEPES (Sigma, H7523), 1,5 mM wasserfreies Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (vorzugsweise nicht MilliQ). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH-Lösung (Calbiochem, 567530) auf 7,0 ein.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>Stammlösung in einer 100x-Konzentration, zur Herstellung von HeLa und 293T-Kulturmedium in einer Endkonzentration von 10x.</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513-100</td><td>Stammlösung bei 200 mM, zur Herstellung von HeLa und 293T Kulturmedium in einer Endkonzentration von 6 mM.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Life technologies</td><td>11360-039</td><td>Stammlösung bei 100 mM, zur Herstellung von HeLa und 293T Kulturmedium in einer Endkonzentration von 1 mM.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Wird zur Herstellung von 293 T Nährmedium in einer Endkonzentration von 1 % verwendet.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>Stammlösung enthält 5.000 Einheiten/ml Penicillin und 5 mg/ml Streptomycin. Wird zur Herstellung von HeLa und 293T-Nährmedium in einer Endkonzentration von 1 % verwendet.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Mit Phenolrot, enthält 2,5 g Schweinetrypsin und 0,2 g EDTA 4Na/L HBSS.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>Ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, 10x, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen. Stammlösung zur Herstellung von 1x PBS in Wasser in Zellkulturqualität.</td></tr><tr><td>Polybren (Hexadimethrinbromid) &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>Pulver. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung mit 8 mg/ml in dH<sub2O</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd EM-Qualität 16%</td><td>EM Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Teil 2: Sterotaktische Injektion von LV in die SEZ selbst oder den lateralen Ventrikel.<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Ausrüstung:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernier stereotaktisches Instrument</td><td>NeuroLab, Leica</td><td>39463001</td><td>http://www.leicabiosystems.com/</td></tr> <tr><td>Cunningham-Maus und Adapter für Neugeborenen-Ratten</td><td>NeuroLab, Leica</td><td>39462950</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenhalter</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-311-CE</td><td></td></tr><tr><td>33 Gauge Spritze</td><td>Hamilton</td><td>P/N&nbsp; &nbsp; &nbsp; 84851/00</td><td>#85RN</td></tr><tr><td>Bohrmaschine</td><td>Fine Science Tool</td><td>98096</td><td></td></tr><tr><td>Wärmedecke</td><td>Ufesa</td><td>AL5512/01</td><td>230-240 V, 100-110 W, Typ C_AL01</td></tr><tr><td>Rasierer&nbsp;</td><td>Jata</td><td>MP373N</td><td>Modell: beauty, 3 V, 300 mA, Typ HT-03.</td></tr><tr><td>Reagenzien:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Esteve</td><td>DOMTOR&nbsp;</td><td>Kommerzielle Lösung in einer Dosis von 1 mg/ml.</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Merial</td><td>Imalgene 500&nbsp;</td><td>Handelsfähige Lösung in einer Dosierung von 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Medetomidina/Ketamin-Gemisch</td><td></td><td></td><td>Bereiten Sie ein Arbeitsgemisch aus Medetomidin in einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml Verdünnung und Ketamin in einer Endkonzentration von 15 mg/ml in Kochsalzlösung vor. Verwenden Sie als Anästhesie, indem Sie ein Volumen injizieren, um eine Endkonzentration von 0,5-1 mg Medetomidina pro kg Körpergewicht und 50-75 mg Ketamin pro kg Körpergewicht zu erhalten</td></tr><tr>.<td>Butorphanol</td><td>Pfizer</td><td>Torbugesic</td><td>Stammlösung bei 10 mg/ml. Wird als Analgesie bei 1 mg/ml in Kochsalzlösung verwendet.</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Esteve</td><td>Antisedan</td><td>Stammlösung bei 5 mg/ml, verwendet in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml in Kochsalzlösung zum Verlassen der Anästhesie.</td></tr><tr><td>0,9%ige Kochsalzlösung</td><td>Braun</td><td>13465412</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>Topischer Hautkleber</td></tr><tr><td>HydroGel</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>11 cm x 21 cm</td></tr><tr><td>Bleach/Virkon</td><td>Dupont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgischer Marker</td><td>Staedler</td><td>313-9</td><td>Permanent lumocolor</td></tr><tr><td>Gleitgel für die Augenheilkunde</td><td></td><td>SICCAFLUID</td><td>0,5 g/Dosis, Carbomer 974P</td></tr><tr><td>Povidon-Jod</td><td>Betadine</td><td>694109,6</td><td>10% Povidon-Jod</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Teil 3: Histologische Analyse.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatische Schlauchpumpe</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07524-55</td><td>Masterflex L/S Sparantrieb mit variabler Drehzahl, 1,6-100 U/min, 230 V</td></tr><tr><td>Pumpenkopf</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07518-00</td><td>Masterflex L/S Easy-Load-Pumpenkopf für Präzisionsschläuche; PSF-Gehäuse, CRS-Rotor</td></tr><tr><td>Silikonschlauch</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-96410-16</td><td>Platinum L/S 16</td></tr><tr><td>Kopfhautvenen-Set</td><td>Vygon V-grün</td><td>70246.05T</td><td>25 G, 30 cm Tubuslänge</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FluoView FV10i</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Tehtnica</td><td>SHP-10</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer (PB)</td><td></td><td></td><td>0,2 M PB: 0,2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) und 0,2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, pH-Wert auf 7,2-7,4</td></tr><tr><td>einstellen Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Panreac</td><td>141451.1211</td><td>Jedes Mal frisch zubereiten. Heizen dH2O bis zu 55&ndash; 60°; C mit einer Heizplatte, die in einen Abzug gestellt wird, und unter Rühren PFA-Pulver einfüllen, um eine 8%ige Lösung zu erhalten. Die Lösung ist trübweiß, da sich PFA nicht leicht auflöst. Fügen Sie 1N NaOH Tropfen für Tropfen hinzu, bis die Lösung klar ist. Kühlen Sie ab, filtern Sie durch Whatman-Papier und fügen Sie ein äquivalentes Volumen von 0,2 M PB hinzu.</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td></td><td></td><td>0,9% NaCl in dH2O</td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>LOCTITE</td><td>767547</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Panreac</td><td>122712.1608</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Millipore</td><td>S30-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>Reinigungsmittelmittel</td></tr><tr><td>Anti-GFP-Kaninchen-Antikörper</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-215</td><td>Verwendung in einer Verdünnung von 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-21206</td><td>Verwendung in einer Verdünnung von 1:750</td></tr><tr><td>6-Diamindino-2-phenylindol-dihydrochlorid-hydrat (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Fluoreszierende Kernfärbung. Bei 2 mg/ml in ddH2O verwenden. Im Dunkeln bei 4 °C aufbewahren.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>EM Sciences</td><td>17984-25</td><td>Eindeckmedium für fluoreszierende Präparationen</td></tr></tbody></table>

stabile und effiziente genetische veränderung von zellen in der erwachsenen maus v-svz für die analyse von neural stem cell autonome und nicht autonome effekte

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relativ ruhig unterstützen somatische Stammzellen lebenslang die Zellerneuerung in den meisten adulten Geweben. Neurale Stammzellen im erwachsenen Gehirn von Säugetieren sind zwei spezifische neurogenen Nischen eingeschränkt: die Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus und der ventrikulären-Subventrikularzone; in den Wänden der seitlichen (V-SVZ auch subependymale Zone oder SEZ bezeichnet) Ventrikel. Die Entwicklung von In-vivo-Gentransfer-Strategien für die adulte Stammzellpopulationen (dh diejenigen des Säugetiergehirns), die sich in langfristige Expression des gewünschten Transgene in den Stammzellen und deren abgeleiteten Nachkommen ist ein wichtiges Instrument in der aktuellen biomedizinischen und biotechnologischen Forschung. Hier wird eine direkte in vivo-Verfahren für die stabile genetische Veränderung von erwachsenen Maus V-SVZ Zellen präsentiert, die den Vorteil des Zellzyklus-unabhängig Infektion durch LVs und dem hoch spezialisierte Zellarchitektur des V-SVZ Nische findet. Insbesondere beinhalten die aktuelle Protokolls die Injektion von Leer LVs (Kontrolle) oder LVs kodiert bestimmten Transgen-Expressionskassetten entweder in die V-SVZ selbst, für den in-vivo-Targeting von allen Arten von Zellen in der Nische oder in die lateralen Ventrikel Lumen zum Targeting von ependymalen Zellen, die nur. Expressionskassetten werden dann in das Genom der transduzierten Zellen und fluoreszierende Proteine ​​integriert, die ebenfalls von dem LVs kodiert, erlauben die Detektion der transduzierten Zellen für die Analyse der Zelle autonom und nicht autonomen, Nische abhängige Effekte in den markierten Zellen und ihre Nachkommen.

LV-vermittelte Gen-Delivery-System kann für die Langzeit-in vivo Transduktion von Zellen in der adulten Maus V-SVZ verwendet werden, so dass ihre Verfolgung und genetische Veränderung während der Proliferation, Migration und Differenzierung. Die Infektion und die Expression sind hochwirksame und zahlreiche Zellen ergeben, die leicht zu unterscheiden und auch nicht-infizierten Zellen durch die Expression des Reporter aufgenommen werden können. Wir haben bisher transduzierten Zellen mit GFP fluoreszierenden Repor...

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das auf der Verwendung von lentiviralen Partikeln zur langfristigen genetischen Modifikation von neuralen Stammzellen und/oder ihren benachbarten ependymalen Zellen in der adulten ventrikulär-subventrikulären neurogenen Nische basiert und die getrennte Analyse von zellautonomen und nicht-autonomen, nischenabhängigen Effekten auf neurale Stammzellen ermöglicht.

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, geringe Volumina hochtitriger Lentiviren, die spezifische DNA-Konstrukte tragen, entweder in die ventrikulär-subventrikuläre Zone erwachsener Mäuse zu injizieren, um alle dort vorkommenden Zelltypen zu infizieren, oder in das Seitenventrikel, um ausschließlich Ependymzellen zu beeinflussen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bezüglich der Interaktionen zu beantworten, die erwachsene neuronale Stammzellen der ventrikulär-subventrikulären Nische mit ihren benachbarten Ependymzellen eingehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Lentiviralvektoren unabhängig vom Zellzyklus in das Genom der Zielzellen integrieren und somit eine langfristige Differenzierung selten teilender Zellen ermöglichen. Bei der Demonstration des Verfahrens wird mir die Doktorandin Beatriz Mart

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Quelle: Porlan, E., et al. Stabile und effiziente genetische Modifikation von Zellen in der adulten Maus V-SVZ zur Analyse von autonomen und nicht-autonomen Effekten neuraler Stammzellen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt eine stabile genetische Modifikation von neuralen Stammzellen (NSCs) in der ventrikulär-subventrikulären Zone (V-SVZ) durch stereotaktische Injektion eines virustragenden therapeutischen Gens in ein Mausmodell. Das Virus dringt in NSCs ein, durchläuft eine reverse...

Stereotaktische Injektion von Viren für eine stabile genetische Veränderung in einem Mausmodell

Virale Vektoren können für gezielte Genmanipulation. Wir demonstrieren, ein Verfahren zur bedingten Genexpression oder Ablation im Rückenmark der Maus, stereotaktische Injektion unter Verwendung eines viralen Vektors in der dorsalen Horn, ein bekannter Ort der synaptischen Kontakt zwischen primären somatosensorischen Afferenzen und Neuronen des zentralen Nervensystems.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Wir berichten über eine auf Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) basierende Methode, um neurale Stammzellen (NSCs) und ihre Nachkommen aus der subventrikulären Zone (SVZ) des adulten Mäusegehirns zu isolieren. Angewendet auf FUCCI-transgene Mäuse (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) ermöglicht es die Untersuchung des Zellzyklusverlaufs durch Live-Bildgebung.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Wir beschreiben ein Protokoll der stereotaktischen Operation mit einer hausgemachten Kopf fixiert Vorrichtung zur microinjecting Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Diese Technik ermöglicht Genmanipulation in neuronalen Zellen bestimmter Regionen des Neugeborenen mäusegehirnen.

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung genetisch veränderter Mausmodelle mit embryonalen Stammzellen vor, insbesondere für große DNA-Knock-In (KI). Dieses Protokoll wird mithilfe der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung optimiert, was zu einer signifikant verbesserten KI-Effizienz im Vergleich zur konventionellen homologen rekombinationsvermittelten linearisierten DNA-Targeting-Methode führt.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Eine Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirn lebender Ratten wird hier experimentell detailliert vorgestellt. Es ermöglicht die mehrfache Entnahme dieser Zellen von denselben Tieren, ohne ihr Wohlbefinden zu beeinträchtigen.

Die "Brain Milking"-Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus lebenden Ratten

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung chemisch umprogrammierter Stammzellen, um eine präzise neuronale Modulation zu erreichen, indem diese Zellen in dopaminerge Vorläuferzellen differenziert, in Mausmodelle der Parkinson-Krankheit transplantiert und verhaltensbezogene und elektrophysiologische Ergebnisse ausgewertet werden, um die erfolgreiche Integration und funktionelle Wirksamkeit der transplantierten Zellen zu bestätigen.

Chemogenetische Regulation in reprogrammierten Stammzell-abgeleiteten Vorläuferzellen bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen

Erfahren Sie die stabile genetische Modifikation von Neuralen Stammzellen in der erwachsenen Maus mittels lentiviraler Partikel. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellautonomer und nischenabhängiger Effekte für die Stammzellforschung.

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte (Video) | JoVE Journal

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

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