Erdmagnetfeld (GMF) und Pflanze Evolution: Untersuchung der Auswirkungen von Gmf Reversal auf

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe von Helmholz-Spulen, die über eine Stromversorgung gesteuert werden, eine Umkehrung des erdmagnetischen Feldes (GMF) zu erzeugen. Letztendlich wird gezeigt, dass die GMF-Umkehrung die Morphologie und Genexpression von Pflanzen beeinflusst. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pflanzenentwicklung zu beantworten, beispielsweise, ob die Umkehrung des Erdmagnetfelds eine Rolle in der Pflanzenentwicklung und -anpassung gespielt haben könnte.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur Untersuchung möglicher biologischer Wirkungen schwacher Magnetfelder in einem einfachen Modellorganismus verwendet werden kann, der mit zahlreichen Wiederholungen unter exakt kontrollierten Bedingungen kultiviert werden kann. Die Demonstration dieses Verfahrens erfolgt durch Alberto Bocco und eine betreute Studentin aus meinem Labor sowie Kiara aa. Sie ist Doktorandin in meinem Labor und CIA Bertea, die außerordentliche Professorin in meiner Arbeitsgruppe ist.

Zunächst schalten Sie die drei Gleichstromnetzgeräte ein, die mit den drei Paaren von Helmholtz-Spulen verbunden sind, und schalten Sie das Dreiaxen-Magnetometer ein, dessen Sonde in den dreiaxigen Spulen eingeführt ist. Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Magnetometer-Software, mit der Daten vom Dreiaxen-Magnetometer erfasst werden können. Die Netzgeräte sind ebenfalls über eine GPIB-Verbindung (A-G-P-I-B) an einen Computer zur Steuerung angeschlossen.

Stellen Sie die Spannungen der Stromversorgungen so ein, dass das gewünschte Magnetfeld mit umgekehrtem Magnetfeldvektor erzeugt wird, wie im textlichen Protokoll beschrieben. Geben Sie die Samen des Arabidopsis-Aliana-Ekotyps Columbia, null, in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, dessen Oberfläche durch Behandlung mit einer Calciumhypochlorit-Lösung für 10 bis 12 Minuten bei 25 bis 28 Grad Celsius unter kontinuierlichem Schütteln sterilisiert wurde. Spülen Sie die Samen anschließend zweimal mit 80 % Ethanol und danach mit 100 % Ethanol.

Und abschließend eine Spülung mit steriler, destillierter Wasser. Bereiten Sie einen Liter Murrah-Shiga- und SCOG-modifiziertes Medium gemäß der schriftlichen Anleitung vor der Verfestigung vor. Gießen Sie 80 Milliliter Medium in jede quadratische Petrischale, sodass 30 sterile Samen pro Schale liegen.

Dann versiegeln Sie die Platten mit einem wachsartigen Film. Verkälten Sie die Platten horizontal bei vier Grad Celsius für zwei Tage, um die Keimung zu potenzieren und zu synchronisieren. Bereiten Sie Natriumdampflampen vor, indem Sie den Scheinwerfer mit einem blauen Gelatinefilm abdecken, um die rote Komponente der Lampen nach der Verkühlung zu reduzieren.

Bereiten Sie die Exposition von Petrischalen entweder gegenüber normalem oder umgekehrtem GMF vor. Exponieren Sie die Samen in einer klimakontrollierten Umgebung bei 22 Grad Celsius in vertikaler Position. Führen Sie parallele Experimente sowohl außerhalb als auch innerhalb der triaxialen Spulen durch.

Unter einem Licht-Dunkel-Rhythmus mit acht Stunden Dunkelheit und 16 Stunden Licht. Nach der Exposition Bilder der Petrischalen aufnehmen, um die Wurzellänge und die Blattflächen zu berechnen. Zunächst messen Sie die Seitenlänge der Petrischale.

Öffnen Sie dann das Bild der Petrischale in der Image-J-Software und verwenden Sie die gerade Linie, um eine Linie zu zeichnen, die genau die Seite der Schale kreuzt. Wählen Sie im Menü „Analysieren“ die Option „Maßstab festlegen“ und geben Sie die tatsächliche Distanz im Feld „bekannte Distanz“ ein. Geben Sie anschließend die Längeneinheit ein.

Klicken Sie abschließend die globale Option an, um die Einstellungen für alle Messungen der Wurzellänge verfügbar zu machen. Folgen Sie sorgfältig der Form der Wurzel, indem Sie das Freihand-Werkzeug verwenden. Messen Sie die Länge mithilfe der Messoption im Analysemenü.

Messen Sie weiterhin alle Wurzeln auf dem Bild und speichern Sie die Datei für eine weitere statistische Analyse. Für die Blattfläche wählen Sie im Bildmenü die Option „Anpassen“, gefolgt von „Farbschwelle“, selektieren Sie das einzelne Blatt und wählen dann im Analysemenü „Teilchen analysieren“. Speichern Sie die einzelnen Messwerte für die statistische Analyse. Sammeln Sie 30 Sprosse und 30 Wurzeln getrennt und frieren Sie diese sofort in flüssigem Stickstoff ein.

Anschließend in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und einem Pistill pulverisieren, bevor die Gesamt-RNA gemäß dem schriftlichen Protokoll isoliert wird. Führen Sie alle Experimente auf einem Echtzeitsystem unter Verwendung von Cyber Green mit ROX als internem Ladestandard durch und setzen Sie eine Reaktionsmischung von 25 Mikroliter ein. Verwenden Sie die im schriftlichen Protokoll aufgeführten Primer und schließen Sie Kontrollen ohne Reverse Transkriptase zur Überwachung einer genomischen DNA-Kontamination sowie Kontrollen ohne Vorlage ein. Messen Sie die Fluoreszenz nach jeder Annealing- und Verlängerungsphase.

Die beiden Lupe-Symbole stellen die gesammelten Daten dar, einschließlich der Assoziations- und Dissoziationskurven. Navigieren Sie zum Analyse- und Einrichtungsbildschirm und stellen Sie sicher, dass der Datensatz ausgewählt ist, der während des Dissoziationsabschnitts des Experiments erfasst wurde. Führen Sie für die Analyse aller Durchläufe eine Schmelzkurvenanalyse von 55 bis 95 Grad Celsius durch, indem Sie den Dissoziationsabschnitt in das thermische Profil einbeziehen.

Verwenden Sie den über die Registerkarte „Ergebnisse“ zugänglichen Dissoziationskurvenbildschirm, um das Dissoziationsprofil anzuzeigen. Analysieren Sie alle Amplifikationskurven mit der Software des Echtzeit-PCR-Geräts.

Um CT-Werte zu erhalten, kalibrieren und normalisieren Sie die relativen RNA-Spiegel mit dem Spiegel der besten Housekeeping-Gene. Rufen Sie den Bildschirm für Amplifikationskurven über den Ergebnis-Tab auf. Wählen Sie mithilfe des Analyse-, Auswahl- und Einrichtungsbildschirms den Bereich aus, für den die Daten analysiert werden sollen, entweder die Rampe oder die Plateauphase.

Wählen Sie anschließend die baselinemäßig korrigierte, normalisierte Fluoreszenz aus dem Fluoreszenzmenü im Befehlsfeld aus. Rufen Sie den Bildschirm mit den Probewerten der Platte über den Reiter „Ergebnisse“ auf, um die CT-Werte der analysierten Wells anzuzeigen.

Verwenden Sie vier verschiedene Referenzgene, um die Ergebnisse der Echtzeit-PCR zu normalisieren. Wählen Sie das am höchsten eingestufte Gen mithilfe der Analyse-Software aus und verwenden Sie das stabilste Gen für die Normalisierung. Ordnen Sie die Eingabedaten kurzfristig in einer Excel-Tabelle an, wobei die erste Spalte die Genbezeichnungen und die erste Zeile die Probennamen enthält.

Danach die Analyse-Software über die Menüleiste auswählen. Über das Dialogfeld die Eingabedaten auswählen. Anschließend die Feldprobennamen, Gen-Namen und ausschließlich die einfache Ausgabe überprüfen.

Klicken Sie auf die Schaltfläche „Los“, um die Analyse durchzuführen, und wählen Sie das am höchsten eingestufte Gen als Kandidatengen mit der stabilsten Expression aus. Nach 10 Tagen Exposition zeigen Kontrollpflanzen eine signifikant größere Wurzellänge und stärker ausgebildete Fiederblätter im Vergleich zu Pflanzen, die nach 10 Tagen Exposition umgekehrten GMF-Bedingungen ausgesetzt waren. Die Umkehrung des GMF führte zu einer drastischen Veränderung der Genexpression aller getesteten Gene, einschließlich Crucifer, Copper Transport Protein 1 und Redox-responsiver Transkriptionsfaktor 1. Die Balken zeigen den Standardfehler an; Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen Pflanzen, die umgekehrten und normalen GMF-Bedingungen ausgesetzt waren.

Die Umkehrung des GMF führte zu keiner signifikanten Veränderung der Genexpression in den Sprossen. In der Wurzelgenexpression von Pflanzen, die unter umgekehrten GMF-Bedingungen wuchsen, wurde jedoch eine drastische Herunterregulierung beobachtet. Zu diesen Genen gehörten thal, aate Peroxidase, aate Peroxidase, eine Eisen-Superoxiddismutase, ein N-A-D-P-H, respiratorische Burst-Oxidase, Protein und Katalysator drei.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie je nach erforderlichem Experiment von Minuten bis zum heutigen Tag durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man das geomagnetische Feld umkehrt oder verändert und morphologische sowie genetische Untersuchungen an exponierten Pflanzen durchführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Quellen von Magnetfeldern aus dem Bereich zu entfernen, der von den Helm-Coils umgeben ist.

Es ist wichtig, dass die Helmspulen und ihre Generatoren keine Wärme oder Vibrationen erzeugen. Der Untersucher sollte bis zur endgültigen Aufzeichnung der Daten gegenüber der Bedingung der Magnetfeldexposition verblindet bleiben. Mithilfe dieser Technik konnten Forscher auf dem Gebiet der Magnetorezeption die Wirkung von Magnetfeldern auf die Pflanzenentwicklung, das Verhalten und die Orientierung von Tieren sowie auf humane Zelllinien untersuchen.

In Zukunft hoffen wir, ähnliche Studien unter Mikrogravitationsbedingungen durchzuführen, um zu bewerten, wie sich die Veränderung des Magnetfelds unter Weltraumbedingungen auf das Pflanzenwachstum auswirkt. Die Arbeit mit Systemen, die schwache Magnetfelder erzeugen, wird nicht als gefährlich angesehen. Dennoch sollten Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen treffen und vor der Arbeit mit Geräten wie den Stromversorgungen für die Helmholtz-Spulenpaare einen fachkundigen Elektriker konsultieren.