Biolumineszenz-Bildgebung von einem immunkompetenten Tiermodell für Glioblastoma

GL261 Gliomzellen stellen ein nützliches immunkompetentes Tiermodell des Glioblastoms dar. Die Ziele dieses Protokolls sind die Demonstration geeigneter Techniken zur Überwachung des intrakraniellen Tumorwachstums unter Verwendung von in vivo Biolumineszenz-Bildgebung und die Überprüfung des Nutzens von Luciferase-modifizierten GL261-Zellen für die Untersuchung der Tumorimmunologie und immuntherapeutischer Ansätze zur Behandlung von Glioblastomen.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die geeigneten Techniken zur Überwachung des Tumorzell- und intrakraniellen Tumorwachstums unter Verwendung von in vivo Biolumineszenz-Bildgebung zu demonstrieren, um den Nutzen der Luciferase-Modifikation von GL261-Maustumorzellen zu überprüfen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Erforschung der Tumorimmunologie und des immuntherapeutischen Ansatzes zu beantworten. Zum Beispiel, ob die Stressmodifikation die Proliferation der GL261-Zellen beeinflusst und in vivo wächst.

Der Hauptvorteil dieser Technik, die Luziferase-Modifikation von GL261-Tumorzellen, erleichtert die nicht-invasive Überwachung ihres Wachstums und des Ansprechens auf die Behandlung in situ. Wenn die GL261-Luziferase-Zellkultur in einem T75-Kolben eine Konfluenz von 70 % erreicht, werden die Zellen durch Trypsinisierung entnommen. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie sie dann mit abgestufter Dichte auf eine 24-Well-Platte.

Öffnen Sie nach drei Stunden in einem Zellkultur-Inkubator die Biolumineszenz-Bildgebungssoftware und initialisieren Sie das Bildgebungssystem. Wenn die Kamera auf minus 90 Grad Celsius abgekühlt ist, stellen Sie die Bildgebungssoftware auf Lumineszierend mit einer Belichtungszeit von 10 Sekunden und einem mittleren Binning ein. Inkubieren Sie dann die Zellen in 25 Mikrolitern Luciferin pro Vertiefung für eine Minute bei Raumtemperatur und legen Sie die Platte auf die Bildgebungsstation.

Wählen Sie Erfassen aus, um das Imaging zu starten. Wenn ein Bild erfolgreich abgerufen wurde, werden ein Bildfenster und eine Werkzeugpalette angezeigt. Klicken Sie auf die Werkzeuge für Interessenbereiche und wählen Sie 6 x 4 aus dem Schlitzsymbol aus.

Decken Sie den Signalbereich mit 6 x 4 Schlitzen ab und wählen Sie das Stiftsymbol auf der Registerkarte Messungen aus. Es erscheint ein Fenster mit einer Tabelle mit den Messungen der Region of Interest in Einheiten von Photonen pro Sekunde pro Steradiant pro Quadratzentimeter. Um einen In-vitro-Proliferationsassay durchzuführen, ernten Sie die Zellkulturen wie gerade gezeigt, wenn sie eine Konfluenz von 70 % erreichen.

Und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Tumorzellen in jeweils 20 Vertiefungen einer 96-Well-Platte im Verhältnis von 1,5 mal 10 bis 3. Zellen pro 80 Mikroliter RPMI-Medium pro Vertiefung zu platzieren. Um die Verdunstung der Zellkulturen zu begrenzen, füllen Sie die umliegenden leeren Vertiefungen mit 100 Mikrolitern frischem RPMI-Medium. Um die zelluläre Proliferation zu beurteilen, fügen Sie dann 20 Mikroliter MTS-Reagenz zu jeder Zellvertiefung hinzu.

Und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach drei Stunden messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption bei 490 Nanometern. Um die Absorptionswerte zu normalisieren, dividieren Sie die Werte jedes Tages durch die entsprechenden Messwerte, die am ersten Tag erhalten wurden.

Am Tag der Implantation suspendieren Sie einmal 10 bis 5. Zellen pro Mikroliter in HBSS ohne Calcium und Magnesium aus einer 70%igen konfluenten Tumorzellkultur. Nachdem Sie den geeigneten Sedierungsgrad durch Zehenkneifen bestätigt haben, rasieren Sie die Oberseite des Kopfes jedes Versuchstieres. Reinigen Sie jeden Schädel mit einem Wattestäbchen mit 2% Chlorhexidin.

Tragen Sie dann Gleitmittel auf die Augen jeder Maus auf. Verwenden Sie nun ein steriles Skalpell, um einen etwa 1 Zentimeter langen sagittalen Schnitt über dem parietalen Hinterhauptbein des ersten Tieres zu machen. Und reinigen Sie die Oberfläche des Schädels erneut mit 3% Wasserstoffperoxid, wobei Sie das offensichtliche Bregma bemerken.

Bohren Sie dann mit einer sterilen 25-Gauge-Nadel ein 3-Millimeter-Loch in den Schädel rechts neben dem Bregma und direkt hinter der Kronennaht. Um die richtige Injektionstiefe zu gewährleisten, schneiden Sie mit einer Schere 3 Millimeter vom spitzen Ende einer 20-Mikroliter-Pipettenspitze ab und schieben Sie eine 26-Gramm-Hamilton-Spritze in die Spitze, bis 3 Millimeter der Nadel aus dem Ende der Spitze herausragen. Führen Sie die Nadel in das Loch im Schädel ein und injizieren Sie langsam 3 Mikroliter von 3 mal 10 bis zum 5. der Tumorzellen über einen Zeitraum von einer Minute.

Lassen Sie die Nadel eine weitere Minute an Ort und Stelle und ziehen Sie sie dann langsam zurück. Tauschen Sie den freiliegenden Knochen gegen 3 % Wasserstoffperoxid und 2 % Chlorhexidinlösung aus. Dann, nachdem du den Schädel mit einem frischen Wattestift-Applikator getrocknet hast, schneide ein 3 Quadratmillimeter großes Stück steriles Knochenwachs aus und befestige das Wachs an einem blanken Ende eines Wattestift-Applikators.

Bedecken Sie die Injektionsstelle mit dem Knochenwachs. Ziehe dann mit einer Pinzette jede Seite der Kopfhaut über das Wachs. Nach dem Verschließen der Wunde und der Verabreichung der entsprechenden postoperativen Analgesie ist das Verfahren für jedes Versuchstier zu wiederholen.

Um das Wachstum des intrakraniellen Tumors abzubilden, initialisieren Sie zunächst die Bildgebungsstation, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie den geeigneten Sedierungsgrad durch Schwanzkneifen bestätigt haben, richten Sie die Parameter des Bildgebungssystems wie gerade gezeigt ein. Mit Ausnahme der Auswahl von Auto für die Belichtungszeit.

Wenn das Bildgebungssystem bereit ist, setzen Sie die Mäuse auf die Bildgebungsstation und wählen Sie Erfassen, um Bilder der Luciferase-Expression zu erhalten. Wenn das Bild erfolgreich aufgenommen wurde, wählen Sie das Werkzeug "Interessenbereich" aus der Werkzeugpalette und "Auto" aus dem Kreissymbol aus. Kreisen Sie die Signalbereiche ein, um die interessierenden Regionen zu definieren, und erhalten Sie dann Messungen der Regionen als Einheiten von Photonen pro Sekunde pro Steradiant pro Quadratzentimeter.

Nehmen Sie schließlich die Mäuse aus der Bildgebungskammer und überwachen Sie die tumortragenden Tiere, bis sie vollständig genesen sind. Die In-vitro-Biolumineszenz-Bildgebung von GL261-Zellen, die mit Luciferase-haltigen Lentiviren infiziert sind, zeigen eine robuste Luciferase-Expression, die den Luciferase-Spiegeln ähnelt, die von einer U87MG-Luziferase-exprimierenden humanen Glioblastom-Zelllinie mit positiver Kontrolle exprimiert werden. Wie erwartet zeigen nicht infizierte GL261-Zellen keine Luziferase-Expression im Hintergrund.

Vor der intrakraniellen Implantation wurde kein Unterschied in den in vitro Wachstumsraten von GL261-Luciferase und GL261-Zelllinien beobachtet. Wie die serielle Biolumineszenz-Bildgebung von intrakraniellen tumorinjizierten Tieren zeigt, zeigen GL261-Luziferase-exprimierende Tumorzellen auch in vivo eine schnelle und konsistente Wachstumsrate ohne signifikanten Unterschied in den Überlebensraten zwischen den beobachteten experimentellen tumortragenden Gruppen. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um bis zu 25 Mäuse pro Stunde abzubilden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung verbessert diese Technik die Fähigkeit der Biolumineszenz-Bildgebung, das Wachstum von GL261-Tumoren in vivo zu überwachen und die Untersuchung immuntherapeutischer Reaktionen in immunkompetenten Mausmodellen zu fördern.