Biolumineszenz-Bildgebung von einem immunkompetenten Tiermodell für Glioblastoma

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die korrekten Techniken zur Überwachung von Tumorzellen und intrakraniellem Tumorwachstum mittels in-vivo-Biolumineszenzbildgebung zu demonstrieren, um die Nützlichkeit der Luciferase-Modifikation von GL261-Maus-Tumorzellen zu überprüfen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Erforschung der Tumorimmunologie und immuntherapeutischer Ansätze zu beantworten, beispielsweise, ob die Stresmodifikation die Proliferation von GL261-Zellen und deren Wachstum in vivo beeinflusst.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Luciferase-Modifikation von GL261-Tumorzellen die nichtinvasive Überwachung ihres Wachstums und ihrer Reaktion auf eine Behandlung vor Ort ermöglicht. Wenn die GL261-Luciferase-Zellkultur in einem T75-Fläschchen eine Konfluenz von 70 % erreicht hat, werden die Zellen durch Trypsinisierung geerntet. Anschließend die Zellen zählen und in eine 24-Loch-Platte mit steigenden Dichten überführen.

Nach drei Stunden im Zellkulturschrank öffnen Sie die Biolumineszenz-Bildgebungssoftware und initialisieren Sie das Bildgebungssystem. Sobald die Kamera auf minus 90 Grad Celsius abgekühlt ist, stellen Sie die Bildgebungssoftware auf Lumineszenz mit einer Belichtungszeit von 10 Sekunden und mittlerer Binning-Stufe ein. Inkubieren Sie die Zellen anschließend für eine Minute bei Raumtemperatur mit 25 µL Luciferin pro Vertiefung und stellen Sie die Platte auf die Bildgebungsstation.

Wählen Sie „Acquire“ aus, um die Bildaufnahme zu starten. Sobald ein Bild erfolgreich erfasst wurde, erscheinen ein Bildfenster und eine Werkzeugpalette. Klicken Sie auf die Werkzeuge für interessierende Bereiche (Regions of Interest Tools) und wählen Sie 6 × 4 im Schlittsymbol aus.

Bedecken Sie den Signalbereich mit 6 mal 4 Schlitzen und wählen Sie das Stift-Symbol auf der Registerkarte „Measurements“ (Messungen). Ein Fenster mit einer Tabelle der Messungen des interessierenden Bereichs in Einheiten von Photonen pro Sekunde pro Steradiant pro Quadratzentimeter wird angezeigt. Um einen In-vitro-Proliferationsassay durchzuführen, gewinnen Sie die Zellkulturen wie zuvor gezeigt, sobald sie eine Konfluenz von 70 % erreichen.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Tumorzellen in jeweils 20 Vertiefungen einer 96-Loch-Platte bei 1,5 × 10³ Zellen pro 80 µL RPMI-Medium pro Vertiefung zu platzieren. Um die Verdunstung der Zellkulturen zu begrenzen, füllen Sie die umliegenden leeren Vertiefungen mit jeweils 100 µL frischem RPMI-Medium. Fügen Sie anschließend zur Beurteilung der zellulären Proliferation 20 µL MTS-Reagenz zu jeder Zellvertiefung hinzu.

Und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Messen Sie nach drei Stunden mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption bei 490 Nanometern. Um die Absorptionswerte zu normalisieren, dividieren Sie die Werte jedes Tages durch die entsprechenden Messwerte vom ersten Tag.

Am Tag der Implantation suspendieren Sie 1 × 10⁵ Zellen pro Mikroliter in HBSS ohne Calcium und Magnesium aus einer 70 % konfluenten Tumorzellkultur. Danach rasieren Sie den Kopf jedes Versuchstieres nach Bestätigung der geeigneten Sedierungstiefe durch Zehenquetschung. Reinigen Sie jeden Schädel mit 2 % Chlorhexidin unter Verwendung eines Wattestäbchens.

Dann tragen Sie ein Schmiermittel auf die Augen jedes Mäuses auf. Verwenden Sie nun einen sterilen Skalpell, um eine etwa einen Zentimeter lange sagittale Inzision über dem parieto-okzipitalen Knochen des ersten Tieres anzulegen. Reinigen Sie die Schädeloberfläche erneut mit 3%igem Wasserstoffperoxid und beachten Sie dabei die sichtbare Bregma.

Dann mit einer sterilen 25-Gauge-Nadel ein 3-Millimeter-Loch im Schädel rechts vom Bregma und direkt hinter der Sagittalfuge bohren. Um die geeignete Injektionstiefe sicherzustellen, die Spitze eines 20-Mikroliter-Pipettenspitze mit einer Schere um 3 Millimeter kürzen und eine 26-Gauge-Hamilton-Spritze in die Spitze schieben, bis 3 Millimeter der Nadel aus dem Ende der Spitze herausragen. Die Nadel in das Loch im Schädel einführen und langsam 3 Mikroliter einer dreimal 10 hoch 5 Tumorzellen enthaltenden Lösung über einen Zeitraum von einer Minute injizieren.

Lassen Sie die Nadel noch eine Minute lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie langsam zurückziehen. Wechseln Sie den freiliegenden Knochen mit 3 % Wasserstoffperoxid und 2 % Chlorhexidin-Lösung. Danach, nach dem Trocknen des Schädels mit einem frischen Wattestäbchen, schneiden Sie ein 3 Quadratmillimeter großes Stück steriles Knochenwachs aus und befestigen Sie das Wachs an einem unbedeckten Ende eines Wattestäbchens.

Bedecken Sie die Injektionsstelle mit Knochenwachs. Ziehen Sie dann mit einer Pinzette jede Seite der Kopfhaut über das Wachs. Nach der Wundverschluss und Verabreichung der geeigneten postoperativen Analgetika wiederholen Sie den Vorgang für jedes Versuchstier.

Um das Wachstum des intrakraniellen Tumors abzubilden, initialisieren Sie zuerst die Bildgebungseinheit, wie gerade gezeigt. Danach richten Sie, nachdem Sie die angemessene Sedierungstiefe durch Zupinzen des Schwanzes bestätigt haben, die Parameter des Bildgebungssystems wie gerade gezeigt ein. Mit der Ausnahme, dass Sie „Auto“ für die Belichtungszeit wählen.

Wenn das Bildgebungssystem bereit ist, platzieren Sie die Mäuse auf der Bildgebungseinheit und wählen Sie „Acquire“, um Bilder der Luciferase-Expression zu erhalten. Sobald das Bild erfolgreich aufgenommen wurde, wählen Sie das Werkzeug für den Bereich von Interesse (Region of Interest Tool) aus der Werkzeugpalette und „Auto“ über das Kreissymbol. Umkreisen Sie die Signalbereiche, um die Regionen von Interesse zu definieren, und nehmen Sie anschließend Messungen der Regionen in Einheiten von Photonen pro Sekunde, pro Steradian und pro Quadratzentimeter vor.

Entfernen Sie abschließend die Mäuse aus der Bildgebungskammer und überwachen Sie die tumortragenden Tiere, bis sie sich vollständig erholt haben. Die in vitro-Biolumineszenzbildgebung von GL261-Zellen, die mit einem Lentivirus, das Luciferase enthält, infiziert wurden, zeigt einen starken Luciferase-Ausdruck, der den Luciferase-Spiegeln einer positiven Kontrolle, der humanen Glioblastom-Zelllinie U87MG, die Luciferase exprimiert, ähnelt. Wie erwartet weisen nicht infizierte GL261-Zellen keinen Hintergrund-Luciferase-Ausdruck auf.

Vor der intrakraniellen Implantation wird kein Unterschied in den Wachstumsraten der GL261-Luciferase- und GL261-Zelllinien im In-vitro-System beobachtet. Wie die serielle Biolumineszenz-Bildgebung von Tieren mit intrakraniell injizierten Tumoren zeigt, weisen GL261-Luciferase-exprimierende Tumorzellen auch im In-vivo-System eine schnelle und konsistente Wachstumsrate auf, wobei kein signifikanter Unterschied in den Überlebensraten zwischen den experimentellen, tumortragenden Gruppen festgestellt wird. Sobald die Technik beherrscht ist, können bis zu 25 Mäuse pro Stunde abgebildet werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung verbessert diese Technik die Fähigkeit der Biolumineszenzbildgebung, das Wachstum von GL261-Tumoren in vivo zu überwachen, und fördert so die Untersuchung immuntherapeutischer Reaktionen in immunkompetenten Mausmodellen.