Name: Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Erfahren Sie, wie endotheliale Zellen als planares Antigen-präsentierendes Zellmodell zur Untersuchung immunologischer Synapsen und T-Zell-Aktivierungsdynamiken eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung adaptiver Immunantworten.

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Wir danken Dr. Peter T. Sage für seine Hilfe bei der Erstellung einiger der repräsentativen Bilder. Diese Arbeit wurde durch einen NIH R01-Zuschuss an C.V.C. (HL104006) unterstützt.

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+function+and+migration.+Two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell function and migration. Two sides of the same coin.</a> N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
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<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+T-cell+interactions+with+antigen+presenting+cells+in+culture+and+in+intact+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue.</a> Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).</li>
<li>Brossard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+structure+of+the+T+cell+-+dendritic+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse.</a> Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+context+of+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cellular context of T cell signaling.</a> Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
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<li>Oddos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+imaging+of+intercellular+immune+synapses+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers.</a> Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).</li>
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<li>Bunnell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Seminario, M. C., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+T-cell+receptor+microclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in T-cell receptor microclusters.</a> Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).</li>
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<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+recognition+is+facilitated+by+invadosome-like+protrusions+formed+by+memory%2Feffector+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).</li>
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<li>Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+mechanics+and+molecular+organization+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Bending mechanics and molecular organization in biological membranes.</a> Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Insgesamt ist dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung Endothelzellen als i) under physiologischen APCs und ii) als eine neue Art von &quot;planare Zell APC-Modell&quot;. In Bezug auf die frühere, wurde es zunehmend klar, daß nicht-hämatopoetischen peripheren (oder &quot;Stromazellen&quot;) APCs spielen kritische, nicht redundanten Rollen (dh gegenüber hämatopoetischen APCs) bei der Gestaltung der adaptiven Immunantwort 16-18. Unter solchen &#39;semi-professionellen &quot;APCs, vaskuläre...

T-Lymphozyten sind ein Zweig des adaptiven Immunsystems gekennzeichnet durch die Fähigkeit, Peptidantigen (Ag) effizient zu erkennen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) gebundenen Moleküle durch ihre T-Zell-Rezeptoren (TCRs) 1. Naive Lymphozyten konstitutiv migrieren und scannen Berufs Ag-präsentierende Zellen &quot;(APC; zB dendritische Zellen) innerhalb von Lymphknoten, während Memory / Effektor-T-Zellen benötigen, um eine extrem breite Palette von APCs und potentiellen Zielzellen im peripheren Gewebe effektiv zu überwachen. Im min nach dem erstmaligen Ansatz des verwandten Ag auf einer APC, Lymphozyten zu verhaften ihre Migration und beginnen, eine spezialisierte intime Zell-Zell-Schnittstelle genannt &#39;immunologischen Synapse&#39; zu bilden (IS). Anhaltende (dh 30-60 min) Kontakte sind erforderlich, um zu verstärken und zu erhalten Signalisierungs 2-7. Schwellen Studien identifizieren, die innerhalb der IS, ist es die kontinuierliche und schnelle Bildung remodeling diskreter subzellulären Signalisierungsmikrocluster (dh enthaltend MHC / Ag-TCR, F-Actin, Adhäsion und Signalmolekülen), die die Stärke und Qualität der resultierenden Immunantworten 2-7 zu bestimmen. Allerdings sind dynamische Details und regulatorischen Mechanismus dieses Prozesses unvollständig verstanden 8,9. Dies ergibt sich im Wesentlichen aus technischen Herausforderungen mit unregelmäßigen Topologien von APC Oberflächen und schlecht kontrollierte Ausrichtung der Zell-Zell-Interaktion Flugzeuge, Fragen, die zutiefst begrenzen die erforderliche Raumzeit-Bildgebung assoziiert nähert 8-10 (Abbildung 1a). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein Physiologische Planar Handy APC-Modell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics. Die Abbildung zeigt, traditionellen Bildgebung von immunologischen Synapse zwischen einer T-Zelle und einer professio<html> nal APC (A) und T-Zell-und ein traditionelles planaren Lipid-Doppelschicht APC-Modell (B) im Vergleich zu diesem Roman Endothelzellen planar APC-Modell (C). Professionelle APCs bereitzustellen physiologischen immunologischen Synapsen bieten aber schlecht orientierte Zell-Zell-Schnittstelle (dh in Bezug auf die optimale xy Abbildungsebene; Auflösung ~ 0,2 &amp; mgr; m), die dramatisch beeinträchtigt räumliche (z Abbildungsebene Auflösung ~ 1 &amp; mgr; m) und zeitliche (dh aufgrund der Notwendigkeit, immer wieder zu scannen durch alle z Abbildungsebenen) Auflösung der Bildgebung. Doppelschicht-Modelle haben eine planare Topologie, die eine optimale Raumzeit-Bildauflösung bietet, werden aber auch in stark vereinfachter, nicht-physiologischen und starr. Diese Endothelzellen-Modell vereint die planare Topologie der Lipid-Doppelschichten mit dem physiologischen Substrat eines klassischen APC, um eine optimale räumliche und zeitliche Bildauflösung in einer physiologischen Umgebung zu liefern.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Frühere Arbeiten haben zum Teil diese Hindernisse durch Entwicklung planaren Substrat Modellen (dh Lipiddoppelschichten und Antikörper-beschichteten Oberflächen), welche optimale Raum-Zeit-Auflösung (dh bereitzustellen umgangen über Fixierung des T-Zell-Aktivierungsfläche in einem einzigen Plan, die parallel zu der optimalen xy Bildgebung Ebene) 11-15 (1B). Diese Modelle haben wichtige Einblicke in die subzelluläre / ​​Molekulardynamik, die Antigen-Signalisierung in T-Zellen, einschließlich der Entdeckung der dynamischen Aktin / TCR Signalisierung Mikro-Clustern 7,11-14 Kontrolle erleichtert. Allerdings sind solche Modelle von Natur aus stark vereinfacht, sowie starre (Ausschluss der Entwicklung / Untersuchung der 3-dimensionale topologische Merkmale) (1B). Daher bleibt es unsicher, wie man solche Feststellungen phy beziehensiologic Zell-Zell-Immunüberwachung. Obwohl noch under werden vaskulären und lymphatischen Endothelzellen als großen Schwellen (dh mehr in den Zahlen als alle professionellen APCs, die von ~ 1.000-fach) Peripheriefach &#39;semi-professionellen &quot;APCs 16-18. Diese Zellen exprimieren MHC-I- MHC-II- und einer Vielzahl von Co-Stimulator Moleküle (zB CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, nicht aber CD80 und CD86) und sind strategisch an der Blut-Gewebe-Grenzfläche, wo sie dienen spezialisierte Sentinel-Funktionen 16-18 positioniert. Frühere Studien zeigten, dass Endothelzellen wirksam neu zu stimulieren Effektor / Memory, aber nicht naiv, T-Zellen 19-25. Somit sind Endothelzellen wahrscheinlich einzigartig APC Rollen in Effektorphase adaptive Immunantworten in den peripheren Geweben, wie etwa lokale Einfluss auf T-Zellaktivierung, Differenzierung, Speicher und Toleranz 16,17,26 spielen. Crimatisch, wenn sie in vitro gezüchtet, Endothelzellen bilden praktisch planaren Zelloberflächen und leicht transfektierbare (beispielsweise mit fluoreszierenden Reporterproteine). Diese Eigenschaften sind ideal für hohe Raum-Zeit-auflösende Bildgebung der topologischen Dynamik während der Zell-Zell-Wechselwirkungen 19,27. So Endothelzellen als physiologische &#39;planaren Zell APC-Modell ausgesprochen geeignet für die Untersuchung der subzellulären / molekulare Umbaumechanismen, die Antigen-Erkennung zu fahren und zu regulieren Antworten (1C) 19,20 dienen könnte. Vorher festgelegten komplementären Bildgebungstechniken (einschließlich Transfektion der Endothelzellen mit fluoreszierenden Protein Trägern der Plasmamembran und Cytosol) zur Untersuchung der Details der Leukozyten-Endothel-Interaktion während der Adhäsion und transendotheliale Migration 27, zeigte, daß Leukozyten die Oberfläche des Endothels Sonde aktiv durch dynamische Insertion eind Einfahren der Submikron-Maßstab, Actin-reiche zylindrischen Vorsprünge (~ 200-1000 nm Durchmesser und Tiefe) bezeichnet invadosome artigen Vorsprüngen (dh &quot;ILPs &#39;) 27,28. Diese bildgebenden Ansätze wurden weitere mit der Erstellung von Protokollen erweitert, um die Vorteile der endothelialen APC-Funktion, um die ersten Methoden zur hohen Raum-Zeit-auflösende Bildgebung des T-Zell-endothelialen immunologischen Synapse wie berichtet 19,20 entwickeln und weiter zu beschreiben hier. Eine zentrale Erkenntnis aus diesem neuartigen planaren Zell APC-Modell abgeleitet ist, dass T-Zell-ILPs funktionieren sowohl bei der Förderung der anfänglichen Ag Nachweis und bei der Aufrechterhaltung nachfolgende Signalisierung. Tatsächlich Arrays von mehreren ILPs (die stabilisiert und als Reaktion auf aufgelaufene Calciumfluss initial wurden) zeigen die Anreicherung in TCR und Molekülen andeutend aktives Melde wie PKC-Q, ZAP-70, Phosphotyrosin und HS1. Daher ILPs scheinen eine dreidimensionale physiologischen äquivalent der TCR-Signalgebung Mikro darstellenCluster in planare Doppelschicht-Modellen gesehen. Dieser Ansatz, so zeigt sensibel / Berichte molekularen und architektonischen (und stillschweigende biomechanischen) Dynamik sonst nicht nachweisbar. Das hier beschriebene Verfahren ist nützlich, um die Lücke zwischen professionellen APC und künstliche APC-Substrat-Modelle, um unsere Fähigkeit, grundlegende Mechanismen der adaptiven Immunantwort zu verhören zu verbessern. Während hier der Schwerpunkt auf der Aktivierung von CD4 + Th1-Typ-Effektor / Speicherzelle kann dieser Ansatz leicht modifiziert werden, um eine breite Palette von T-Zell-Typen und Ags zu studieren, wie unten diskutiert.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Stretch latexfreies Tourniquet</td><td>BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BD Alkoholtupfer</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Druckknopf Blutentnahmeset</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Vor Gebrauch in RT bringen</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td>Hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Staphylokokken-Enterotoxin</td> B-Toxin-Technologie <td></td><td>BT202RED</td><td>Stammlösung 1mg/ml in PBS toxisches</td></tr><tr><td>Schocksyndrom Toxin 1</td><td>Toxin Technology</td><td>TT606RED</td><td>Stammlösung 1mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>humanes IL-15</td><td>R& D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>Stammlösung 50ug/ml in PBS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Stammlösung 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermale MV Endozellen</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>Andere humane mikrovaskuläre ECs können verwendet werden, z.B. HLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>Stammlösung 10x, verdünnt in PBS</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Nukleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>Erforderliches Kit für Schritt 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>Stammlösung 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>TNF-alpha 10ug, human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Stammlösung 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>Phenol Rotfrei HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Stammlösung 1M in H20</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>Stammlösung 1M in H20</td></tr><tr><td>Humanserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F fluoreszenzfreies Immersionsöl</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Stammlösung 1mM in DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRot-Monomer (lösliches zytoplasmatisches DsRot)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsRot-Monomer Membran (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Aktin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>Giftig, Abzug verwenden</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Falcon 15mL Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mit Falcon Gewebekulturen behandelte Kolben T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mit Falcon Gewebekulturen behandelte Kolben T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mit Corning Zellkulturen behandeltes T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Abdeckgläser aus Glas&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85&nbsp;</td><td>12 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>&nbsp; Falcon Tissue Culture Plates 24-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Delta-T Platten</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Einweg-Pasteur-Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ICAM1 Maus Anti-Human-BD</td><td>Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 Maus Anti-Human-BD</td><td>Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD11a (LFA-1alpha) Gereinigt</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD3 Alexa Fluor&reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MHC Klasse II Antikörper&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Talin 1 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKC Theta Antikörper&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>Phosphotyrosin (4G10 Platin)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>Erforderlicher Elektroporator für Schritt 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovison Software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Serie 60) Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Forma STRCYCLE 37 &deg; C, 5% CO2 Zellkultur-Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; Z359629</td><td>Bright-Line Hämozytometer</td></tr><tr><td>Isotemp Wasserbad Modell 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

ein endothelial planar zellmodell für imaging immunologischen synapse dynamics

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptiven Immunität wird von dynamischen Wechselwirkungen zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen (&quot;APCs&quot;) reguliert die so genannte &quot;immunologischen Synapsen. Innerhalb dieser intimen Zell-Zell-Schnittstellen diskreten subzellulärer Cluster von MHC / Ag-TCR, F-Actin, Adhäsion und Signalmoleküle bilden und umgestalten schnell. Diese Dynamik werden gedacht, um kritische Determinanten der sowohl die Effizienz und die Qualität der Immunantwort, die sich entwickeln und damit der Schutz gegen pathologische Immunität. Aktuelle Verständnis der immunologischen Synapsen mit physiologischer APCs wird durch die Unzulänglichkeit der erhältliche Bildauflösung beschränkt. Obwohl künstlichen Substrat-Modelle (zB planaren Lipid-Doppelschichten) bieten hervorragende Auflösung und waren äußerst wertvolle Instrumente, sie sind von Natur aus nicht-physiologischen und vereinfacht. Vaskulären und lymphatischen Endothelzellen haben sich als wichtige peripheren Gewebe (oder Stroma) Abteil &quot;semi-Beruf entstandenal APCs &quot;. Diese APCs (die meisten der molekularen Maschinerie der professionellen APCs Express) haben die einzigartige Eigenschaft von nahezu planaren Zelloberfläche bilden und sind (mit fluoreszierenden Proteins Reportern zB) leicht transfizierbar. Hier ein grundlegendes Konzept für Endothelzellen als neuartige und physiologische &#39;planaren Zell APC-Modell &quot;für eine verbesserte Bildverarbeitung und Abfrage der Grundantigenen Signalprozesse zu implementieren beschrieben.

Eine neuartige Abbildungsansatz mit Endothelzellen und Kombinieren der Auflösung Vorteile der planaren Lipiddoppelschicht-Modell mit der physiologischen Komplexität und Verformbarkeit professionelle APCs wurde (Figur 1) entwickelt. 2 stellt Beispiele von typischen Migration, Calciumflusses und topologische Dynamik bei dieser beobachtete Ansatz. In Abwesenheit der SAG auf Endothel SAG-spezifische CD4 + Th1-Lymphozyten schnell verbreiten, zu pol...

Die adaptive Immunität wird durch dynamische 'immunologische Synapsen' gesteuert, die zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen gebildet werden. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung von Endothelzellen sowohl als wenig untersuchte physiologische APCs als auch als eine neuartige Art von "planarem zellulärem APC-Modell".

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, Endothelzellen als neuartiges Modell für planare antigenpräsentierende Zellen zu nutzen, um grundlegende antigenvermittelte Signalprozesse zu untersuchen. Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen im Bereich der adaptiven Immunität zu klären, beispielsweise wie subzelluläre und molekulare Umbauprozesse räumlich und zeitlich innerhalb des immunologischen Synapses koordiniert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das Endothel eine nahezu planare antigenpräsentierende Oberfläche bildet.Dies ermöglicht die Bildgebung mit optimaler räumlicher und zeitlicher Auflösung im Kontext einer physiologisch komplexen und formbaren Zelloberfläche. Obwohl sich diese Methode auf die Aktivierung von CD4-positiven TH1-Effektor-Gedächtnis-Zellen konzentriert, kann sie ebenfalls zur Untersuchung einer Vielzahl von T-Zell-Typen, Antigenen und Signalprozessen angewendet werden. Heute werden Chris und ich Ihnen zeigen, wie man die zweite Begin-Methode durchführt, indem primäre humane Lungen- oder dermale mikrovaskuläre Endothelzellen mit membrangebundenem YFP und löslichem DS-Red über NU-Nukleofektion transfiziert und die transfizierten Zellen auf Kultivierungsplatten für die Live-Cell-Bildgebung ausplattiert.Am nächsten Tag ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch frisches Medium, das mit Interferon-gamma ergänzt ist, um die Expression von MHC-Klasse-II auf den Endothelzellen zu induzieren, gefolgt von einer Stimulation der Zellen mit 20 Nanogramm pro Milliliter TNF-alpha am dritten Tag 24 Stunden später für 30 bis 60 Minuten. Vor Beginn des Experiments inkubieren Sie das Endothel mit jeweils einem Mikrogramm pro Milliliter der bakteriellen Superantigene Staphylokokken-Enterotoxin B und Toxisches-Shock-Syndrom-Toxin-1 bei 37 Grad Celsius. Während der Inkubation zählen Sie die Anzahl vitaler Zellen aus der gewünschten Lymphozytenkultur und übertragen zwei mal 10 hoch 6 Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas.Als Nächstes die Zellen abzentrifugieren und das Pellet in zwei Milliliter frisch zubereiteter Pufferlösung A resuspendieren, sodass keine Zellklumpen mehr vorhanden sind. Anschließend zwei Mikromolar RA zwei zur T-Zellprobe hinzufügen, das Gefäß verschließen und sofort umzudrehen, um den Farbstoff gleichmäßig in der Zellsuspension zu verteilen.Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius die markierten Lymphozyten abzentrifugieren und die Zellen vorsichtig, aber gründlich in 20 bis 40 Mikroliter frischem Puffer A resuspendieren, um lebende Bilder aufzunehmen. Das Mikroskopsystem einschalten und die entsprechende Software zur Bildaufnahme öffnen. Die geeigneten Parameter für die automatisierte Mehrkanal-Zeitrafferaufnahme festlegen, sowie ein Aufnahmeintervall von 10 bis 30 Sekunden und eine Gesamtdauer von etwa 20 bis 60 Minuten. Danach frisches Öl auf das Objektiv geben.Montieren Sie eine Mikroskopierplatte, die 0,5 Milliliter Puffer A enthält, auf dem Heizstufenadapter und schalten Sie diesen unverzüglich ein, nachdem er zuvor auf 37 Grad Celsius eingestellt wurde. Nach einer Equilibrierungszeit von zwei bis drei Minuten geben Sie mithilfe einer 20-Mikroliter-Pipette die ruhenden mit RA zwei beladenen Lymphozyten in die Kammer der montierten Mikroskopierplatte und schalten die Hellfeld-Bildgebung ein. Wählen Sie den Lichtweg zu den Okularen aus und verwenden Sie den Grob-Fokus-Regler, um das Objektiv mit dem Boden der Mikroskopierplatte in Kontakt zu bringen.Verwenden Sie dann das Okular und den Feinfokussierknopf, um die T-Zellen zu lokalisieren, die sich am Boden der Petrischale abgesetzt haben, und nutzen Sie die XY-Bühnensteuerung, um ein Feld auszuwählen, das mindestens 10 Zellen enthält, sobald die geeigneten Zellen gefunden wurden. Wechseln Sie von Hellfeldbeleuchtung zur fluoreszierenden Lichtquelle und von der IP-Bildgebung zur CCD-Kamera. Optimieren Sie die Aufnahmeparameter und nehmen Sie anschließend Ruhezustandsbilder von Fira 2 3 40 und FIRA 2 3 80 auf.Ein entscheidender Schritt für die Erzielung erfolgreicher Ergebnisse ist die sorgfältige Optimierung der Fluoreszenz-Aufnahmeparameter, um sicherzustellen, dass ein ausreichendes Signal gesammelt wird, und im Fall von FIRA zwei, dass das Basislinienverhältnis 3 43 80 nahe bei eins liegt. Nachdem die Belichtungszeiten für FIRA zwei eingestellt wurden, ersetzen Sie die Schale mit T-Zellen durch eine Mikroskopschale mit endothelialen Zellen. Entfernen Sie mithilfe einer Einweg-Transferpipette schnell das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter vorgewärmtem Puffer A, anschließend ersetzen Sie die Waschung durch 0,5 Milliliter frischen Puffer A. Suchen Sie mit dem Objektiv Bereiche, in denen die stark fluoreszierenden endothelialen Zellen gesund erscheinen. Passen Sie dann die Aufnahmeparameter für Membran-YFP und DS-RED wie zuvor für FIRA zwei gezeigt an.Darauf achten, dass die mittlere fluoreszente Signalmittelintensität in jedem Kanal zwischen 25 und 75 % der dynamischen Reichweite des Detektors liegt. Vor der Durchführung des Live-Cell-Bildgebungsexperiments mehrere Bildintervalle der Endothelzellen allein aufnehmen, um mit der automatisierten Software eine Grundlinie zu etablieren. Anschließend die Spitze eines kleinen Volumens in das Medium nahe dem Zentrum des Objektivs einführen.Geben Sie langsam fünf Mikroliter konzentriertes Fira mit zwei beladenen Lymphozyten in die Mitte des bildgebenden Bereichs der Mikroskopschale. Während sich die Lymphozyten absetzen, nehmen Sie feine Fokuseinstellungen vor, um sicherzustellen, dass die Grenzflächen zwischen T-Zellen und endothelialen Zellen in der Fokusebene verbleiben. Mit den 40- und 63-fachen Objektiven ist eine Dichte von 10 bis 20 Zellen pro Feld optimal.Nach dem gewünschten Beobachtungsintervall fortfahren mit der Bildaufnahme und unverzüglich CIN direkt in die Mikroskopschale pipettieren, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolar zu erreichen, wodurch ein maximaler Kalziumfluss in der Sphera induziert wird. Zwei Signal. Bei der Applikation von Behandlungen auf die Zellen darauf achten, den scharfen Fokus auf der apikalen Membran-Oberfläche des Endothels mit YFP-Markierung beizubehalten, um eine optimale Auflösung der Umgestaltung des Immun-Synapse zu gewährleisten.Bei Abwesenheit eines Superantigens auf den endothelialen, superantigen-spezifischen CD4-positiven TH1-Lymphozyten breiten sich diese schnell aus, polarisieren und migrieren lateral über die Endothelzellen. Während dieses Vorgangs bilden die Lymphozyten kurzlebige Ausstülpungen oder ILPs in die endotheliale Oberfläche, die als Ringe der Membran-YFP-Fluoreszenz sichtbar werden – vergleichbar mit Fußabdrücken. In Gegenwart eines Superantigens sind enge Zell-Zell-Kontakte, die durch die ILPs vermittelt werden, mit der Initiierung eines Kalziumflusses assoziiert, was zur Ansammlung stabilisierter ILPs innerhalb des immunologischen Synapses führt. Solche ILP-Anordnungen sind mit anhaltender Kalziumsignalgebung gekoppelt.Die Ringe aus Membranfluoreszenz, die während der Interaktionen zwischen T-Zellen und endothelialen Zellen entstehen, entsprechen den T-Zell-Ausstülpungen, die diskrete Einbuchtungsstellen in den endothelialen Zellen hervorrufen, wie durch den Nachweis bestätigt wurde, dass diese Ringe räumlich und kinetisch mit den Zonen des verdrängten und ausgeschlossenen Zytoplasmas korrelieren. Innerhalb weniger Minuten nach der gemeinsamen Inkubation der endothelialen Zellen und T-Zellen in Gegenwart von Superantigen haften und signalisieren Moleküle, die mit der antigenspezifischen Signalgebung assoziiert sind, innerhalb der pSMAC und ILPs des immunologischen Synapses angereichert. Tatsächlich weist die immunologische Synapse zwischen T-Zelle und endothelialer Zelle eine diskrete dreidimensionale Architektur auf, die durch T-Zell-ILPs unterbrochen ist, die sich in die Oberfläche der antigenpräsentierenden Zelle hinein erstrecken, innerhalb derer die molekulare Erkennungsmaschinerie für Antigene angereichert ist.Mit diesem Ansatz können wesentliche Hindernisse in bestehenden aPC-Modellen überwunden werden, was die Beobachtung einer sonst nicht nachweisbaren dreidimensionalen subzellulären Architektur sowie die schnelle Umgestaltung physiologischer T-Zell-aPC-Oberflächen ermöglicht. Dies bietet die Möglichkeit, antigenvermittelte Signalprozesse auf einer neuen Erkenntnisebene zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Hier zeigen wir Methoden zur Verankerung Zelladhäsionsproteine ​​bekannt zu modulieren Synapsenbildung an der oberen Flugblatt der Lipid bilyer und visualisieren Synapsenbildung mit TIRF-Mikroskopie.

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bildung einer HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsen auf Glas unterstützt planare Doppelschichten durch Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie sichtbar zu machen. Das Verfahren kann auch mit Immunfluoreszenzfärbung kombiniert werden, um die Aktivierung und Umverteilung von Signalmolekülen, die während der HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsenbildung auftreten zu erkennen.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Dieses Video zeigt die Bildgebung von lebenden Zellen der immunologischen Synapsentopologie und untersucht die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und Epithelzellen, die fluoreszierende Antigene tragen. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine rote Zytoplasma-Verschiebung und gelbe Membranringe in Endothelzellen, was auf die Bildung immunologischer Synapsen hinweist.

Beurteilung der immunologischen Synapsentopologie durch Lebendzell-Bildgebung

Quelle: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Zeitraffer-Bildgebung der neuronalen Arborisierung unter Verwendung der spärlichen Adeno-assoziierten Virusmarkierung von genetisch ausgerichteten retinalen Zellpopulationen. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video demonstriert den Einsatz der konfokalen Mikroskopie zur Visualisierung der dendritischen Dynamik in lebenden Netzhautexplantaten von Mäusen. Es beschreibt die Schritte zur Stabilisierung der Netzhaut unter einem konfokalen Mikroskop, zur...

Konfokale Zeitraffer-Bildgebung der neuronalen dendritischen Dynamik in retinalen Explantaten der Maus

Wir beschreiben hier eine Kombination aus der glasgestützten Lipid-Doppelschichttechnik zur Bildung immunologischer Synapsen und der superhochauflösenden Bildgebungstechnik der STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion). Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Benutzern die notwendigen Anweisungen zur Verfügung zu stellen, um diese beiden Techniken erfolgreich durchzuführen.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

Lichtmikroskopische Techniken in Verbindung mit biochemischen Assays klären die Beteiligung der SNARE-vermittelten Exozytose an der Netrin-abhängigen Axonverzweigung auf. Diese Kombination von Techniken ermöglicht die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Axonverzweigung und die Veränderung der Zellform steuern.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Hier beschreiben wir einen kompletten Workflow für die qualitative und quantitative Analyse von immun Synapsen zwischen primären menschlichen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen. Die Methode basiert auf bildgebende Durchflusszytometrie, ermöglicht die Erfassung und Auswertung von mehreren tausend Zelle Bildern innerhalb relativ kurzer Zeit.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll zeigt sowohl die immunologische Synapsenbildung als auch den anschließenden polarisierten Sekretorischen Verkehr zur immunologischen Synapse. Zelluläre Konjugate wurden zwischen einer superantigen-gepulsten Raji-Zelle (als Antigen-präsentierende Zelle) und einem Jurkat-Klon (als Effektorhelfer T-Lymphozyten) gebildet.

Bildgebung der humanen immunologischen Synapse

Dieses Protokoll beschreibt eine chronische Cranial Window Implantationstechnik, die für die Längsbildgebung von neurogliovaskulären Strukturen, Wechselwirkungen und Funktion unter gesunden und kranken Bedingungen verwendet werden kann. Es dient als ergänzende Alternative zum transkraniellen Bildgebungsansatz, der zwar oft bevorzugt wird, aber einige kritische Einschränkungen besitzt.

Präzise Gehirnkartierung zur Durchführung von Repetitiven In-Vivo-Bildgebungen der Neuro-Immun-Dynamik bei Mäusen

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Diese Arbeit demonstriert eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Mikroglia-Motilität und des Kontakts mit postsynaptischen Puncta in der Netzhaut mittels rotierender Scheiben-Konfokalmikroskopie.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik und Wechselwirkungen mit Synapsen in erkrankter Maus-Netzhaut

Erfahren Sie, wie endotheliale Zellen als planares Antigen-präsentierendes Zellmodell zur Untersuchung immunologischer Synapsen und T-Zell-Aktivierungsdynamiken eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung adaptiver Immunantworten.

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

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