Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, Endothelzellen als neuartiges planares Antigen-präsentierendes Zellmodell zu nutzen, um grundlegende antigene Signalprozesse zu untersuchen. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen im Bereich der adaptiven Immunität zu beantworten, z. B. wie die subzelluläre und molekulare Umbaudynamik innerhalb der immunologischen Synapse räumlich und zeitlich koordiniert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Endothel eine praktisch planare PC-Oberfläche bildet.

Dies ermöglicht eine Bildgebung mit optimaler räumlicher und zeitlicher Auflösung im Kontext einer physiologisch komplexen und einer formbaren Zelloberfläche. Obwohl sich diese Methode auf die Aktivierung von CD vier positiven TH Ein-Effektor-Gedächtniszellen konzentriert, kann sie auch für die Untersuchung einer Vielzahl von T-Zelltypen, Antigen- und Signalprozessen eingesetzt werden. Heute zeigen Chris und ich, wie Sie den zweiten Begin Begin durchführen, indem Sie primäre menschliche Lungen- oder dermale mikrovaskuläre Endothelzellen mit Membran-YFP und löslichem DS-Rot über die NU-Kernaffektion durchtrennen und die transfizierten Zellen auf lebende Zell-Imaging-Kulturplatten aufplättieren.

Am nächsten Tag wird das Zellkulturmedium durch frisches Medium ersetzt, das mit Interferon-gamma ergänzt wurde, um die M MHC two-Expression auf den Endothelzellen zu induzieren, gefolgt von einer Stimulation der Zellen mit 20 Nanogramm pro Milliliter TNF alpha 24 Stunden später am dritten Tag 30 bis 60 Minuten. Vor Beginn des Experiments inkubieren Sie das Endothel mit jeweils einem Mikrogramm pro Milliliter, wobei jedes der bakteriellen Superantigene Staphylokokken-Enterotoxin B und toxisches Schocksyndrom-Toxin eins bei 37 Grad Celsius ist. Während der Inkubation wird die Anzahl der lebensfähigen Zellen aus der interessierenden Lymphozytenkultur gezählt und zweimal 10 bis zum Sechstel der Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Als nächstes schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren das Pellet in zwei Millilitern frisch zubereitetem Puffer A, so dass keine Zellcluster übrig bleiben. Geben Sie dann zwei mikromolare RA zwei in die T-Zell-Probe, verschließen Sie das Röhrchen und invertieren Sie es sofort in homogen. Verteilen Sie den Farbstoff in der Zellsuspension.

Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius schleudern Sie die markierten Lymphozyten herunter und resuspendieren Sie die Zellen in 20 bis 40 Mikrolitern frischem Puffer A sanft, aber gründlich zum Livebild, die Zellen schalten das Mikroskopsystem ein und öffnen die entsprechende Bilderfassungssoftware. Stellen Sie die entsprechenden Parameter für die automatisierte Mehrkanal-Zeitrafferbildgebung sowie das Intervall für die Aufnahme auf 10 bis 30 Sekunden und eine Gesamtdauer von ca. 20 bis 60 Minuten ein. Fügen Sie als nächstes frisches Öl zum Ziel hinzu.

Montieren Sie eine Mikroskopschüssel mit 0,5 Millilitern Puffer A auf den Heiztischadapter und schalten Sie den zuvor auf 37 Grad Celsius eingestellten Adapter sofort ein. Nach zwei bis drei Minuten Äquilibrierung verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Pipette, um die ruhenden RA und zwei geladene Lymphozyten in die montierte Mikroskopschalenkammer zu geben und die Hellfeldbildgebung einzuschalten. Wählen Sie den Strahlengang zu den Okularen und bringen Sie das Objektiv mit dem Kursfokusknopf in Kontakt mit dem Boden der Mikroskopschale.

Verwenden Sie dann das Okular und den Feinfokusknopf, um die T-Zellen am unteren Rand der Schüssel zu lokalisieren, und verwenden Sie die XY-Tischregler, um ein Feld mit mindestens 10 Zellen auszuwählen, wenn die entsprechenden Zellen lokalisiert wurden. Wechseln Sie vom Hellfeld zur Leuchtstofflichtquelle und von IP-Imaging zur CCD-Kamera. Optimieren Sie die Erfassungsparameter und erfassen Sie dann ruhende Fira 2 3 40 und FIRA 2 3 80 Bilder.

Einer der wichtigsten Schritte zur Erzielung erfolgreicher Ergebnisse ist die sorgfältige Optimierung der Fluoreszenzerfassungsparameter, um sicherzustellen, dass ein ausreichendes Signal erfasst wird und im Fall von fira two das Ausgangsverhältnis von 3 43 80 nahe bei eins liegt. Wenn die FIRA zwei Belichtungszeiten eingestellt hat, ersetzen Sie die Schale mit den T-Zellen durch eine Mikroskopschale mit Endothelzellen, entfernen Sie mit einer Einweg-Transferpipette schnell das Medium und spülen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter vorwarmem Puffer A, dann ersetzen Sie die Wäsche durch 0,5 Milliliter frischen Puffer A. Identifizieren Sie unter Verwendung des Objektivs Felder, in denen die hell fluoreszierenden Endothelzellen gesund erscheinen. Passen Sie dann die Erfassungsparameter für Membran YFP und DS RED an, wie gerade für fira two gezeigt

Dabei ist darauf zu achten, dass die mittlere Intensität des Fluoreszenzsignals in jedem Kanal zwischen 25 und 75 % des Dynamikbereichs des Detektors liegt. Bevor Sie das Experiment zur Bildgebung lebender Zellen durchführen, nehmen Sie mehrere Intervalle von Bildern allein der Endothelzellen auf, um mit der automatisierten Software eine Ausgangsbasis zu erstellen. Führen Sie dann die Spitze eines kleinen Volumens in das Medium nahe der Mitte des Objektivs ein.

Geben Sie langsam fünf Mikroliter konzentriertes Fira, zwei beladene Lymphozyten, in die Mitte des Bildgebungsfeldes der Mikroskopschüssel ab. Wenn sich die Lymphozyten absetzen, nehmen Sie feine Anpassungen am Fokus vor, um sicherzustellen, dass die Grenzflächen zwischen T-Zell-Endothelzellen in der Fokalebene bleiben. Bei den 40 und 63 x Objektiven sind 10 bis 20 Zellen pro Feld optimal.

Nach dem gewünschten Beobachtungsintervall fahren Sie mit der Bildgebung fort und pipettieren Sie CIN sofort direkt in die Mikroskopschale auf eine Endkonzentration von zwei Mikromolaren, um eine maximale Kalziumflusssphera zu induzieren. Zwei Signale. Achten Sie bei der Anwendung von Behandlungen auf Zellen darauf, den Fokus auf die mit dem apikalen Membran-YFP markierte Oberfläche des Endothels zu halten, um eine optimale Auflösung des Umbaus der Immunsynapse zu gewährleisten.

In Abwesenheit von Superantigen auf dem endothelialen Superantigen-spezifischen CD breiten sich vier positive TH-1-Lymphozyten schnell aus, polarisieren und wandern lateral über die Endothelzellen. Während dieses Prozesses verlängern die Lymphozyten kurzlebige Protrusionen oder ILPs in die Endotheloberfläche, die sich als Ringe aus Membran-YFP-Fluoreszenz analog zu Fußabdrücken in Gegenwart von Superantigenen zeigen, enge Zell-zu-Zell-Kontakte, die durch die ILPs angetrieben werden, sind mit der Initiierung eines Kalziumflusses verbunden, der zu einer Akkumulation von stabilisierten ILPs innerhalb der immunologischen Synapse führt. Solche ILP-Arrays sind an eine anhaltende Kalziumsignalgebung gekoppelt.

Die Ringe der Membranfluoreszenz, die sich während der Interaktionen von T-Zell-Endothelzellen bilden, entsprechen den T-Zell-Protrusionen, die diskrete Einstechflecken in Endothelzellen antreiben, was durch den Nachweis bestätigt wurde, dass diese Ringe räumlich und kinetisch mit den Zonen des verschobenen und ausgeschlossenen Zytoplasmas korrelieren. Innerhalb von Minuten nach der Co-Inkubation der Endothel- und T-Zellen in Gegenwart von Superantigen-Adhäsion und Signalmolekülen, die mit antigener Signalübertragung assoziiert sind, werden in den Pota-Prints und ILPs der immunologischen Synapse coen-angereichert. Tatsächlich weist die endotheliale immunologische Synapse der T-Zellen eine diskrete dreidimensionale Architektur auf, die von T-Zell-ILPs unterbrochen wird, die sich in die antigenpräsentierende Zelloberfläche erstrecken, in der die molekulare Maschinerie der Antigenerkennung angereichert ist.

Mit diesem Ansatz können wichtige Hindernisse innerhalb bestehender PC-Modelle überwunden werden, was die Beobachtung einer ansonsten nicht nachweisbaren subzellulären 3D-Architektur und die schnelle Umgestaltung physiologischer T-Zell-PC-Schnittstellen ermöglicht. Dies bietet das Potenzial für ein neues Verständnis antigener Signalprozesse.