Name: Hochdurchsatz- Danio rerio Energieumsatz-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Erfahren Sie einen hochdurchsatzfähigen Energieumsatz-Assay für Stoffwechselforschung mit Danio rerio Larven. Diese resazurinbasierte fluorometrische Methode ermöglicht die Messung von NADH2-Produktion und Screening genetischer sowie pharmakologischer Effekte.

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Die Autoren danken Dr. Roger Cone und Dr. Chao Zhang für ihre Beiträge zur Validierung der Anwendung dieses Assays, wie bereits veröffentlicht. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Hinweis: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Universität von Arizona Amt für verantwortliches Handeln in der Forschung und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss gebilligt wurde 1. Zebrafisch-Embryo Zucht und Wartung <ol><li> Bereiten E3 Embryo Medium 8. Um 60x Stammlösung machen, lösen sich 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl 2 ● 2 H 2 O und 9,78 g MgCl 2 ● 6 H 2 O in 1,95 L ddiH 2 O. Der pH-Wert auf 7,2 unter Verwendung von NaOH und HCl Lautstärke bis 2 L mit ddiH 2 O. </li><li> Um 1x E3 Embryo Medium herzustellen, verdünnte 16,5 ml 60x Lager in 1 L ddiH20. Fügen Sie 100 ul 1% Methylenblau. </li><li> Zucht <ol><li> Haus Männliche und weibliche Zuchtbestands (7-18 Monate alt) separat an Fruchtbarkeit zu maximieren. </li><li> Mach das Licht aus 1-2 Stunden vor der am Tag vor der Eier erwünscht sind. Richten Sie Paarung (1 männlich und 1-2 Weibchen) in cRossing Käfige 9, wie zuvor beschrieben. Crossing Käfigen ermöglichen die Eier Raub zu entkommen, als sie durch den perforierten Boden des Tanks Einsatz, in dem die ausgewachsene Fische gehalten werden, übergeben. </li><li> Optional:. Für zeitgesteuerte Zucht, (wie es für Studien mit Morpholino Injektion erforderlich), trennen Sie den männlichen und weiblichen Fische von einem durchsichtigen Kunststoff-Teiler, entfernen diese am Morgen, um in zeitlicher Verlegung der Eier und die Befruchtung führen. Für Morpholino Studien durchführen Leistungsberechnungen, die Zahl der embryonalen Fisch pro Behandlung erforderlich zu bewerten. Ohne eine Schätzung der Größe des Effekts oder Abwandlung kann eine vorläufige Prüfung bei der n = 8 ausgeführt. </li></ol></li><li> Gießen Sie die Eier aus der Kreuzung Käfig in eine Petrischale (100 bis 150 Embryonen / 10 cm Petrischale). Lassen Sie die Eier auf den Boden der Schale niederzulassen und abgießen. Entfernen Sie das restliche Wasser mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette. Zurück E3 Embryo Medium in Schritt 1.1 gemacht hinzufügen. </li><li> Machen aflame poliert Einwegpipette für zukünftige Ei und Fisch Übertragung. Mit einer Schere, schneiden Sie ein absolvierte Einmaltransferpipette an der 0,25 ml Graduierung. Um Ecken und Kanten, Flammpolitur der Schnitt Spitze über einem Bunsenbrenner zu entfernen. </li><li> Pflegen embryonale Fisch bis 4 Tage nach der Befruchtung (DPF) in 10 cm Petrischalen im Zebrafisch E3 Embryo Medium bei 28,5 ○ C Zweimal täglich, verwenden Sie eine Flamme poliert absolvierte Einmaltransferpipette, um alle unbefruchteten Eiern oder toten Embryonen (opak weißes Aussehen) zu entfernen. Einmal täglich, tauschen E3 Embryo Medium. Abgießen E3 Embryo Medium, entfernen Sie verbleibende Flüssigkeit mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette, und fügen Sie wieder vorgewärmten (28,5 ○ C) E3 Embryo Medium. </li></ol> 2. Bereiten Sie Testlösung <ol><li> Vorbereitung der Testlösung gemäß Tabelle 1. Sterile Filter Assay Lösung unter Verwendung eines 0,22 um-Filter. Vor Beginn testen, warm die sterile Testlösung in einer 28,5 ○ CWasserbad. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bestandteil </td><td> % Der Gesamt </td><td> Volumen (ul / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embryo Medium </td><td> 1,667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Doppel deionisiertem (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9.623,3 </td></tr><tr><td> Alamar-Blau- </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 mM NaOH </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Assay-Medium 3. Führen Assay <ol><li> Spülen Zebrafischembryonen 3 mal mit steril filtriert E3 Embryo Medium. Kombinieren Sie alle lebensfähigen Zebrafischembryonen von der Kupplung in ein Becherglas. Sterilfilter 75 ml E3 Embryo Medium. Mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette, rebewegen, wie viel von der E3 Embryo Medium aus den Zebrafischembryonen wie möglich. 20 ml steril filtriert E3 Embryo Medium Rücken. Entfernen und 3 mal ersetzen E3 Embryo Medium. </li><li> Fischplatte 1 in jede der 93 Vertiefungen einer 96-Loch schwarz Seitige durchsichtigen Bodenplatte. Übertragen Sie die embryonale Fisch auf den Teller durch individuelles Einfangen eines Embryos in eine Flamme poliert absolvierte Kunststoff-Einweg-Transferpipette (Schritt 1.5) und sanft Auswerfen in den Brunnen. Bringen E3 Embryo Medium aus dem Becherglas gespült Fisch in den 3 leeren Brunnen entnommen. Dies stellt sicher, dass leere Brunnen wurden auf die gleiche Wasser wie die Brunnen, die Fisch enthalten ausgesetzt. Beide Brunnen, die Fisch und leere Brunnen enthalten sollte mindestens ½ volle (200 ul) auf den Abschluss dieser Schritt sein. </li><li> Ersetzen E3 Embryo Medium mit Assay-Lösung in allen 96 Wells, einschließlich leere Brunnen. Dieser Schritt sollte 1 Spalte zu einer Zeit für jede der 12 Spalten in einer 96-Well-Platte durchgeführt werden. Mit einer feinen Spitze Einweg-transfer Pipette entfernen E3 Embryo Medium aus jeder auch in einer Spalte der Platte (8 Kavitäten). Achten Sie auf die Zebrafischembryo nicht berühren. Werden 300 &amp; mgr; l Assay-Lösung zu jeder Vertiefung, aus dem Wasser entfernt wurde. Wiederholen die Entfernung von E3 Embryo Mediums und Ersatz mit Assaylösung für alle 12 Spalten der Platte. </li><li> Optional: Um die metabolische Rate Änderung in Reaktion auf eine Testverbindung, stellen eine Lösung, die 100-mal (100X) die gewünschte Behandlungskonzentration ist. Zu beachten ist, sicherzustellen, dass die Lösung 100x 10% DMSO nicht überschreiten, um die endgültige DMSO-Konzentration auf nicht mehr als 0,1% zu begrenzen. Werden 3 ul des 100-fach-Lösung in jede der Behandlungs Vertiefungen. HINWEIS: Führen Sie Leistungsberechnungen, die Zahl der Behandlungs Brunnen zu bewerten. Jedoch ohne eine Schätzung der Grße der Reaktion oder einer Variation, einem Vorversuch kann in 8 Verbindung behandelten und 8 mit Vehikel behandelten Kontrollvertiefungen, die Fische enthalten ausgeführt werden. <ol><li> In 3 ul Fahrzeugkontrolle, die Kontrolle (keine drug Behandlung) Brunnen, die Fisch enthalten. Um sicherzustellen, dass das fluoreszierende Reaktion auf Verbindung ist ein Ergebnis der Maßnahmen, die im Fisch, gelten Drogen-und Fahrzeuganwendungen bis 3 leere Wells in einer Platte mit 96 Vertiefungen. </li></ol></li><li> Lesen Fischen gefüllt Platte auf Fluoreszenzplattenlesegerät mit Anregungswellenlänge bei 530 nm und die Emissionswellenlänge bei 590 nm. </li><li> Platz Platte in befeuchteten Inkubator auf 28,5 ○ C (halten Platte in der Dunkelheit über sie Assay zur Photobleichen der Testlösung zu vermeiden) eingestellt. Der Test kann für die Dauer der Zeit, die von 1 Stunde bis 24 Stunden reichen ausgeführt werden. Die Dauer des Tests hängt von der Zielsetzung der Studie. Zum Testen der Reaktion auf eine kurzwirksamen nicht stabile Verbindung eine kurze Dauer kann am besten geeignet. Doch die Maximierung Assay Dauer für eine stabile Verbindung, Tests oder Prüfungen der genetische Effekte, vorzuziehen, die Vorteile mit der Summensignal zugeordnet zu nutzen. </li><li> Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt (siehe Schritt 3.6, um festzustellen Timing)Lesen Fluoreszenz des fischreichen Platte wieder mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 3.5. </li></ol> 4. Bewerten Sie die relative Veränderung der Fluoreszenz Verbunden mit Treatment <ol><li> Änderung in der Fluoreszenz von jeder Berechnung auch durch Subtrahieren der Fluoreszenz zum Zeitpunkt 0 von der Fluoreszenz am Ende der Studie. Wells ohne Fisch (Rohlinge) sollten Werte nahe 0 haben, weit unter Werte von Brunnen, die Fisch enthalten. Veränderung der Fluoreszenz = Fluorescence am Schluss - Fluoreszenz zum Zeitpunkt 0 </li><li> Um die relative Veränderung der Fluoreszenz zu ermitteln, berechnen die durchschnittliche Veränderung der Fluoreszenz für die Kontrollvertiefungen dann teilen die Veränderung der Fluoreszenz jedes vom durchschnittlichen Veränderung der Fluoreszenz der Kontrollvertiefungen. Zu beachten ist, könnte Kontrollen entweder Fahrzeugsteuerungen oder genetische Kontrolle zu sein. <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545(2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Kontamination mit Bakterien oder Pilzen stark begrenzen Anwendung dieses Assays. Methylenblau in der E3-Embryomedium begrenzt die Möglichkeit einer Kontamination mit Pilzen. Im gesamten Embryo Aufzucht es wichtig, dass darauf geachtet wird, tote Embryonen zu entfernen zweimal täglich ist. Zusätzlich ist es wichtig, die Embryos mit sterilem E3 Embryo Medium gründlich am Tag Assayinitierungsbereich. Diese 2 Schritte begrenzen das Potenzial für bakterielle Kontamination der Embryonen. Die Einbeziehung der in Schritt 3.2 be...

Die Maus ist derzeit das vorherrschende Modell für Adipositas-Forschung. Die kurze Generationsintervall und genetischer Werkzeuge zur Verfügung, in der Maus wurden unerreicht auf dem Laufenden. Allerdings hat der Zebrafisch auch eine kurze Generationsintervall (3-4 Monate) und übertrifft sogar die Maus in eine einfache genetische Manipulation 1,2. Der Zebrafisch unterhält fast 90% der Säugetiergenen, während Sie die Maus weit über der Zahl der Nachkommen und das Potenzial für den Einsatz in genetischen und Drogen-Bildschirme 3. Um das Potenzial des Zebrafisch-Modell für Studien der Fettleibigkeit zu erschließen, müssen Tests entwickelt werden, um Faktoren, die Gewichtsregulation, einschließlich Energieverbrauch beeinflussen zu untersuchen. Als Metaboliten werden durch β-Oxidation und Tricarbonsäurezyklus Sauerstoff verarbeitet verbraucht und NADH 2 wird erzeugt. Somit NADH 2 ist ein direkter Indikator des Flusses von Metaboliten durch Stoffwechselwege (Metabolit Oxidation). In poikilotherms, H + Leck durch die innere Mitochondrienmembran, die NADH 2 -Oxidation entkoppelt von der ATP-Synthese ist 4-5-fach geringer als bei Warmblütern 4. Dementsprechend wird in Zebrafisch NADH 2 sehr fest an die ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung verknüpft. Hier beschreiben wir einen Test, der NADH 2 Produktion misst in Larven Zebrafisch als Proxy für den Energieverbrauch 5. Der Sauerstoffverbrauch ist der Goldstandard zur Messung der Energieaufwand. Doch am besten nutzen Sie die Hochdurchsatz-Potenzial des Zebrafisch-Assays des Energieverbrauchs muss zugänglich für Hochdurchsatz sein. Sauerstoffverbrauch Systeme, die auf einer geschlossenen Kammer Umlaufsystem abhängt, werden im Durchsatz durch die Anzahl von Kammern vorhanden 6 begrenzt. Open-Air-O 2 Verbrauch / CO 2 -Produktion Assays wurden ebenfalls in der Zebrafisch 5,7 angewandt. Diese Open-Air-Platte mit 96 Vertiefungen BasisD Systems zugänglich sind hohem Durchsatz. Leider Gasaustausch mit der Umgebung begrenzt Empfindlichkeit dieser Assays. Wir haben vor kurzem veröffentlicht die Anwendung eines Assays, die NADH 2 Monitore mit dem Redoxindikator alamarBlue 5. Dieser Test überwindet die Beschränkungen in Durchsatz und Empfindlichkeit gemeinsam Analysen der Sauerstoffverbrauch in der Zebrafisch. Der Zebrafisch ist ein zunehmend wichtiges Modell für die Untersuchung der ganze Körper Energie-Homöostase. Zum Teil, weil Zebrafisch zugänglich sind in den zukunfts genetischen Screens und Drogen-Bildschirme verwenden. Darüber hinaus gezielte genetische Manipulation, einschließlich Zuschlags und Knock-in, kann schnell angewendet werden. Wir haben bereits gezeigt, dass dieser Test kann mit Badewanne Medikamentenapplikation und der genetischen Zuschlags oder KO kombiniert werden, um Verbindungen und Gene, die Stoffwechselrate zu ändern 5 zu identifizieren. Außerdem ist dieser Test für die hohen Durchsatzvorteile inhärent Zebrabärbling auszunutzen. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Hergestellt von Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Einweg-Pipette mit feiner Spitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Hergestellt von Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand graduierte Einweg-Transferpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Hergestellt von Thermo Scientific</td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit schwarzem Boden und klarem Boden</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Hergestellt von E& K Scientific Products Inc.</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-<em&gt; danio rerio</em&gt; energieumsatz-assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafische sind ein wichtiger Modellorganismus mit inhärenten Vorteile, die das Potenzial Zebrafisch ein weithin angewandt Modell für die Untersuchung der Energie-Homöostase und Übergewicht zu machen. Die geringe Größe der Zebrafisch ermöglicht Tests an Embryonen in einem 96 oder 384 Well-Plattenformat durchgeführt werden, Morpholino und CRISPR basierte Technologien zu fördern einfache genetische Manipulation, und medikamentöse Behandlung von Badanwendung lebensfähig ist. Darüber hinaus sind Zebrafisch ideal für zukunfts genetischen Screens so dass für neues Gen Entdeckung. Angesichts der relativen Neuheit der Zebrafisch als Modell für Übergewicht, ist es notwendig, Werkzeuge, die diese Vorteile voll ausschöpfen zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine Methode, um den Energieverbrauch in Tausenden von embryonalen Zebrafisch gleichzeitig zu messen. Wir haben eine ganze Tiermikroplattform, in der wir Platten mit 96 Vertiefungen zu einzelnen Fische zu isolieren entwickelt und wir beurteilen kumulative NADH 2-Produktion unter Verwendung des im Handel erhältlichen Zellkulturfähigkeit reMittel alamarBlue. In poikilotherms die Beziehung zwischen NADH 2 Produktion und Energieverbrauch ist eng verknüpft. Dieser Energieverbrauch Test schafft das Potenzial, sich rasch zu screenen pharmakologische oder genetische Manipulationen, die den Energieverbrauch direkt zu ändern oder ändern Sie die Reaktion auf eine angelegte Drogen (zB Insulin-Sensitizer).

Assay-Lösung nicht-Fluoreszenz in Abwesenheit von embryonalen Fisch (1) zu erhöhen. Jedoch ist der Test sehr empfindlich auf kleine Änderungen der Stoffwechselrate im Bohrloch. Eine einzelne Fische innerhalb einer gut schafft ein Signal deutlich von leeren Brunnen innerhalb 1 Stunde (P &lt;0,0001). Abbildung 2 bietet eine visuelle Darstellung der Signale, die von embryonalen Fische nach 24 Stunden Inkubation erzeugt. Für die Zwecke dieses Bildes klar seitige Vertiefungen wurden verwende...

Zebrafische sind ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung der Energiehomöostase. Durch die Verwendung eines NADH2-empfindlichen Redoxindikators, alamar Blue, haben wir einen Assay entwickelt, der die Stoffwechselrate von Zebrafischlarven in einem 96-Well-Plattenformat misst und in der Arzneimittel- oder Genforschung eingesetzt werden kann.

Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Das übergeordnete Ziel dieses hochdurchsatzfähigen, auf Resazurin basierenden fluorometrischen Assays besteht darin, die Wirkung genetischer oder pharmakologischer Eingriffe auf die Produktion von NADH2 zu überwachen, was ein Maß für die Stoffwechselrate darstellt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Adipositasforschung zu beantworten, beispielsweise welchen Einfluss ein bestimmtes Medikament oder Gen auf die Stoffwechselrate hat. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um in einem gesamten Tiermodell potenzielle Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln oder zwischen Arzneimitteln und Genen zu screenen.Der Hauptvorteil dieses Assays im Vergleich zu Sauerstoffverbrauchs-Assays liegt in der hohen Durchsatzkapazität und der zeitlichen Signalakkumulation, wodurch der Anwender geringfügige Unterschiede in der Stoffwechselrate nachweisen kann. Diese Prozedur wird Caroline Foy, eine Doktorandin in meinem Labor, demonstrieren. Bereiten Sie nach Herstellung einer 60X-Stammlösung des E3-Mediums gemäß der Textanleitung 1X E3-Medium vor, indem Sie 16,5 Milliliter der Stammlösung mit einem Liter zweifach destilliertem Wasser verdünnen.Gegeben Sie anschließend 100 µL 1 % Methylenblau hinzu. Um eine abflammgeglühte Einwegpipette für die Ei- und Fischübertragung herzustellen, schneiden Sie eine skalierte Einweg-Übertragungspipette mit einer Schere am 0,25-mL-Strich ab. Entfernen Sie dann die rauen Kanten, indem Sie die abgeschnittene Spitze mit einem Bunsenbrenner abflammen.Nachdem die Zebrafisch-Kreuzungen eingerichtet und die Eier gesammelt wurden, lassen Sie die Eier auf den Boden der Schale absinken und gießen Sie das Wasser ab. Entfernen Sie das restliche Wasser mit einer Einweg-Transferpipette mit feiner Spitze. Anschließend geben Sie das E3-Medium wieder hinzu.Die embryonalen Fische bei 28,5 Grad Celsius bis zu vier Tagen nach der Befruchtung, oder TBN, inkubieren. Entfernen Sie zweimal täglich mithilfe einer flammenglasierten, abgestuften Einweg-Transferpipette alle unbefruchteten Eier oder toten Embryonen. Gießen Sie anschließend einmal täglich das E3-Medium ab.Entfernen Sie mit einer Pipette mit feiner Spitze das restliche Medium und ersetzen Sie es durch frisches, auf 28,5 Grad Celsius vorgewärmtes E3-Medium. Um den Energieverbrauchstest durchzuführen, bereiten Sie die Testlösung gemäß dieser Tabelle vor. Filtern und sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-Mikrometer-Filter und erwärmen Sie sie für den Test im Wasserbad auf 28,5 Grad Celsius. In einer Petrischale alle lebensfähigen Zebrafischembryonen aus der Gelegeprobe zusammengeben. Nachdem 75 Milliliter E3-Medium filtratsterilisiert wurden, mit einer Einweg-Pipette mit feiner Spitze so viel wie möglich vom E3-Medium aus der Petrischale entfernen. Danach 20 Milliliter steriles E3-Medium wieder hinzufügen. Anschließend das sterile E3-Medium noch zweimal entfernen und erneut ersetzen.Als Nächstes überführen Sie mit einer flammenglasierten, abgestuften, plastischen Einweg-Transferpipette einzelne embryonale Fische in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Arbeiten Sie dabei jeweils mit einer Plattenreihe. Entfernen Sie das E3-Medium aus den acht Vertiefungen der ersten Reihe, wobei darauf zu achten ist, dass die Embryonen nicht mit der Transferpipette berührt werden. Geben Sie anschließend 300 Mikroliter Assay-Lösung in jede Vertiefung.Wiederholen Sie dies mit allen 12 Spalten der Platte. Um eine Behandlung mit einem Wirkstoff durchzuführen, geben Sie nach der Herstellung einer 100X-Lösung der gewünschten Verbindung drei Mikroliter in jedes Behandlungs-Loch. Geben Sie anschließend drei Mikroliter des Fahrzeugkontrollmittels in die Kontroll-Löcher mit den Fischen.Um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzantwort auf die Verbindung auf Aktivität innerhalb der Fische beruht, bereiten Sie jeweils drei leere Vertiefungen pro Probe in einer 96-Loch-Platte mit Wirkstoff und Fahrzeugmedium vor. Messen Sie nun mithilfe eines Fluoreszenz-Plattenlesegeräts mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von jeweils 530 Nanometern und 590 Nanometern die Vertiefungen der Fisch-Platte. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 28,5 Grad Celsius.Je nach Assay und der Stabilität der getesteten Verbindung die Fluoreszenz zu einem vorbestimmten Zeitpunkt erneut messen. Um die relative Änderung der Fluoreszenz zu bewerten, berechnen Sie die durchschnittliche Änderung der Fluoreszenz der Kontrollgefäße. Anschließend teilen Sie die Fluoreszenzänderung jedes einzelnen Gefäßes durch die durchschnittliche Fluoreszenzänderung der Kontrollgefäße. Hier ist ein Beispiel für die Verwendung von zwei Spalten einer 96-Loch-Platte. Die Wells der Spalte A enthalten mit Fahrzeug behandelt Kontroll-Zebrafische, während die Wells der Spalte B mit Insulin behandelte Zebrafische enthalten. In Tabelle A ist die Fluoreszenz, die zum Zeitpunkt null gemessen wurde, dargestellt.Tabelle B enthält die 24 Stunden später gemessene Fluoreszenz. In Tabelle C wurde die Fluoreszenz zum Zeitpunkt null von der Fluoreszenz nach 24 Stunden subtrahiert, um die Änderung der Fluoreszenz zu bewerten. Berechnen Sie anschließend die durchschnittliche Änderung der Fluoreszenz in den Kontrollgefäßen.Tabelle D zeigt die Änderung der Fluoreszenz jedes einzelnen Wells, dividiert durch die durchschnittliche Änderung der Kontrollwells. Hier ist ersichtlich, dass eine Insulinbehandlung mit 10 µM eine 2,77-fache Zunahme des Signals hervorrief, das von Zebrafischen innerhalb von 24 Stunden erzeugt wurde, mit einem P-Wert von weniger als 0,0001. Wie hier zu sehen ist, verändert die Assaylösung weder ihre Farbe noch ihre absoluten Fluoreszenzwerte in Abwesenheit von Embryonen.Der Test ist jedoch sehr empfindlich gegenüber geringfügigen Änderungen der Stoffwechselrate innerhalb des Wells. Diese Abbildung zeigt Signale, die von embryonalen Tilapia nach einer Inkubation von 24 Stunden erzeugt wurden. Rosa markierte Wells deuten auf Fische mit einer hohen Stoffwechselrate hin.Lila gefärbte Vertiefungen enthalten Fische mit mäßigen Stoffwechselraten, und die blauen Vertiefungen repräsentieren eine niedrige Stoffwechselrate. Dies zeigt auch die Vielseitigkeit dieses Assays und seiner Anwendung über verschiedene Teleostei-Arten hinweg. Da die durch NADH2 vermittelte Reduktion von Alamar Blue nicht umkehrbar ist, sammelt sich das Signal im Laufe der Zeit an, wodurch kleine Veränderungen verstärkt werden können.Hier ist die relative Änderung der Fluoreszenz dargestellt, die durch ein bis fünf Fische nach einer, zwei und vier Stunden hervorgerufen wird. Mit jeder Erhöhung der Fischanzahl steigt die relative Fluoreszenzänderung signifikant mit der Zeit an, und je größer die Anzahl der Fische ist, desto stärker ist die Zunahme der Fluoreszenzänderung über die Zeit. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie an bis zu 5.000 embryonalen Fischen pro Tag durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Embryonen der Fische nicht zu verletzen. Nach der Durchführung dieses Assays können weitere Verfahren wie die Nile-Rot-Messung neutraler Lipide oder die Messung des phagischen Antriebs durch die Aufnahme von mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Paramecien durchgeführt werden. Dies ermöglicht uns, den Zusammenhang zwischen Stoffwechselrate und Lipidstoffwechsel bzw. zwischen Stoffwechselrate und phagischem Antrieb zu vergleichen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet des Energiestoffwechsels und der Stoffwechselerkrankungen den Weg, den Energieverbrauch bei Zebrafischen ohne Einschränkungen hinsichtlich der Durchsatzleistung zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das fluorometrische Reagenz Resazurin verwenden kann, um die Produktion von NADH2 im Zebrafisch zu messen.

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Hochdurchsatz-

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