Whole-Mount In Situ Hybridisierung

Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung ist eine leistungsstarke Technik, die es Wissenschaftlern ermöglicht, die molekulare Grundlagen der embryonalen Entwicklung zu verstehen. "Ganz-Mount" zeigt an, dass der gesamte Embryo verwendet wird, nicht nur ein Stück Gewebe. "In Situ" ist eine lateinische Phrase Bedeutung "in Position." Und zu guter Letzt "Hybridisierung" bezieht sich auf die komplementäre Bindung eines synthetisch hergestellten RNA-Moleküls zu einem mRNA-Transkript innerhalb der Zelle eines Organismus.

Dieses Video veranschaulicht das Verfahren, die erwarteten Ergebnisse und ausgewählte Anwendungen dieser Technik, die zum besseren Verständnis der Entwicklungsstörungen erlauben kann.

Genen zugrunde liegenden Organismus Morphogenese werden in zeitlich und räumlich eingeschränkten Muster im Laufe der embryonalen Entwicklung ausgedrückt.

Synthetisch hergestellte RNA-Sonden, genannt Riboprobes, werden zur ergänzenden Bindung mRNAs eingesetzt. Riboprobes sind mit speziellen Nukleotide mit "Haptens," wie Dinitrophenol, Biotin oder Digoxygenin gekennzeichnet. Haptens sind Moleküle, die eine Immunantwort bei größeren Molekülen verbunden hervorrufen können, und sind daher Ziele für die Antikörperbindung. Diese Erkennung Antikörper sind an Enzyme, wie Meerrettich Peroxidase oder alkalische Phosphatase, konjugiert, die chemische Reaktionen katalysieren, wo ein Farbstoff Fluoreszenz oder farbiger hinterlegt werden kann.

Traditionelle in Situ Hybridisierung Techniken erfordern die Vorbereitung der Gewebeschnitte eines Embryos, die Aufdeckung der internen Strukturen zu erleichtern. Infolgedessen müssen eine umfassende Beurteilung der Genexpression im gesamten Organismus aus der 5-6 μm Gewebe Scheiben mit Hilfe von Computer-Software rekonstruiert werden. Mit der Entwicklung des gesamten-Mount Techniken, kann gen Expressionsanalyse über größere Entfernungen innerhalb der gesamte Embryo bezogen werden.

Nach einem Blick auf die Prinzipien hinter vollständig-hängen in Situ Hybridisierung, lassen Sie uns die experimentelles Protokoll Schritt für Schritt.

Der erste Schritt in diesem Verfahren beinhaltet die Identifizierung der Zielsequenz in vorbildlicher Organismus untersucht werden. Die Ziel DNA-Sequenz wird dann verstärkt durch PCR unter Verwendung Zündkapseln, die RNA-Polymerase-Einleitung-Sequenzen enthalten. Die amplifizierte DNA-Vorlage ist nun in vitro mit Hapten-markierte Nukleotide transkribiert. Dieses Hapten-mit der Bezeichnung Riboprobe ist nun bereit für den Schritt der Hybridisierung.

Embryonen sind für die Hybridisierung durch Fixierung mit Formaldehyd, eine vernetzende Reagenz bereit, die Proteine stabilisiert und schützt gegen RNases. Nach der Fixierung ist das Formaldehyd durch Waschen des Embryos mehrmals mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit einer kleinen Menge an Reinigungsmittel, wie z.B. Tween entfernt. Um zellularen Lipide zu entfernen und Sonde Eindringen in das Gewebe zu erleichtern, sind Embryonen in einer abgestuften Reihe von Methanol Waschungen, dehydriert, zum Beispiel: 25 %, 50 %, 75 %, 100 % Methanol. Embryonen können in 100 % Methanol für bis zu einem Monat (oder mehr) bei-20 ° c aufbewahrt werden

Um Embryonen für die Hybridisierung vorzubereiten, müssen sie durch eine abgestufte Reihe von Methanol Waschungen mit immer weniger Methanol pro Waschgang rehydriert werden. Embryonen werden dann mit einer Protease, Diffusion von Riboprobe in den Geweben zu erleichtern verdaut. Die beschrifteten Riboprobe wird hinzugefügt, um den Embryo und die Hybridisierung durchgeführt.

Post-Hybridisierung Waschungen werden durchgeführt, um unspezifische Hybridisierungen zu entfernen. RNases A ein T1 werden hinzugefügt, um unvollständig entfernen hybridisiert Sonden durch einsträngige RNA zu verdauen. Der hybridisierten Sonden sind mit einem Antikörper-Enzym-Konjugat erkannt, die das Hapten-markierten Riboprobes bindet. Wie bereits erwähnt, Enzyme wie alkalische Phosphatase, Hapten-spezifische Antikörper konjugiert sind, und werden durch Zugabe von Enzym-Substrate eine Farbänderung zu entlocken erkannt. Das Reaktionsprodukt bildet einen dunklen lila Niederschlag markieren die Position der zum Ausdruck gebrachten mRNA, wie in diesem Beispiel zu sehen.

Nun, da Sie wissen wie man ganze- in Situ Hybridisierung Mount, schauen Sie bitte einige Anwendungen der Technik.

Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung wurde zur tödlichen Moskito übertragene Krankheiten, wie Malaria, Dengue-Fieber und West-Nil-Krankheit zu bewältigen helfen. Durch die Charakterisierung der Gene Moskito Fortpflanzung und Entwicklung beteiligt, können neue biologische oder chemische Insektizide, bessere Ziel der Krankheit-tragen Mücken gestaltet werden.

Eine weitere Anwendung dieser Technik ist die Charakterisierung der gen Ausdruck Muster Veränderungen im Zusammenhang mit der Exposition gegenüber teratogene oder Agenten, die Entwicklung des Fötus beeinträchtigen.

Hier wurde vollständig-hängen in Situ Hybridisierung verwendet in einem Zebrafisch-Modell der fetalen Alkoholsyndrom, um Gene zu identifizieren, deren Expressionsmuster nach Alkoholexposition geändert werden. Dies hilft bei der Entwicklung von Therapien zur Milderung der Folgen der Exposition in utero Alkohol.

Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung kann auch zur phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit Erbkrankheiten zu validieren. Mutationen im Zusammenhang mit dem Bardet-Bardet-Syndrom wurden in Zebrafisch-Embryonen über synthetisch hergestellten mutierten mRNAs eingeführt. Nach einer definierten Zeit waren Embryonen anhand der Schwere der Mängel in Gruppen unterteilt. Visualisierung der Expression von Genen des mutierten Gens downstream diente der phänotypischen Veränderungen zu überprüfen. So kann vollständig-hängen in Situ Hybridisierung in Kombination mit phänotypischen scoring ermöglichen ein besseres Verständnis der Rolle von spezifischen Mutationen zugrunde liegenden Entwicklungsschäden.

Sie haben genau beobachtete sie JoVE video auf ganz-Mount in Situ Hybridisierung an. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das ermöglicht die genaue zeitliche und räumliche Charakterisierung der Genexpression innerhalb eines Lebewesens. Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung wird derzeit verwendet, einen Atlas der gen Expressionsmuster während der Entwicklung in einer Vielzahl von Modellorganismen zu generieren. Diese Studien können die Entwicklung neuer Therapeutika zur Behandlung von Krankheiten, einschließlich Krebs erleichtern. Danke fürs Zuschauen!