2.6: Whole-Mount In Situ Hybridisierung

Die In-situ-Hybridisierung ist eine leistungsfähige Technik, die es Wissenschaftlern ermöglicht, die molekularen Grundlagen der Embryonalentwicklung zu verstehen. "Whole-Mount" bedeutet, dass der gesamte Embryo verwendet wird, nicht nur ein Gewebestück. "In situ" ist eine lateinische Phrase, die "in Position" bedeutet. Und schließlich bezieht sich "Hybridisierung" auf die komplementäre Bindung eines synthetisch hergestellten RNA-Moleküls an ein mRNA-Transkript innerhalb der Zelle eines Organismus.

Dieses Video zeigt das Verfahren, die erwarteten Ergebnisse und ausgewählte Anwendungen dieser Technik, die ein besseres Verständnis von Entwicklungsstörungen ermöglichen können.

Gene, die der Morphogenese von Organismen zugrunde liegen, werden im Laufe der Embryonalentwicklung in zeitlich und räumlich begrenzten Mustern exprimiert.

Synthetisch hergestellte RNA-Sonden, sogenannte Ribosonden, werden verwendet, um mRNAs durch komplementäre Bindung nachzuweisen. Ribosonden werden mit speziellen Nukleotiden markiert, die "Haptene" wie Dinitrophenol, Biotin oder Digoxygenin enthalten. Haptene sind Moleküle, die eine Immunantwort auslösen können, wenn sie an größere Moleküle gebunden sind, und daher Ziele für die Antikörperbindung sind. Diese Nachweisantikörper sind an Enzyme wie Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase konjugiert, die chemische Reaktionen katalysieren, bei denen ein fluoreszierender oder farbiger Farbstoff abgeschieden werden kann.

Traditionelle In-situ-Hybridisierungstechniken erfordern die Präparation von Gewebeschnitten eines Embryos, um die Detektion der inneren Strukturen zu erleichtern. Infolgedessen muss eine vollständige Bewertung der Genexpression im gesamten Organismus aus den 5-6 μm großen Gewebeschnitten mit Hilfe von Computersoftware rekonstruiert werden. Mit der Entwicklung von Whole-Mount-Techniken kann jedoch eine Genexpressionsanalyse über größere Entfernungen innerhalb des gesamten Embryos durchgeführt werden.

Nachdem wir uns die Prinzipien hinter der Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung angesehen haben, gehen wir das experimentelle Protokoll Schritt für Schritt durch.

Der erste Schritt dabei ist die Identifizierung der Zielsequenz im zu untersuchenden Modellorganismus. Die Ziel-DNA-Sequenz wird dann durch PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, die RNA-Polymerase-Initiationssequenzen enthalten. Das amplifizierte DNA-Template wird nun in vitro mit Hapten-markierten Nukleotiden transkribiert. Diese hapten-markierte Ribosonde ist nun bereit für den Hybridisierungsschritt.

Die Embryonen werden durch Fixierung mit Formaldehyd, einem Vernetzungsreagenz, das Proteine stabilisiert und vor RNasen schützt, für die Hybridisierung vorbereitet. Nach der Fixierung wird das Formaldehyd entfernt, indem der Embryo mehrmals mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen wird, die eine kleine Menge Reinigungsmittel enthält, z. B. Tween. Um zelluläre Lipide zu entfernen und das Eindringen der Sonde in das Gewebe zu erleichtern, werden die Embryonen in einer abgestuften Reihe von Methanolwaschungen dehydriert, zum Beispiel: 25%, 50%, 75%, 100% Methanol. Embryonen können bis zu einem Monat (oder länger) bei -20 °C in 100%igem Methanol konserviert werden.

Um Embryonen für die Hybridisierung vorzubereiten, müssen sie durch eine abgestufte Reihe von Methanolwaschungen mit zunehmend weniger Methanol pro Waschgang rehydriert werden. Die Embryonen werden dann mit einer Protease verdaut, um die Diffusion der Ribosonde in das Gewebe zu erleichtern. Die markierte Ribosonde wird dem Embryo zugesetzt und die Hybridisierung durchgeführt.

Waschungen nach der Hybridisierung werden durchgeführt, um unspezifische Hybridisierungen zu entfernen. Die RNasen A und T1 werden hinzugefügt, um unvollständig hybridisierte Sonden durch Verdau einzelsträngiger RNA zu entfernen. Die hybridisierten Sonden werden mit einem Antikörper-Enzym-Konjugat detektiert, das die Hapten-markierten Ribosonden bindet. Wie bereits erwähnt, werden Enzyme wie die alkalische Phosphatase an Hapten-spezifische Antikörper konjugiert und durch Zugabe von Enzymsubstraten nachgewiesen, um eine Farbänderung hervorzurufen. Das Reaktionsprodukt bildet einen dunkelvioletten Niederschlag, der den Ort der exprimierten mRNA markiert, wie in diesem Beispiel zu sehen ist.

Jetzt, da Sie wissen, wie man eine In-situ-Hybridisierung durchführt, schauen wir uns einige Anwendungen der Technik an.

Die In-situ-Hybridisierung wurde eingesetzt, um Wissenschaftlern bei der Bekämpfung tödlicher, durch Mücken übertragener Krankheiten wie Malaria, Dengue-Fieber und West-Nil-Krankheit zu helfen. Durch die Charakterisierung der Gene, die an der Fortpflanzung und Entwicklung von Mücken beteiligt sind, können neue biologische oder chemische Insektizide entwickelt werden, um die krankheitsübertragenden Mücken besser zu bekämpfen.

Eine weitere Anwendung dieser Technik umfasst die Charakterisierung von Veränderungen des Genexpressionsmusters, die mit der Exposition gegenüber Teratogenen oder Wirkstoffen verbunden sind, die die Entwicklung des Fötus beeinträchtigen.

Hier wurde die Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung in einem Zebrafischmodell des fetalen Alkoholsyndroms verwendet, um Gene zu identifizieren, deren Expressionsmuster nach Alkoholexposition verändert sind. Dies kann bei der Entwicklung von Therapien helfen, um die Folgen der In-utero-Alkoholexposition zu mildern.

Die Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung kann auch verwendet werden, um phänotypische Veränderungen zu validieren, die mit angeborenen Krankheiten verbunden sind. Mutationen, die mit dem Bardet-Biedl-Syndrom assoziiert sind, wurden über synthetisch hergestellte mutierte mRNAs in Zebrafischembryonen eingeschleppt. Nach einer definierten Zeit wurden die Embryonen basierend auf der Schwere der Defekte in Gruppen eingeteilt. Die Visualisierung der Expression von Genen, die dem mutierten Gen nachgeschaltet sind, wurde verwendet, um die phänotypischen Veränderungen zu validieren. Daher kann die Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung in Kombination mit phänotypischem Scoring ein besseres Verständnis der Rolle spezifischer Mutationen ermöglichen, die Entwicklungsdefekten zugrunde liegen.

Sie haben sich gerade das Video von JoVE über die In-situ-Hybridisierung von Ganzmount angesehen. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das eine präzise zeitliche und räumliche Charakterisierung der Genexpression innerhalb eines Organismus ermöglicht. Die Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung wird derzeit verwendet, um einen Atlas der Genexpressionsmuster während der Entwicklung in einer Vielzahl von Modellorganismen zu erstellen. Diese Studien können die Entwicklung neuer Therapeutika zur Behandlung menschlicher Krankheiten, einschließlich Krebs, erleichtern. Danke fürs Zuschauen!