Whole-Mount In Situ Hybridisierung

Whole-Mount <em>In Situ</em> Hybridization

JoVE Science Education
Developmental Biology

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Whole-Mount In Situ Hybridization

2.2: Gene Silencing with Morpholinos

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08:00 min

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April 30, 2023

Overview

Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung (WMISH) ist eine verbreitete Methode zur Visualisierung von des Speicherort der zum Ausdruck gebrachten RNAs in Embryonen. In diesem Prozess synthetisch hergestellte RNA-Sonden sind erste komplementär gebunden, oder “hybridisiert,” um die Transkripte der Zielgene. Immunohistochemistry oder Fluoreszenz wird dann verwendet, um diese RNA-Hybriden erkennen enthüllt räumlichen und zeitlichen Muster der Genexpression. Im Gegensatz zu traditionellen in Situ Hybridisierung Techniken, die dünne Gewebeschnitte deren Bilder rechnerisch zusammengesetzt werden müssen erfordern, ermöglicht die gesamte-Mount-Technik gen Expressionsmuster über den gesamten Embryo oder Struktur beurteilt werden.

Dieses Video führt die grundlegenden Konzepte der ganze Berg Färbung und Detail wichtige Verfahrensschritte, einschließlich Sonde Design und Produktion, Embryo Fixierung und Färbung, und Post-Hybridisierung Signalerkennung. Zuschauer werden dann lernen über wie Entwicklungs Biologen WMISH auf aktuelle wissenschaftliche Studien anwenden.

Procedure

Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung ist eine leistungsstarke Technik, die es Wissenschaftlern ermöglicht, die molekulare Grundlagen der embryonalen Entwicklung zu verstehen. “Ganz-Mount” zeigt an, dass der gesamte Embryo verwendet wird, nicht nur ein Stück Gewebe. “In Situ” ist eine lateinische Phrase Bedeutung “in Position.” Und zu guter Letzt “Hybridisierung” bezieht sich auf die komplementäre Bindung eines synthetisch hergestellten RNA-Moleküls zu einem mRNA-Transkript innerhalb der Zelle eines Organismus.

Dieses Video veranschaulicht das Verfahren, die erwarteten Ergebnisse und ausgewählte Anwendungen dieser Technik, die zum besseren Verständnis der Entwicklungsstörungen erlauben kann.

Genen zugrunde liegenden Organismus Morphogenese werden in zeitlich und räumlich eingeschränkten Muster im Laufe der embryonalen Entwicklung ausgedrückt.

Synthetisch hergestellte RNA-Sonden, genannt Riboprobes, werden zur ergänzenden Bindung mRNAs eingesetzt. Riboprobes sind mit speziellen Nukleotide mit “Haptens,” wie Dinitrophenol, Biotin oder Digoxygenin gekennzeichnet. Haptens sind Moleküle, die eine Immunantwort bei größeren Molekülen verbunden hervorrufen können, und sind daher Ziele für die Antikörperbindung. Diese Erkennung Antikörper sind an Enzyme, wie Meerrettich Peroxidase oder alkalische Phosphatase, konjugiert, die chemische Reaktionen katalysieren, wo ein Farbstoff Fluoreszenz oder farbiger hinterlegt werden kann.

Traditionelle in Situ Hybridisierung Techniken erfordern die Vorbereitung der Gewebeschnitte eines Embryos, die Aufdeckung der internen Strukturen zu erleichtern. Infolgedessen müssen eine umfassende Beurteilung der Genexpression im gesamten Organismus aus der 5-6 μm Gewebe Scheiben mit Hilfe von Computer-Software rekonstruiert werden. Mit der Entwicklung des gesamten-Mount Techniken, kann gen Expressionsanalyse über größere Entfernungen innerhalb der gesamte Embryo bezogen werden.

Nach einem Blick auf die Prinzipien hinter vollständig-hängen in Situ Hybridisierung, lassen Sie uns die experimentelles Protokoll Schritt für Schritt.

Der erste Schritt in diesem Verfahren beinhaltet die Identifizierung der Zielsequenz in vorbildlicher Organismus untersucht werden. Die Ziel DNA-Sequenz wird dann verstärkt durch PCR unter Verwendung Zündkapseln, die RNA-Polymerase-Einleitung-Sequenzen enthalten. Die amplifizierte DNA-Vorlage ist nun in vitro mit Hapten-markierte Nukleotide transkribiert. Dieses Hapten-mit der Bezeichnung Riboprobe ist nun bereit für den Schritt der Hybridisierung.

Embryonen sind für die Hybridisierung durch Fixierung mit Formaldehyd, eine vernetzende Reagenz bereit, die Proteine stabilisiert und schützt gegen RNases. Nach der Fixierung ist das Formaldehyd durch Waschen des Embryos mehrmals mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit einer kleinen Menge an Reinigungsmittel, wie z.B. Tween entfernt. Um zellularen Lipide zu entfernen und Sonde Eindringen in das Gewebe zu erleichtern, sind Embryonen in einer abgestuften Reihe von Methanol Waschungen, dehydriert, zum Beispiel: 25 %, 50 %, 75 %, 100 % Methanol. Embryonen können in 100 % Methanol für bis zu einem Monat (oder mehr) bei-20 ° c aufbewahrt werden

Um Embryonen für die Hybridisierung vorzubereiten, müssen sie durch eine abgestufte Reihe von Methanol Waschungen mit immer weniger Methanol pro Waschgang rehydriert werden. Embryonen werden dann mit einer Protease, Diffusion von Riboprobe in den Geweben zu erleichtern verdaut. Die beschrifteten Riboprobe wird hinzugefügt, um den Embryo und die Hybridisierung durchgeführt.

Post-Hybridisierung Waschungen werden durchgeführt, um unspezifische Hybridisierungen zu entfernen. RNases A ein T1 werden hinzugefügt, um unvollständig entfernen hybridisiert Sonden durch einsträngige RNA zu verdauen. Der hybridisierten Sonden sind mit einem Antikörper-Enzym-Konjugat erkannt, die das Hapten-markierten Riboprobes bindet. Wie bereits erwähnt, Enzyme wie alkalische Phosphatase, Hapten-spezifische Antikörper konjugiert sind, und werden durch Zugabe von Enzym-Substrate eine Farbänderung zu entlocken erkannt. Das Reaktionsprodukt bildet einen dunklen lila Niederschlag markieren die Position der zum Ausdruck gebrachten mRNA, wie in diesem Beispiel zu sehen.

Nun, da Sie wissen wie man ganze- in Situ Hybridisierung Mount, schauen Sie bitte einige Anwendungen der Technik.

Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung wurde zur tödlichen Moskito übertragene Krankheiten, wie Malaria, Dengue-Fieber und West-Nil-Krankheit zu bewältigen helfen. Durch die Charakterisierung der Gene Moskito Fortpflanzung und Entwicklung beteiligt, können neue biologische oder chemische Insektizide, bessere Ziel der Krankheit-tragen Mücken gestaltet werden.

Eine weitere Anwendung dieser Technik ist die Charakterisierung der gen Ausdruck Muster Veränderungen im Zusammenhang mit der Exposition gegenüber teratogene oder Agenten, die Entwicklung des Fötus beeinträchtigen.

Hier wurde vollständig-hängen in Situ Hybridisierung verwendet in einem Zebrafisch-Modell der fetalen Alkoholsyndrom, um Gene zu identifizieren, deren Expressionsmuster nach Alkoholexposition geändert werden. Dies hilft bei der Entwicklung von Therapien zur Milderung der Folgen der Exposition in utero Alkohol.

Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung kann auch zur phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit Erbkrankheiten zu validieren. Mutationen im Zusammenhang mit dem Bardet-Bardet-Syndrom wurden in Zebrafisch-Embryonen über synthetisch hergestellten mutierten mRNAs eingeführt. Nach einer definierten Zeit waren Embryonen anhand der Schwere der Mängel in Gruppen unterteilt. Visualisierung der Expression von Genen des mutierten Gens downstream diente der phänotypischen Veränderungen zu überprüfen. So kann vollständig-hängen in Situ Hybridisierung in Kombination mit phänotypischen scoring ermöglichen ein besseres Verständnis der Rolle von spezifischen Mutationen zugrunde liegenden Entwicklungsschäden.

Sie haben genau beobachtete sie JoVE video auf ganz-Mount in Situ Hybridisierung an. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das ermöglicht die genaue zeitliche und räumliche Charakterisierung der Genexpression innerhalb eines Lebewesens. Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung wird derzeit verwendet, einen Atlas der gen Expressionsmuster während der Entwicklung in einer Vielzahl von Modellorganismen zu generieren. Diese Studien können die Entwicklung neuer Therapeutika zur Behandlung von Krankheiten, einschließlich Krebs erleichtern. Danke fürs Zuschauen!

Transcript

Whole-mount in situ hybridization is a powerful technique that enables scientists to understand the molecular basis of embryonic development. “Whole-mount” indicates that the entire embryo will be used, not just a tissue slice. “In situ” is a Latin phrase meaning “in position.” And finally, “hybridization” refers to the complementary binding of a synthetically produced RNA molecule to an mRNA transcript within the cell of an organism.

This video will demonstrate the procedure, the expected results, and selected applications of this technique that can allow for better understanding of developmental disorders.

Genes underlying organism morphogenesis are expressed in temporally and spatially restricted patterns during the course of embryonic development.

Synthetically produced RNA probes, called riboprobes, are used to detect mRNAs by complementary binding. Riboprobes are labeled with special nucleotides containing “haptens,” such as dinitrophenol, biotin, or digoxygenin. Haptens are molecules that can elicit an immune response when attached to larger molecules, and are therefore targets for antibody binding. These detection antibodies are conjugated to enzymes, such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, that catalyze chemical reactions where a fluorescent or colored dye can be deposited.

Traditional in situ hybridization techniques require the preparation of tissue sections of an embryo to facilitate the detection of the internal structures. As a result, a complete assessment of gene expression throughout the organism will need to be reconstructed from the 5-6 μm tissue slices with the help of computer software. However, with the development of whole-mount techniques, gene expression analysis over larger distances within the whole embryo can be obtained.

After looking at the principles behind whole-mount in situ hybridization, let’s go through the experimental protocol step-by-step.

The first step in this procedure involves the identification of the target sequence in the model organism to be investigated. The target DNA sequence is then amplified by PCR using primers containing RNA polymerase initiation sequences. The amplified DNA template is now transcribed in vitro with hapten-labeled nucleotides. This hapten-labeled riboprobe is now ready for the hybridization step.

Embryos are prepared for hybridization via fixation with formaldehyde, a cross-linking reagent that stabilizes proteins and protects against RNases. After fixation, the formaldehyde is removed by washing the embryo several times with phosphate buffered saline containing a small amount of detergent, such as Tween. To remove cellular lipids and facilitate probe penetration into the tissues, embryos are dehydrated in a graded series of methanol washes, for example: 25%, 50%, 75%, 100% methanol. Embryos can be preserved in 100% methanol for up to one month (or more) at -20°C.

To prepare embryos for hybridization, they must be rehydrated by a graded series of methanol washes with progressively less methanol per wash. Embryos are then digested with a protease to facilitate diffusion of riboprobe into the tissues. The labeled riboprobe is added to the embryo and the hybridization is carried out.

Post-hybridization washes are performed to remove nonspecific hybridizations. RNases A an T1 are added to remove incompletely hybridized probes by digesting single-stranded RNA. The hybridized probes are detected with an antibody-enzyme conjugate that binds the hapten-labeled riboprobes. As mentioned previously, enzymes like alkaline phosphatase are conjugated to hapten-specific antibodies, and are detected by adding enzyme substrates to elicit a color change. The reaction product forms a dark purple precipitate marking the location of the expressed mRNA, as seen in this example.

Now that you know how to do whole-mount in situ hybridization, let’s look at some applications of the technique.

Whole-mount in situ hybridization has been used to help scientists tackle deadly mosquito-borne diseases, such as malaria, dengue fever, and West Nile disease. By characterizing the genes involved in mosquito reproduction and development, new biological or chemical insecticides may be designed to better target the disease-carrying mosquitos.

Another application of this technique involves the characterization of gene expression pattern changes associated with exposure to teratogens, or agents that interfere with fetal development.

Here, whole-mount in situ hybridization was used in a zebrafish model of fetal alcohol syndrome to identify genes whose expression patterns are changed after exposure to alcohol. This can help in the development of therapies to mitigate the consequences of in utero alcohol exposure.

Whole-mount in situ hybridization can also be used to validate phenotypic changes associated with congenital diseases. Mutations associated with the Bardet-Biedl syndrome were introduced into zebrafish embryos via synthetically produced mutant mRNAs. After a defined period of time, embryos were divided into groups based on the severity of defects. Visualizing the expression of genes downstream of the mutated gene was used to validate the phenotypic changes. Thus, whole-mount in situ hybridization in combination with phenotypic scoring can facilitate a better understanding of the roles of specific mutations underlying developmental defects.

You’ve just watched JoVE’s video on whole-mount in situ hybridization. This technique is a powerful tool that enables precise temporal and spatial characterization of gene expression within an organism. Whole-mount in situ hybridization is currently being used to generate an atlas of gene expression patterns during development in a multitude of model organisms. These studies may facilitate the development of new therapeutics to treat human diseases, including cancer. Thanks for watching!

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