Name: In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Messung der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase-Aktivität in Leishmania-Zellextrakten. Diese Methode erfordert keine Enzymreinigung und liefert wertvolle Einblicke in den Lipidstoffwechsel von Parasiten.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse ARRA RO3 AI078145 und 1SC3GM113743 an RZ unterstützt.

1. Zellextrakt Vorbereitung <ol><li> Wachsen die Leishmania-Zellen in einem sterilen Plastikflasche mit luftdichten Deckel verschlossen bei 26 ºC in einem Medium mit M199 1x machte mit 20 mM HEPES pH 7,4, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 5 ug / ml Häm ergänzt 0,35 g / L NaCO 2 H, 0,1 mM Adenin, und 2 &amp; mgr; g / ml biopterin ohne Schütteln. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 1.500 g für 5 min bei 4 ºC, wenn sie eine Zelldichte von 1-2 x 10 7 / ml zu erreichen. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen durch Resuspendieren des Zellpellets mit einer serologischen Pipette in die Hälfte der Kultur Volumen von kaltem phosphatgepufferter Kochsalzlösung (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4). Entsorgen Zellüberständen nach BL2 Sicherheitsrichtlinien. </li><li> Zentrifuge Zellen erneut bei 1500 g für 5 min bei 4 ºC. Überstand verwerfen mit einer Pipette. Gehen to mit dem nächsten Schritt oder Schnapp einfrieren das Zellpellet in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung bei -80 ° C (bis zu drei Monaten). </li><li> Bereiten 2x Lysepuffer (0,5 M Sucrose, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, und 2x-Protease-Inhibitor-Cocktail) und halten Sie sie bei 4 ° C auf Eis. </li><li> Zellpellet (frisch oder gefroren) in gleichen Volumen 2x Lysepuffer. Hinzufügen 1x Volumen von Glasperlen. Vortex kräftig bei 4 ° C für 10 min. </li><li> In 2 Volumen 1x Lysepuffer und mischen. Centrifuge Zellextrakte bei 1.500 × g bei 4 ° C für 10 min pelletiert ungebrochen Zellen und Kerne. </li><li> Den Überstand mit einer Pipette in ein frisches kühles Zentrifugenröhrchen und bewahren Zellextrakten auf Eis bis zum Abschluss des Experiments. </li></ol> 2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Zellextrakt unter Verwendung von Protein Estimation Kit Wie Bicinchoninsäure-Assay <ol><li> Bereiten Sie die Bicinchoninsäure (BCA) (1 ml / Röhrchen) durch Mischen des BCA und Kupfer (II) sulfate in einem Verhältnis von 49: 1 (v / v). </li><li> Vorbereitung der Proteinstandards von 0, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 ug / ml durch Verdünnen einer 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) Stammlösung in 1 ml-Aliquots der BCA-Lösung. </li><li> Add 2 ul Zellen Extrakte in 1 ml BCA-Lösung in Duplikaten. Standards und Proteinproben inkubieren für 10 Minuten in einem vorgewärmten 60 ° C Wasserbad. </li><li> Transfer Proben für 3 min Eis. Die Extinktion der Standards und der Proteinproben mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 562 nm. </li><li> Berechnung der Proteinkonzentration der Zellextrakte unter Verwendung der BSA-Standard als Referenz, wie in dem Protokoll des Herstellers beschrieben. Verdünnte Zellextrakten zu einer Proteinkonzentration von 10 mg / ml mit 1x Lysepuffer ml. </li></ol> 3. enzymatischen Assay in 200 ul pro Rohr HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer chemischen Abzugshaube. <ol><li> Testen Sie jede Probe in zweifacher Ausfertigung in einem 15 mlkonischen Rohr. Es werden 20 &amp; mgr; l 1 M Tris-HCl pH 7,5 pro Röhrchen und bewahren Sie es auf Eis. Vorbereitung wurden 2 ml Chloroform / Methanol (1: 1 (v / v); Stopp-Lösung) bei Raumtemperatur für jedes Röhrchen. </li><li> Pipettieren Sie 20 ul 1 M Tris-HCl pH 7,5, in jeder 15 ml konischen Röhrchen auf Eis. </li><li> Folgen Strahlenschutzrichtlinien von hier an. Füge das Äquivalent von 0,06 um (0,2 uCi) S - [Methyl- 3 H] Adenosyl-L-Methionin und 50 &amp; mgr; M kaltes SAM pro Röhrchen für insgesamt 50,06 uM SAM. Add x ul kaltem Wasser mit x = 200- (20 (für Puffer) + 20 (für die Zellextrakte) + Volumen von kaltem und radioaktivem SAM) pro Röhrchen. </li><li> Übertragen Sie jede konische Röhrchen in eine vorgewärmte 30 ºC Wasserbad. Hinzufügen zu jedem Röhrchen 20 ul Zellextrakte (Äquivalent von 200 ug Protein), um die Reaktion zu starten. Inkubation für die gewünschte Zeit (0-45 min). </li><li> Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 2 ml Chloroform / Methanol (1: 1; v / v; Stopplösung) in jedes Röhrchen. Übertragen Sie die konische Röhrchen auf Raumtemperatur (20-256; C). </li></ol> 4. Lipidextraktion HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer chemischen Abzugshaube. <ol><li> Fügen Sie 700 ul Wasser zu jedem Röhrchen die enzymatische Reaktion enthaltenden Probe. Vortex kräftig für 30 Sekunden. Zentrifuge bei 1500 × g für 5 min bei RT, die organische von der Wasserphase trennen. </li><li> Übertragen die untere organische Phase in ein neues 15 ml konischen Röhrchen mit einer Pipette. 1 ml Wasser in jedes &quot;Unterphase&quot; Rohr und Wirbel enthält kräftig für 30 Sekunden. Zentrifuge wieder bei 1.500 xg für 5 min, um die organische von der Wasserphase zu trennen. </li><li> Übertragen die untere organische Phase wird in einem Scintillationsröhrchen mit einer Pipette. Trockenproben unter einem Strom von N 2. Entsorgen Sie die Wasserphasen, die das nicht-radioaktive eingebaut SAM und die radioaktiven konische Röhrchen nach Strahlungs Richtlinien. </li><li> 2 ml / Röhrchen Szintillationsflüssigkeit. Messen Sie die eingebaute Radioaktivität mit einem Scintillations counter gemäß dem Protokoll des Herstellers und die Verwendung Instruments. </li><li> Berechnung der enzymatischen Aktivität in nmol / mg Protein unter Verwendung der folgenden allgemeinen Gleichung: cpm Wert x 10 3 x [Gesamt (radioaktive und kalt) Konzentration von SAM (mM)] x 5 spezifische Aktivität des radioaktiven SAM (Ci / mmol) x [Konzentration von radioaktivem SAM (mM)] HINWEIS: der obige Protokoll kann für eine SAM-Konzentration abhängige oder einem Protein abhängig PEMT Test geändert werden. SAM konzentrationsabhängigen enzymatischen Assay wird die Zeitkonstante (15 min, die in dem linearen Bereich ist) und verschiedenen Mengen von kalter SAM gehalten, während für Protein abhängigen PEMT Assay SAM-Konzentration werden dem Assay hinzugefügt (wählten wir 0,05 mM) und Zeit konstant (15 min) gehalten wird. Auch der pH-Wert des Puffers kann wie erforderlich, wenn einige PEMT Enzyme haben eine unterschiedliche optimale pH-Wert verändert werden. </li></ol>

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</ol>

Kein Interessenkonflikt erklärt

Diese einfache, schnelle PEMT Assay ermöglicht die Quantifizierung von methylierten Formen von PE, die aus der Übertragung von radioaktiver Methylgruppen von SAM auf PE mit Gesamtzellextrakt als Proteinquelle führt. Es ist schnell, empfindlich, reproduzierbar, und auch für die gereinigten Enzyme 17 geeignet. Monomethyl- oder Dimethyl-PE zu dem Assay zugegeben werden, wenn die Methyltransferase von Interesse spezifisch auf diesen Substraten anstatt PE 12,13,18,19. Wenn gereinigt PEMT Enzym verwendet...

Phosphatidylethanolamin methyltransferase (PEMT) Enzyme katalysieren die kovalente Bindung von einem oder mehreren Methylgruppen mit S -adenosylmethionine (SAM) als Methylgruppendonator auf PE, PE oder Monomethyl-dimethyl-PE zu Monomethyl-PE, Dimethyl-PE und / oder geben Phosphatidylcholin (PC). Diese Enzyme sind fast allgegenwärtig in Tierzellen und Pilze. Sie können auch in einigen Anlagen 1 und etwa 10% der Bakterien, insbesondere solche, die mit Eukaryonten 2 interagieren gefunden werden. PEMTs sind nicht nur, indem sie zur Herstellung von PC, die Hauptlipidklasse in tierischen Zellen, aber auch von der Erfüllung anderer wichtigen zellulären Funktionen, die für die Biologie der Zelle. Bei Säugetieren sind PEMTs hauptsächlich in der Leber, wo sie für normale Sekretion von Very Low Density Lipoprotein erforderlich sind, ausgedrückt, und sie auch ernährungsbedingte Fettleibigkeit 3, Atherosklerose 4 beitragen und Insulin Resistance 5. Zusätzlich werden Säugetier PEMT auch in Adipozyten exprimiert, wenn auch in den unteren Ebenen, und beteiligen sich an Fettablagerung 6, 7. PEMT Rolle bei der Krebsentwicklung 8. Apoptose 9, und das Zellwachstum 10 wurden ebenfalls demonstriert. In Bakterien haben PEMT Enzyme gezeigt, wichtig für die normale Zellwachstum 2, Virulenz 2 und Symbiose mit der Wirtspflanze 11 zu sein. Das Ziel und Grundprinzip der vorliegenden Protokolls ist es, PEMU-Aktivität aus Gesamtzellextrakten zu messen, ohne die Notwendigkeit, um das Enzym zu reinigen. Zwei unterschiedliche Protokolle wurden entwickelt, um PEMT Aktivität zu messen. Die erste und häufigste misst die Übertragung von tritiiertem Methylgruppe von radioaktivem SAM auf PE, die das Thema dieses Artikels. Dieses Protokoll wurde ursprünglich entwickelt, um PEMU-Aktivität zu messen aus Hefe 12 und Säugerzellen (Leber) 13, eine underst gewinnenVerknüpfen der PC-Biosynthese in diesen Zellen als auch die Spezifität dieser Enzyme zu bestimmen. Später wurde diese Technik auf andere Zelltypen, wie beispielsweise Bakterien 2 (unter Verwendung eines basischen pH-Wertes für den Assay, obwohl 15) und Protozoenparasiten 14 angewendet. Diese Technik kann mit Gesamtzellextrakten sowie gereinigtes Enzym verwendet werden, und können möglicherweise zu jedem Zellextrakt System angewendet werden. Ein nichtradioaktiver Assay wurde ebenfalls entworfen, das auf die enzymatische Quantifizierung von S -adenosylhomocysteine, der Trans Produkt der SAM 16 stützt. Letztere Assay kann einfacher sein, da es sich nicht um die Radioaktivität, aber es ist nur gereinigte Enzyme geeignet.

<table><tbody><tr><td>S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionin (spezifische Aktivität von 5-15 Ci/mMol)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>das Reagenz aliquotieren und bei -20 μg einfrieren; C; Befolgen Sie die Strahlenschutzrichtlinien, wenn Sie dieses Reagenz</td></tr><tr><td>verwenden Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Roche Life Sciences</td><td>11836170001</td><td>verdünnen Sie es frisch&nbsp;</td></tr><tr><td>Glasperlen, säuregewaschen, 425-600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninsäurelösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationszähler MicroBeta2 mit 1-Detektor</td><td>Perkin Elmer</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300 BSA-Stammlösung</td><td></td></tr><tr><td>(10 mg/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationsflüssigkeit&nbsp;</td><td>Research Product International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>S-(5'-Adenosyl)-L-methioninchlorid (hydrochlorid)&nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>verdünnt das Reagenz in 20 mM HCl und friert die Aliquote bei -80 &deg ein; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro-test an phosphatidylethanolamin methyltransferase-aktivität zu messen

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamin-Methyltransferasen sind biosynthetische Enzyme, die den Transfer einer oder mehrerer Methylgruppe(n) von S-Adenosyl-L-methionin auf Phosphatidylethanolamin, Monomethyl-Phosphatidylethanolamin oder Dimethyl-Phosphatidylethanolamin katalysieren, um entweder Monomethyl-Phosphatidylethanolamin, Dimethyl-Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylcholin zu erhalten. Diese Enzyme sind in tierischen Zellen und Pilzen allgegenwärtig und kommen auch in etwa 10 % der Bakterien vor. Sie erfüllen über ihre direkte Rolle im Fettstoffwechsel hinaus verschiedene wichtige Funktionen in der Zellphysiologie, wie z.B. bei Insulinresistenz, Diabetes, Arteriosklerose, Zellwachstum oder Virulenz. Das vorliegende Manuskript berichtet über einen einfachen zellfreien enzymatischen Assay, der den Transfer von tritiierten Methylgruppen(en) von S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionin auf Phosphatidylethanolamin unter Verwendung von Ganzzellextrakten als Enzymquelle misst. Die resultierenden methylierten Formen von Phosphatidylethanolamin sind hydrophob und können daher durch organische Extraktion von wasserlöslichem S-[Methyl-3-H]adenosyl-L-methionin getrennt werden. Dieser Assay kann möglicherweise auf alle anderen Zelltypen angewendet und verwendet werden, um Inhibitoren/Arzneimittel zu testen, die spezifisch für eine Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase von Interesse sind, ohne dass das Enzym gereinigt werden muss.

Figur 1 zeigt eine zeitabhängige PEMT Assay, der mit Leishmania Gesamtzellextrakt als Enzymquelle mit endogenen PE als Substrat durchgeführt wurde. Die Menge der Radioaktivität in der organischen Phase wurde durch Szintillationszählung quantifiziert. Die erhaltenen Zahlen wurden genutzt, um die Menge an tritiiertem Methylgruppen auf PE übertragen berechnen. Die PEMT Aktivität war linear für ca. 20 min. Es erreichte dann ein Plateau bei rund 30 min, wonach es bli...

Der vorliegende Bericht beschreibt einen enzymatischen In-vitro-Assay zur Messung der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Leishmania-Zellextrakten. Dieser Assay basiert auf der Übertragung einer radioaktiven Methylgruppe von S-[Methyl-3-H]adenosyl-L-methionin auf endogenes Phosphatidylethanolamin.

In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, die Aktivität der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase oder PEMT aus Gesamtzell-Extrakten zu quantifizieren. Mit dieser Methode können wir zentrale Fragen auf dem Gebiet des Lipidstoffwechsels beantworten, beispielsweise die Bedeutung der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferasen bei der Biosynthese von Phosphatidylcholin. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass die Messung direkt aus Gesamtzell-Extrakten erfolgen kann und keine Reinigung des Enzyms erforderlich ist.Daher kann dieses Protokoll Einblicke geben, wie der Parasit sein am häufigsten vorkommendes Lipid, Phosphatidylcholin, synthetisiert. Dieses Protokoll kann auch auf andere Zelltypen wie Säugetierzellen und Bakterien angewendet werden. Kultivierung von Leishmania-Zellen in einer sterilen Kunststoffflasche, verschlossen mit einem luftdichten Verschluss, bei 26 Grad Celsius in mit Zusätzen angereichertem M199-Medium ohne Schütteln.Die Zellen durch Zentrifugation bei 1500&nbsp;×&nbsp;g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius gewinnen. Sobald sie eine Zelldichte von 10 bis 20 Millionen Zellen pro Milliliter erreichen. Nach dem Entfernen des Überstandes mit einer Pipette, die Zellen durch Wiederaufschlämmen des Zellenpellets mit einer serologischen Pipette in der halben Kulturmenge kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen.Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 1550G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder schockgefrieren Sie das Zellpellet in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius.Als Nächstes das Zellpellet in einem gleichen Volumen 2X-Lysepuffer resuspendieren. Ein Volumen Glasperlen hinzufügen und 10 Minuten lang kräftig bei vier Grad Celsius verwirbeln. Zwei Volumina 1X-Lysepuffer hinzufügen und mischen.Anschließend die Zelllysate bei 1500G und vier Grad Celsius zehn Minuten lang zentrifugieren, um unlysierte Zellen und Zellkerne zu pelletieren. Das Überstand mit einer Pipette in ein frisches, kaltes Zentrifugenröhrchen überführen und die Zelllysate bis zum Ende des Experiments auf Eis lagern. Zwei Mikroliter Zelllysat zu einem Milliliter Bicinchoninsäure-Lösung geben und duplizieren.Die Standards und Proteinproben 10 Minuten lang in einem vorgewärmten Wasserbad mit 60 Grad Celsius inkubieren. Die Proben anschließend für drei Minuten auf Eis überführen. Die Extinktion der Standards und der Proteinproben mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 562 Nanometern messen.Berechnen Sie die Proteinkonzentration der Zellextrakte unter Verwendung von Rinderserumalbumin-Standard als Referenz gemäß der Herstelleranleitung. Verdünnen Sie die Zellextrakte mit 1X-Lysepuffer auf eine Proteinkonzentration von 10 Milligramm pro Milliliter. Testen Sie jede Probe und ihre Verdopplung im Abzug in einem 15-Milliliter-Kegelrohr.20&nbsp;Mikroliter einer 1-molaren TrisHCl-Lösung mit pH&nbsp;7,5 pro Reagenzglas vorbereiten und auf Eis lagern. Außerdem 2&nbsp;Milliliter Chloroform-Methanol-Stopplösung bei Raumtemperatur pro Reagenzglas vorbereiten. 20&nbsp;Mikroliter der 1-molaren TrisHCl-Lösung in jedes 15-Milliliter-Konischglas auf Eis pipettieren.Dann unter Einhaltung der Strahlenschutzrichtlinien je Probe mit der äquivalenten Menge von null Komma null sechs Mikromolar tritiiertem SAM und 50 Mikromolar kaltem SAM, insgesamt 50,06 Mikromolar SAM. Zu diesem Zeitpunkt je Probe eine Menge kaltes Wasser zugeben, die gemäß dem schriftlichen Protokoll berechnet wurde. Jede Konusprobe in ein vorgewärmtes Wasserbad von 30 Grad Celsius überführen.Fügen Sie 20 µL Zelllysate zu jedem Reaktionsgefäß hinzu, um die Reaktion zu starten. Inkubieren Sie die Proben für die gewünschte Zeit. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie zwei Milliliter Chloroform-Methanol zu jedem Gefäß hinzufügen.Die konischen Röhrchen auf Raumtemperatur bringen. Unter Arbeit in einer Abzugshaube 700 Mikroliter Wasser zu jedem Röhrchen mit der enzymatischen Reaktionsprobe hinzufügen. Anschließend 30 Sekunden gründlich vermischen, indem kräftig verwirbelt wird.Anschließend fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 1500g zentrifugieren, um die organische Phase von der wässrigen Phase zu trennen. Während des Übertragens der unteren Phase ist es entscheidend, keine Anteile der wässrigen Phase mitzuübertragen, da dies die Berechnung des Assays verfälschen würde. Überführen Sie die untere organische Phase mit einer Pipette in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen.Geben Sie ein Milliliter Wasser zu jeder Probe in der unteren Phase und wirbeln Sie kräftig 30 Sekunden lang. Zentrifugieren Sie anschließend erneut mit 1500G für fünf Minuten, um die organische Phase von der wässrigen Phase zu trennen. Überführen Sie die untere organische Phase mit einer Pipette in ein Szintillationsgefäß.Trocknen Sie die Proben unter einem Strom von Stickstoffgas. Entsorgen Sie die wässrigen Phasen, die das nicht eingebaute radioaktive SAM und die radioaktiven kegelförmigen Röhrchen enthalten, gemäß den Strahlenschutzrichtlinien. Fügen Sie anschließend zwei Milliliter Szintillationsflüssigkeit pro Röhrchen hinzu.Messen Sie die eingebaute Radioaktivität mit einem Szintillationszähler gemäß dem Herstellerprotokoll und den verwendeten Geräten. Berechnen Sie die enzymatische Aktivität in Nanomol pro Milligramm Protein unter Verwendung der im Textprotokoll angegebenen Gleichung. Dargestellt ist hier ein zeitabhängiger PEMT-Assay, der mit einem Gesamtzellextrakt von Leishmania als Enzymquelle unter Verwendung von endogenem PE als Substrat durchgeführt wurde.Die Menge an Radioaktivität in der organischen Phase wurde durch Szintillationszählung quantifiziert und zur Berechnung der Menge an auf PE übertragenen tritierten Methylgruppen verwendet. Die PEMT-Aktivität war etwa 20 Minuten lang linear. Danach erreichte sie nach ungefähr 30 Minuten ein Plateau, auf dem sie weitere 15 Minuten konstant blieb. Wie erwartet wurde keine PEMT-Aktivität nachgewiesen, wenn keine Zellextrakte zugegeben wurden, während Aktivität detektiert wurde, wenn Zellextrakte dem Assay hinzugefügt wurden.Außerdem wurde diese Aktivität in Gegenwart von 100 Mikromolar Octadecyltrimethylammoniumbromid abgeschwächt, einem spezifischen Inhibitor der Leishmania major-Phosphatidylethanolamin-Methyltransferasen LMJ PEM One und LMJ PEM two. Die PEMT-Aktivität war ebenfalls abhängig von der Proteinkonzentration, wobei ein linearer Zusammenhang zwischen der Aktivität und der Menge an Protein, die im enzymatischen Assay verwendet wurde, bestand. Schließlich wurde ein SAM-konzentrationsabhängiger PEMT-Assay durchgeführt, bei dem steigende Konzentrationen von SAM getestet wurden.Die PEMT-Aktivität erreichte eine Platteau-Phase bei einer SAM-Konzentration von etwa 0,5 mM. Ein erfahrener Anwender kann dieses Protokoll in drei bis fünf Stunden durchführen, abhängig von der Anzahl der Proben. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es sehr wichtig, kürzlich gekauftes SAM zu verwenden, da diese Verbindung instabil ist.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheitserregern und Radioaktivität äußerst gefährlich sein kann. Daher ist es wichtig, die Sicherheitsrichtlinien zu befolgen und die richtige Laborausrüstung zu tragen.

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Biologie

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Wir beschreiben ein grundlegendes Protokoll zur Quantifizierung der in vitro ATPase-Aktivität. Dieses Protokoll kann basierend auf dem Aktivitätsgrad und den Anforderungen an eine bestimmte gereinigte ATPase optimiert werden.

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Es ist eine Forderung, prä-klinischen Tests für eine neuartige Klasse von "Orphan" Medikamenten, den sogenannten pharmakologischer Chaperonen reproduzierbar, schnell und effizient zu machen. Wir entwickelten einen einfache, hoch standardisiert und vielseitige Zelle kulturbasierte Assay zum Bildschirm für geeignete Patienten sowie neuartige pharmakologische Chaperon Medikamente.

In-vitro- Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe

Hier beschreiben wir eine Methode zur Reinigung von Histidin-markierten Pyrophosphokinase Enzyme und Dünnschichtchromatographie radioaktiv Substrate und Produkte, für die enzymatische Aktivität in Vitroassay nutzen. Die Enzym-Aktivität-Assay ist breit anwendbar auf Kinase, Nukleotid-Cyclase oder Phosphor-Transfer-Reaktion, deren Mechanismus Nukleotid Triphosphat Hydrolyse umfasst.

Eine Reinigung und In vitro- Aktivität Assay für ein (p) PpGpp Synthestase von Clostridium difficile

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Lernen Sie die In-vitro-Messung der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase-Aktivität in Leishmania-Zellextrakten. Diese Methode erfordert keine Enzymreinigung und liefert wertvolle Einblicke in den Lipidstoffwechsel von Parasiten.

In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen

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