Name: In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Messung der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase-Aktivität in Leishmania-Zellextrakten. Diese Methode erfordert keine Enzymreinigung und liefert wertvolle Einblicke in den Lipidstoffwechsel von Parasiten.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse ARRA RO3 AI078145 und 1SC3GM113743 an RZ unterstützt.

1. Zellextrakt Vorbereitung <ol><li> Wachsen die Leishmania-Zellen in einem sterilen Plastikflasche mit luftdichten Deckel verschlossen bei 26 ºC in einem Medium mit M199 1x machte mit 20 mM HEPES pH 7,4, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 5 ug / ml Häm ergänzt 0,35 g / L NaCO 2 H, 0,1 mM Adenin, und 2 &amp; mgr; g / ml biopterin ohne Schütteln. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 1.500 g für 5 min bei 4 ºC, wenn sie eine Zelldichte von 1-2 x 10 7 / ml zu erreichen. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen durch Resuspendieren des Zellpellets mit einer serologischen Pipette in die Hälfte der Kultur Volumen von kaltem phosphatgepufferter Kochsalzlösung (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4). Entsorgen Zellüberständen nach BL2 Sicherheitsrichtlinien. </li><li> Zentrifuge Zellen erneut bei 1500 g für 5 min bei 4 ºC. Überstand verwerfen mit einer Pipette. Gehen to mit dem nächsten Schritt oder Schnapp einfrieren das Zellpellet in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung bei -80 ° C (bis zu drei Monaten). </li><li> Bereiten 2x Lysepuffer (0,5 M Sucrose, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, und 2x-Protease-Inhibitor-Cocktail) und halten Sie sie bei 4 ° C auf Eis. </li><li> Zellpellet (frisch oder gefroren) in gleichen Volumen 2x Lysepuffer. Hinzufügen 1x Volumen von Glasperlen. Vortex kräftig bei 4 ° C für 10 min. </li><li> In 2 Volumen 1x Lysepuffer und mischen. Centrifuge Zellextrakte bei 1.500 × g bei 4 ° C für 10 min pelletiert ungebrochen Zellen und Kerne. </li><li> Den Überstand mit einer Pipette in ein frisches kühles Zentrifugenröhrchen und bewahren Zellextrakten auf Eis bis zum Abschluss des Experiments. </li></ol> 2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Zellextrakt unter Verwendung von Protein Estimation Kit Wie Bicinchoninsäure-Assay <ol><li> Bereiten Sie die Bicinchoninsäure (BCA) (1 ml / Röhrchen) durch Mischen des BCA und Kupfer (II) sulfate in einem Verhältnis von 49: 1 (v / v). </li><li> Vorbereitung der Proteinstandards von 0, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 ug / ml durch Verdünnen einer 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) Stammlösung in 1 ml-Aliquots der BCA-Lösung. </li><li> Add 2 ul Zellen Extrakte in 1 ml BCA-Lösung in Duplikaten. Standards und Proteinproben inkubieren für 10 Minuten in einem vorgewärmten 60 ° C Wasserbad. </li><li> Transfer Proben für 3 min Eis. Die Extinktion der Standards und der Proteinproben mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 562 nm. </li><li> Berechnung der Proteinkonzentration der Zellextrakte unter Verwendung der BSA-Standard als Referenz, wie in dem Protokoll des Herstellers beschrieben. Verdünnte Zellextrakten zu einer Proteinkonzentration von 10 mg / ml mit 1x Lysepuffer ml. </li></ol> 3. enzymatischen Assay in 200 ul pro Rohr HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer chemischen Abzugshaube. <ol><li> Testen Sie jede Probe in zweifacher Ausfertigung in einem 15 mlkonischen Rohr. Es werden 20 &amp; mgr; l 1 M Tris-HCl pH 7,5 pro Röhrchen und bewahren Sie es auf Eis. Vorbereitung wurden 2 ml Chloroform / Methanol (1: 1 (v / v); Stopp-Lösung) bei Raumtemperatur für jedes Röhrchen. </li><li> Pipettieren Sie 20 ul 1 M Tris-HCl pH 7,5, in jeder 15 ml konischen Röhrchen auf Eis. </li><li> Folgen Strahlenschutzrichtlinien von hier an. Füge das Äquivalent von 0,06 um (0,2 uCi) S - [Methyl- 3 H] Adenosyl-L-Methionin und 50 &amp; mgr; M kaltes SAM pro Röhrchen für insgesamt 50,06 uM SAM. Add x ul kaltem Wasser mit x = 200- (20 (für Puffer) + 20 (für die Zellextrakte) + Volumen von kaltem und radioaktivem SAM) pro Röhrchen. </li><li> Übertragen Sie jede konische Röhrchen in eine vorgewärmte 30 ºC Wasserbad. Hinzufügen zu jedem Röhrchen 20 ul Zellextrakte (Äquivalent von 200 ug Protein), um die Reaktion zu starten. Inkubation für die gewünschte Zeit (0-45 min). </li><li> Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 2 ml Chloroform / Methanol (1: 1; v / v; Stopplösung) in jedes Röhrchen. Übertragen Sie die konische Röhrchen auf Raumtemperatur (20-256; C). </li></ol> 4. Lipidextraktion HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer chemischen Abzugshaube. <ol><li> Fügen Sie 700 ul Wasser zu jedem Röhrchen die enzymatische Reaktion enthaltenden Probe. Vortex kräftig für 30 Sekunden. Zentrifuge bei 1500 × g für 5 min bei RT, die organische von der Wasserphase trennen. </li><li> Übertragen die untere organische Phase in ein neues 15 ml konischen Röhrchen mit einer Pipette. 1 ml Wasser in jedes &quot;Unterphase&quot; Rohr und Wirbel enthält kräftig für 30 Sekunden. Zentrifuge wieder bei 1.500 xg für 5 min, um die organische von der Wasserphase zu trennen. </li><li> Übertragen die untere organische Phase wird in einem Scintillationsröhrchen mit einer Pipette. Trockenproben unter einem Strom von N 2. Entsorgen Sie die Wasserphasen, die das nicht-radioaktive eingebaut SAM und die radioaktiven konische Röhrchen nach Strahlungs Richtlinien. </li><li> 2 ml / Röhrchen Szintillationsflüssigkeit. Messen Sie die eingebaute Radioaktivität mit einem Scintillations counter gemäß dem Protokoll des Herstellers und die Verwendung Instruments. </li><li> Berechnung der enzymatischen Aktivität in nmol / mg Protein unter Verwendung der folgenden allgemeinen Gleichung: cpm Wert x 10 3 x [Gesamt (radioaktive und kalt) Konzentration von SAM (mM)] x 5 spezifische Aktivität des radioaktiven SAM (Ci / mmol) x [Konzentration von radioaktivem SAM (mM)] HINWEIS: der obige Protokoll kann für eine SAM-Konzentration abhängige oder einem Protein abhängig PEMT Test geändert werden. SAM konzentrationsabhängigen enzymatischen Assay wird die Zeitkonstante (15 min, die in dem linearen Bereich ist) und verschiedenen Mengen von kalter SAM gehalten, während für Protein abhängigen PEMT Assay SAM-Konzentration werden dem Assay hinzugefügt (wählten wir 0,05 mM) und Zeit konstant (15 min) gehalten wird. Auch der pH-Wert des Puffers kann wie erforderlich, wenn einige PEMT Enzyme haben eine unterschiedliche optimale pH-Wert verändert werden. </li></ol>

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</ol>

Kein Interessenkonflikt erklärt

Diese einfache, schnelle PEMT Assay ermöglicht die Quantifizierung von methylierten Formen von PE, die aus der Übertragung von radioaktiver Methylgruppen von SAM auf PE mit Gesamtzellextrakt als Proteinquelle führt. Es ist schnell, empfindlich, reproduzierbar, und auch für die gereinigten Enzyme 17 geeignet. Monomethyl- oder Dimethyl-PE zu dem Assay zugegeben werden, wenn die Methyltransferase von Interesse spezifisch auf diesen Substraten anstatt PE 12,13,18,19. Wenn gereinigt PEMT Enzym verwendet...

Phosphatidylethanolamin methyltransferase (PEMT) Enzyme katalysieren die kovalente Bindung von einem oder mehreren Methylgruppen mit S -adenosylmethionine (SAM) als Methylgruppendonator auf PE, PE oder Monomethyl-dimethyl-PE zu Monomethyl-PE, Dimethyl-PE und / oder geben Phosphatidylcholin (PC). Diese Enzyme sind fast allgegenwärtig in Tierzellen und Pilze. Sie können auch in einigen Anlagen 1 und etwa 10% der Bakterien, insbesondere solche, die mit Eukaryonten 2 interagieren gefunden werden. PEMTs sind nicht nur, indem sie zur Herstellung von PC, die Hauptlipidklasse in tierischen Zellen, aber auch von der Erfüllung anderer wichtigen zellulären Funktionen, die für die Biologie der Zelle. Bei Säugetieren sind PEMTs hauptsächlich in der Leber, wo sie für normale Sekretion von Very Low Density Lipoprotein erforderlich sind, ausgedrückt, und sie auch ernährungsbedingte Fettleibigkeit 3, Atherosklerose 4 beitragen und Insulin Resistance 5. Zusätzlich werden Säugetier PEMT auch in Adipozyten exprimiert, wenn auch in den unteren Ebenen, und beteiligen sich an Fettablagerung 6, 7. PEMT Rolle bei der Krebsentwicklung 8. Apoptose 9, und das Zellwachstum 10 wurden ebenfalls demonstriert. In Bakterien haben PEMT Enzyme gezeigt, wichtig für die normale Zellwachstum 2, Virulenz 2 und Symbiose mit der Wirtspflanze 11 zu sein. Das Ziel und Grundprinzip der vorliegenden Protokolls ist es, PEMU-Aktivität aus Gesamtzellextrakten zu messen, ohne die Notwendigkeit, um das Enzym zu reinigen. Zwei unterschiedliche Protokolle wurden entwickelt, um PEMT Aktivität zu messen. Die erste und häufigste misst die Übertragung von tritiiertem Methylgruppe von radioaktivem SAM auf PE, die das Thema dieses Artikels. Dieses Protokoll wurde ursprünglich entwickelt, um PEMU-Aktivität zu messen aus Hefe 12 und Säugerzellen (Leber) 13, eine underst gewinnenVerknüpfen der PC-Biosynthese in diesen Zellen als auch die Spezifität dieser Enzyme zu bestimmen. Später wurde diese Technik auf andere Zelltypen, wie beispielsweise Bakterien 2 (unter Verwendung eines basischen pH-Wertes für den Assay, obwohl 15) und Protozoenparasiten 14 angewendet. Diese Technik kann mit Gesamtzellextrakten sowie gereinigtes Enzym verwendet werden, und können möglicherweise zu jedem Zellextrakt System angewendet werden. Ein nichtradioaktiver Assay wurde ebenfalls entworfen, das auf die enzymatische Quantifizierung von S -adenosylhomocysteine, der Trans Produkt der SAM 16 stützt. Letztere Assay kann einfacher sein, da es sich nicht um die Radioaktivität, aber es ist nur gereinigte Enzyme geeignet.

<table><tbody><tr><td>S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionin (spezifische Aktivität von 5-15 Ci/mMol)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>das Reagenz aliquotieren und bei -20 μg einfrieren; C; Befolgen Sie die Strahlenschutzrichtlinien, wenn Sie dieses Reagenz</td></tr><tr><td>verwenden Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Roche Life Sciences</td><td>11836170001</td><td>verdünnen Sie es frisch&nbsp;</td></tr><tr><td>Glasperlen, säuregewaschen, 425-600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninsäurelösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationszähler MicroBeta2 mit 1-Detektor</td><td>Perkin Elmer</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300 BSA-Stammlösung</td><td></td></tr><tr><td>(10 mg/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationsflüssigkeit&nbsp;</td><td>Research Product International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>S-(5'-Adenosyl)-L-methioninchlorid (hydrochlorid)&nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>verdünnt das Reagenz in 20 mM HCl und friert die Aliquote bei -80 &deg ein; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro-test an phosphatidylethanolamin methyltransferase-aktivität zu messen

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamin-Methyltransferasen sind biosynthetische Enzyme, die den Transfer einer oder mehrerer Methylgruppe(n) von S-Adenosyl-L-methionin auf Phosphatidylethanolamin, Monomethyl-Phosphatidylethanolamin oder Dimethyl-Phosphatidylethanolamin katalysieren, um entweder Monomethyl-Phosphatidylethanolamin, Dimethyl-Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylcholin zu erhalten. Diese Enzyme sind in tierischen Zellen und Pilzen allgegenwärtig und kommen auch in etwa 10 % der Bakterien vor. Sie erfüllen über ihre direkte Rolle im Fettstoffwechsel hinaus verschiedene wichtige Funktionen in der Zellphysiologie, wie z.B. bei Insulinresistenz, Diabetes, Arteriosklerose, Zellwachstum oder Virulenz. Das vorliegende Manuskript berichtet über einen einfachen zellfreien enzymatischen Assay, der den Transfer von tritiierten Methylgruppen(en) von S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionin auf Phosphatidylethanolamin unter Verwendung von Ganzzellextrakten als Enzymquelle misst. Die resultierenden methylierten Formen von Phosphatidylethanolamin sind hydrophob und können daher durch organische Extraktion von wasserlöslichem S-[Methyl-3-H]adenosyl-L-methionin getrennt werden. Dieser Assay kann möglicherweise auf alle anderen Zelltypen angewendet und verwendet werden, um Inhibitoren/Arzneimittel zu testen, die spezifisch für eine Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase von Interesse sind, ohne dass das Enzym gereinigt werden muss.

Figur 1 zeigt eine zeitabhängige PEMT Assay, der mit Leishmania Gesamtzellextrakt als Enzymquelle mit endogenen PE als Substrat durchgeführt wurde. Die Menge der Radioaktivität in der organischen Phase wurde durch Szintillationszählung quantifiziert. Die erhaltenen Zahlen wurden genutzt, um die Menge an tritiiertem Methylgruppen auf PE übertragen berechnen. Die PEMT Aktivität war linear für ca. 20 min. Es erreichte dann ein Plateau bei rund 30 min, wonach es bli...

Der vorliegende Bericht beschreibt einen enzymatischen In-vitro-Assay zur Messung der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Leishmania-Zellextrakten. Dieser Assay basiert auf der Übertragung einer radioaktiven Methylgruppe von S-[Methyl-3-H]adenosyl-L-methionin auf endogenes Phosphatidylethanolamin.

In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, die Aktivität der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase oder PEMT aus Gesamtzell-Extrakten zu quantifizieren. Mit dieser Methode können wir zentrale Fragen auf dem Gebiet des Lipidstoffwechsels beantworten, beispielsweise die Bedeutung der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferasen bei der Biosynthese von Phosphatidylcholin. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass die Messung direkt aus Gesamtzell-Extrakten erfolgen kann und keine Reinigung des Enzyms erforderlich ist.Daher kann dieses Protokoll Einblicke geben, wie der Parasit sein am häufigsten vorkommendes Lipid, Phosphatidylcholin, synthetisiert. Dieses Protokoll kann auch auf andere Zelltypen wie Säugetierzellen und Bakterien angewendet werden. Kultivierung von Leishmania-Zellen in einer sterilen Kunststoffflasche, verschlossen mit einem luftdichten Verschluss, bei 26 Grad Celsius in mit Zusätzen angereichertem M199-Medium ohne Schütteln.Die Zellen durch Zentrifugation bei 1500&nbsp;×&nbsp;g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius gewinnen. Sobald sie eine Zelldichte von 10 bis 20 Millionen Zellen pro Milliliter erreichen. Nach dem Entfernen des Überstandes mit einer

in-vitro-assay-to-measure-phosphatidylethanolamine-methyltransferase

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines synthetischen tRNA Substrat für...

In-vitro-tRNA Methylierungs-Assay mit der Entamoeba histolytica DNA und tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Dieses Video zeigt einen auf Dünnschichtchromatographie basierenden Enzymassay zur Bestimmung der Pyrophosphokinase-Aktivität mit radioaktiv markierten Nukleotiden. Die Methode gibt Einblicke in die Nukleotidsynthese und Phosphotransferreaktionen.

Dünnschichtchromatographie-basierter Enzymaktivitätsassay: Eine Technik zur Bestimmung der In-vitro-Pyrophosphokinase-Aktivität mittels Dünnschichtchromatographie

Wir beschreiben ein grundlegendes Protokoll zur Quantifizierung der in vitro ATPase-Aktivität. Dieses Protokoll kann basierend auf dem Aktivitätsgrad und den Anforderungen an eine bestimmte gereinigte ATPase optimiert werden.

Messung<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase Aktivität für die enzymatische Charakterisierung

Viele vorhergesagte (Phospho)lipasen sind hinsichtlich ihrer Substratspezifitäten und physiologischen Funktionen schlecht charakterisiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, um die Enzymaktivitäten zu optimieren, nach natürlichen Substraten zu suchen und physiologische Funktionen für diese Enzyme vorzuschlagen.

Definieren von Substratspezifität für Lipase und Phospholipase-Kandidaten

Es ist eine Forderung, prä-klinischen Tests für eine neuartige Klasse von "Orphan" Medikamenten, den sogenannten pharmakologischer Chaperonen reproduzierbar, schnell und effizient zu machen. Wir entwickelten einen einfache, hoch standardisiert und vielseitige Zelle kulturbasierte Assay zum Bildschirm für geeignete Patienten sowie neuartige pharmakologische Chaperon Medikamente.

In-vitro- Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe

Hier beschreiben wir eine Methode zur Reinigung von Histidin-markierten Pyrophosphokinase Enzyme und Dünnschichtchromatographie radioaktiv Substrate und Produkte, für die enzymatische Aktivität in Vitroassay nutzen. Die Enzym-Aktivität-Assay ist breit anwendbar auf Kinase, Nukleotid-Cyclase oder Phosphor-Transfer-Reaktion, deren Mechanismus Nukleotid Triphosphat Hydrolyse umfasst.

Eine Reinigung und In vitro- Aktivität Assay für ein (p) PpGpp Synthestase von Clostridium difficile

Hierwird wird ein antikörperfreier In-vitro-Assay zur direkten Analyse der Methyltransferase-Aktivität an synthetischer oder in vitro transkribierter RNA beschrieben.

Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

Die Palmitoylierung beinhaltet die Umarbeitung einer 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moiety zu Cysteinrückständen von Zielproteinen in reversibler Weise. Hier beschreiben wir einen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay, um den Palmitoylierungszustand eines Proteins zu untersuchen, das für Maushirnlysate von Interesse ist.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay zur quantitativen Bestimmung der Palmitoylierung von Gehirnmembranproteinen

Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Die Fähigkeit, das Zielengagement von Kandidateninhibitoren in intakten Zellen zu bewerten, ist entscheidend für die Entdeckung von Arzneimitteln. Dieses Protokoll beschreibt einen 384 gut formatierten zellulären thermischen Schichttest, der zuverlässig die zelluläre Zielinteraktion von Inhibitoren erkennt, die entweder auf Den Wildtyp SHP2 oder seine onkogenen Varianten abzielen.

Bewertung des zellulären Zielengagements durch SHP2 (PTPN11) Phosphatase-Inhibitoren

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

Lernen Sie die In-vitro-Messung der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase-Aktivität in Leishmania-Zellextrakten. Diese Methode erfordert keine Enzymreinigung und liefert wertvolle Einblicke in den Lipidstoffwechsel von Parasiten.

In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen

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