Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische In Utero Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

Das übergeordnete Ziel dieser in vivo Zellmanipulation ist es, Zellen bestimmter Regionen im zentralen Nervensystem des mausähnlichen Kortex, des Hippocampus, des Thalamus, des Hypothalamus, des Nucleus lateralis septum und des Striatums spezifisch zu modifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Entwicklung und Funktion des Gehirns zu beantworten, z.B. durch die Identifizierung verschiedener Signalkaskaden und die Bestimmung des Grades der Zelldifferenzierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle und effiziente Manipulation verschiedener Zelltypen im Zentralnervensystem ermöglicht, ohne dass zeitaufwändige genetisch veränderte Mäuse erzeugt werden müssen.

Im Allgemeinen ist die Demonstration dieser Methode hilfreich, da Personen, die neu in dieser Methode sind, oft Schwierigkeiten haben, die richtige Elektrodenposition zu finden, die für eine spezifische Elektroporation entscheidend ist. Um diesen Eingriff zu starten, schneiden Sie die Bauchhöhle einer betäubten schwangeren Maus mit einem Skalpell auf. Verhindern Sie, dass die geöffnete Bauchhöhle austrocknet, indem Sie sie mit 0,9% warmer Methylalkohol-Kochsalzlösung anfeuchten.

Ziehen Sie dann die Gebärmutterhörner vorsichtig mit einer Ringzange heraus. Positionieren Sie als Nächstes einen E14-Embryo so, dass sich über der Einstichstelle keine sichtbaren Gefäße befinden. Um eine bessere Visualisierung zu erhalten, verwenden Sie eine 5-Millimeter-Elektrode, um den Winkel und die Position des gewünschten Bereichs im Gehirn für die Transfektion zu lokalisieren.

Für die In-utero-Elektroporation des kortikalen Bereichs injizieren Sie langsam 1,5 bis zwei Mikroliter der DNA-Lösung in den linken lateralen Ventrikel. Und achten Sie darauf, dass die Einstichtiefe ein bis zwei Millimeter beträgt, gemessen von der Gebärmutterwand. Überprüfen Sie dann die blau-grüne Färbung mit einer scharfen Abgrenzung.

Verwenden Sie zur besseren Visualisierung eine 5-Millimeter-Elektrode, um den Winkel und die Position der gewünschten Stelle im Gehirn für die Transfektion zu lokalisieren. Platzieren Sie danach die Mitte der drei Millimeter großen Platinelektrodenpaddel direkt vor den Ohrprimodien und stellen Sie sicher, dass sie nicht über den Gefäßen oder der Plazenta platziert werden. Legen Sie anschließend eine Spannung an, um die Transfektion zu starten.

Für die In-utero-Elektroporation der Hippocampusbildung injizieren Sie zwei Mikroliter DNA-Lösung in den rechten Seitenventrikel eines E15-Embryos. Platzieren Sie dann den Minuspol der drei bis fünf Millimeter großen Platinelektrodenpaddel direkt vor dem Ohrprimordium und den Pluspol in der Mitte des Ohrprimordiums. Legen Sie dann eine Spannung an, um die Transfektion zu starten.

Für die In-utero-Elektroporation des lateralen Septumkerns und des Striatums injizieren Sie einen Mikroliter DNA-Lösung in den rechten lateralen Ventrikel eines E12-Embryos. Platzieren Sie dann die 5-Millimeter-Elektroden auf Höhe der Ohrprimodien. Legen Sie anschließend eine Spannung an, um die Transfektion zu starten.

Für die In-utero-Elektroporation des Thalamus und des Hypothalamus injizieren Sie ein bis 1,5 Mikroliter DNA-Lösung in den lateralen Ventrikel eines E12- bis E13-Embryos. Warten Sie dann zwei bis drei Minuten, bis die Lösung in den dritten Ventrikel diffundiert ist. Platzieren Sie dann die 5- oder Drei-Millimeter-Elektroden direkt hinter den Ohrprimodien.

Legen Sie danach eine Spannung an, um die Transfektion zu starten. Dieses Schema zeigt die geeigneten Positionen für den Plus- und Minuspol für die Transfektion kortikaler Areale. Und dieses hier zeigt die Positionen des positiven und negativen Pols für die Transfektion der Hippocampus-Formationen.

Hier sind die Positionen des Plus- und Minuspols für die Transfektion des Striatums und des lateralen Septumkerns dargestellt. Und hier werden die entsprechenden Positionen der Elektroden für die Transfizierung des Thalamus und des Hypothalamus gezeigt. Die Spezifität der Transfektion hängt von der Elektrodengröße ab.

Durch die Vergrößerung des Elektrodenpaddels wird die Spezifität der Transfektion verringert. Dies ist besonders deutlich in jüngeren Embryonalstadien, aber auch in späten Embryonalstadien sichtbar. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 15 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Embryonen und die Mütter mit großer Sorgfalt zu behandeln. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie bestimmte Regionen im Zentralnervensystem der Black 6-Maus transfiziert werden.