Name: Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische In Utero Electroporation in der C57BL / 6-Maus, (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Lernen Sie die In-utero-Elektroporation zur gezielten Transfektion von Cortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, lateralen Septumkern und Striatum bei C57BL/6-Mäusen. Diese effiziente Methode ermöglicht die schnelle Manipulation von Zelltypen im ZNS ohne zeitaufwändige Erzeugung genetisch modifizierter Mäuse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Technisch unterstützt von Melanie Pfeifer und Nikolai Schmarowski (Institut für Mikroskopische Anatomie und Neurobiologie, Universitätsmedizin Mainz).

Ethics Statement: Die Handhabung der Mäuse und die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit europäischen, nationalen und institutionellen Richtlinien für die Tierpflege durchgeführt. 1. In Utero Elektroporation Hinweis: In utero Elektroporation wurde wie zuvor veröffentlichten 12,14. Daher ist das Verfahren nur kurz beschrieben in den folgenden (1). <ol><li> Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Fast Green farbigen endotoxinfreiem advanced Transfektion-Grade-Plasmid-Lösung (enthaltend 1,5 pCAGGS), wie zuvor beschrieben 12. </li><li> Ziehen und Schleifen (35 ° Winkel) Borosilikatglas Kapillaren (0,8-0,9 Durchmesser) für Injektionszwecke. </li><li> Sterilisieren Instrumente. </li></ol></li><li> Chirurgie <ol><li> Verwalten Analgetika (Carprofen, 4 mg / kg Körpergewicht, sc, 24-Stunden-Depot) mindestens 30 Minuten vor Beginn der Operation. </li><li> Halten Sie die Längedie Anästhesie zu einem Maximum von 35-45 min (Stufe III - Phase der chirurgischen Anästhesie nach Guedel 15 - maximal 25-30 min). </li><li> Anesthetize zeitlich trächtige Mäuse mit Isofluran (Induktion in einer Kammer: 2,8%, Chirurgie über Maske: 2,5%). Bestätigen Anästhesie durch Teilnahmslosigkeit bis zu den Zehen Prise. </li><li> Bewerben Augensalbe, um ins Auge Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Sterilisieren Sie den OP-Bereich mit 7,5% Providon-Jod-Lösung und decken Sie die Maus mit steriler Gaze (feucht mit 0,9% Benzylalkohol Kochsalzlösung) nur mit dem OP-Bereich ausgesetzt. </li><li> Schneiden Sie die Bauchhöhle mit einem Skalpell (Hautschnitt: 1,5-2 cm, Muskel Einschnitt: 1-1,5 cm). </li><li> Erhaltung der geöffneten Bauchhöhle vor dem Austrocknen durch Befeuchten mit erwärmtem 0,9% Benzylalkohol Kochsalzlösung oder einem anderen sterilen isotonischen Lösung wie von Tierärzten oder Ausschuss gerichtet. </li><li> Vorsichtig heraus Gebärmutterhörner (mit Ringzangen, die Gebärmutter mit dem Finger nicht berührens). </li></ol></li><li> Injektion von DNA und Elektroporation. Hinweis: Die genauen Details für die auf bestimmte Regionen in Punkt 2. <ol><li> Langsam spritzen die farbigen DNA-Lösung in die Herzkammer, wie in Abbildung 1 und Abschnitt 2 über die vorbereiteten Borosilikatglas Kapillaren angezeigt. </li><li> Tragen Sie die entsprechende Spannung für den entsprechenden embryonalen Phase (z. B. 36 bis 38 V zur E14) über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). Pulse die Elektroporation Paddel während des Anlegens der Spannung zu Schäden an der Gebärmutterwand zu minimieren. </li></ol></li><li> Beitrag Elektroporation / post-operative Betreuung <ol><li> Vorsichtig wieder die Gebärmutterhörner in der Bauchhöhle. </li><li> Naht der Muskeln und der Hautschnitt getrennt. </li><li> Lassen Sie die Maus Rest auf einer Wärmevorrichtung für die Wiederherstellung. </li><li> Beaufsichtigen Sie die Maus während der Wiederherstellung (Verhalten, Futtermittel undWasserverbrauch), 4 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Operation. Falls erforderlich, zusätzliche Analgetika (Carprofen, 4 mg / kg Körpergewicht, 24-Stunden-Depot) für weitere 2 Tage. </li></ol></li></ol> 2. Transfektion von spezifischen Hirnarealen Anmerkung: Die Position des positiven Pols wird als der Winkel zwischen der vertikalen Mittellinie durch die Herzkammer mit der DNA-Lösung (die rechte oder dritten Ventrikel) und der Position der mit dem positiven Pol gezeigt gefüllt. Beim Befüllen des linken Ventrikels die Positionen spiegelbildlich. In Figur 4 sind die Positionen der Gehör primordialen gezeigt, die wichtige Anhaltspunkte liefern. <ol><li> Transfektion von kortikalen Arealen (2A, Tabelle 1). <ol><li> Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für die in utero Elektroporation von kortikalen Arealen verwenden E14 Embryonen. </li><li> Injizieren 1,5-2 ul DNA-Lösung, die 4 &amp; mgr; g DNA in der rechten lateralen Ventrikelüber die vorbereiteten Borosilikatglas Kapillaren. <ol><li> Der Embryo sorgfältig zu positionieren, indem Ringzange, so dass es keine sichtbaren Gefäße über der Einstichstelle. </li><li> Und injizieren die DNA-Lösung von etwa 0,75 mm koronal vom Lambdanaht und 0,5 mm lateral von der Pfeilnaht (Abbildung 3). Sicherzustellen, dass die Eintauchtiefe beträgt 1,2 mm (E14, von der Gebärmutterwand gemessen). Überprüfen Sie für eine blau-grüne Färbung mit einer scharfen Abgrenzung. </li></ol></li><li> Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). <ol><li> Verwenden Sie ein 3 oder 5 mm-Elektrode Paddel. </li><li> Verwenden Sie eine Spannung im Bereich von 36 bis 38 V. </li><li> Legen Sie die Mitte der Elektroden nur vordere der Ohr primordia. </li><li> Um die retrosplenialen Cortex Verwendung Winkel 330-0 ° transfizieren, um die motorischen Kortex 0-40 ° transfizieren, um den somatosensorischen Kortex 40-95 ° Transfektion, zur TransfektionCortex piriformis (2A) 95-110 ° beträgt. </li></ol></li><li> Führen Sie die nach der Elektroporation / postoperative Versorgung, wie im Abschnitt 1.4 beschrieben. Opfern, die Mäuse und 4 Tage Analyse der Embryonen nach der Elektroporation (E18), wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol></li><li> Transfektion des Hippocampus (2B, Tabelle 1). <ol><li> Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für die in utero Elektroporation von Hippocampus verwenden E15 Embryonen. </li><li> Injizieren 2 ul DNA-Lösung, die 4 &amp; mgr; g DNA in der rechten lateralen Ventrikel über den hergestellten Borosilikat Kapillaren. </li><li> Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). <ol><li> Verwenden Sie ein 3 oder 5 mm-Elektrode Paddel. </li><li> Verwenden Sie eine Spannung im Bereich von 38 bis 40. </li><li> Legen Sie die Mitte der Minuspol nur vordere des Ohres Primordium und dem Zentrum Of den Pluspol an der Mitte des Ohr primordium. </li><li> Zur Transfektion von Gyrus dentatus verwenden Winkel von 190 bis 210 °, um die Ammonshorn (CA) 3 210 bis 230 ° zu transfizieren, um die CA2 230-250 ° transfizieren, um die CA1 250-275 ° (2B) zu transfizieren. </li></ol></li><li> Führen Sie die nach der Elektroporation / postoperative Versorgung, wie im Abschnitt 1.4 beschrieben. Führen Analyse nach vollständiger Hippocampus (nach der Geburt, p21), wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol></li><li> Transfektion des lateralen Septums Kern und Striatum (2C, Tabelle 1) Hinweis: Die Winkel überschneiden sich mit denen, für die Transfektion der Hippocampus. Effektiv transfizieren die laterale Septum Kern und das Striatum ohne unerwünschte Hippocampus Transfektion früher Embryonalstadien (E12) verwendet werden müssen. <ol><li> Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für das in utero Elektroporation des lateralen Septums Kern und striatum zu verwenden E12 Embryonen. </li><li> Injiziert 1 ul DNA-Lösung, die 4 &amp; mgr; g DNA in der rechten lateralen Ventrikel über den hergestellten Borosilikat Kapillaren. </li><li> Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). <ol><li> Verwenden Sie ein 0,5 mm-Elektrode. </li><li> Verwenden Sie 33 V. </li><li> Legen Sie die Mitte der Elektroden auf der Ebene der Ohr primordia. </li><li> Die seitlichen septalen Kern Verwendung Winkeln von 100-170 ° zu transfizieren, um die Striatum 170-240 ° (2C) zu transfizieren. </li></ol></li><li> Führen Sie die nach der Elektroporation / postoperative Versorgung, wie im Abschnitt 1.4 beschrieben. Opfern, die Mäuse und zu analysieren, die Embryonen 6 Tage nach der Elektroporation (E18), wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol></li><li> Transfektion des Thalamus und Hypothalamus (2D, Tabelle 1) <ol><li> Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für die in uTero Elektroporation der Thalamus und Hypothalamus Einsatz E12-E13 Embryonen. </li><li> Injizieren 1-1,5 &amp; mgr; l DNA-Lösung, die 4 &amp; mgr; g DNA in den lateralen Ventrikel (links oder rechts) über den hergestellten Borosilikat Kapillaren. Warten für 2-3 min, bis die Lösung in das dritte Ventrikel diffundiert. Alternativ direkt in den dritten Ventrikel zu injizieren. Hinweis: Dies verbessert Spezifität, aber vielleicht eine verminderte Überlebensrate (hohe Beschädigungsgefahr) führen. </li><li> Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). <ol><li> Verwenden Sie eine 0,5 oder 3 mm-Elektrode. </li><li> Verwenden Sie eine Spannung im Bereich von 33 bis 35 V. </li><li> Legen Sie die Mitte der Elektroden nur posterior die Ohr primordia. </li><li> Zum Thalamus Verwendung Winkel 25-40 ° transfizieren, um die Hypothalamus 90-180 ° (2D) zu transfizieren. </li></ol></li><li> Führen Sie die nach der Elektroporation / post-operative Betreuung als described in Abschnitt 1.4. Opfern, die Mäuse und zu analysieren, die Embryonen 6 Tage nach der Elektroporation (E18), wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Perfusionsfixierung <ol><li> Vorbereitungen <ol><li> Warm 4% Paraformaldehyd (PFA) auf 37 ° C. </li><li> Füllen Sie einen 50-ml-Spritze mit PBS (4 ° C) und eine zweite Spritze mit aufgewärmt PFA. Vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Verbinden der Spritzen zu einem Dreiwegehahn. Verbinden Sie das dritte Ende mit einem venenverweilkanüle (Schmetterling). </li><li> Spülen Sie die venenverweilkanüle mit PBS. </li></ol></li><li> Perfusion <ol><li> Tief betäuben die Mäuse (Schwangerschaft oder postnatale transfiziert) mit subkutanen Anwendung Ketaminhydrochlorid (60 mg / kg) und Xylazin (7,5 mg / kg). </li><li> Bestätigen Sie die chirurgische Toleranzstufe durch Teilnahmslosigkeit bis zu den Zehen Prise. </li><li> Öffnen Sie die Bauchhöhle direkt unter dem Brustkorb. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig die Membran. </li><li> Den Brustkorb öffnen Sie vorsichtig über einen Schnitt auf each Website bis zum Schlüsselbein. </li><li> Legen Sie die Spitze des Schmetterlings in die linke Herzkammer (ausgehend von der Spitze des Herzens). </li><li> Schneiden Sie die linke Herzohr. </li><li> Langsam durchströmen die Maus mit PBS (ca. 10 ml). </li><li> Schalten Sie den Dreiwegehahn. </li><li> Perfusion der Maus mit 5-10 ml 4% PFA. </li><li> Enthaupten die Maus mit einer Schere und sezieren das Gehirn beginnend am Foramen magnum. Führen Sie die Dissektion als bisher veröffentlichten 16. </li><li> Postfixate das Gehirn für 2 Tage in 4% PFA. Halten Sie die Gehirne bei 4 ° C im Dunkeln. </li></ol></li></ol> 4. Immunhistochemie <ol><li> Erzeugen 70 um Abschnitte (zB mit einem Vibratom). </li><li> Optional: Verbessern Fluoreszenz mit Antikörperfärbung. <ol><li> Blockieren die Abschnitte für 1 h bei RT (0,1-0,2% Triton X-100, 5% normalem Ziegenserum) </li><li> Inkubieren O / N mit dem entsprechenden Antikörper (Anti-GFP, 1: 1.000) </li><li> Wash 3-5-Mal mit 0,1 M Phosphatpuffer. </li><li> Inkubieren Sie 3-5 Stunden mit dem entsprechenden Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488 konjugierten Anti-Kaninchen-IgG, 1: 1.000). </li><li> Optional: 4-6-diaminodino-2-phenylindol (DAPI, 0,2 g / ml in 0,1 M Phosphatpuffer) Gegenfärbung für 1 min. </li><li> Analyse Fluoreszenz mit einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).</li>
<li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+generation%2C+migration%2C+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).</li>
<li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li>
<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22FNMOL%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> FNMOL. 4 (November), 37(2011).</li>
<li>Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted-in-schizophrenia-1+%28Disc1%29+is+necessary+for+migration+of+the+pyramidal+neurons+during+mouse+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Hu+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development.</a> Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).</li>
<li>Niwa, M., Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+DISC1+by+In+Utero+Gene+Transfer+Disturbs+Postnatal+Dopaminergic+Maturation+in+the+Frontal+Cortex+and+Leads+to+Adult+Behavioral+Deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits.</a> Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).</li>
<li>Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+ventral+forebrain+cells+migrate+to+the+cortex+and+contribute+to+the+generation+of+cortical+myelinating+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes.</a> Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).</li>
<li>Baumgart, J., Grebe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C57BL%2F6-specific+conditions+for+efficient+in+utero+electroporation+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system.</a> J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> JoVE. (54), (2011).</li>
<li>Guedel, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuedel%2C+AE+%22Inhalation+anesthesia%3A+a+fundamental+guide%22">Inhalation anesthesia: a fundamental guide</a>. , Macmillan. New York. (1937).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mizutani, K., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+resume+generating+neurons+after+temporary+inhibition+of+neurogenesis+by+Notch+activation+in+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex.</a> Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%2C+Growth+%26+Differ%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Protokoll wird detailliert beschrieben, wie der retrospleniale Kortex, der motorische Kortex, der somatosensorische Kortex, der piriforme Kortex, der cornu ammonis 1-3, der Gyrus dentatus, das Striatum, der Nucleus septus lateralis, der Thalamus und der Hypothalamus von C75BL/6-Mäusen transfiziert werden. Mit all den bereitgestellten Informationen ist dies das erste Protokoll, das alle notwendigen Informationen liefert, um Transfektionen dieser Hirnregionen in der C57BL/6-Maus einfach zu rekonstruieren. Bisheri...

Seit der ersten Beschreibung im Jahr 2001 von drei unabhängigen Gruppen 1-3 i n utero Elektroporation hat sich zu einem weit verbreiteten Standard-Tool zur Analyse der Genexpression in der Nagetier zentralen Nervensystems. Im Vergleich zu der Erzeugung von Knockout-Mäusen, die, trotz kontinuierlich Verbesserung der Techniken, noch Zeit und Geld raub, die in utero Elektroporation gefällt durch ihre Einfachheit. Also, in utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle und effiziente Verstärkungs- und loss-of-function-Studien 4. Die Hirnregionen zu transfizieren, wird die Lösung, welche das negativ geladene Plasmid in einem Ventrikel injiziert. Während des elektrischen Impulses, wandert der negativ geladenen DNA zum positiven Pol und daher kann die transfizierte Region einfach durch Verändern der Position des positiven Pols ausgewählt werden. Es ist oft gezeigt worden, dass zahlreiche Regionen des zentralen Nervensystems können targeted 3,5-8. Beispielsweise zeigen neuere Studien, spezifische Transfektionen des Hippocampus, der piriformen Cortex oder Striatum 9-11. Die Information über den richtigen Positionen sind jedoch oft nur kaum standardisiert und sind nicht immer leicht zu verschiedenen Mäusestämme zu übertragen. Transfektion bestimmter Embryonalstadien ist bei weitem nicht trivial. Viele Einflussfaktoren zu beachten bei der Auswahl des Set-up für bestimmte in utero Elektroporation genommen werden. Erstens, um optimal zu transfizieren, die entsprechenden embryonalen Stadien, ist das Wissen über die geeigneten Spannungen notwendig. Hohe Spannungen verringern die Überlebensrate, wohingegen niedrige Spannungen reduzieren die Transfektionseffizienz 2,3,12. Auch die Größe der Elektrode Paddel spielt eine entscheidende Rolle, denn die Verwendung von Elektroden Paddel, die zu groß zu einer verringerten Spezifität sind oder Tod aufgrund von Erkrankung des Herzrhythmus 4,12,13 verursachen. Die angelegteSpannung und die Größe und die Position der Elektrode Paddel sind die wichtigsten Merkmale zu berücksichtigen, es gibt aber auch weitere Faktoren, die die Ergebnisse der Elektroporation, wie die aufgebrachte Menge an DNA-Lösung. Wir haben ein detailliertes Protokoll, das eine schnelle und effiziente Transfektion von verschiedenen Hirnregionen der C57BL / 6-Maus 12 ermöglicht. In diesem Protokoll detaillierte Information über die Spannungen, die verwendet werden und die Größe der Elektrode Paddel für erhöhte Spezifität bereitgestellt. Weitere Information über die Herzkammer mit Empfehlungen für die Menge der Plasmid-Lösung und der Lage der Elektrode zugeführt wird, gefüllt werden. Die Anzeige der detaillierten Positionsinformationen in der Karte und der weiteren Darstellung von diesen Positionen ermöglicht eine einfache spezifische und effiziente in utero Elektroporation des retrosplenialen Cortex, dem motorischen Cortex, somatosensorischen Cortex piriformis cortex, ter Ammonshorn 1-3, dem Gyrus dentatus, das Striatum, die laterale Septum-Kern, der Thalamus und Hypothalamus.

<table><tbody><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Roth</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas (0,8-0,9 mm Durchmesser)</td><td>würde Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Foren)</td><td>Abbott</td><td>PZN 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>Zulassungsnummer: 400684.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe (Bepanthen Augen und Nasensalbe)</td><td>Bayer&nbsp;</td><td>PZN 01578681</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % Benzylalkohol 0,9 % Kochsalzlösung</td><td>Apotheke der Universitätsmedizin Mainz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaze (ES-Kompressen)</td><td>Hartmann</td><td>407835</td><td></td></tr><tr><td>steril 5-0 Perma-Hand Seidennaht</td><td>Ethicon Johnson & Johnson</td><td>K890H</td><td></td></tr><tr><td>Ringzange 1/ 1,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11101-09</td><td></td></tr><tr><td>Ringzange 4,8/ 6 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Ringzange 2,2/ 3 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Adson-Pinzette gezahnt Gerade 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>IrisSchere-Zart Gerade-Scharf/ Blunt 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Mayo-Stille Schere-Gerade 15 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14012-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Nadelhalter-mit Lock-Wolframkarbid 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator CUY21 SC&nbsp;</td><td>Nepa Gene Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FST 250 Hot Bead Sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder EG-44</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Micropette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Platin-Elektroden 650P 0,5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P0,5</td><td></td></tr><tr><td>Platin-Elektroden 650P 3 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P3</td><td></td></tr><tr><td>Platinelektroden 650P 5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Platinelektroden 650P 10 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P10</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiesystem</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>CV-30511-3 Vapor 19.3</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler 220V AC</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr></tbody></table>

cortex, hippocampus-, thalamus-, hypothalamus, lateral septal nucleus- und striatum spezifische<em&gt; in utero</em&gt; electroporation in der c57bl / 6-maus,

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Die In-utero-Elektroporation ist eine weit verbreitete Technik zur schnellen und effizienten raumzeitlichen Manipulation verschiedener Gene im zentralen Nervensystem von Nagetieren. Eine Überexpression erwünschter Gene ist ebenso möglich wie shRNA-vermittelte Loss-of-Function-Studien. Daher bietet es ein breites Anwendungsspektrum. Die Möglichkeit, bestimmte Zellen in einem bestimmten Bereich gezielt anzusprechen, erweitert das Spektrum der Anwendungsmöglichkeiten dieser sehr nützlichen Methode weiter. Für eine effiziente Ausrichtung auf bestimmte Regionen ist die Kenntnis der Feinheiten wie des embryonalen Stadiums, der anzulegenden Spannung und vor allem der Position der Elektroden unerlässlich.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das eine spezifische und effiziente In-utero-Elektroporation mehrerer Regionen des zentralen Nervensystems der C57BL/6-Maus ermöglicht. Insbesondere wird gezeigt, wie Regionen, die sich in den retrosplenialen Kortex, den motorischen Kortex, den somatosensorischen Kortex, den piriformen Kortex, den cornu ammonis 1-3, den Gyrus dentatus, das Striatum, den Nucleus septus lateralis, den Thalamus und den Hypothalamus entwickeln, transfiziert werden können. Für diese Information über das geeignete Embryonalstadium wird die entsprechende Spannung für das entsprechende Embryonalstadium bereitgestellt. Vor allem aber wird eine Winkelkarte abgebildet, die die entsprechende Position des Pluspols anzeigt. Dieses standardisierte Protokoll trägt zu einer effizienten In-utero-Elektroporation bei, die auch zu einer geringeren Anzahl von Tieren führen kann.

Abbildung 2 zeigt Beispiele für die spezifische in utero Elektroporation der Regionen entwickelt sich der retrosplenialen Hirnrinde, dem motorischen Kortex, dem somatosensorischen Kortex, die piriformen Cortex, Ammonshorn 1-3, dem Gyrus dentatus, das Striatum, die laterale Septum-Kern , Thalamus und Hypothalamus. Die Ergebnisse der Transfektionen sind gezeigt neben dem empfohlenen Winkel (Abbildung 2). Zur besseren Veranschaulichung der Winkel in vivo die Position der ...

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie verschiedene Regionen im Zentralnervensystem C57BL/6 mittels in utero-Elektroporation spezifisch transfiziert werden. In diesem Protokoll sind detaillierte Anweisungen für Transfektionen von Regionen enthalten, die sich zum Kortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Nucleus lateralis septum lateralis und Striatum entwickeln.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Das übergeordnete Ziel dieser in-vivo-Zellmanipulation besteht darin, Zellen bestimmter Regionen des zentralen Nervensystems der Maus – wie beispielsweise der Großhirnrinde, des Hippocampus, des Thalamus, des Hypothalamus, des lateralen Septumkerns und des Striatums – geziilt zu veränderen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Entwicklung und Funktion des Gehirns zu beantworten, zum Beispiel durch die Identifizierung unterschiedlicher Signaltransduktionskaskaden und die Bestimmung des Differenzierungsgrades der Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine schnelle und effiziente Manipulation verschiedener Zelltypen im zentralen Nervensystem ermöglicht, ohne dass die zeitaufwändige Erzeugung genetisch veränderter Mäuse erforderlich ist.Im Allgemeinen ist die Demonstration dieser Methode hilfreich, da Personen, die neu in dieser Methode sind, häufig Schwierigkeiten haben, die richtige Elektrodenposition zu finden, was für eine gezielte Elektroporation entscheidend ist. Um diese Prozedur zu beginnen, öffnen Sie mit einem Skalpell die Bauchhöhle einer anesthetisierten trächtigen Maus. Verhindern Sie, dass die geöffnete Bauchhöhle austrocknet, indem Sie s

cortex-hippocampus-thalamus-hypothalamus-lateral-septal-nucleus

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E15 muriner Embryonen

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Dieser Artikel beschreibt im Detail, ein Protokoll zur in utero elektroporieren die Hirnrinde und im Hippocampus bei E14.5 bei Mäusen. Wir zeigen auch, dass dies eine wertvolle Methode, um Dendriten und Dornen in diesen beiden Hirnregionen zu untersuchen ist.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das...

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des...

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.

Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das ein Werkzeug zur Untersuchung der Regulationsmechanismen bestimmter Gene während der Hippocampus-Entwicklung bietet. Der Einsatz von Ex-utero-Elektroporation und organotypischer Schnittkultur ermöglicht die Hoch- und Herunterregulierung der Expression von Genen von Interesse in einzelnen Zellen und die Verfolgung ihres Schicksals während der Entwicklung.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

Zelle-autonome Funktionen der Gene im Gehirn können durch Induktion Verlust studiert werden oder der Funktion in geringer Dichte Bevölkerungen der Zellen gewinnen. Hier beschreiben wir in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase in spärlichen Bevölkerung kortikale Neuronen mit Floxed Genen zu entwickeln, Verlust der Funktion in Vivozu liefern.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Lernen Sie die In-utero-Elektroporation zur gezielten Transfektion von Cortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, lateralen Septumkern und Striatum bei C57BL/6-Mäusen. Diese effiziente Methode ermöglicht die schnelle Manipulation von Zelltypen im ZNS ohne zeitaufwändige Erzeugung genetisch modifizierter Mäuse.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische In Utero Electroporation in der C57BL / 6-Maus, (Video) | JoVE Journal

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische

Weitere Videos entdecken