Name: Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische In Utero Electroporation in der C57BL / 6-Maus, (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Lernen Sie die In-utero-Elektroporation zur gezielten Transfektion von Cortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, lateralen Septumkern und Striatum bei C57BL/6-Mäusen. Diese effiziente Methode ermöglicht die schnelle Manipulation von Zelltypen im ZNS ohne zeitaufwändige Erzeugung genetisch modifizierter Mäuse.

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Technisch unterstützt von Melanie Pfeifer und Nikolai Schmarowski (Institut für Mikroskopische Anatomie und Neurobiologie, Universitätsmedizin Mainz).

Ethics Statement: Die Handhabung der Mäuse und die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit europäischen, nationalen und institutionellen Richtlinien für die Tierpflege durchgeführt. 1. In Utero Elektroporation Hinweis: In utero Elektroporation wurde wie zuvor veröffentlichten 12,14. Daher ist das Verfahren nur kurz beschrieben in den folgenden (1). <ol><li> Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Fast Green farbigen endotoxinfreiem advanced Transfektion-Grade-Plasmid-Lösung (enthaltend 1,5 pCAGGS), wie zuvor beschrieben 12. </li><li> Ziehen und Schleifen (35 ° Winkel) Borosilikatglas Kapillaren (0,8-0,9 Durchmesser) für Injektionszwecke. </li><li> Sterilisieren Instrumente. </li></ol></li><li> Chirurgie <ol><li> Verwalten Analgetika (Carprofen, 4 mg / kg Körpergewicht, sc, 24-Stunden-Depot) mindestens 30 Minuten vor Beginn der Operation. </li><li> Halten Sie die Längedie Anästhesie zu einem Maximum von 35-45 min (Stufe III - Phase der chirurgischen Anästhesie nach Guedel 15 - maximal 25-30 min). </li><li> Anesthetize zeitlich trächtige Mäuse mit Isofluran (Induktion in einer Kammer: 2,8%, Chirurgie über Maske: 2,5%). Bestätigen Anästhesie durch Teilnahmslosigkeit bis zu den Zehen Prise. </li><li> Bewerben Augensalbe, um ins Auge Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Sterilisieren Sie den OP-Bereich mit 7,5% Providon-Jod-Lösung und decken Sie die Maus mit steriler Gaze (feucht mit 0,9% Benzylalkohol Kochsalzlösung) nur mit dem OP-Bereich ausgesetzt. </li><li> Schneiden Sie die Bauchhöhle mit einem Skalpell (Hautschnitt: 1,5-2 cm, Muskel Einschnitt: 1-1,5 cm). </li><li> Erhaltung der geöffneten Bauchhöhle vor dem Austrocknen durch Befeuchten mit erwärmtem 0,9% Benzylalkohol Kochsalzlösung oder einem anderen sterilen isotonischen Lösung wie von Tierärzten oder Ausschuss gerichtet. </li><li> Vorsichtig heraus Gebärmutterhörner (mit Ringzangen, die Gebärmutter mit dem Finger nicht berührens). </li></ol></li><li> Injektion von DNA und Elektroporation. Hinweis: Die genauen Details für die auf bestimmte Regionen in Punkt 2. <ol><li> Langsam spritzen die farbigen DNA-Lösung in die Herzkammer, wie in Abbildung 1 und Abschnitt 2 über die vorbereiteten Borosilikatglas Kapillaren angezeigt. </li><li> Tragen Sie die entsprechende Spannung für den entsprechenden embryonalen Phase (z. B. 36 bis 38 V zur E14) über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). Pulse die Elektroporation Paddel während des Anlegens der Spannung zu Schäden an der Gebärmutterwand zu minimieren. </li></ol></li><li> Beitrag Elektroporation / post-operative Betreuung <ol><li> Vorsichtig wieder die Gebärmutterhörner in der Bauchhöhle. </li><li> Naht der Muskeln und der Hautschnitt getrennt. </li><li> Lassen Sie die Maus Rest auf einer Wärmevorrichtung für die Wiederherstellung. </li><li> Beaufsichtigen Sie die Maus während der Wiederherstellung (Verhalten, Futtermittel undWasserverbrauch), 4 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Operation. Falls erforderlich, zusätzliche Analgetika (Carprofen, 4 mg / kg Körpergewicht, 24-Stunden-Depot) für weitere 2 Tage. </li></ol></li></ol> 2. Transfektion von spezifischen Hirnarealen Anmerkung: Die Position des positiven Pols wird als der Winkel zwischen der vertikalen Mittellinie durch die Herzkammer mit der DNA-Lösung (die rechte oder dritten Ventrikel) und der Position der mit dem positiven Pol gezeigt gefüllt. Beim Befüllen des linken Ventrikels die Positionen spiegelbildlich. In Figur 4 sind die Positionen der Gehör primordialen gezeigt, die wichtige Anhaltspunkte liefern. <ol><li> Transfektion von kortikalen Arealen (2A, Tabelle 1). <ol><li> Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für die in utero Elektroporation von kortikalen Arealen verwenden E14 Embryonen. </li><li> Injizieren 1,5-2 ul DNA-Lösung, die 4 &amp; mgr; g DNA in der rechten lateralen Ventrikelüber die vorbereiteten Borosilikatglas Kapillaren. <ol><li> Der Embryo sorgfältig zu positionieren, indem Ringzange, so dass es keine sichtbaren Gefäße über der Einstichstelle. </li><li> Und injizieren die DNA-Lösung von etwa 0,75 mm koronal vom Lambdanaht und 0,5 mm lateral von der Pfeilnaht (Abbildung 3). Sicherzustellen, dass die Eintauchtiefe beträgt 1,2 mm (E14, von der Gebärmutterwand gemessen). Überprüfen Sie für eine blau-grüne Färbung mit einer scharfen Abgrenzung. </li></ol></li><li> Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). <ol><li> Verwenden Sie ein 3 oder 5 mm-Elektrode Paddel. </li><li> Verwenden Sie eine Spannung im Bereich von 36 bis 38 V. </li><li> Legen Sie die Mitte der Elektroden nur vordere der Ohr primordia. </li><li> Um die retrosplenialen Cortex Verwendung Winkel 330-0 ° transfizieren, um die motorischen Kortex 0-40 ° transfizieren, um den somatosensorischen Kortex 40-95 ° Transfektion, zur TransfektionCortex piriformis (2A) 95-110 ° beträgt. </li></ol></li><li> Führen Sie die nach der Elektroporation / postoperative Versorgung, wie im Abschnitt 1.4 beschrieben. Opfern, die Mäuse und 4 Tage Analyse der Embryonen nach der Elektroporation (E18), wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol></li><li> Transfektion des Hippocampus (2B, Tabelle 1). <ol><li> Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für die in utero Elektroporation von Hippocampus verwenden E15 Embryonen. </li><li> Injizieren 2 ul DNA-Lösung, die 4 &amp; mgr; g DNA in der rechten lateralen Ventrikel über den hergestellten Borosilikat Kapillaren. </li><li> Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). <ol><li> Verwenden Sie ein 3 oder 5 mm-Elektrode Paddel. </li><li> Verwenden Sie eine Spannung im Bereich von 38 bis 40. </li><li> Legen Sie die Mitte der Minuspol nur vordere des Ohres Primordium und dem Zentrum Of den Pluspol an der Mitte des Ohr primordium. </li><li> Zur Transfektion von Gyrus dentatus verwenden Winkel von 190 bis 210 °, um die Ammonshorn (CA) 3 210 bis 230 ° zu transfizieren, um die CA2 230-250 ° transfizieren, um die CA1 250-275 ° (2B) zu transfizieren. </li></ol></li><li> Führen Sie die nach der Elektroporation / postoperative Versorgung, wie im Abschnitt 1.4 beschrieben. Führen Analyse nach vollständiger Hippocampus (nach der Geburt, p21), wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol></li><li> Transfektion des lateralen Septums Kern und Striatum (2C, Tabelle 1) Hinweis: Die Winkel überschneiden sich mit denen, für die Transfektion der Hippocampus. Effektiv transfizieren die laterale Septum Kern und das Striatum ohne unerwünschte Hippocampus Transfektion früher Embryonalstadien (E12) verwendet werden müssen. <ol><li> Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für das in utero Elektroporation des lateralen Septums Kern und striatum zu verwenden E12 Embryonen. </li><li> Injiziert 1 ul DNA-Lösung, die 4 &amp; mgr; g DNA in der rechten lateralen Ventrikel über den hergestellten Borosilikat Kapillaren. </li><li> Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). <ol><li> Verwenden Sie ein 0,5 mm-Elektrode. </li><li> Verwenden Sie 33 V. </li><li> Legen Sie die Mitte der Elektroden auf der Ebene der Ohr primordia. </li><li> Die seitlichen septalen Kern Verwendung Winkeln von 100-170 ° zu transfizieren, um die Striatum 170-240 ° (2C) zu transfizieren. </li></ol></li><li> Führen Sie die nach der Elektroporation / postoperative Versorgung, wie im Abschnitt 1.4 beschrieben. Opfern, die Mäuse und zu analysieren, die Embryonen 6 Tage nach der Elektroporation (E18), wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol></li><li> Transfektion des Thalamus und Hypothalamus (2D, Tabelle 1) <ol><li> Durchführung von Operationen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Für die in uTero Elektroporation der Thalamus und Hypothalamus Einsatz E12-E13 Embryonen. </li><li> Injizieren 1-1,5 &amp; mgr; l DNA-Lösung, die 4 &amp; mgr; g DNA in den lateralen Ventrikel (links oder rechts) über den hergestellten Borosilikat Kapillaren. Warten für 2-3 min, bis die Lösung in das dritte Ventrikel diffundiert. Alternativ direkt in den dritten Ventrikel zu injizieren. Hinweis: Dies verbessert Spezifität, aber vielleicht eine verminderte Überlebensrate (hohe Beschädigungsgefahr) führen. </li><li> Bewerben Spannung über den Fachzange Typ Platinelektroden (Intervall Zykluslänge 50 msec, Intervallpause 950 ms). <ol><li> Verwenden Sie eine 0,5 oder 3 mm-Elektrode. </li><li> Verwenden Sie eine Spannung im Bereich von 33 bis 35 V. </li><li> Legen Sie die Mitte der Elektroden nur posterior die Ohr primordia. </li><li> Zum Thalamus Verwendung Winkel 25-40 ° transfizieren, um die Hypothalamus 90-180 ° (2D) zu transfizieren. </li></ol></li><li> Führen Sie die nach der Elektroporation / post-operative Betreuung als described in Abschnitt 1.4. Opfern, die Mäuse und zu analysieren, die Embryonen 6 Tage nach der Elektroporation (E18), wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Perfusionsfixierung <ol><li> Vorbereitungen <ol><li> Warm 4% Paraformaldehyd (PFA) auf 37 ° C. </li><li> Füllen Sie einen 50-ml-Spritze mit PBS (4 ° C) und eine zweite Spritze mit aufgewärmt PFA. Vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Verbinden der Spritzen zu einem Dreiwegehahn. Verbinden Sie das dritte Ende mit einem venenverweilkanüle (Schmetterling). </li><li> Spülen Sie die venenverweilkanüle mit PBS. </li></ol></li><li> Perfusion <ol><li> Tief betäuben die Mäuse (Schwangerschaft oder postnatale transfiziert) mit subkutanen Anwendung Ketaminhydrochlorid (60 mg / kg) und Xylazin (7,5 mg / kg). </li><li> Bestätigen Sie die chirurgische Toleranzstufe durch Teilnahmslosigkeit bis zu den Zehen Prise. </li><li> Öffnen Sie die Bauchhöhle direkt unter dem Brustkorb. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig die Membran. </li><li> Den Brustkorb öffnen Sie vorsichtig über einen Schnitt auf each Website bis zum Schlüsselbein. </li><li> Legen Sie die Spitze des Schmetterlings in die linke Herzkammer (ausgehend von der Spitze des Herzens). </li><li> Schneiden Sie die linke Herzohr. </li><li> Langsam durchströmen die Maus mit PBS (ca. 10 ml). </li><li> Schalten Sie den Dreiwegehahn. </li><li> Perfusion der Maus mit 5-10 ml 4% PFA. </li><li> Enthaupten die Maus mit einer Schere und sezieren das Gehirn beginnend am Foramen magnum. Führen Sie die Dissektion als bisher veröffentlichten 16. </li><li> Postfixate das Gehirn für 2 Tage in 4% PFA. Halten Sie die Gehirne bei 4 ° C im Dunkeln. </li></ol></li></ol> 4. Immunhistochemie <ol><li> Erzeugen 70 um Abschnitte (zB mit einem Vibratom). </li><li> Optional: Verbessern Fluoreszenz mit Antikörperfärbung. <ol><li> Blockieren die Abschnitte für 1 h bei RT (0,1-0,2% Triton X-100, 5% normalem Ziegenserum) </li><li> Inkubieren O / N mit dem entsprechenden Antikörper (Anti-GFP, 1: 1.000) </li><li> Wash 3-5-Mal mit 0,1 M Phosphatpuffer. </li><li> Inkubieren Sie 3-5 Stunden mit dem entsprechenden Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488 konjugierten Anti-Kaninchen-IgG, 1: 1.000). </li><li> Optional: 4-6-diaminodino-2-phenylindol (DAPI, 0,2 g / ml in 0,1 M Phosphatpuffer) Gegenfärbung für 1 min. </li><li> Analyse Fluoreszenz mit einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Protokoll wird detailliert beschrieben, wie der retrospleniale Kortex, der motorische Kortex, der somatosensorische Kortex, der piriforme Kortex, der cornu ammonis 1-3, der Gyrus dentatus, das Striatum, der Nucleus septus lateralis, der Thalamus und der Hypothalamus von C75BL/6-Mäusen transfiziert werden. Mit all den bereitgestellten Informationen ist dies das erste Protokoll, das alle notwendigen Informationen liefert, um Transfektionen dieser Hirnregionen in der C57BL/6-Maus einfach zu rekonstruieren. Bisheri...

Seit der ersten Beschreibung im Jahr 2001 von drei unabhängigen Gruppen 1-3 i n utero Elektroporation hat sich zu einem weit verbreiteten Standard-Tool zur Analyse der Genexpression in der Nagetier zentralen Nervensystems. Im Vergleich zu der Erzeugung von Knockout-Mäusen, die, trotz kontinuierlich Verbesserung der Techniken, noch Zeit und Geld raub, die in utero Elektroporation gefällt durch ihre Einfachheit. Also, in utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle und effiziente Verstärkungs- und loss-of-function-Studien 4. Die Hirnregionen zu transfizieren, wird die Lösung, welche das negativ geladene Plasmid in einem Ventrikel injiziert. Während des elektrischen Impulses, wandert der negativ geladenen DNA zum positiven Pol und daher kann die transfizierte Region einfach durch Verändern der Position des positiven Pols ausgewählt werden. Es ist oft gezeigt worden, dass zahlreiche Regionen des zentralen Nervensystems können targeted 3,5-8. Beispielsweise zeigen neuere Studien, spezifische Transfektionen des Hippocampus, der piriformen Cortex oder Striatum 9-11. Die Information über den richtigen Positionen sind jedoch oft nur kaum standardisiert und sind nicht immer leicht zu verschiedenen Mäusestämme zu übertragen. Transfektion bestimmter Embryonalstadien ist bei weitem nicht trivial. Viele Einflussfaktoren zu beachten bei der Auswahl des Set-up für bestimmte in utero Elektroporation genommen werden. Erstens, um optimal zu transfizieren, die entsprechenden embryonalen Stadien, ist das Wissen über die geeigneten Spannungen notwendig. Hohe Spannungen verringern die Überlebensrate, wohingegen niedrige Spannungen reduzieren die Transfektionseffizienz 2,3,12. Auch die Größe der Elektrode Paddel spielt eine entscheidende Rolle, denn die Verwendung von Elektroden Paddel, die zu groß zu einer verringerten Spezifität sind oder Tod aufgrund von Erkrankung des Herzrhythmus 4,12,13 verursachen. Die angelegteSpannung und die Größe und die Position der Elektrode Paddel sind die wichtigsten Merkmale zu berücksichtigen, es gibt aber auch weitere Faktoren, die die Ergebnisse der Elektroporation, wie die aufgebrachte Menge an DNA-Lösung. Wir haben ein detailliertes Protokoll, das eine schnelle und effiziente Transfektion von verschiedenen Hirnregionen der C57BL / 6-Maus 12 ermöglicht. In diesem Protokoll detaillierte Information über die Spannungen, die verwendet werden und die Größe der Elektrode Paddel für erhöhte Spezifität bereitgestellt. Weitere Information über die Herzkammer mit Empfehlungen für die Menge der Plasmid-Lösung und der Lage der Elektrode zugeführt wird, gefüllt werden. Die Anzeige der detaillierten Positionsinformationen in der Karte und der weiteren Darstellung von diesen Positionen ermöglicht eine einfache spezifische und effiziente in utero Elektroporation des retrosplenialen Cortex, dem motorischen Cortex, somatosensorischen Cortex piriformis cortex, ter Ammonshorn 1-3, dem Gyrus dentatus, das Striatum, die laterale Septum-Kern, der Thalamus und Hypothalamus.

<table><tbody><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Roth</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas (0,8-0,9 mm Durchmesser)</td><td>würde Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Foren)</td><td>Abbott</td><td>PZN 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>Zulassungsnummer: 400684.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe (Bepanthen Augen und Nasensalbe)</td><td>Bayer&nbsp;</td><td>PZN 01578681</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % Benzylalkohol 0,9 % Kochsalzlösung</td><td>Apotheke der Universitätsmedizin Mainz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaze (ES-Kompressen)</td><td>Hartmann</td><td>407835</td><td></td></tr><tr><td>steril 5-0 Perma-Hand Seidennaht</td><td>Ethicon Johnson & Johnson</td><td>K890H</td><td></td></tr><tr><td>Ringzange 1/ 1,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11101-09</td><td></td></tr><tr><td>Ringzange 4,8/ 6 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Ringzange 2,2/ 3 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Adson-Pinzette gezahnt Gerade 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>IrisSchere-Zart Gerade-Scharf/ Blunt 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Mayo-Stille Schere-Gerade 15 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14012-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Nadelhalter-mit Lock-Wolframkarbid 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator CUY21 SC&nbsp;</td><td>Nepa Gene Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FST 250 Hot Bead Sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder EG-44</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Micropette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Platin-Elektroden 650P 0,5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P0,5</td><td></td></tr><tr><td>Platin-Elektroden 650P 3 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P3</td><td></td></tr><tr><td>Platinelektroden 650P 5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Platinelektroden 650P 10 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P10</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiesystem</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>CV-30511-3 Vapor 19.3</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler 220V AC</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr></tbody></table>

cortex, hippocampus-, thalamus-, hypothalamus, lateral septal nucleus- und striatum spezifische<em&gt; in utero</em&gt; electroporation in der c57bl / 6-maus,

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Die In-utero-Elektroporation ist eine weit verbreitete Technik zur schnellen und effizienten raumzeitlichen Manipulation verschiedener Gene im zentralen Nervensystem von Nagetieren. Eine Überexpression erwünschter Gene ist ebenso möglich wie shRNA-vermittelte Loss-of-Function-Studien. Daher bietet es ein breites Anwendungsspektrum. Die Möglichkeit, bestimmte Zellen in einem bestimmten Bereich gezielt anzusprechen, erweitert das Spektrum der Anwendungsmöglichkeiten dieser sehr nützlichen Methode weiter. Für eine effiziente Ausrichtung auf bestimmte Regionen ist die Kenntnis der Feinheiten wie des embryonalen Stadiums, der anzulegenden Spannung und vor allem der Position der Elektroden unerlässlich.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das eine spezifische und effiziente In-utero-Elektroporation mehrerer Regionen des zentralen Nervensystems der C57BL/6-Maus ermöglicht. Insbesondere wird gezeigt, wie Regionen, die sich in den retrosplenialen Kortex, den motorischen Kortex, den somatosensorischen Kortex, den piriformen Kortex, den cornu ammonis 1-3, den Gyrus dentatus, das Striatum, den Nucleus septus lateralis, den Thalamus und den Hypothalamus entwickeln, transfiziert werden können. Für diese Information über das geeignete Embryonalstadium wird die entsprechende Spannung für das entsprechende Embryonalstadium bereitgestellt. Vor allem aber wird eine Winkelkarte abgebildet, die die entsprechende Position des Pluspols anzeigt. Dieses standardisierte Protokoll trägt zu einer effizienten In-utero-Elektroporation bei, die auch zu einer geringeren Anzahl von Tieren führen kann.

Abbildung 2 zeigt Beispiele für die spezifische in utero Elektroporation der Regionen entwickelt sich der retrosplenialen Hirnrinde, dem motorischen Kortex, dem somatosensorischen Kortex, die piriformen Cortex, Ammonshorn 1-3, dem Gyrus dentatus, das Striatum, die laterale Septum-Kern , Thalamus und Hypothalamus. Die Ergebnisse der Transfektionen sind gezeigt neben dem empfohlenen Winkel (Abbildung 2). Zur besseren Veranschaulichung der Winkel in vivo die Position der ...

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie verschiedene Regionen im Zentralnervensystem C57BL/6 mittels in utero-Elektroporation spezifisch transfiziert werden. In diesem Protokoll sind detaillierte Anweisungen für Transfektionen von Regionen enthalten, die sich zum Kortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Nucleus lateralis septum lateralis und Striatum entwickeln.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Das übergeordnete Ziel dieser in-vivo-Zellmanipulation besteht darin, Zellen bestimmter Regionen des zentralen Nervensystems der Maus – wie beispielsweise der Großhirnrinde, des Hippocampus, des Thalamus, des Hypothalamus, des lateralen Septumkerns und des Striatums – geziilt zu veränderen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Entwicklung und Funktion des Gehirns zu beantworten, zum Beispiel durch die Identifizierung unterschiedlicher Signaltransduktionskaskaden und die Bestimmung des Differenzierungsgrades der Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine schnelle und effiziente Manipulation verschiedener Zelltypen im zentralen Nervensystem ermöglicht, ohne dass die zeitaufwändige Erzeugung genetisch veränderter Mäuse erforderlich ist.Im Allgemeinen ist die Demonstration dieser Methode hilfreich, da Personen, die neu in dieser Methode sind, häufig Schwierigkeiten haben, die richtige Elektrodenposition zu finden, was für eine gezielte Elektroporation entscheidend ist. Um diese Prozedur zu beginnen, öffnen Sie mit einem Skalpell die Bauchhöhle einer anesthetisierten trächtigen Maus. Verhindern Sie, dass die geöffnete Bauchhöhle austrocknet, indem Sie sie mit einer 0,9 %igen warmen Lösung aus Methylalkohol und Kochsalzlösung befeuchten.Danach die Uterushörner vorsichtig mit einer Ringpinzette entnehmen. Als Nächstes positionieren Sie einen E14-Embryo so, dass über der Punktionsstelle keine sichtbaren Gefäße vorhanden sind. Zur besseren Visualisierung verwenden Sie eine 5-Millimeter-Elektrode, um den Winkel und die Position des gewünschten Bereichs im Gehirn für die Transfektion zu bestimmen.Für die In-utero-Elektroporation des kortikalen Bereichs injizieren Sie langsam 1,5 bis zwei Mikroliter der DNA-Lösung in das linke Seitenventrikel. Achten Sie darauf, dass die Eindringtiefe ein bis zwei Millimeter beträgt, gemessen ab der Uteruswand. Überprüfen Sie anschließend die Färbung auf blau-grüne Verfärbung mit scharfer Abgrenzung.Zur besseren Visualisierung verwenden Sie eine 5-Millimeter-Elektrode, um den Winkel und die Position des gewünschten Zielortes im Gehirn für die Transfektion zu bestimmen. Danach platzieren Sie die Mitte der drei Millimeter breiten Platin-Elektrodenflächen direkt vor den Ohranlagen und stellen sicher, dass sie nicht über Gefäßen oder der Plazenta positioniert sind. Anschließend wird Spannung angelegt, um die Transfektion zu starten.Für die In-utero-Elektroporation der Hippocampusformation zwei Mikroliter DNA-Lösung in das rechte Seitenventrikel eines E15-Embryos injizieren. Anschließend wird die negative Elektrode der drei bis fünf Millimeter großen Platin-Elektrodenplättchen knapp vor das Ohrenanlage gelegt und die positive Elektrode in die Mitte der Ohrenanlage positioniert. Danach wird eine Spannung angelegt, um die Transfektion zu starten.Für die In-utero-Elektroporation des lateralen Septumkerns und des Striatums wird ein Mikroliter DNA-Lösung in das rechte Seitenventrikel eines E12-Embryos injiziert. Anschließend werden die 5-Millimeter-Elektroden auf der Höhe der Ohrenanlagen positioniert. Danach wird eine Spannung angelegt, um die Transfektion zu starten.Bei der in utero-Elektroporation von Thalamus und Hypothalamus ein bis 1,5 µL DNA-Lösung in das Seitenventrikel eines Embryos im Stadium E12 bis E13 injizieren. Anschließend zwei bis drei Minuten warten, bis sich die Lösung im dritten Ventrikel ausgebreitet hat. Danach die 5-mm- oder 3-mm-Elektroden unmittelbar hinter den Ohranlagen platzieren.Anschließend Spannung anlegen, um die Transfektion zu starten. Dieses Schema zeigt die geeigneten Positionen für die positiven und negativen Pole zur Transfektion kortikaler Bereiche. Dieses hingegen zeigt die Positionen des positiven und negativen Pols zur Transfektion der hippocampalen Formationen.Die Positionen der positiven und negativen Pole zur Transfektion des Striatums und des lateralen septalen Kerns sind hier dargestellt. Und die geeigneten Positionen der Elektroden zur Transfektion des Thalamus und des Hypothalamus sind hier gezeigt. Die Spezifität der Transfektion hängt von der Größe der Elektroden ab.Die Vergrößerung der Elektrodenplatte verringert die Spezifität der Transfektion. Dies ist besonders in frühen embryonalen Stadien offensichtlich, aber auch in späteren embryonalen Stadien sichtbar. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 15 Minuten durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Embryonen und die Mütter äußerst sorgfältig zu behandeln. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man spezifische Regionen im zentralen Nervensystem der Black-6-Maus transfectiert.

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Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische In Utero Electroporation in der C57BL / 6-Maus, (Video) | JoVE Journal

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische

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