Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA

Hier zeigen wir die Verwendung eines zellpenetrierenden Peptids mit einem modifizierten Antisense-Oligonukleotid, um micro-RNA im Gehirn von Mäusen spezifisch abzubauen. Dies wurde erreicht, indem ein Antigo gegen den 29. Mai entworfen wurde. In dieser Studie haben wir Antigo-Männchen verwendet, um microRNAs an Nukleinsäuremodifikationen zu hindern.

Das heißt, LNA-Modifikationen wurden an fünf verschiedenen Positionen eingebaut. Dabei erhöht der Einbau von LNA-Modifikationen die Bindungsaffinität zur micro-RNA. Außerdem verleiht es dem Zellkern Resistenz und erhöht somit die Effizienz des microRNA-Targetings.

Komplexe des ANTIGO MAR mit dem Peptid wurden in vitro hergestellt und den Mäusen durch die Schwanzvene injiziert. Der Knockdown der microRNA führte zu Verhaltensänderungen, die auf eine Beteiligung dieser microRNA an der Ataxie hindeuten: Drei aufeinanderfolgende Injektionen reichten aus, um nach der Behandlung eine merkliche Veränderung des Gangbildes zu induzieren, Hirngewebe wurde entnommen und der Knockdown der microRNA bestätigt. CPPs oder selbstpenetrierende Peptide haben sich in jüngster Zeit als attraktive Träger für die Verabreichung von Nukleinsäuren herausgestellt.

Hier haben wir ein solches argininreiches neurotropes Peptid verwendet, das eine ladungsbasierte Komplexierung mit dem LNA durchlaufen kann, das bei Verabreichung in den systemischen Kreislauf seinen vorgesehenen Zielort erreicht, in diesem Fall neuronale Zellen, und eine ordnungsgemäße Freisetzung des LNA in diese Zellen gewährleistet. Die Sequenzen der ME 29-Familienmitglieder wurden aus mease entnommen und der 16 MER-Antisense wurde mit Lock-Nukleinsäuremodifikationen an fünf gleichmäßig verteilten Positionen synthetisiert, um Komplexe vorzubereiten. Die Peptid- und Antigo-Lösungen in geeigneten Konzentrationen wurden separat in steriler 10%iger Glukose hergestellt.

Unter aseptischen Bedingungen. Die Antigo-Lösung wurde unter leichtem Rühren langsam tropfenweise zur Peptidlösung gegeben. Langsame Zugabe und sanftes Rühren sind entscheidend für die Bildung von monodispergierten Komplexen, deren Größe in der tric-Skala liegt.

Das Antigo wurde jedes Mal in drei gleichen Teilen zugegeben, so dass eine Minute zum Mischen zur Verfügung stand, gefolgt von einer Minute Inkubation ohne Mischen. Eine schnelle Zugabe kann zur Aggregation der Komplexe und zur Ausfällung führen. Der Antigo-Komplex ist jetzt bereit für die Injektion.

Der Komplex wurde durch eine Schwanzveneninjektion verabreicht. Die Mäuse wurden in denselben Käfig zurückgebracht. Verhaltenstests für Ataxie wurden täglich, drei Stunden nach der Injektion, durchgeführt.

Die Maus wurde an ihrem Schwanz festgehalten, so dass sie keine umliegenden Objekte berühren konnte. Achte darauf, wie die Hintergliedmaßen 10 Sekunden lang gespreizt sind. Im Kantentest mussten die Mäuse an der dünnen Kante des Käfigs entlanglaufen.

Die Mäuse laufen durch einen dünnen Kanal und hinterlassen Fußabdrücke mit eingefärbten Füßen auf einem Streifen aus dickem, saugfähigem Papier, nur die Hinterfüße. Um verwirrende Daten von vier Gliedmaßen zu vermeiden, sehen wir uns die Wirkung der Antigo-Behandlung an. Wir isolierten das Gehirn und andere Gewebe von den behandelten und kontrollierten Mäusen.

Wir fanden heraus, dass das R-VG-Peptid eine fluoreszenzmarkierte siRNA spezifisch an das Gehirn lieferte, aber nicht an andere Gewebe wie die Leber. Ein nicht-neurotropes Kontrollpeptid RVM lieferte die siRNA an die Leber. Mäuse, die mit ANTIER 29 behandelt wurden, zeigten Defekte in den Hintergliedmaßen.

Kontrollierte Mäuse, die mit einem verschlüsselten Anme behandelt wurden, konnten die Kante überwinden, aber nach der Behandlung mit Anme gegen MARE 29 zeigten die Mäuse leichte Defekte in diesem Assay. Im footprint Assay zeigte sich bei den behandelten Mäusen eine auffällige Verkürzung der Schrittlänge. Darüber hinaus haben wir durch QR tpcr bestätigt, dass die Spiegel von mid 29 A und mid 29 B für die Entwicklung von micro NNA-basierten Therapeutika herunterreguliert wurden.

Die gehirnspezifische Verabreichung von anti-microRNAs ist aufgrund der Blut-Hirn-Schranke eine Herausforderung. Mit der hier vorgestellten Technik können wir die herkömmliche Verabreichungsmethode von Anti-microRNAs an das Gehirn vermeiden. Diese Methode macht den Knockdown von microRNAs technisch machbar und erhöht die Gewebespezifität.