Name: Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur hirnspezifischen miRNA-Knockdown bei Mäusen mittels zellpenetrierendem Peptid und Antagomir. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen ohne stereotaktische Injektion.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Souvik Maiti für die Hilfe bei der Gestaltung der Antagomire. Wir danken auch Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey und Bijay Pattnaik für ihre Hilfe bei experimentellen Methoden. Diese Arbeit wurde vom Rat für wissenschaftliche und industrielle Forschung (BSC0123) finanziert. HS, MV und RR erhalten ein Stipendium des Council of Scientific and Industrial Research, Indien. Die MAS erkennt das Stipendium der University Grants Commission, Indien, an.

Hinweis: Alle Verfahren einschließlich Tier Themen wurden von Institutional Tiere Ethikkommission (IAEC) am Institut für Genomik und Integrative Biologie, Neu-Delhi genehmigt worden (IGIB / AEC / 10/2013). Dieses Protokoll ist speziell für die gezielte Abgabe Antagomir-29 im Gehirn und Knockdown von miR-29 eingestellt. 1. Antagomir Design Strategy <ol><li> Rufen Sie die reife miRNA-Sequenz aus miRBase 11 <a href="http://www.mirbase.org/">(http://www.mirbase.org/).</a> </li><li> Rufen Sie den Sequenzen verwandter miRNA Familienmitglieder über den Link &quot;Gene Family&quot; in der miRBase Rekord <a href="http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009">(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).</a> </li><li> Reverse Komplement der Sequenz: <a href="http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html">http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html</a> bietet ein komfortables Werkzeug zurreverse Komplement-Sequenzen. </li><li> Markieren Sie die Positionen, die von LNA geändert werden mit Hilfe der folgenden Richtlinien: <ol><li> Wählen Thyminreste 3-4 Basen auseinander für den LNA Modifikation platziert, da LNA Pyrimidine sind stabiler als Purine 12. </li><li> Wählen Cytosinreste um 3-4 Reste getrennt, wenn vorhergehenden Schritt erzeugt weniger als fünf Modifikationen. </li><li> Priorisieren der fünf Modifikationen am 5&#39;-Ende des antagomir, da die Saat-Sequenz vermieden wird. </li></ol></li></ol> 2. Antagomir-Neuropeptid Complex Vorbereitung Anmerkung: Dies ist der wichtigste Schritt im Protokoll und Standardisierung muss. Um das Protokoll zu jeder fluoreszenzmarkierte Oligonucleotid (FLO) kann anstelle des antagomir 9 verwendet werden standardisieren. Die Peptide sollten von hoher Reinheit sein (HPLC-Qualität, 98% Reinheit) .Sequences und Ladung des Peptids und antagomir sind in Tabelle 1 angegeben. <ol><li> Entscheiden Sie, die Anzahl der moles von antagomir bezogen auf molare Ladung auf antagomir, seiner Toxizität und Gewicht der Maus injiziert werden. Berechnen Sie die Anzahl der Mole des Peptids injiziert basieren auf molare Ladungsverhältnis von Antagomir: Peptid. HINWEIS: Standardisieren molaren Ladungsverhältnis von Antagomir: Peptid zur Toxizität und effektive Bereitstellung im Gehirn der Maus. Verwenden Sie unterschiedliche molare Ladungsverhältnissen von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid: Peptids zur Standardisierung. Wir fanden, dass Antagomir-29 und Kontrolle waren beide bei 4microgram / Gramm Körpergewicht der Maus giftig. Antagomir-29 und Kontrolle wurden bei 2microgram / Gramm Körpergewicht verwendet, aber das effektive Konzentration dürfte für jeden microRNA variieren. </li><li> Verdünnen des Peptids und antagomir in getrennten Mikrozentrifugenröhrchen aus Stammlösungen mit steriler 10% D-Glucose auf die gewünschte Endkonzentration in Schritt 1 berechnet. </li><li> Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Peptid-Lösung auf einem Vortex bei moderaten Vortexen Geschwindigkeit. </li><li> In 1/3 der einentagomir Lösung der Peptidlösung Rohr langsam tropfenweise, während es wird gründlich auf einem Vortex-Mischer gemischt. </li><li> Setze das Mischen der Lösungen auf dem Vortex für den nächsten 1 min und dann lassen Sie die Mischung für 1 min stehen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4 und 5 zwei weitere Male um den verbleibenden antagomir Lösung mit der Peptidlösung in die gleiche Mikrozentrifugenröhrchen gemischt. Langsame Zugabe ist kritisch für die Bildung von monodispersen Komplexe, die wirksam bei der Transfektion. Schnelle hinaus kann die Aggregation der Komplexe und deren Niederschlag führen. </li><li> Inkubieren des Komplexes für 30 min bei RT ohne Verwirbelung. Während dieser Zeit der Inkubation akklimatisieren die Mäuse ins Labor, wo Injektionen durchgeführt. </li></ol> 3. Schwanzveneninjektion von Antagomir-Neuropeptid-Komplex <ol><li> Um das Tier zurückzuhalten, die Maus in einem Verzögerer oder decapicone der richtigen Größe. </li><li> Reinigen Sie die Oberfläche des Schwanzes mit Wattestäbchen pre getränkten in warmem Wasser (ca. 40 ° C). Dies wird Vasodilatation fördern und erhöhen die Sichtbarkeit der Vene. </li><li> Nähern Sie sich dem Schwanz mit einem kleinen Volumen (0,5 bis 1,0 cc) Insulinspritze in einem 15-20 ° -Winkel. Darauf achten, dass keine Luft in die Spritze einzuführen. Beginnen an dem distalen Abschnitt des Schwanzes. Spritzen Sie die Anlage. Entfernen Sie die Nadel und wenden eine antiseptische Tupfer direkt an der Injektionsstelle (etwa 5-10 sec), um Blutungen zu stoppen. </li><li> Ersetzen Sie die Maus in einem individuell belüfteten Käfig in der Gruppe von 3-5, mit dem Maiskolben und Tissue-Papier als Bereicherung. Injizierten und injizierten Mäusen halten Sie nicht in demselben Käfig. </li></ol> 4. Verhaltens Assays Hinweis: Bewahren Sie die Zeitspanne von 3-4 Stunden zwischen Injektion und Verhaltenstests zur Erholung nach der Injektion zu ermöglichen. Bringen Sie die Maus, um ein ruhiges Zimmer. In dieser Zeit der Eingewöhnung der Tiere nicht stören. <ol><li> Akklimatisieren Sie die Maus auf dieneuer Raum für 30 Minuten und starten Sie dann die folgenden Verhaltenstests. Halten Sie einen Abstand von 10 Minuten zwischen den einzelnen Verhaltenstest. </li><li> Hinterlauf clasping: HINWEIS: Dieser Test zeigt, motorische Störungen und neurologischen Störungen. <ol><li> Heben Sie die Maus sanft, indem in der Nähe Basis des Schwanzes im klaren Hintergrund. </li><li> Überprüfen Sie die hinteren Gliedmaßen Position für 10-15 Sekunden. Wildtyp-Maus spreizt Hinterbeine von Bauch, während eine ataktische Maus neigt dazu, eine oder beide Hinterbeine in Richtung des Bauches mehr als 50% der Zeit ausgesetzt 13 zurückzuziehen. </li><li> Bringen Sie die Maus, um den Käfig </li></ol></li><li> Ledge-Test: <ol><li> Heben Sie die Maus vorsichtig, indem Sie den Schwanz und halten Sie auf dem Sims eines Käfigs. </li><li> Beachten Sie die Maus, die speziell auf die Ecke des Käfigs. Wildtyp-Maus können Sie die Ecken problemlos ohne Angst und verlieren das Gleichgewicht. Ataktische Maus verliert sein Gleichgewicht, einfrieren oder schüttelt bei einem Spaziergang entlang des Käfigs Leiste und an den Ecken. </li></ol></li><li&gt; Mouse Fußdruck Assay: HINWEIS: Für diesen Test halten die Absorptionslage bereit, auf dem Boden einer schmalen Landebahn (~ 70 cm langen, ~ 5 cm breit mit ca. 5 cm hohe Wände.) <ol><li> Halten Sie die Maus sanft mit einer Hand und wenden Tinte auf den Hinterbeinen mit einem Pinsel. </li><li> Legen Sie die Absorptionsschicht auf dem Boden einer schmalen Landebahn. </li><li> Lassen Sie Maus zu gehen oder laufen über eine Absorptionsschicht in einer geraden Linie in einer Start- und Landebahn von einem Ende zum anderen. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal mit jeder Maus mit frischen Absorptionslage. </li><li> Den Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Schritten in der Vorwärtsbewegung. Fügen Sie keine ersten und letzten paar Fußspuren, wo das Tier ist nur die Einleitung und Beendigung ihrer Sicht sind. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+novel+therapeutic+targets+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases.</a> Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).</li>
<li>Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA%3A+Implications+for+Alzheimer+Disease+and+other+Human+CNS+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders.</a> Current Genomics. 10, 154-168 (2009).</li>
<li>Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+Disease+and+Potential+Therapeutic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications.</a> Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).</li>
<li>Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Promise+of+MicroRNA+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">The Promise of MicroRNA Replacement Therapy.</a> Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).</li>
<li>Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microRNA+function+by+antimiR+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Silence%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides.</a> Silence. 3, 1-17 (2012).</li>
<li>Trang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Delivery+of+Tumor+Suppressor+microRNA+Mimics+Using+a+Neutral+Lipid+Emulsion+Inhibits+Lung+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice.</a> Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).</li>
<li>Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+Injection+of+MicroRNA-expressing+Lentiviruses+to+the+Mouse+Hippocampus+CA1+Region+and+Assessment+of+the+Behavioral+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome.</a> J Vis Exp. (76), e50170(2013).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39-43 (2007).</li>
<li>Roshan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-specific+knockdown+of+miR-29+results+in+neuronal+cell+death+and+ataxia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice.</a> RNA. 20, 1287-1297 (2014).</li>
<li>Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+DNA%E2%88%92RNA+Heteroduplex+Formation%3A+Effects+of+Locked+Nucleic+Acid+Nucleotides+Incorporated+into+the+DNA+Strand%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand.</a> Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).</li>
<li>Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+Chemistry+and+Therapeutic+Applications+of+Locked+Nucleic+Acid+%28LNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA).</a> Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).</li>
<li>Guyenet, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Composite+Phenotype+Scoring+System+for+Evaluating+Mouse+Models+of+Cerebellar+Ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia.</a> J. Vis. Exp. (39), (2010).</li>
<li>Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+Approaches+for+Neuronal+Delivery+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids.</a> Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).</li>
<li>Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Penetrating+Peptide-Mediated+Therapeutic+Molecule+Delivery+into+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System.</a> Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).</li>
<li>Hwang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brain-targeted+rabies+virus+glycoprotein-disulfide+linked+PEI+nanocarrier+for+delivery+of+neurogenic+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA.</a> Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier demonstrieren wir eine allgemein zugängliche Methode, um die Auswirkungen der miRNA-Modulation zu untersuchen. Derzeit beinhalten die meisten Versuche zur In-vivo-Charakterisierung von miRNA-Funktionen die Schaffung von Knockout-Mäusen oder eines Transgenen, das einen miRNA-Schwamm exprimiert. Die meisten miRNAs, auch die zelltypspezifischen, werden in mehr als einem Organ exprimiert. Zum Beispiel werden miRNAs, von denen ursprünglich angenommen wurde, dass sie spezifisch für das hämatopoetische System s...

MicroRNAs sind als neue therapeutische Targets aufgrund ihrer universellen Rolle bei der Regulation der Genexpression und direkte Beweise für die Beteiligung an der Krankheit entstanden. MiRNAs werden aktiv auf ihr Potenzial untersucht, wie Drogen-Ziele 1,2. Ferner werden Veränderungen der miRNA-Expression mit verschiedenen Krankheiten 3 und Simulation dieser Veränderungen durch künstliche Störung der miRNA-Expression verbunden sind, können verwendet werden, um die zelluläre Signalwege in Krankheitsmanifestation beteiligt untersuchen. Gewebespezifische Lieferung von miRNA gezielt Medikamente ist derzeit eine der größten Herausforderungen für die miRNA-basierte Wirkstoffentwicklung. Antagomirs und miRNA-Mimetika sind vielversprechend Mittel zum Stören miRNA Ebenen 4-6. Spezielle Funktionen, die ihre Spezifität und Wirksamkeit erhöhen, weisen jedoch in der Gestaltung der Antagomirs eingebaut werden, bevor sie für die in vivo Störung der miRNA-Expression verwendet werden. MicroRNAs sind besonders relevant,<html> als Ziele in derzeit unheilbaren neurodegenerativen und neuroentwicklungs Krankheiten. Die Blut-Hirn-Schranke stellt eine Beschränkung für die Lieferung von Antagomirs im Gehirn. Stereotaktische Injektionen sind weit verbreitet in Nagetiermodellen verwendet werden, um Moleküle an bestimmten Stellen im Gehirn 7 zu liefern. Es erfordert Geschick, umfangreiche Investitionen in der Instrumentierung und Zeit. Stereotaktische Injektionen sind invasive, umfassen Chirurgie, führen zumindest leichten Verletzungen und an lokale Auslieferung beschränkt. Die Verwendung von Zelldringenden Peptide mit einer Vorliebe für die Ausrichtung Neuronen können diese Einschränkungen zu begegnen, da sie durch die trans-Kreislauf-Strecke geliefert werden, sondern durchbrechen die Bluthirnschranke. Solch ein Peptid aus der Rabies Virus Glycoprotein (RVG) abgeleitet ist, wurde zuvor verwendet, um siRNA gegen Japanische Enzephalitis-Virus bei Mäusen 8 zu liefern. Wir haben festgestellt, dass unter Verwendung des Peptids für Antagomir Lieferung, miRNAs kann wirksam sein niedergeschlagen im Gehirn der Maus 9. NHALT &quot;&gt; Die zweite große Herausforderung der miRNA knock-down ergibt sich aus der geringen Größe der miRNAs und das Vorhandensein von eng verwandten Sequenz Isoformen. Wir nehmen das Beispiel des MMU-miR-29-Familie, die aus drei eng verwandte Isoformen besteht, miR-29a , b und c. Antagomire sind auch allgemein entlang der Hauptkette modifiziert werden, um ihre Stabilität zu erhöhen und machen sie beständig gegenüber Nukleasen angreifen. Locked Nucleic Acids (LNAs) bieten einen weiteren Vorteil, dass sie verbessern die thermische Stabilität und sogar dazu führen, um den Abbau über und jenseits Ziel sterische Hinderung. 10 Einführung Änderungen entlang der Hauptkette kann wirksam, aber teuer sein. Wir haben bereits gesehen, daß Modifikationen über eine optimale Anzahl kann nicht weiter die Wirksamkeit. Die Gestaltung des antagomir beinhaltet daher die optimale Änderung der antagomir. Um die komplexen Antagomir nicht-kovalent mit dem neurotropen Peptid, einem geladenen Hepta- zu nona-Arginin-Erweiterung verwendet wird. D-ArgininRückstände werden verwendet, da sie eine höhere Stabilität zu verleihen, da sie nicht anfällig für eine Spaltung durch Proteasen. Hepta- zu nona-Arginin Strecken wirken als effiziente Zellpenetrationsmittel, obwohl sie Behandlungen nicht die Zelltyp-Spezifität. Durch kovalente Verknüpfung der RVG-Peptid an die nona-Arginin-Linker, einem neurotropen, Zelle eindringende Peptid generiert wurde. Die positiv geladenen Reste des Peptids in Wechselwirkung mit der negativ geladenen Nukleinsäure Rückgrat, um Komplexe zu bilden. Diese Komplexe können verwendet werden, um DNA oder RNA effektiv transfizieren in kultivierten Zellen und in vivo in das Gewebe wird.

<table><tbody><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restrainer oder Decapicone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schmale Start- und Landebahn</td><td></td><td></td> <td>~ 70 cm lang, ~ 5 cm breit mit ~ 5 cm hohen Wänden.</td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide (siGLO)</td><td>GE Healthcare Dharmacon INC</td><td>D0016300120</td><td></td></tr><tr><td>10% sterile D-Glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antagomir-29</td><td>Exiqon</td><td>Custom Synthesis</td><td></td></tr><tr><td>Antagomir-Control</td><td>Exiqon</td><td>Custom Synthesis</td><td></td></tr><tr><td>Neuropeptide</td><td>RVG G.L.Biochem ( Shanghai) Ltd.</td><td>kundenspezifische Synthese</td><td>>98% Reinheit</td></tr><tr><td>Neuropeptid RVM</td><td>G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td>Kundenspezifische Synthese</td><td>>98% Reinheit</td></tr><tr><td>Andere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baumwolle Warmes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saugfähige Blätter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tinte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinsel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptisch</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache alternative zur stereotaktische injektion für hirnspezifische knockdown von mirna

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) sind Schlüsselregulatoren der Genexpression. Im Gehirn hängen lebenswichtige Prozesse wie die neurologische Entwicklung und neuronale Funktionen von der korrekten Expression von microRNAs ab. Die Störung von microRNAs im Gehirn kann genutzt werden, um neurodegenerative Erkrankungen zu modellieren, indem der neuronale Zelltod moduliert wird. Derzeit wird die stereotaktische Injektion verwendet, um miRNA-Knockdown-Wirkstoffe an eine bestimmte Stelle im Gehirn zu bringen. Hier diskutieren wir Strategien zum Design von Antagomiren gegen miRNA mit gesperrten Nukleotidmodifikationen (LNA). Beschreiben Sie anschließend eine Methode zur gehirnspezifischen Verabreichung von Antagomiren, einheitlich über verschiedene Regionen des Gehirns. Diese Methode ist einfach und breit anwendbar, da sie die Operation, die damit verbundene Verletzung und die Einschränkung der lokalen Verabreichung bei stereotaktischen Injektionen überwindet. Wir haben einen Komplex aus neurotropem, zellpenetrierendem Peptid Tollwutvirus-Glykoprotein (RVG) mit Antagomir gegen miRNA-29 hergestellt und durch die Schwanzvene injiziert, um es spezifisch im Gehirn zu verabreichen. Das Antagomir-Design enthielt Merkmale, die ein spezifisches Targeting der miRNA und die Bildung nicht-kovalenter Komplexe mit dem Peptid ermöglichen. Der Knock-down der miRNA in neuronalen Zellen führte zum apoptotischen Zelltod und damit verbundenen Verhaltensstörungen. Somit kann die Methode für akute Modelle der Neurodegeneration durch die Störung von miRNAs verwendet werden.

Unter Verwendung der hier vorgestellten Verfahren, Komplexe von 50microgram fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid (FLO) und ~ 850microgram RVG-Peptid von 1:15 molaren Ladungsverhältnis: wurden (FLO Peptid) hergestellt und nur einmal durch Schwanzvene injiziert. Komplexe von nicht-neurotropen Rabies Virus Matrix (RVM) Peptid und FLO wurde als Lieferkontrolle verwendet. Am nächsten Tag, Mäuse Gehirn und Leber wurden isoliert und Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt. Die Zellen wurden unter dem Mikroskop für grüne Fluo...

MicroRNAs spielen eine entscheidende Rolle im Gehirn und sind potenzielle Ziele für die Modellierung der Neurodegeneration. Die Störung des miRNA-Spiegels ist jedoch aufgrund der kurzen Länge der miRNA und der Unzugänglichkeit des Hirngewebes eine Herausforderung. Dieses Video stellt eine Methode für das Antagomir-Design und die gehirnspezifische Verabreichung unter Verwendung eines Neuropeptids bei Mäusen vor.

Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Hier zeigen wir die Verwendung eines zellpenetrierenden Peptids zusammen mit einem modifizierten Antisense-Oligonukleotid, um spezifisch die Mikro-RNA im Gehirn von Mäusen herunterzuregulieren. Dies wurde durch die Entwicklung eines Antigo gegen den 29. Mai erreicht. In dieser Studie haben wir Antigo-Männchen verwendet, um Mikro-RNAs mit Locked-Nucleic-Acid-Modifikationen gezielt anzusteuern.Das bedeutet, dass LNA-Modifikationen an fünf verschiedenen Positionen eingefügt wurden. Dabei verstärkt die Einfügung von LNA-Modifikationen die Bindungsaffinität zum Mikro-RNA. Außerdem verleiht sie Nukleus-Resistenz und erhöht somit die Effizienz der Mikro-RNA-Zielgerichtetheit.Komplexe des ANTIGO MAR mit dem Peptid wurden in vitro hergestellt und den Mäusen über die Schwanzvene injiziert. Die Herabregulierung der Mikro-RNA führte zu Verhaltensänderungen, die auf eine Beteiligung dieser Mikro-RNA an der Ataxie hindeuten; drei aufeinanderfolgende Injektionen reichten aus, um nach der Behandlung eine bemerkbare Gangstörung hervorzurufen. Anschließend wurde Gehirngewebe gesammelt und die Herabregulierung der Mikro-RNA bestätigt. Zellpenetrierende Peptide (CPPs) oder selbstpenetrierende Peptide haben sich kürzlich als attraktive Trägersysteme für die Nukleinsäureabgabe etabliert.Hier haben wir ein solches argininreiches neurotrope Peptid verwendet, das aufgrund seiner Ladung eine Komplexierung mit der LNA eingehen kann. Nach Verabreichung in den systemischen Kreislauf erreicht es die vorgesehenen Zielzellen – in diesem Fall neuronale Zellen – und sorgt für eine gezielte Freisetzung der LNA in diese Zellen. Die Sequenzen der ME-29-Familienmitglieder wurden aus mease abgerufen, und die 16 MER-Antisense-Stränge wurden mit Lock-Nucleic-Acid-Modifikationen an fünf gleichmäßig verteilten Positionen synthetisiert, um die Komplexe herzustellen. Die Peptid- und Antigo-Lösungen in geeigneten Konzentrationen wurden separat in steriler 10 %iger Glukose hergestellt.Unter aseptischen Bedingungen wurde die Antigo-Lösung langsam tropfenweise unter leichtem Rühren zu der Peptidlösung gegeben. Eine langsame Zugabe und ein sanftes Rühren sind entscheidend für die Bildung monodisperser Komplexe mit einer Größe im Tric-Bereich.Das Antigo wurde dreimal in jeweils gleichen Teilen zugegeben, wobei jeweils eine Minute zum Mischen und anschließend eine Minute zur Inkubation ohne Mischen eingeplant wurden. Eine schnelle Zugabe kann zur Aggregation der Komplexe und zur Ausfällung führen. Der Antigo-Komplex ist nun bereit zur Injektion.Der Komplex wurde über eine Schwanzveneninjektion verabreicht. Die Mäuse wurden in denselben Käfig zurückgebracht. Täglich wurden drei Stunden nach der Injektion Verhaltensanalysen auf Ataxie durchgeführt.Die Maus wurde am Schwanz festgehalten, sodass sie keine umgebenden Gegenstände berühren konnte. Achten Sie darauf, wie die Hintergliedmaßen 10 Sekunden lang gespreizt werden. Beim Leisten-Test mussten die Mäuse entlang der schmalen Leiste des Käfigs laufen.Die Mäuse laufen durch einen engen Kanal und hinterlassen mit angefärbten Füßen Abdrücke auf einem Streifen dickes saugfähiges Papier; dabei werden nur die Hinterfüße eingefärbt. Um Verwechslungen der Daten aus vier Gliedmaßen zu vermeiden, betrachten wir die Wirkung der Antigo-Behandlung. Wir isolierten das Gehirn und andere Gewebe aus den behandelten und kontrollierten Mäusen.Wir fanden heraus, dass das R-VG-Peptid ein fluoreszenzmarkiertes siRNA-spezifisch ins Gehirn, aber nicht in andere Gewebe wie die Leber, transportierte. Ein nicht neurotropes Kontrollpeptid RVM beförderte die siRNA in die Leber. Mäuse, die mit ANTIER 29 behandelt wurden, wiesen Defekte in den Hinterbeinen auf.Mäuse mit kontrollierter Griffkraft, die mit einem zufällig geordneten anme behandelt wurden, konnten die Kante überqueren, doch nach Behandlung mit einem anme gegen MARE 29 zeigten die Mäuse leichte Defizite in diesem Test. Beim Abdrucktest war bei den behandelten Mäusen eine deutliche Verkürzung der Schrittlänge zu beobachten. Zusätzlich bestätigten wir mittels qR tpcr, dass die Spiegel von mid 29 A und mid 29 B herunterreguliert waren, für die Entwicklung von mikro NNA-basierten Therapeutika.Die gezielte Abgabe von Anti-Mikro-RNAs im Gehirn ist aufgrund der Blut-Hirn-Schranke eine Herausforderung. Mithilfe der hier vorgestellten Technik können wir die herkömmliche Abgabemethode von Anti-Mikro-RNAs an das Gehirn umgehen. Diese Methode macht die Herunterregulation von Mikro-RNAs technisch machbar und erhöht die Gewebespezifität.

a-simple-alternative-to-stereotactic-injection-for-brain-specific

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein Verfahren, durch welches die Genexpression in der Neuralrohr sein herunterreguliert kann in einem Zelltyp-spezifische, nachvollziehbar beschrieben. Wir zeigen,...

In ovo Elektroporation von miRNA-basierte Plasmide in der Entwicklung von Neuralrohr und Beurteilung der Phänotypen von DiI Injection in Open-book Vorbereitungen

Quelle: Ullah, I., et.al. Ein Positionierungsgerät für die Platzierung von Mäusen während der intranasalen siRNA-Abgabe an das zentrale Nervensystem. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt eine präzise intranasale Verabreichungstechnik zur Verabreichung von Neuronen-targeting-Peptid-siRNA-Komplexen an das Gehirn von Mäusen unter Verwendung eines speziellen Positionierungsgeräts. Anästhesierte Mäuse werden in einer Kopf-und-Vorwärts-Position fixiert, um die siRNA-Inhalation zu optimieren und...

Intranasale Verabreichung von siRNA an das Gehirn von Mäusen mit Hilfe eines Positionierungsgeräts

MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung...

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Hier beschreiben wir die Lieferung von MicroRNA verwenden ein rekombinantes Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 in einem Mausmodell der neuromuskulären Erkrankungen. Eine einzelne periphere Verabreichung bei Mäusen führte zu nachhaltigen MiRNA Überexpression in Muskel und motorischen Neuronen, bietet eine Möglichkeit, MiRNA Lernfunktion und therapeutische Potenzial in Vivo.

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

Dieses Protokoll enthält einen Workflow, künstliche MicroRNA-vermittelten RNA-Interferenz mit Optogenetik Förderung insbesondere präsynaptischen Boutons mit reduzierten Expression von selektiven-Gens in intakte neuronale Schaltkreise zu kombinieren.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

Gewebe-spezifische MicroRNA-Hemmung ist eine Technologie, die im Feld MicroRNA unterentwickelt ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um erfolgreich die MiR-181 MicroRNA-Familie in Myoblast Zellen aus dem Herzen zu hemmen. Nanovector-Technologie wird verwendet, um eine MicroRNA Schwamm zu liefern, die erhebliche in Vivo Cardio-spezifische MiR-181 Familie Hemmung zeigt.

In Vivo Nanovector Lieferung von einem Herz-spezifische MicroRNA-Schwamm

Hier stellen wir ein Protokoll mit einem Maus-Positionierungsgerät vor, das die angemessene Platzierung von Mäusen für die intranasale Verabreichung einer hirngezielten Peptid-SiRNA-Formulierung ermöglicht, die eine effektive Gen-Silencing im zentralen Nervensystem ermöglicht.

Ein Positionierungsgerät für die Platzierung von Mäusen während der intranasalen siRNA-Lieferung an das Zentrale Nervensystem

Hier wird ein Protokoll zur Charakterisierung von Modulen biologisch synergistischer miRNAs und deren Montage in kurze Transgene beschrieben, das eine gleichzeitige Überexpression für Gentherapieanwendungen ermöglicht.

Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs in Glioblastom und deren Engineering in künstliche Cluster für die Gentherapie

Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Cluster-Clustered-Regular-Interspaced-Short-Palindromic-Repeats-Gen-Editing-Workflow für die microRNA-Cluster-Netzwerkanalyse, der die schnelle Generierung eines Panels genetisch veränderter Zelllinien mit einzigartigen miRNA-Cluster-Deletionskombinationen von bis zu 35 kb innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.

CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

Lernen Sie eine Methode zur hirnspezifischen miRNA-Knockdown bei Mäusen mittels zellpenetrierendem Peptid und Antagomir. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen ohne stereotaktische Injektion.

Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA

Weitere Videos entdecken