Name: Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Lernen Sie die Intravitalmikroskopie zur Beobachtung von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Leukozyten-Dynamik unter Ruhe- und Entzündungsbedingungen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von EMBO (zu Y.E.), Foundation Machaon (zu Y.E.) und SNF (zu B.A.I.). Wir danken der Bioimaging Core Facility für die Verfügbarkeit des Nikon A1r Mikroskops und die technische Unterstützung. Wir danken Frau Clarissa Bartley für die Korrektur ins Englische.

HINWEIS: Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der institutionellen Ethikkommission der Animal Care in Genf, die Schweiz und die kantonalen Veterinäramt durchgeführt. Zulassungsnummer GE / 63/14. 1. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus dem Knochenmark <ol><li> Sacrifice Maus (8-12 Wochen alt) durch Genickbruch. Sterilisieren Sie die Hinterbeine mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Haut vor den Hinterbeinen. </li><li> Sezieren Maus Oberschenkelknochen und Schienbeinknochen und Gewebe zu entfernen von den Beinen mit einem Skalpell. Beine mit 90% Ethanol und Ort Spülen in eine Kulturschale mit PBS gefüllt. </li><li> Unter dem Kultur Kapuze, sauberen Tuch ab Oberschenkelknochen und Schienbeine mit einem Skalpell und separatem am Kniegelenk. Abgeschnitten jedes Ende der Knochen. </li><li> Flush Knochenmark aus jedem Knochen Verwendung einer 23G Nadel und einer 1 ml Spritze mit Präparationsmedium (Phenolrot-freiem DMEM / F12, 1% Rattenserum) gefüllt ist, in einen 50 ml Schneckenrohr. Stören Zellaggregate durch zart Passage durch die 23G needle und eine 1 ml-Spritze. Bringen Gesamtvolumen auf 25 ml mit Präparationsmedium. </li><li> Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C. Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml Lyse der roten Blutkörperchen RBLC Puffer (8,3 g NH 4 Cl, 1 g NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), vollständig auf 1 l mit destilliertem Wasser, das Filter von 0,22 um) in einem 15 ml Schraubenrohr. Inkubieren Sie 30 Sekunden auf Eis. </li><li> 10 ml Herstellungsmedium und Zentrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendieren in 2 ml Herstellungsmedium. </li></ol> 2. Neutrophilen-Anreicherung durch negative Selektion <ol><li> Fügen Sie 150 ul Maus-Neutrophilen-Anreicherungscocktail (Zellisolation Plattform-Kit wie EasySep). Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> 10 ml Phenolrot-freiem DMEM. Kehren Sie sofort und Zentrifuge 250 xg, 3 min, 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen. Pellet in 1,75 ml Herstellungsmedium in 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Fügen Sie 250 ul Biotin Auswahl Cocktail. Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> Mischen Sie den magnetischen Partikeln (aus der Zellisolation Plattform-Kit) für 30 Sekunden, um Partikel zu resuspendieren. Gib 500 &amp; mgr; l magnetischen Teilchen an Zellen in Suspension. Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> Das Röhrchen wird in den Magneten. 3 min warten. </li><li> Kehren Sie die Magneten auf eine neue 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen, um die gewünschten unmarkierten Zellen zu sammeln. Nehmen Sie nicht den letzten Tropfen hängen in der Röhre. Unerwünschte Zellen wird in dem Rohr innerhalb des Magneten bleibt. Entsorgen Sie diesen Schlauch in einem biohazard Abfälle. </li><li> Setzen Sie die neue Röhre in den Magneten. 3 min warten. </li><li> Kehren Sie die Magneten auf ein neues 15 ml Schraubenrohr, um die gewünschten unmarkierten Zellen zu sammeln. Nehmen Sie nicht den letzten Tropfen hängen in der Röhre. </li><li> Komplette Volumen auf 5 ml mit Phenolrot-freiem DMEM. </li></ol> 3. Kennzeichnung von Neutrophilen <ol><li> Mit 0,5 ul einer orangen Farbstoff wie Zell Tracker Orange (Arbeitskonzentration1 &amp; mgr; M, CMRA - Chlormethyl-Rodol-Acetat, Lager 10 mM in DMSO). Inkubieren 2 min bei 37 ° C. </li><li> In 2,5 ml Herstellungsmedium. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml Herstellungsmedium in einem 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Einen aliquoten mit Zählkammer zählen. </li><li> Inkubiere 5 min bei 37 ° C. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml PBS. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C zu waschen. </li><li> Überstand verwerfen. Pellet als 10x10 6 Zellen pro 100 &amp; mgr; l PBS. Halten Sie auf Eis, bis iv Injektion. HINWEIS: Die Zellen werden iv injiziert, so schnell wie möglich. 6-12x10 6 Neutrophile / Maus sind in der Regel erhalten. </li></ol> 4. Maus Vorbereitung Intravitalmikroskopie HINWEIS:.. Schritt 4.1) und 4.2) sollte zu Beginn des Experiments durchgeführt, um längere Wartezeit von markierten Neutrophilen zu vermeiden ice. <ol><li> Wiegen Sie die CX 3 CR1 GFP-Maus (8-12 Wochen alt). </li><li> Vorzubereiten 800 ul von Anästhetika (Ketamin 60 mg / kg, Xylazin 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg in PBS). </li><li> Anesthetize Maus. Injektion ip mit 200 &amp; mgr; l / 20 g Maus. Steuer Anästhesie durch Zehen Kneifen und durch Überprüfung der Atemfrequenz. </li><li> Injizieren Neutrophilen (10x10 &amp; sup6; Zellen in 100 ul PBS) intravenös über die laterale Schwanzvene oder den retro-orbitalen Sinus, auf den Komfort des Experimentators. </li><li> Setzen Sie die Maus auf Heizkissen und die Augen mit Augen Gel schützen. </li><li> Ein Deckglas (35 mm Durchmesser) wird in einem 10 cm Gewebekulturschale, die einen Durchmesser von 30 mm Loch setzen. Verwendung Öl wird der Gewebekulturschale in Kontakt mit dem Deckglas zu erhalten. </li><li> Einzuschneiden Bauchhaut mit einer Schere, um das Bauchfell aus. Einzuschneiden Peritoneum mit einer Schere auf Darm freizulegen. </li><li> Zugeben von 200 &amp; mgr; l PBS (auf 37 ° C vorgewärmt) in die peritoneal Höhle. Nehmen Sie die Maus in der Hand und drehen Sie sie nach unten, so dass der Darm steigt aus der Bauchhöhle mit einem sanften Druck. Platzieren Sie die Maus in der Gewebekulturschale. </li><li> Deroll vorsichtig den Darm mit sterilisierten Wattestäbchen auf das Deckglas, um die Mesenterialgefäße aussetzen. </li><li> Schneiden Sie Papiertaschentücher in Bands und benetzen sie mit 37 ° C erhitzt PBS. Immobilisieren den Darm mit den Stücken von Papiertaschentüchern, um die Bewegungen von Peristaltik resultierenden verringern. </li><li> Legen Sie die Gewebekulturschale und die Maus in den 37 ° C temperiert Kammer auf die maßgeschneiderten Fach Stufe der inversen Mikroskop. Einführung einer Spritze mit Betäubungsmittel sc in das Hinterbein. HINWEIS: Zusätzlich kann die Maus Sauerstoff (0,5 L / min) mit einer Maske erhalten. </li><li> Kontroll-Maus für die Anästhesie durch Zehen kneifen und die Kontrolle der Atemfrequenz alle 30 min. Bei Bedarf liefern einen Schub von Anästhetika (20 ul) auf die Anästhesie richtig pflegen. NICHTE: Das Trocknen des Gefäßsystems zu vermeiden. Daher ist seine Feuchtigkeit durch regelmäßige Benetzung der verwendet wird, um den Darm mit 37 ° C wärmten PBS immobilisieren Papiertaschentücher gehalten. </li></ol> 5. Messung der Neutrophilen und Monozyten Verhalten in Entzündete Gefäße in vivo unter Verwendung von Intravitalmikroskopie <ol><li> Set Laser 488- und 561- auf dem niedrigsten Leistungs notwendig, laserinduzierte Phototoxizität zu vermeiden. In unseren Versuchen ist es niedriger als 0,5%. Intensität der GFP in Monozyten und orangen Farbstoff in Neutrophilen ist so hell, dass in der Regel 0,3% ist genug. ANMERKUNG: Dies entspricht einer Laserleistung von 0,15 bis 0,25 mW mit unserem System. </li><li> Erwerben Sie Bilder von 512 x 512 Pixeln (dh 635 &amp; mgr; m) in 2,2 sec mit einem offenen Lochblende unter Verwendung der 20X Trockenziel der inversen Mikroskop. Verwenden Sie einen z-Tiefe zwischen 10 bis 20 um, die eine ausreichende Signal mit den niedrigen Laserleistungen gewährleistet. HINWEIS: Wir in der Regel führen Experimente mit einem z-Tiefe zwischen 12 und 1656; m. Im Falle der dargestellten Zahlen und Filme, die z-Tiefe 20 um. Phasenkontrast ermöglicht die Identifizierung von endothelialen Wandungen und Abbilden auf Mesenterialvenen geführt. Seit patrouillieren Zellen bewegen ganz langsam mit einer Geschwindigkeit von 5 bis 10 &amp; mgr; m / min 6, Aufzeichnung eines Interessengebiet alle 20 sec ist zufriedenstellend. Mit den beschriebenen Einstellungen, ermöglicht es dem Motortisch die Aufnahme von bis zu 7 Interessengebieten gleichzeitig. </li><li> Platzieren Sie die Maus und die Mesenterialgefäße in der Thermostatkammer des Mikroskops werden es ihnen ermöglichen, von der Vorbereitung für 30 Minuten vor dem Erwerb des ersten Films zu erholen. Während dieser Zeit, wählen Sie mehrere Felder in der Umgebung. Konzentrieren sich auf die luminale Oberfläche des Behälters in der Nähe des Ziels. Falls erforderlich, die Vorteile der leichten Autofluoreszenz des Endothels, um den Fokus einzustellen. HINWEIS: Chirurgie während der Maus Vorbereitung etwas betont die Endothel. Folglich rollt von Neutrophilen und/ oder Monozyten in den ersten 15 Minuten nach der Zubereitung der Maus beobachtet werden. </li><li> Nehmen Sie einen ersten Film für 30 min unter stationären Bedingungen, ein Bild alle 20 sec. Hinweis: Die Software übernimmt jedes Interessengebiet in 2,2 s und die Motortisch fährt automatisch von einem Feld zum anderen. Es geht während der 30 min der Aufzeichnungsfilm zurück in die erste Position innerhalb von 20 sec. </li><li> Zur Entzündung der Blutgefäße zu initiieren, einen Tropfen von 20 ul PBS, das 100 ug TLR2 / TLR1 Agonist Pam3CSK4 12 direkt auf die abgebildeten Gefäße. </li><li> Steuern Sie den Fokus für jedes Feld von Interesse. Hinweis: Im Verlauf der Übernahme, es gibt immer geringfügige Änderungen des Fokus auf der z-Achse. Trotz der 10-20 um z-Tiefe kann dies zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führen. Daher manuell jedes Interessengebiet am Ende jedes Films zu konzentrieren, wenn nötig. Nehmen Sie die Videos für 30 Minuten-Zeiträumen und bis zu 3 h auftal nach Beginn der Entzündung. </li><li> Am Ende des Experiments zu opfern anästhesierten Maus durch zervikale Dislokation. </li></ol> 6. Generierung von Filmdateien und Verfolgung von Leukozyten HINWEIS: Die Nikon Erfassungssoftware erzeugt .nd2-Dateien, aber die folgende Vorgehensweise wäre ähnlich mit anderer Software und Marken sein. <ol><li> Export-Dateien als TIFF-Serie. </li><li> Zum ImageJ Software <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">(http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> Importieren Sie das tiff-Serie. Jeder Kanal als eine andere Datei. </li><li> Tragen Sie eine Medianfilter mit einem Radius von 2,0 Pixel für den grünen und roten Kanälen, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren (Process&gt; Filter&gt; Median ...). </li><li> Dateien zu konvertieren in binäre (Process&gt; Binary&gt; Make Binary). Kann die Software den Schwellenwert für jedes Bild zu berechnen. </li><li> Merge-Kanälen zu einem Bild-Serie (Bild&gt; Farbe&gt; Merge Kanäle ...). Wählen Sie die Monozyten im green-Kanal, die Neutrophilen im roten Kanal und das durchgelassene Licht in der Grau Kanals. </li><li> Konvertieren gestapelten Bildern in RGB-Farben (Bild&gt; Farbe&gt; Stapeln zu RGB). </li><li> Datei speichern unter .avi </li><li> Die Daten werden importiert und in Imaris Software (Bitplane) zusammengestellt. Bewegungen von Monozyten und Neutrophile werden dann mit Hilfe der Spot-Tracking-Wizard verfolgt. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die in dieser Handschrift beschriebenen Methoden bieten einen konsistenten Ansatz für Monozyten und Neutrophilen Verhalten effizient studieren in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Erkrankungen. Der entscheidende Schritt der Herstellung ist die Immobilisierung des Darms mit PBS-befeuchtete Tücher. Wenn sie richtig durchgeführt wird, werden Mesenterialgefäße schön auf dem Deckglas für die Bildaufnahme ausgesetzt ist. Dies ermöglicht die Auswahl von mehreren Bereichen von Int...

<html> Neutrophilen und Monozyten sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die kontinuierlich im Blut zirkulieren. Nach Verletzung oder Infektion, Entzündungssignale induzieren Leukozyten-Diapedese in beschädigte und infizierten Geweben, die hierin Initiieren eine zelluläre Immunantwort 1-3. Die Schnelligkeit der Mobilisierung von Leukozyten bestimmt das positive Ergebnis der Immunantworten. Diese komplizierte Prozesse stützen sich auf spezifische Moleküle (zB Selectine, Endothel-gebundenen Chemokine) auf der entzündeten Endothel vorhanden, die für die Einrichtung von Klebe Kontakte zwischen zirkulierenden Leukozyten und dem Endothel 1-3 .Um Erkenntnisse über die Moleküle in der Leukozyten beteiligt Hilfe bekommen Einstellungskaskade ist es wichtig, um die Kinetik der Zellrekrutierung zu visualisieren und das Verhalten der einzelnen Zelle / Population verfolgen. Eine wirksame Methode beinhaltet Intravitalmikroskopie an transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine ​​in Zellen von Interesse. Inhalt &quot;&gt; Bis heute wurden mehrere Ansätze mit Intravitalmikroskopie, um Bild entwickelt das Gefäßsystem 4,5. So wurde beispielsweise bildgebende Ohr Dermis Gefäßsystem oder Mesenterialvenen von Intravital konfokale Mikroskopie verwendet, um das Verhalten der Mäuse-Patrouillen Ly6C niedrigen Monozyten und menschliche identifizieren CD14 dim CD16 + Monozyten auf der luminalen Seite der Blutgefäße unter stationären Bedingungen 6-8. Die Maus Cremaster Gefäßmodell wird häufig verwendet, um das Verhalten von Neutrophilen oder entzündlichen Ly6C Hoch Monozyten unter entzündlichen oder ischämischen Bedingungen in transgenen Mäusen zu überwachen. In der Fall wird Cremaster über intrascrotal Injektion von IL1β, CCL2, TNFß oder fMLP stimuliert. Nach 2-4 Stunden, Gewebe werden dann chirurgisch nach außen verlagert und durch Intravitalmikroskopie 9-11 analysiert konfokalen. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um Monozyten und Neutrophile gleichzeitig mit jedem Monitorinvertierten Fluoreszenz konfokalen Mikroskop. Außerdem Details unserer Methode zur Darstellung von demselben Schiff vor (Beharrungszustand) und nach Entzündungen und wie man die Kinetik der Rekrutierung von Leukozyten zu folgen. Zu diesem Zweck verwenden wir die CX 3 CR1 gfp / wt-Maus, deren Monozyten exprimieren eGFP, IV mit einem orangen Farbstoff-markierten Maus-Neutrophilen injiziert. Unter Verwendung eines invertierten konfokalen Mikroskop ist es möglich, (1) zu verfolgen und zu analysieren, die Patrouillen Ly6C niedrigen Monozyten unter stationären Bedingungen und (2), um die Einstellung beider Monozyten und Neutrophilen im gleichen Gefäß nach dem lokale Entzündung zu folgen. Hier schaffen wir die entzündlichen Erkrankungen mit Hilfe der TLR2 / TLR1 Agonist Pam3CSK4 12. Darüber hinaus können solche Bildern dienen, die die Rolle von spezifischen Molekülen von Interesse in den verschiedenen Schritten der Leukozytenrekrutierung Kaskade bestimmen, ob auf bestimmten Knock-out-Mäusen oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpern 6,9,13 geführt.

<table><tbody><tr><td>5 ml Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x CFI Plan Apochromat 0,45&nbsp; &nbsp; DT: 4mm & nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange CMRA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Maus Neutrophilen-Anreicherungskit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl Typ A</td><td>Nikon</td><td></td><td>alle viskosen Öle</td></tr><tr><td>Life Box Temperaturkontrollsystem</td><td>Life Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R konfokales Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td>inverses Mikroskop, motorisierter x/y/z-Tisch, NIS-Elemente-Software</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>phenolrot frei DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td>Jedes phenolrote freie Medium ist geeignet</td></tr><tr><td>PAM3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>rekonstituiert in PBS</td></tr><tr><td>Rattenserum</td><td>Stammzelltechnologien</td><td></td><td>im EasySep Maus-Neutrophilen-Anreicherungskit</td></tr><tr><td>Gewebekulturschale 100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table> enthalten

abbilden neutrophilen und monozyten in mesenterialvenen von intravitalmikroskopie an narkotisierten ratten in echtzeit

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Effiziente Immunantwort ist abhängig schnelle Mobilisierung von Blut Leukozyten an den Ort der Infektion oder Verletzung. Untersuchung Leukozytenmigration in vivo ist entscheidend für das Verständnis der molekularen Basis der Leukozyten transendotheliale Migration und Interaktion mit Gefäßendothel. Ein leistungsfähiger Ansatz beinhaltet Intravitalmikroskopie an transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine ​​in Zellen von Interesse. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Bildgebung Monozyten und Neutrophilen im CX 3 CR1 gfp / wt-Maus iv mit orangefarbenen Farbstoff markierten Neutrophilen mit einem invertierten konfokalen Mikroskop injiziert. Zeitraffer-Filme gesammelt von 30 Minuten bis zu mehreren Stunden der Bildgebung ermöglicht die Analyse von Leukozyten-Verhalten in Mesenterialvenen unter beiden stationären und entzündlichen Erkrankungen. Wir beschreiben auch die Schritte, um vor Ort zu induzieren Entzündung der Blutgefäße mit TLR2 / TLR1 Agonist Pam3SK4 und Überwachung der subsequent Rekrutierung von Neutrophilen und Monozyten. Die vorgestellte Technik kann auch verwendet werden, um andere Populationen von Leukozyten zu überwachen und zu untersuchen, Moleküle mit anderen Reizen oder transgenen Mäusen in Leukozytenrekrutierung oder Menschenhandel in Verbindung gebracht werden.

Das Manuskript beschreibt ein optimiertes Protokoll einfach das Verhalten von Monozyten und Neutrophilen in den Mesenterialvenen der narkotisierten Mäusen in Echtzeit überwachen. Die Verwendung eines 37 ° C-thermostatisierten Kammer ist obligatorisch, um die Temperatur der Maus erhalten und auch aufgrund der temperaturabhängigen Bewegung der Leukozyten. Vorbereitung der Maus ist in Abbildung dargestellt 1. Abbildung 2 zeigt die ganze Fläche unter dem Mikroskop zu sehen. Durchlicht ermög...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens der intravitale Konfokalmikroskopie besteht darin, die Dynamik von Neutrophilen und Monozyten in mesenterischen Venen unter Ruhebedingungen und entzündlichen Bedingungen bei Mäusen zu überwachen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, beispielsweise nach der molekularen Grundlage der Leukozytenmigration, Rekrutierung und Interaktion mit der vaskulären Endothelzelle. Die Hauptvorteile dieser Technik liegen in der Möglichkeit, das Patrouillieren von LY60-low-Monozyten unter Ruhebedingungen zu verfolgen und zu analysieren sowie die Rekrutierung sowohl von Monozyten als auch von Neutrophilen in dasselbe Gefäß nach lokalen entzündlichen Reizen zu beobachten. Stefan Ler, der Techniker aus dem Labor, wird die Durchführung des Verfahrens demonstrieren. Um eine Einzelzellpräparation aus dem Knochenmark herzustellen, desinfizieren Sie die Hinterbeine einer acht bis zwölf Wochen alten Maus mit 70 %igem Ethanol und entnehmen anschließend mit einem Skalpell die Femora und Tibiae, sobald alle Knochen gelöst sind.Spülen Sie die Beine mit 90 % Ethanol ab und übertragen Sie die Knochen in eine Kulturschale, die mit PBS gefüllt ist. Reinigen Sie anschließend im laminarer Luftstrom mit dem Skalpell die Femora und Tibia und trennen Sie diese am Kniegelenk. Danach schneiden Sie die Enden der Knochen ab und verwenden eine Eins-Milliliter-Spritze, die mit Vorbereitungsmedium und einer 23-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um das Mark aus jedem Knochen in ein 50-Milliliter-Konischgefäß auszuspülen.Lösen Sie die Zellaggregate auf, indem Sie sie erneut durch die Nadelöffnung ziehen, und stellen Sie anschließend das Gesamtvolumen der Zellsuspension mit frischem Präparationsmedium auf 25 Milliliter ein. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie. Suspendieren Sie das Zellmaterial in einem Milliliter Puffer zur Lyse von roten Blutkörperchen und überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen auf Eis. Nach 30 Sekunden beenden Sie die Lyse durch Zugabe von 10 Milliliter Präparationsmedium.Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter Aufarbeitungsmedium, um die Neutrophilen durch negative Selektion anzureichern. Inkubieren Sie die Knochenmarkszellen zunächst 10 Minuten lang auf Eis mit 150 Mikrolitern der Maus-Neutrophilen-Anreicherungslösung.Am Ende der Inkubation werden 10 Milliliter phenolrotfreies DMEM hinzugefügt. Das Gefäß einmal umkehren und die Zellen abzentrifugieren. Den Pellet in 1,75 Millilitern Aufbereitungsmedium resuspendieren und die Zellen in ein 5-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenrohr überführen.Anschließend inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis mit 250 µL Biotin-Auswahlcocktail. Am Ende der Inkubation suspendieren wir die magnetischen Partikel aus dem Zellisolsierungs-Kit durch 30 Sekunden Vortexen. Danach inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis mit 500 µL der Partikel.Am Ende der Inkubation das Gefäß in den Magneten stellen. Nach drei Minuten den Magneten in ein neues, fünf Milliliter fassendes, runde Boden aufweisendes Polystyrolgefäß umstülpen. Um die nicht markierten Zellen zu sammeln, das Gefäß mit den nicht markierten Zellen in den Magneten stellen.Nach drei Minuten das Magnet umkehren und in ein 15-Milliliter-Kegelrohr überführen, um die nicht markierten Zellen zu transferieren, wobei der letzte Tropfen im Rohr verbleibt. Anschließend das Volumen mit frischem, phenolrotfreiem DM auf fünf Milliliter auffüllen. Danach einen halben Mikroliter des geeigneten zytoplasmatischen Farbstoffs, wie hier beispielsweise dem Cell Tracker Orange, zu den Zellen bei 37 Grad Celsius hinzufügen.Nach zwei Minuten waschen Sie die Zellen mit 2,5 Milliliter Vorbereitungsmedium und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter Vorbereitungsmedium in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, zählen die Zellen und inkubieren sie anschließend fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Nachdem die Zellen abzentrifugiert wurden, resuspendieren wir das Pellet in einem Milliliter PBS, gefolgt von einer weiteren Zentrifugation, während die Zellen rotieren. Verwenden Sie Öl, um eine 35-Millimeter-Glaskover zu einer 10-Zentimeter-Zellkultur-Schale mit einem 30-Millimeter-Durchmesser-Loch zu befestigen.Dann das Pellet in 100 µl PBS mit einer Dichte von 1 × 10⁷ Zellen pro 100 µl resuspendieren und die Zellen unmittelbar nach der Markierung auf Eis stellen. Die markierten neutrophilen Zellen intravenös in eine anästhesierte 8 bis 12 Wochen alte CX3CR1-GFP-Maus injizieren und die Maus auf eine Wärmeunterlage legen. Unmittelbar danach Augensalbe auf die Augen des Tieres auftragen, die Bauchhaut mit einer Schere öffnen, um das Peritoneum freizulegen, und das Peritoneum mit der Schere einschneiden, um den Darm freizulegen.Verabreichen Sie anschließend 200 µL PBS bei 37 Grad Celsius in die Bauchhöhle und drehen Sie die Maus mit dem Gesicht nach unten über die Zellkulturschale, um die Därme mit sanftem Druck aus der Bauchhöhle zu entfernen. Verwenden Sie dann sterile Wattestäbchen, um die Därme vorsichtig auf den Deckglasobjektträger aufzurollen, um die mesenterischen Gefäße freizulegen, und fixieren Sie das Gewebe mit Stücken von mit PBS bei 37 Grad Celsius angefeuchtetem Filterpapier, um die durch Peristaltik verursachten Bewegungen zu verringern. Es ist sehr wichtig, sich ausreichend Zeit zu nehmen, um den Darm sorgfältig mit mit PBS getränktem Papier zu immobilisieren.Andernfalls ruinieren Bewegungen, die während der Bildaufnahme durch Peristaltik verursacht werden, das Experiment. Überführen Sie als Nächste die Zellkulturschale und die Maus in eine auf einer speziell angefertigten Spurhalterung eines invertierten Mikroskops befindliche Thermostatkammer mit 37 Grad Celsius und verabreichen Sie eine zweite Dosis Anästhetikum intramuskulär in das Hinterbein. Stellen Sie nun die geeigneten Laser auf die niedrigste erforderliche Leistung ein, um laserinduzierte Phototoxizität zu vermeiden, und lassen Sie die Maus 30 Minuten ruhen.Wenn sich das Tier erholt hat, nehmen Sie den ersten Film 30 Minuten lang unter stationären Bedingungen auf. Um die Entzündung der Blutgefäße auszulösen, geben Sie danach einen Tropfen von 20 µL PBS, der 100 µg des TLR2/TLR1-Agonisten PAM3CSK4 enthält, direkt auf die abgebildeten Gefäße. Nehmen Sie schließlich einen zweiten Film auf, wobei Sie nach Zugabe des Agonisten besonders auf die Fokuskontrolle achten sollten, da die Entzündung Veränderungen der Endothelbreite hervorruft und somit den Fokus der Z-Achse verändert. In diesem Film werden die einzelnen Schritte der Bildverarbeitung für den ersten Zeitpunkt eines unter stationären Bedingungen aufgenommenen Films, wie gerade dargestellt, gezeigt.Das Patrouillieren von grünen LASIK-Cilo-Monozyten unter stabilen Bedingungen kann zusammen mit roten Neutrophilen, die im Blutkreislauf zirkulieren, sichtbar gemacht werden. Dasselbe Beobachtungsfeld wird 90 Minuten nach der Zugabe von PAM drei CSK vier gezeigt, was zur massiven Rekrutierung von Neutrophilen und Monozyten an die endotheliale Wand führt, die von den Monozyten mithilfe geeigneter Software genau abgescannt wird, um die exakten Bewegungsbahnen der Monozyten und Neutrophilen zu verfolgen. Das Patrouillieren entlang des Endothels kann vor und nach Beginn der Entzündungsreaktion nachverfolgt werden.Es ist wichtig zu beachten, dass ein Verlust der Fokussierung auf der Z-Achse oder eine XY-Verschiebung infolge von Darmbewegungen das Experiment beeinträchtigen können. Diese Technik kann weiter modifiziert werden, indem verschiedene genetisch veränderte Mausmodelle verwendet oder blockierende Antikörper beziehungsweise pharmazeutische Wirkstoffe injiziert werden, um die Rolle spezifischer Moleküle des Interesses beim Verhalten von Leukozyten zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Dynamik gesättigter Leukozyten in mesenterischen Venen überwachen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

In diesem Video demonstrieren wir die Echtzeit-Visualisierung von Blutzell-Endothel-Wechselwirkungen in den Mesenterialvenen eines Mausmodells, das intraperitoneal mit Lipopolysaccharid injiziert wurde.

Intravitalmikroskopie zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Blutzellen und Endothel in einem Entzündungs-Mausmodell

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Diese vereinfachte Anwendung der Intravitalmikroskopie von Mesenterialvenen bei Mäusen kann in verschiedenen Entzündungsmodellen verwendet werden, um Leukozyten-Endothel- und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu beobachten.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Dieses aktuelle Protokoll verwendet Fluoreszenzreporter, In-vivo-Markierung und intravitale Bildgebungstechniken, um die Überwachung des dynamischen Prozesses des Neutrophilen-Primings bei lebenden Tieren zu ermöglichen.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges Maus-Femur-Fensterkammermodell, das verwendet werden kann, um die Bewegung von Zellen im femoralen Knochenmark in vivo zu verfolgen. Die Intravital-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um drei Komponenten des femoralen Knochenmarks (Gefäße, Kollagenmatrix und Neutrophile) im Zeitverlauf abzubilden.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Monozyten sind wichtige Vermittler des Arteriogenesis im Rahmen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Mit einem Basalmembran-wie Matrix und intravitalen Mikroskopie, untersucht dieses Protokoll Monocyte homing und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese nach Monocyte-Injektion in die Femoral Arterie Ligatur Mausmodell.

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Die Migration von Neutrophilen beruht auf dem schnellen und kontinuierlichen Umbau der Plasmamembran als Reaktion auf den Chemolockstoff und seine Wechselwirkungen mit der extrazellulären Mikroumgebung. Hierin wird ein Verfahren beschrieben, das auf der Intravitalen Subzellulären Mikroskopie basiert, um die Dynamik des Membranumbaus bei Neutrophilen zu untersuchen, die in das Ohr von anästhesierten Mäusen injiziert werden.

Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Induktion einer mesenterialen Ischämie-Reperfusionsverletzung und zur Visualisierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in mesenterialen Venolen mittels intravitaler Mikroskopie vor. Der Blutfluss in der Arteria mesenterica superior war für 1 h eingeschränkt, gefolgt von einer Reperfusion, was eine direkte Quantifizierung der Leukozytenadhäsion und NETose ermöglichte.

Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie

Lernen Sie die Intravitalmikroskopie zur Beobachtung von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Leukozyten-Dynamik unter Ruhe- und Entzündungsbedingungen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

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