Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Das übergeordnete Ziel dieses intravitalen konfokalen Mikroskopieverfahrens ist es, die Dynamik von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen bei Mäusen zu überwachen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, z. B. was die molekularen Grundlagen der Leukozytenmigration, der Rekrutierung und der Interaktion mit dem vaskulären Endothel sind. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Möglichkeit, die Patrouille von LY 60 niedrigen Monozyten unter statischen Bedingungen zu verfolgen und zu analysieren und die Rekrutierung von Monozyten und Neutrophilen zum selben Gefäß zu verfolgen. Nach lokalen Entzündungsreizen, die das Verfahren demonstrieren, wird Stefan ler, der Techniker aus dem Labor, Um ein Einzelzellpräparat aus Knochenmark herzustellen, Sterilisieren Sie die Hinterbeine einer acht bis 12 Wochen alten Maus mit 70 % Ethanol und verwenden Sie dann ein Skalpell, um die Oberschenkelknochen und das Schienbein zu entnehmen, wenn alle Knochen getrennt wurden.

Spülen Sie die Beine mit 90%igem Ethanol ab und geben Sie die Knochen in eine mit PBS gefüllte Kulturschale. Verwenden Sie dann in einer Kulturhaube das Skalpell, um die Oberschenkelknochen und das Schienbein zu reinigen und am Kniegelenk zu trennen. Schneiden Sie dann die Enden der Knochen ab und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit Präparationsmedium, die mit einer 23-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um das Mark von jedem Knochen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu spülen.

Unterbrechen Sie die Zellaggregate, indem Sie sie durch die Nadelspitze zurückführen, und bringen Sie dann das Gesamtvolumen der Zellsuspension mit frischem Präparat auf bis zu 25 Milliliter, schleudern Sie die Zellen mit mittlerem Schleudern und dann Reanimation. Suspendieren Sie den Gaumen in einem Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Stoppen Sie die Lyse nach 30 Sekunden mit 10 Millilitern Präparat. Mittel.

Schleudern Sie die Zellen wieder herunter und resus suspendieren Sie das Pellet. Zwei weitere Milliliter Präparationsmedium zur Anreicherung der Neutrophilen durch Negativselektion. Inkubieren Sie zunächst die Knochenmarkzellen mit 150 Mikrolitern Maus-Neutrophilenanreicherungscocktail 10 Minuten lang auf Eis.

Am Ende der Inkubation bei 10 Millilitern phenolrotfreiem dmem. Drehen Sie das Rohr einmal um und drehen Sie die Zellen nach unten. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 1,75 Millilitern Vorbereitungsmedium und geben Sie die Zellen in ein Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenröhrchen.

Dann inkubieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern Biotin Selection Cocktail auf Eis für 10 Minuten. Am Ende der Inkubation suspendieren wir die magnetischen Partikel mit 30 Sekunden Vortexing aus dem Zellisolationskit. Anschließend werden die Zellen mit 500 Mikrolitern der Partikel 10 Minuten lang auf Eis inkubiert.

Setzen Sie am Ende der Inkubation das Röhrchen in den Magneten ein. Drehen Sie den Magneten nach drei Minuten in ein neues Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenröhrchen um. Um die unmarkierten Zellen zu sammeln, legen Sie das Röhrchen mit den unmarkierten Zellen in den Magneten.

Drehen Sie den Magneten nach drei Minuten in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen um, um die unmarkierten Zellen zu übertragen, wobei der letzte Tropfen im Röhrchen verbleibt. Bringen Sie dann das Volumen mit frischem phenolrotfreiem dm auf fünf Milliliter. Geben Sie nun einen halben Mikroliter des passenden zytoplasmatischen Farbstoffs, wie zum Beispiel den hier verwendeten Cell Tracker Orange, bei 37 Grad Celsius in die Zellen.

Nach zwei Minuten, bei 37 Grad Celsius, waschen Sie die Zellen mit 2,5 Millilitern Präparationsmedium und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter Präparationsmedium in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, zählen Sie die Zellen und inkubieren Sie sie dann fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem wir die Zellen heruntergeschleudert haben, suspendieren wir das Pellet in einem Milliliter PBS, gefolgt von einer weiteren Zentrifugation, während sich die Zellen drehen. Befestigen Sie mit Öl einen 35 Millimeter großen Glasdeckglas an einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale mit einem Loch von 30 Millimetern.

Dann resuspendieren Sie das Pellet einmal 10 bis zu den sieben Zellen pro 100 Mikroliter PBS und legen Sie die Zellen so schnell wie möglich nach der Markierung auf Eis. Injizieren Sie die markierten neutrophilen Zellen intravenös in eine anästhesierte acht bis 12 Wochen alte CX drei CR eine GFP-Maus und legen Sie die Maus auf ein Heizkissen. Tragen Sie dann sofort Salbe auf die Augen des Tieres auf und öffnen Sie mit einer Schere die Bauchhaut, legen Sie das Bauchfell frei, schneiden Sie das Bauchfell mit der Schere ein, um den Darm freizulegen.

Verabreichen Sie dann 200 Mikroliter 37 Grad Celsius PBS in die Bauchhöhle und drehen Sie die Maus mit der Vorderseite nach unten über die Gewebekulturschale, um den Darm mit sanftem Druck aus der Bauchhöhle zu entfernen. Tupfen Sie dann mit sterilen Wattestäbchen den Darm vorsichtig auf das Deckglas, um die Mesenterialgefäße freizulegen, und immobilisieren Sie das Gewebe mit Seidenpapierstücken, die mit 37 Grad Celsius PBS nass sind, um die Bewegungen zu verringern, die sich aus der Peristaltik ergeben. Es ist sehr wichtig, dass Sie sich Zeit nehmen, um den Darm sorgfältig mit PBS-gewichtetem Gewebe zu immobilisieren.

Andernfalls ruinieren Bewegungen, die sich aus der Peristaltik während der Bildaufnahme ergeben, das Experiment. Bringen Sie dann die Gewebekulturschale und die Maus in eine 37 Grad Celsius heiße Thermostatkammer auf einem speziell angefertigten Spurentisch eines inversen Mikroskops und verabreichen Sie eine zweite Runde Anästhetika intramuskulär an das Hinterbein. Stellen Sie nun die entsprechenden Laser auf die niedrigste Leistung ein, um eine laserinduzierte Phototoxizität zu vermeiden, und lassen Sie die Maus 30 Minuten ruhen.

Wenn sich das Tier erholt hat, nehmen Sie den ersten Film 30 Minuten lang unter stationären Bedingungen auf. Um die Entzündung der Blutgefäße einzuleiten, geben Sie dann einen 20-Mikroliter-Tropfen PBS mit 100 Mikrogramm TLR, zwei TLR, einem Agonisten PAM und drei CSK vier direkt auf die abgebildeten Gefäße. Erwerben Sie schließlich einen zweiten Film, wobei Sie darauf achten, den Fokus nach Zugabe des Agonisten zu kontrollieren, da die Entzündung Veränderungen in der Endothelbreite induziert und den Fokus der Z-Achse verändert. Hier werden in diesem Film die verschiedenen Schritte der Bildverarbeitung zum ersten Zeitpunkt eines Films gezeigt, der unter stationären Bedingungen aufgenommen wurde, wie gerade gezeigt.

Die Patrouille von grünen LASIK-Cilo-Monozyten unter Steady-State-Bedingungen kann mit roten Neutrophilen visualisiert werden, die im Blutkreislauf zirkulieren. Hier. Das gleiche Interessengebiet zeigt sich 90 Minuten nach der Zugabe von PAM drei CSK four, was zu einer massiven Rekrutierung von Neutrophilen und Monozyten an der Endothelwand führt, die die Monozyten mit der entsprechenden Software akribisch abtasten, die genauen Wege der Monozyten und Neutrophilen. Die Patrouille des Endothels kann vor und nach dem Beginn der Entzündung verfolgt werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass es zu einem Verlust des Fokus auf der Z-Achse oder einer XY-Verschiebung als Folge von Darmbewegungen kommen kann, die das Experiment ruinieren. Diese Technik kann weiter modifiziert werden, indem verschiedene genetisch veränderte Mäusemodelle verwendet oder blockierende Antikörper oder Arzneimittel injiziert werden, um die Rolle bestimmter Moleküle von Interesse für das Verhalten von Leukozyten zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Dynamik der Sättigung der Leukozyten in den Mesenterialvenen überwachen können.