Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die relative Tumorlast der Metastasierung von intraperitonealem Ovarialkarzinom in einem syngenen orthotopen Xenotransplantat-Mausmodell zu bestimmen. Diese neuartige Methode zur Abbildung und Quantifizierung der relativen Tumorlast kann uns helfen, Schlüsselfragen bei der Regulation der Metastasierung von Eierstockkrebs zu beantworten. Der grundlegende Vorteil dieser Technik besteht darin, dass durch das Entmischen der Fluoreszenzspektren die Autofluoreszenz des Gewebes aus den Bildern entfernt wird, was die Messung einer standardisierten, relativen Tumorlast ermöglicht.

Diese Technik gibt Einblicke in die Metastasierung des menschlichen Eierstockkrebses mit Auswirkungen auf die Überwachung der Wirksamkeit von Therapeutika. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da wir eine robuste Bildgebungstechnik mit einem analytischen Verfahren koppeln, um quantitative Daten aus den Bildern zu extrahieren. Yueying Liu, der Programmmanager des Labors für das Stack Lab, wird das Verfahren heute vorführen.

Nach 10 Wochen Tumorzellwachstum legen Sie den Körper jeder anästhesierten Maus nacheinander in ein optisches Bildgebungssystem für kleine Tiere. Scannen Sie alle Mäuse in der Kohorte zu jedem Zeitpunkt. Um fluoreszenzmarkierte Tumorzellen zu beobachten, führen Sie eine multispektrale Erfassung durch, um insgesamt fünf Bilder zu sammeln.

Wählen Sie eine Standardbelichtung von 15 Sekunden, zwei x zwei Binning, ein Sichtfeld von 16 Zentimetern und eine Blendenzahl von 1,1. Nehmen Sie als Nächstes ein Reflexionsbild des gesamten Tieres mit weißem Licht aus einem offenen Anregungsfilter, einem offenen Emissionsfilter, einer Standardbelichtung von 0,2 Sekunden mit zwei mal zwei Binning und einem Sichtfeld von 16 Zentimetern mit einer Blendenzahl von 2,8 auf. Nach der Euthanasie schneiden Sie die Haut mit einer spitzen Präparierschere nach vorne entlang der ventralen Mittellinie der Maus von der Oberseite der Oberschenkel bis zur Unterseite des Brustkorbs.

Trennen Sie die Haut vorsichtig vom Peritonealgewebe und achten Sie darauf, die Peritonealwand nicht zu durchstechen. Schneiden Sie dann seitlich sowohl entlang der Unterseite des Brustkorbs als auch entlang der Oberseite der Oberschenkel, um zwei Hautlappen zu bilden. Platzieren Sie die Maus auf der Bauchseite im Scanner, so dass die Bauchhöhle nach unten zeigt und die Hautlappen geöffnet sind.

Scannen Sie die Maus mit ihren Organen in situ mit den gleichen Parametern, die zuvor für die Live-Maus verwendet wurden. Fahren Sie nun mit der Präparierung der Maus fort, indem Sie die Leber, das Omentum, die Bauchspeicheldrüse, den Magen, das Zwerchfell sowie den Dünn- und Dickdarm mit Standardtechniken extrahieren. Entfernen Sie außerdem das linke und rechte Bauchfell, die Eierstöcke, die Nieren, das Mesenterium und schließlich das Fettpolster.

Beobachten, aufzählen und notieren Sie jeden der sichtbaren Tumoren an den Organen. Verwende einen Messschieber, um den Durchmesser jedes Tumors zu messen. Tumoren mit einem Durchmesser von weniger als zwei Millimetern als klein, zwischen zwei und fünf Millimetern als mittel und mehr als fünf Millimeter als groß bezeichnen.

Legen Sie als Nächstes die Organe auf die Organscan-Vorlage, die in Abbildung 4 des begleitenden Textprotokolls zu finden ist, und verwenden Sie sie, um die Position jedes Organs während des nächsten Scans zu organisieren. Verwenden Sie PBS, um die Organe feucht zu halten. Scannen Sie jedes Organblatt mit dem optischen Bildgebungssystem für Kleintiere und den zuvor verwendeten Parametern.

Legen Sie die Organe nach dem Scannen in 10 % Formaldehyd und bearbeiten Sie sie für die Histologie mit Standardtechniken. Um die Menge der Autofluoreszenz in jedem multispektralen Scan zu reduzieren, laden Sie zuerst die Spektraldatei des rot fluoreszierenden Proteins in vivo, gefolgt von der roten Datei mit dem Auto Floor in vivo im Fenster für ungemischte Bilder, und wählen Sie Entmischung aus. Exportieren Sie dann die Dot-Bip-Dateien in einem unskalierten 16-Bit-Dot-Tif-Format und laden Sie sie in Image J, indem Sie zu Datei gehen, öffnen und dann die richtige 16-Bit-Dot-Tif-Datei auswählen.

Gehen Sie als Nächstes zum Bildmenü und wählen Sie Anpassen, dann Helligkeitskontrast und setzen Sie den minimal angezeigten Wert auf Null und den maximal angezeigten Wert auf plus 35353. Gehen Sie dann im Bildmenü erneut zu Tabellen nachschlagen und wählen Sie Red Hot. Verschiedene Tiermodelle erfordern unterschiedliche Helligkeitsstufen, aber es ist wichtig, die Helligkeit während einer bestimmten Studie konstant zu halten.

Zeichnen Sie mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug eine Freiform-Auswahl des Interessenbereichs um jedes Organ. Der interessierende Freiformbereich sollte nahe an den Organgrenzen gezeichnet werden. Geben Sie dann control und M ein, um mit dem Messwerkzeug die Oberfläche der einzelnen Organe zu berechnen.

Erfassen Sie diese Daten in einer Tabellenkalkulation. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den interessierenden Bereich, der um jedes Organ gezeichnet wurde, und wählen Sie Duplizieren aus, um nur das Organ einzuschließen. Gehen Sie dann unter dem Bild zu Anpassen, dann zu Schwellenwert und legen Sie den unteren Schwellenwert auf plus 1.200 und den oberen Schwellenwert auf plus 1.700 fest.

Überprüfen Sie außerdem den dunklen Hintergrund, und wählen Sie dann OK aus. Dadurch werden nur die am hellsten fluoreszierenden Bereiche ausgewählt. Die Bilder erfordern möglicherweise eine manuelle Manipulation der Schwellenwert-Schieberegler in Bild J, sodass die zuvor hellsten Bereiche für den Analyseschritt ausgewählt werden, wie oben gezeigt.

Unterschiedliche Krankheitsmodelle erfordern unterschiedliche Schwellenwerte, aber es ist wichtig, die Schwellenwerte in einer bestimmten Studie konstant zu halten. Wählen Sie unter "Analysieren" die Option "Partikel analysieren" aus, und ändern Sie die Größe des Pixels zum Quadrat auf 10 bis unendlich. Wählen Sie aus, ob Gliederungen angezeigt werden sollen, und aktivieren Sie diese Option, um nur Anzeigeergebnisse auszuwählen, und klicken Sie dann auf OK.

Dadurch werden sowohl die Bereiche als auch die integrierten Rohdichten der hellen Regionen gemessen, die als Tumore gelten. Notieren Sie die Werte der Oberfläche und die rohe integrierte Dichte jeder Tumorauswahl zusammen in derselben Tabellenblatt, die die Organoberflächen enthält. Wählen Sie dann unter "Analysieren" die Option "Werkzeuge" aus, und wechseln Sie zur Kalibrierungsleiste.

Fügen Sie den Bildern der Organe eine Kalibrierungsskala hinzu. Montagen können eine größere oder geringere Anzahl von Organen enthalten, wie von einer bestimmten Studie vorgegeben. Gehen Sie als Nächstes unter Datei zu Speichern unter und speichern Sie die Montage sowohl als Dot tif als auch als Dot jpeg.

Öffnen Sie dann die Dot-JPEG-Datei der Organe und gehen Sie zum Einfügemenü, um jedem Bild ein Textfeld hinzuzufügen. Fügen Sie Organbeschriftungen hinzu, indem Sie unter jeder der drei Organreihen ein Textfeld erstellen. Öffnen Sie jede der 16-Bit-Dot-Tif-Dateien der Ganzkörper-Scans in Image J in der Reihenfolge der Mauszahl.

Gehen Sie dann zum Bildmenü und wählen Sie Anpassen und dann Helligkeitskontrast. Legen Sie den minimal angezeigten Wert auf null und den maximal angezeigten Wert auf plus 35353 fest. Kehren Sie als Nächstes zum Bildmenü zurück, um Tabellen nachzuschlagen, und wählen Sie dann "glühend" aus.

Sobald dies abgeschlossen ist, speichern Sie die Montage sowohl als Punkt-tif- als auch als Punkt-JPEG-Datei. Die ID8-Maus-Eierstockkrebszelllinie, die den Mäusen 10 Wochen vor der Bildgebung injiziert wird, fluoresziert im roten Kanal und setzt dies während des gesamten Wachstums fort. Die Live-Bildgebung mit einem optischen Bildgebungssystem für Kleintiere ist in der Lage, die expandierenden ID8-Zellen in der Maus zu sehen und bietet einen genaueren Ansatz als das einfache Wiegen der Maus, um die Tumorlast zu beurteilen.

Nach der Euthanasie und Entfernung der ventralen Hautschicht können die intakten Organe genauer betrachtet werden. Einzelne Organe, die auf der Organ-Scan-Schablone platziert sind, zeigen jedoch deutlich die Tumorlast in jedem Organ. Die Tumorlast im Omentum und Pankreas, in den Eierstöcken und im Mesenterium der Maus (links) ist viel größer als bei den gleichen Organen der rechts gezeigten Maus.

Die Beobachtung der differentiellen Tumorlast wird quantitativ sowohl in Bezug auf das Tumorversorgungsgebiet als auch auf die Tumorsignalintensität bestätigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um bis zu 18 lebende Mäuse pro Stunde abzubilden. Die Dissektion und Ex-vivo-Bildgebung einzelner Organe dauert etwa 20 Minuten pro Probe.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die quantitative Magnetresonanz durchgeführt werden, um Hypothesen wie den Einfluss von Fettleibigkeit auf die Metastasierung von Eierstockkrebs zu untersuchen, wie in unserem Krebsforschungsartikel aus dem Jahr 2015 gezeigt