Name: Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Lernen Sie die quantitative Echtzeit-PCR zur Detektion tumorspezifischer mRNA in Maus-Lungengewebe. Diese Methode ermöglicht die präzise Quantifizierung von Metastasen in Mammatumormodellen.

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Die Yeh Labor wird durch Forschungsmittel von einem American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) von einem Department of Defense Zuschuss an die Hollings Cancer Center an MUSC verliehen, durch Forschungsförderung (W81XWH-11-2- unterstützt 0229) bei MUSC und von einem preis vom Concern Foundation (zum ESY).

Das Protokoll folgt den Richtlinien und Tierpflegestandards der Medical University of South Carolina (MUSC) und seine Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Mammatumor-Dissektion (optional je nach Studienziele und ob Primärtumor Analyse oder Schwanzveneninjektion durchgeführt wurde). <ol><li> Euthanize Maus mit einer letalen Dosis von Isofluran-Narkose nach IACUC und Hochschulverordnung. Bestätigen Euthanasie durch chirurgische Luxation. </li><li> Am Schaumbrett, Stift mit Dissektion Stifte, indem Sie die Maus auf seiner Rückseite mit Gliedmaßen Verbreitung. </li><li> Spray-Maus mit 70% Ethanol. </li><li> Mit einer Pinzette, fassen Sie den unteren Teil des Tieres in den Mittelpunkt. </li><li> Verwendung Schere, schneiden oben in Richtung auf den Hals durch die Haut, man aufpassen, nicht in die Bauchhöhle der Maus durchbohren. </li><li> Schnitt zurück Haut an den Extremitäten, um Tumorgewebe zu offenbaren. </li><li> Sezieren Tumorgewebe und preserve von bevorzugten Verfahren wie Gefrier- oder Fixierung, zur weiteren Analyse (nicht weiter in diesem Protokoll beschrieben). </li></ol></li><li> Lungengewebe Dissektion. <ol><li> Wenn Tumorgewebe wurde wie oben beschrieben geerntet, festzunageln überschüssige Haut. </li><li> Mit einer Pinzette fassen Peritoneum am unteren Ende des Tieres und beginnen Schneiden nach oben in Richtung auf die Basis des Halses. </li><li> Vorsichtig entlang der linken und rechten Seite des Brustkorbs vorsichtig, um zu vermeiden Trennen keine Blutgefäße, die in die Brusthöhle bluten können geschnitten. Entfernen der Rippenknochen durch Schneiden nach links und rechts durch die Membran und den oberen Abschnitten der Rippen. </li><li> Mit einer Pinzette greifen die Luftröhre des Maus und nach vorne ziehen. </li><li> Sever die Luftröhre mit Dissektion Schere und der Lunge zu entfernen von der Maus. Hinweis: Das Herz kann in die Lunge angebracht bleiben. In diesem Fall sorgfältig sezieren Herzen von Lunge darauf achten, alle fünf Lappen zu sammeln (siehe Abbildung 1 </strong&gt;). </li><li> Waschen Sie sich leicht mit PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen. </li></ol></li><li> Gross Bewertung der Lungengewebe. <ol><li> Option 1: In-vivo-Bildgebung. <ol><li> Luciferase-Bildgebung, ~ 10 min vor der Bilderzeugung, geben den Tieren eine 150 mg / kg Dosis von Luciferin durch intraperitoneale (ip) Injektion. Bild Lunge in vivo bei anästhesierten Tieren oder beim Entfernen nach der Sektion (2) 5. </li></ol></li><li> Option 2: Brutto Auswertung. <ol><li> Untersuchen Lunge unter Stereomikroskop zur Tumorknoten zu visualisieren. Hinweis: Wenn Zellen GFP-markierten kann ein Fluoreszenz-Stereomikroskop in der Lage, die eine Lichtwürfel mit dem entsprechenden Anregungs- / Emissionsmaxima (zB in der Nähe von 470/510 nm), um GFP erkennen verwendet werden, um die Lunge für die Fluoreszenz vor der Verarbeitung stereoskopisch untersucht werden. </li></ol></li><li> Wenn die Lunge sind sofort analysiert werden, ist dem Kapitel &#39;RNA Isolation&#39; fortzufahren. Andernfalls Snap freeze Gewebe unter Verwendung liquid Stickstoff oder Trockeneis. Bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. RNA-Isolierung Hinweis: Für die repräsentative Analyse wurde RNA mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kit (siehe Materialliste) isoliert. Während die aktuelle Analyse eines bestimmten Herstellers Produkt verwendet, eine Vielzahl von Isolation Kits sind von verschiedenen namhaften Herstellern. Zusätzlich werden nicht-Kit auf Basis Zentrifugationsverfahren auch eine Option. cDNA sollte auch von einer positiven Kontroll-RNA Probe hergestellt werden, beispielsweise eine Zelllinie oder ein Plasmid, für Standard-Kurvenanalyse. Alternativ kann eine positive Kontrolle, die für das Primer Sondensatz erworben werden (siehe Materialliste). <ol><li> Wenn Sie zuvor gefrorenem Gewebe, sammeln gefrorenem Gewebe auf Trockeneis. </li><li> Homogenisieren, mit einer der folgenden Methoden, wie beispielsweise Gewebe: Mörser Schleifen von Hand über Trockeneis nach dem Einfrieren Gewebe in flüssigem Stickstoff durchgeführt wird; Gewebehomogenisator oder mechanische Dissoziation Gerätpro Hersteller Vorschlag; Beschallung oder andere bevorzugte Methode. Hinweis: Für die repräsentative Analyse, ist die bevorzugte Methode der Homogenisierung Beschallung. <ol><li> Für die Analyse in Figur 3 dargestellt, herzustellen Lysepuffer (in RNA Isolation Kit bereitgestellt) und 2-Mercaptoethanol im Verhältnis von 20 ul 2-Mercaptoethanol für je 1 ml Lysepuffer. Resuspendieren Gewebe in 300 ul Lysepuffer ergänzt mit 2-Mercaptoethanol für jede 30 g Gewebe, und mit Ultraschall 10 s mit Beschallungsgerät bei 30% Amplitude eingestellt. </li><li> Wenn Sie nach dem Schleifen Mörser und Stößel, resuspendieren Grundgewebe in 300 ul Lysepuffer. </li></ol></li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Proteinase K bis 590 &amp; mgr; l TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA). Fügen Sie 600 ul Proteinase K-Lösung, um alle 300 &amp; mgr; l (dh für jede 30 mg) von Gewebe. Inkubation für 10 min bei RT. Hinweis: Aufschlusszeit kann variieren. </li><li> Centrifuge Proben bei ≥13.000 g für 10 min, um Trümmer zu entfernen. </li><li> Überstand in ein neues Röhrchen. </li><li> Mit 450 &amp; mgr; l Ethanol (96% -100%) für jeweils 900 &amp; mgr; l des Überstands, um RNA auszufällen. </li><li> Übertragen 700 ul des Lysats / Ethanol Mischung auf die Säule. </li><li> Zentrifuge Proben bei ≥13,000 g für 1 min, um RNA zu Säule bindet. </li><li> Entsorgen flüssiger Abfall und fügen verbleibende Überstand zur Spalte wieder zu spinnen. </li><li> Sobald das gesamte Lysat durch die Säule geschleudert, mit 350 ul Waschpuffer 1 an dem oberen Abschnitt der Säule und Zentrifuge Proben bei ≥13,000 g für 30 sec. </li><li> Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen. </li><li> Vorbereitung DNase durch Mischen von 5 Einheiten DNase I-Enzym mit 5 ul von 10x DNase und 40 ul DNase / RNase freiem Wasser pro Probe (Gesamtvolumen von 50 ul / Probe). </li><li> Dann werden 50 ul DNase mischen, um jede Spalte und Inkubation für 15 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 350 ul Waschpuffer 1 bis Säule und zentrifugieren samsätze bei ≥13,000 g für 30 Sekunden. </li><li> Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen. </li><li> Mit 600 &amp; mgr; l Waschpuffer 2 an die Säule und Spin 30 sec bei ≥13,000 g. </li><li> Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen. </li><li> Fügen Sie 250 ul Waschpuffer 2 und Zentrifuge für 2 min bei ≥13,000 g. </li><li> Setzen Sie Teil der Kolonne in neuen Sammelröhrchen und entsorgen Sie alte Sammelröhrchen. </li><li> In 50 bis 100 &amp; mgr; l RNase / DNase freies Wasser zur Säule und Inkubation für 1 min. </li><li> Spin für 1 min bei ≥13,000 g. </li><li> Re-run bis Spalte gesammelten Eluats auf RNA-Ausbeute zu erhöhen. </li><li> Für den sofortigen Einsatz, halten Proben auf Eis und zur Quantifizierung. Für die spätere Verwendung, Snap freeze auf Trockeneis oder flüssigem Stickstoff. Bei -80 ° C Gefrierschrank bis sie benötigt. </li></ol> 3. Erststrangsynthese Hinweis: Für die repräsentative Analyse wurde die Reverse Transkriptase (RT) -Reaktion durchgeführt a First cDNA-Synthese-Kit für QRT-PCR entwickelt (siehe Materialliste). <ol><li> Wenn Proben wurden zuvor gesammelten, tauen Röhrchen auf Eis. </li><li> Messen Sie RNA-Menge mit einem Spektralphotometer. </li><li> Verwendung 0,5-2 ug Gesamt-RNA, führen die Erststrangsynthese unter Verwendung von reverser Transkriptase in cDNA Lager zu erzeugen. <ol><li> In sterile, RNase / DNase-frei PCR-Gefäße / Platten, bereiten Sie die Reaktionsmischung (Tabelle 1). Vorsichtig mischen und zentrifugieren. Programmieren Sie eine Standard-PCR-Maschine (Tabelle 2). </li></ol></li><li> Verdünnen Sie fertigen Reaktion auf gewünschte Lautstärke (in der Regel 50 bis 100 &amp; mgr; l) mit sterilen Nuklease-freies Wasser. </li></ol> 4. Echtzeit-PCR Hinweis: Für die repräsentative Analyse, SYBR Green verwendet wurde. Jedoch kann jede bevorzugte Methode im Ermessen des Benutzers ersetzt werden. <ol><li> Verwendung eines positiven Steuer cDNA, richten Sie eine Standardkurve für jedes Primerpaar. <ol><li> Für die Analyse gezeigt, in Abbildung 3, bereiten Sie die Standardkurve für den menschlichen HER2 mit dem Hersteller empfohlene positive Kontroll cDNA (siehe Materialliste). Für Maus GAPDH, verwenden Sie die Negativkontrolle Lungen-cDNA um eine Standardkurve zu erzeugen. Für jede Sonde, seriell verdünnter die cDNA 1: 4 bis 5-Norm zu erzeugen. </li></ol></li><li> Berechnen der Gesamtzahl der Proben, die der Standardkurve und die experimentellen Proben enthalten sollte. Hinweis: Für die Analyse hier beschrieben, wurden 2-3 experimentellen Wiederholungen pro Probe analysiert. Standardkurvenanalyse durchgeführt, um ein einfaches lineares Regressionsmodell, die angewendet werden, um die relative Menge von HER2 und GAPDH pro Probe zur endgültigen normierte Größe berechnen bestimmen zu erzeugen. Diese Analyse wird auch dafür sorgen, dass der Primer Effizienz angemessen für die Analyse bei der Hand ist. </li><li> In einem sterilen, RNase / DNase-frei Rohr, bereiten Master-Mix (Tabelle 3). <ol><li> Berechnen Mastermix amount pro Probe. Scale-up für mehr als eine Probe. Verwenden Sie einen Master-Mix für jeden experimentellen Gen von Interesse, als auch als interne Kontrolle, wie GAPDH. Verwenden Primer für GAPDH in einer Endkonzentration von 200 nM. Hinweis: Der interne Kontrolle ist besonders nützlich, wenn versucht wird, zwischen Mensch und Maus-Zell Ursprungs zu unterscheiden. Hinweis: Primer-Konzentration für HER2 wurde optimiert und durch den Hersteller bestimmt. </li></ol></li><li> Bereiten Testplatte, die 1 &amp; mgr; l cDNAs entsprechend jeder Standard- oder Versuchsprobe. Hierbei mindestens 1 cDNA-Probe / Vertiefung für jedes Primersonde. In 19 ul des Master-Mix pro Vertiefung für jedes Primersonde. Anmerkung: Für den repräsentativen Daten in Abbildung 3 wurden die cDNA-Proben in zweifacher Ausführung für jeden Primer Sonde analysiert und als der Mittelwert der zwei Proben grafisch dargestellt. </li><li> Führen Reaktion in QRT-PCR-Maschine mit den empfohlenen oder zuvor PCR-Protokoll getestet. Siehe Tabelle 4 </strong&gt; für den für die repräsentativen Daten in Abbildung 3 und 4 verwendeten PCR-Protokoll. </li></ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
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<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

ESY und MAA nicht durch FirstString Research Inc. verwendet und nicht ein finanzielles Interesse an der Gesellschaft halten. FirstString Research Inc. zur Verfügung gestellt, die die Luciferase Bilddaten, die in diesem Manuskript vorgestellt wurde. GSG ist Präsident und CEO von FirstString Research. CLG ist Mitarbeiter von FirstString Research. GSG und CLG haben Aktienoptionen durch FirstString Forschung ausgegeben.

Dieses Protokoll beschreibt Verwendung von QRT-PCR, um Brust Metastasierung von Tumorzellen in die Lunge mit einem Xenograft Mausmodell zu bewerten. Es wird anerkannt, dass andere Techniken, einschließlich Biolumineszenz-Bildgebung zur Verfügung und sind auch wirksam zum Erfassen Metastasierung obwohl ihre eigenen Werte und Grenzen. Die vorgestellten Daten zeigen, dass qRT-PCR stellt eine wirksame Maßnahme zum Nachweis von Tumor-abgeleitete mRNA im Lungengewebe zur Quantifizierung von Gesamt Metastasierung. Es wird vorg...

QRT-PCR-Analyse als ein Verfahren zur Beurteilung der Tumormetastasierung vorgeschlagen. Dieses Verfahren wird als eine Alternative für die Nutzer, die sich für die Bewertung der Metastasierung sind, aber keinen Zugriff auf bestimmte Geräte wie in vivo bildgebenden Geräten oder einem Fluoreszenz fähig Stereoskop vorgeschlagen. Eine Diskussion der am häufigsten verwendeten Verfahren wird durch eine Demonstration, wie qRT-PCR-Analyse kann entweder als getrennte oder als Begleiter Verfahren zur Metastasierung auszuwerten dieser genutzt werden können gefolgt. Dieses Verfahren hat das Potenzial, eine quantitative Analyse von metastatischen Last bereitzustellen. Standardverfahren der Brutto-Analyse, einschließlich der Visualisierung der Lunge unter einem Stereomikroskop sowie Serienschnitt gefolgt von Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung von Lungengewebe, quantifizierbar sind, sondern verlassen sich stark auf benutzerdefinierte Parameter zum Zählen 2-5. Bei der Bewertung der gesamten Lunge mit einem Stereomikroskop, nur große Oberfläche Metastasen sind visiBLE und Analyse erfordert die Prüfer, angemessene Kenntnisse der Lungen anatomischen Struktur, um festzustellen, was eine metastatische Läsion haben. Fluoreszenzmarkierung von Tumorzellen mit einem Marker, wie GFP und die Verwendung eines Stereomikroskops, das eine Licht Würfel mit dem geeigneten Anregungs- / Emissionsmaxima (zB in der Nähe von 470/510 nm für GFP) enthält hilft bei diesem Verfahren jedoch nur Oberflächentumorknötchen nachweisbar . Zusätzlich Fluoreszenz von Blutkontamination, die unter den gleichen Parametern wie GFP sichtbar ist, kann zu falschen Identifizierung möglicher Metastasen führen. Schneiden der Lunge, gefolgt von H &amp; E-Färbung auf Lungenmetastasen zu visualisieren ist eine nützliche Methode, um Mikrometastasen und anderen mikroskopischen Verfahren, einschließlich Immunzellinfiltration zu bewerten, sondern erfordert oft den Einsatz des gesamten Lungengewebe für die Paraffineinbettung, Schneiden und Färbeverfahren. Daher folgt dieser metho sind nachgeschalteten Verfahren nicht ideald. Obwohl quantifizierbaren, erfordert dieses Verfahren den Forscher eine Vielzahl von gefärbten Lungenschnitten pro Tier bewerten, um sicherzustellen, dass die Analyse berücksichtigt die gesamte 3D-Struktur der Lunge. Somit ist diese Art der Untersuchung zeitaufwendig, können Zählfehler zu führen, und die Analyse stützt sich stark auf Ermittler Diskretion. Mehrere in vivo bildgebenden Verfahren (zB MRT, PET, SPECT) werden gegenwärtig verwendet, durchzuführen oder zu testen, biologische Prozesse in experimentellen Tiermodellen 8. In vivo Biolumineszenz-Bildgebung ist eine gängige Methode verwendet, um eine grobe Ansicht von Metastasen 9 zu erwerben. Diese Technik wird im allgemeinen angewandt, um die Anwesenheit von Luciferase-Reporteraktivität zu beurteilen aufgrund der Akkumulation von Tumorzellen, die dazu entworfen sind, um eine Luciferase-Reaktionselement enthält, die in bestimmten Organen wie der Brustdrüse nach der Tumorzellimplantation und der Lunge, bei einer spontanen Metastasierung aufzuhalten 10. Visualisierung der Luciferase-Reporteraktivität durch die Anwesenheit von Luciferin-Substrat (D-Luciferin) induziert. Luciferase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von D-Luciferin zu Oxyluciferin Erzeugen Biolumineszenz. Während informative wird dieses Verfahren durch mehrere Faktoren, einschließlich Substratstabilität (dh kurze Halbwertszeit), eine angemessene Verteilung des Substrats, wie sie an Versuchstiere geliefert wird, hängt, und geringe Nachweisempfindlichkeit 9 begrenzt. Ein Haupt Vorteil dieser Technik ist, dass sie nicht invasiv ist, kann an lebenden Tieren durchgeführt werden und kann auf den Nachweis von Tumorzellmetastasen in verschiedenen Organen, die nicht normal zu Dissektion 9,10 geerntet führen kann. Ein positiver Aspekt der in vivo bildgebenden Verfahren ist, dass das Lungengewebe ungestört so dass für sekundäre Eingriffe wie Paraffineinbettung oder wie hier, QRT-PCR-Analyse vorgestellt. Da jedoch QRT-PCR ist theoretically ein empfindlicheres Maß für die Erkennung, kann grobe Auswertung nicht verraten geringe Zahl von Tumorzellen in der Lunge vorhanden. Zwar nützlich, können die oben beschriebenen Bildgebungstechniken ersetzt oder die unmittelbar beschriebene qRT-PCR-Verfahren ergänzt werden. QRT-PCR hat das Potential, ein empfindliches Maß tumorderivierten mRNA innerhalb einer Lunge bereitzustellen.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transkription Supermix für QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, human&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR-Template für SYBR Green Assay: ERBB2, human&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Primer-Sequenz</td><td></td><td></td><td>für ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

beurteilung von lungenmetastasen in maus-mammatumormodelle durch quantitative echtzeit-pcr

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastasen ist die Verbreitung von bösartigen Tumorzellen aus dem Primärkrebs Website zu einem entfernten Orgel und ist die Hauptursache von Krebs Tod 1. Gemeinsame Standorte Metastasierung sind Lunge, Lymphknoten, Gehirn und Knochen 2. Mechanismen, die Metastasen zu fahren sind intensiv Bereichen der Krebsforschung. Folglich effektiven Tests, um metastatic Belastung zu messen in entfernten Stellen von Metastasen sind maßgeblich für die Krebsforschung. Bewertung der Lungenmetastasen in Mammatumor-Modellen wird im allgemeinen grob qualitative Beobachtung von Lungengewebe nach Dissektion durchgeführt. Quantitative Methoden zur Bewertung der Metastasierung sind derzeit auf ex vivo- und in vivo-Bildgebungstechniken, die auf Basis benutzerdefinierter Parameter erfordern beschränkt. Viele dieser Techniken sind in den gesamten Organismus Ebene als zellulärer Ebene 3-6. Obwohl neuere bildgebende Verfahren, die Multi-Photonen-Mikroskopie in der Lage, metas bewertenTASIS auf zellulärer Ebene 7 sind diese sehr elegante Verfahren besser geeignet für die Beurteilung Mechanismen der Verbreitung statt quantitative Bewertung der metastatischen Last. Hier wird ein einfaches in vitro-Verfahren für die quantitative Erfassung der Metastasierung wird vorgestellt. Mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) kann tumorzellspezifischen mRNA in der Maus-Lungengewebe nachgewiesen werden.

Über die Zeit, die für den anfänglichen Inokulation von Tumorzellen in das Versuchstier und durchzuführen, wenn die Durchführung ist ein 1-2 Tag Verfahren primären Tumor in vivo Analyse der Gewebeernte, RNA-Isolierung und qRT-PCR-Analyse (Figur 1) . Ein Beispiel für eine grobe Analyse ist Biolumineszenz-Bildgebung, um Tumorzellen im Lungengewebe zu bewerten. Hier wurde eine Brusttumorgenese Experiment...

Dieses Protokoll beschreibt die quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR) verwenden, um Tumorzellen spezifische mRNA, die Metastasen in der Maus Lungengewebe zu erkennen.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Menge einer bestimmten mRNA aus Tumorzellen in der Lunge nachzuweisen, um auf diese Weise Metastasen zu analysieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine quantitative Messung der Metastasierung ermöglicht. Um eine Lungen-Tumor-Dissektion durchzuführen, legen Sie die Maus nach erfolgter Tötung mit einer letalen Dosis Isofluran gemäß dem Textprotokoll auf eine Schaumplatte auf den Rücken, spreizen die Gliedmaßen und befestigen sie mithilfe von Dissektionsnadeln an der Platte. Nachdem Ethanol verwendet wurde, um die Maus zu besprühen, greifen Sie mit einer Pinzette den unteren Teil des Tieres in der Mitte und schneiden mit einer Schere vorsichtig durch die Haut in Richtung Hals, wobei Sie darauf achten müssen, die Bauchhöhle der Maus nicht zu verletzen. Greifen Sie nun das Peritoneum am unteren Ende des Tieres und beginnen Sie, in Richtung Halsansatz nach oben zu schneiden. Schneiden Sie vorsichtig entlang der linken und rechten Seite des Brustkorbs, wobei Sie darauf achten müssen, keine Blutgefäße zu durchtrennen, die in die Brusthöhle bluten könnten.Entfernen Sie die Rippenbögen, indem Sie links und rechts durch das Zwerchfell und die oberen Abschnitte des Brustkorbs schneiden. Greifen Sie dann mit einer Pinzette die Luftröhre der Maus, ziehen Sie sie nach vorne und durchtrennen Sie die Luftröhre mit einer Präzisionsschere, bevor Sie die Lungen aus der Maus entfernen. Spülen Sie das Lungengewebe vorsichtig mit PBS.Danach, nach der makroskopischen Beurteilung des Lungengewebes gemäß dem Textprotokoll, falls die Lungen unverzüglich analysiert werden sollen, fortfahren zur RNA-Isolierung. Um RNA aus Gewebe zu isolieren, beginnen Sie mit der Homogenisierung des Gewebes unter Verwendung einer der im Textprotokoll aufgeführten Methoden. Lysispuffer aus einem RNA-Isolationskit herstellen und 20 Mikroliter Tumorcaptoethanol zu jedem Milliliter Lysispuffer hinzufügen.Suspendieren Sie jeweils 30 Gramm Gewebe in 300 Mikrolitern Lysepuffer und lysieren Sie das Gewebe mit einem Beschallungsgerät, das auf 30 % Amplitude eingestellt ist, für 10 Sekunden. Geben Sie 10 Mikroliter Proteinase K zu 590 Mikrolitern TE-Puffer und fügen Sie 600 Mikroliter des Puffers zu 300 Mikrolitern des beschallten Gewebes hinzu. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten.Zentrifugieren Sie die Proben anschließend mit mindestens 13.000 × g für 10 Minuten, um den Zelltrümmer zu entfernen. Danach überführen Sie den Überstand in neue Röhrchen. Geben Sie 450 µL Ethanol zu je 900 µL Überstand hinzu, um die RNA auszufällen.Überführen Sie dann 700 Mikroliter der Lysat-Ethanol-Mischung auf eine RNA-Säule. Zentrifugieren Sie erneut mit mindestens 13.000 × g für eine Minute, um die RNA an die Säule zu binden. Entsorgen Sie anschließend die flüssige Abfallfraktion, geben Sie das verbleibende Überstand auf die Säule und zentrifugieren Sie erneut.Fügen Sie anschließend 350 Mikroliter Waschpuffer eins zum oberen Teil der Säule hinzu und zentrifugieren Sie die Proben 30 Sekunden lang. Entsorgen Sie die flüssige Abfallfraktion und setzen Sie die Säule wieder in das Röhrchen ein. Bereiten Sie die DNase vor, indem Sie für jede Probe fünf Einheiten des DNase-I-Enzyms mit fünf Mikrolitern 10X-DNase-Puffer und 40 Mikrolitern DNase-RNase-freiem Wasser mischen.Geben Sie 50 µL DNase-Mix zu jeder Säule hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann 350 µL Waschpuffer eins zu den Säulen hinzu und zentrifugieren Sie die Proben 30 Sekunden lang. Nach dem Entsorgen der Abfalllösung geben Sie 600 µL Waschpuffer zwei hinzu und zentrifugieren weitere 30 Sekunden.Entfernen Sie die Flüssigkeit, bevor Sie 250 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzufügen, und zentrifugieren Sie anschließend zwei Minuten lang. Überführen Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen und geben Sie 50 bis 100 Mikroliter RNase- und DNase-freies Wasser auf die Säule. Nach einer Inkubation von einer Minute zentrifugieren Sie eine Minute lang. Das gesammelte Eluat erneut durch die Säule laufen lassen, um die RNA-Ausbeute zu erhöhen. Für die sofortige Verwendung die Proben auf Eis halten. Für die spätere Verwendung rasch in Trockeneis oder flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie benötigt werden.Quantifizieren Sie die RNA mithilfe eines Spektrophotometers. Verwenden Sie dann in sterilen, RNase- und DNase-freien PCR-Röhrchen oder -Platten 0,5 bis 2 Mikrogramm Gesamt-RNA, um das Reaktionsgemisch für die erste Transsynthese gemäß dieser Tabelle vorzubereiten. Mischen Sie das Gemisch und zentrifugieren Sie es vorsichtig. Programmieren Sie anschließend ein Standard-PCR-Gerät mit dem hier gezeigten Programm.Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, verdünnen Sie die fertige Reaktion mit steriler, nukleasefreier Wasser auf das gewünschte Volumen. Führen Sie eine Echtzeit-PCR durch, indem Sie eine positive Kontrolle der cDNA, beispielsweise humane HER2, verwenden, um für jeden Primer-Satz eine Standardkurve aufzustellen, indem Sie eine bis vier serielle Verdünnungen der cDNA vorbereiten, um fünf Standardproben zu erzeugen. Berechnen Sie anschließend die Gesamtanzahl der Proben, die die Standardkurve und die experimentellen Proben umfassen sollte.Dann bereiten Sie in sterilen, RNase- und DNase-freien Röhrchen eine Master-Mix-Lösung für jedes experimentelle Gen der Untersuchung sowie eine interne Kontrolle, wie beispielsweise gapdh, vor. Bereiten Sie eine Testplatte vor, die je ein Mikroliter C-DNase für jede Standard- oder Experimentalsprobe enthält. Weisen Sie jeder Primer-Sonde mindestens eine C-DNA-Probe pro Mulde zu.Fügen Sie für jeden Primer-Probe 19 Mikroliter Mastermix pro Vertiefung hinzu. Dieses Biolumineszenz-Experiment zeigt, dass die Lungen von Mäusen, die mit ACT1 behandelt wurden, das die Gap-Junction-Proteins Connexin 43 gezielt, negativ für Luciferase-Aktivität sind, was auf das Fehlen von Tumorzellen im Gewebe hindeutet. Die Analyse von H&E-Schnitten des Lungengewebes zeigt jedoch Mikrometastasen, die nicht durch Luciferase sichtbar gemacht wurden, was darauf hindeutet, dass die Luciferase-Bildgebung nicht empfindlich genug ist, um geringe Anzahlen von Tumorzellen nachzuweisen.Gezeigt sind hier die Ergebnisse eines qRT-PCR-Experiments unter Verwendung einer spezifischen Sonde für HER2, um humane HER2-positiven JIMT1-Tumorzellen im Lungengewebe nach ursprünglicher Transplantation in das fetale Fettpolster der Maus nachzuweisen. Obwohl an keiner der Lungen makroskopisch sichtbare Metastasen beobachtet wurden, detektierte die qRT-PCR in zwei von 11 Proben Metastasen. In dieser Abbildung wurde eine Standardkurvenanalyse durchgeführt, um die relativen HER2-Spiegel, normalisiert auf das murine Lungen-gapdh, in einer Zellzahlenreihe zu bestimmen.Die Ergebnisse zeigen, dass die qRT-PCR unter Verwendung der HER2-Sonde empfindlich genug war, um HER2-Spiegel bereits in nur 10 Zellen nachzuweisen. Schließlich zeigt diese Regressionsanalyse die relative Zellanzahl in jeder Lungenprobe, einschließlich der positiven und negativen Kontrollen. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in sechs bis acht Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Vorsichtsmaßnahmen zu beachten, um die RNA-Integrität während der RNA-Isolierung und der Reverse-Transkriptase-Reaktion zu bewahren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Metastasen in gesamtem Lungen­gewebe mittels quantitativer Echtzeit-PCR nachweisen kann.

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Forschung

JoVE Journal

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Dieses Modell der orthotopen menschlichen Prostatakrebs ermöglicht die Quantifizierung der Tumorgröße, zirkulierenden Tumorzellen und die Bildung von Metastasen in unterschiedlichen Lungen. Wie Zellen müssen das primäre Organ zu entkommen, in die Blutbahn, und implantieren in einem sekundären Standort dieses Modell effektiv rekapituliert das Szenario in den Menschen.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entstehung von Brusttumoren zu untersuchen. Mit dieser Technik werden Brusttumoren der Maus entfernt und Primärzellen aus Tumoren präpariert. Ein Lungenextraktionsprotokoll zur Untersuchung von Lungenmetastasen ist enthalten. Darüber hinaus ist ein weiteres Protokoll zur Analyse embryonaler Fibroblasten der Maus aus dem Mausembryo enthalten.

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

Hier beschreiben wir das Modell und den Ansatz zur Untersuchung der Funktionen von Lungenalveolarmakrophagen bei der Metastasierung von Krebs. Um die Rolle dieser Zellen bei der Metastasierung zu demonstrieren, wurde das syngene (4T1) Modell des Brustkrebses in Verbindung mit der Depletion von Alveolarmakrophagen mit Clodronat-Liposomen verwendet.

Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

Präklinische Modelle, die eine adjuvante Therapie mit Brustkrebs-Metastase auswerten, fehlen. Um dies zu lösen, entwickelten wir ein murines Modell der de novo pulmonalen Mamma-Adenokarzinom-Metastase, wobei Therapien, die in der adjuvanten Einstellung (postchirurgische Resektion von Primärtumoren) verabreicht werden, auf die Wirksamkeit bei der Auswirkung von zuvor gesäten pulmonalen Metastasen untersucht werden können.

Chirurgische Verfahren und Methodik für ein präklinisches Murine - Modell von De Novo Mamma Krebs Metastase

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

Wir führen einen murinen orthotopen Brust Krebs Modell und radikale Mastektomie Modell mit Biolumineszenz-Technologie, die Tumorlast um menschliche Muttermilch Tumorprogression imitieren zu quantifizieren.

Generieren eines murinen orthotopen metastasierendem Brustkrebs Krebs Modells und Durchführung von murinen radikale Mastektomie

Diese Arbeit setzt ein fortschrittliches Protokoll vor, um die Tumorbelastung durch den Nachweis von grünen Fluoreszenzprotein- und Biolumineszenzsignalen sowie die Integration quantitativer molekularer Detektionstechniken genau zu bewerten.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Die intravenöse Injektion von Krebszellen wird häufig in der Metastasenforschung eingesetzt, aber die metastasierende Tumorbelastung kann schwer zu analysieren sein. Hierin demonstrieren wir ein Schwanzvenen-Injektionsmodell der Metastasierung und beinhalten einen neuartigen Ansatz zur Analyse der resultierenden metastasierenden Lungentumorbelastung.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Wir beschreiben eine konsistentere und beschleunigte Methode zur Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell mit Fidschi-ImageJ.

Verwendung computerbasierter Bildanalyse zur Verbesserung der Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Lernen Sie die quantitative Echtzeit-PCR zur Detektion tumorspezifischer mRNA in Maus-Lungengewebe. Diese Methode ermöglicht die präzise Quantifizierung von Metastasen in Mammatumormodellen.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

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