Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Menge einer spezifischen MRNA aus Tumorzellen in der Lunge als Methode zur Analyse von Metastasen nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein quantitatives Maß für die Metastasierung handelt. Um eine Lungentumordissektion durchzuführen, legen Sie die Maus nach der Euthanasation einer Maus mit einer tödlichen Dosis Isofluor gemäß dem Textprotokoll mit gespreizten Gliedmaßen auf ein Schaumstoffbrett auf dem Rücken und befestigen Sie sie mit Präpariernadeln auf dem Brett.

Nachdem Sie die Maus mit Ethanol besprüht haben, greifen Sie mit einer Pinzette den unteren Teil des Tieres in der Mitte und schneiden Sie mit einer Schere durch die Haut nach oben zum Hals hin, wobei Sie darauf achten, die Bauchhöhle der Maus nicht zu durchstechen. Fassen Sie nun das Bauchfell am unteren Ende des Tieres und beginnen Sie, nach oben zum Halsansatz hin zu schneiden. Schneiden Sie vorsichtig an der linken und rechten Seite des Brustkorbs entlang und achten Sie darauf, keine Blutgefäße zu durchtrennen, die in die Brusthöhle bluten könnten.

Entferne die Rippenknochen, indem du nach links und rechts durch das Zwerchfell und die oberen Teile des Brustkorbs schneidest. Fassen Sie dann mit einer Pinzette die Luftröhre der Maus und ziehen Sie sie nach vorne, und verwenden Sie eine Präparierschere, um die Luftröhre zu durchtrennen, bevor Sie die Lunge von der Maus entfernen. Verwenden Sie PBS, um das Lungengewebe sanft zu waschen.

Dann, nach einer groben Bewertung des Lungengewebes gemäß dem Textprotokoll, wenn die Lunge sofort analysiert werden soll, fahren Sie mit der RNA-Isolierung fort. Um RNA aus Gewebe zu isolieren, beginnen Sie mit der Homogenisierung des Gewebes mit einer der im Textprotokoll aufgeführten Methoden. Bereiten Sie Lysepuffer aus einem RNA-Isolationskit vor und fügen Sie jedem Milliliter Lysepuffer 20 Mikroliter Tumor-Captoethanol hinzu.

Resuspendieren Sie alle 30 Gramm Gewebe in 300 Mikrolitern Lysepuffer und beschallen Sie das Gewebe mit einem Ultraschallgerät mit einer Amplitude von 30 % 10 Sekunden lang. Fügen Sie 10 Mikroliter Protinase K zu 590 Mikrolitern TE-Puffer hinzu und fügen Sie 600 Mikroliter des Puffers zu 300 Mikrolitern beschalltem Gewebe hinzu. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Zentrifugieren Sie anschließend die Proben 10 Minuten lang bei mindestens 13.000 G G, um die Rückstände zu entfernen. Übertragen Sie dann den Überstand auf neue Röhrchen. Fügen Sie 450 Mikroliter Ethanol zu je 900 Mikrolitern Überstand hinzu, um die RNA auszufällen.

Übertragen Sie dann 700 Mikroliter des Lysat-Ethanol-Gemisches in eine RNA-Säule. Drehen Sie sich erneut eine Minute lang mit dem 13.000-fachen G oder mehr, um die RNA an die Säule zu binden. Entsorgen Sie dann den flüssigen Abfall, geben Sie den restlichen Überstand in die Säule und schleudern Sie erneut.

Geben Sie anschließend 350 Mikroliter Waschpuffer eins in den oberen Teil der Säule und zentrifugieren Sie die Proben 30 Sekunden lang. Entsorgen Sie den flüssigen Abfall und setzen Sie die Säule wieder in das Röhrchen ein. Bereiten Sie DNase vor, indem Sie für jede Probe fünf Einheiten DNase, ein Enzym mit fünf Mikrolitern 10X DNase Puffer und 40 Mikroliter DNase RNase freies Wasser mischen.

Geben Sie 50 Mikroliter DNase-Mischung in jede Säule und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 350 Mikroliter Waschpuffer eins in die Säulen und zentrifugieren Sie die Proben 30 Sekunden lang. Nachdem Sie die Abfalllösung entsorgt haben, fügen Sie 600 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzu und schleudern Sie weitere 30 Sekunden lang.

Entsorgen Sie die Flüssigkeit, bevor Sie 250 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzufügen, und schleudern Sie sie dann zwei Minuten lang. Füllen Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen und geben Sie 50 bis 100 Mikroliter RNase DNase freies Wasser in die Säule. Nach einer Minute Inkubation eine Minute lang drehen.

Lassen Sie das gesammelte Eluat erneut durch die Säule laufen, um die RNA-Ausbeute zu erhöhen. Für den sofortigen Gebrauch bewahren Sie die Proben auf Eis auf. Für die spätere Verwendung auf Trockeneis oder flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Quantifizieren Sie die RNA mit einem Spektralphotometer. Verwenden Sie dann in sterilen RNase DNase-freien PCR-Röhrchen oder -Platten 0,5 bis 2 Mikrogramm Gesamt-RNA, um das Reaktionsgemisch für die erste Transynthese vorzubereiten, wie in dieser Tabelle gezeigt. Mischen und zentrifugieren Sie vorsichtig und programmieren Sie ein Standard-PCR-Gerät mit dem hier gezeigten Programm.

Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, verwenden Sie steriles, nukleasefreies Wasser, um die fertige Reaktion auf das gewünschte Volumen zu verdünnen. Um eine Echtzeit-PCR durchzuführen, verwenden Sie eine Positivkontroll-C-DNA, wie z. B. humanes HER2, um eine Standardkurve für jedes Primer-Set zu erstellen, indem Sie ein bis vier serielle Verdünnungen der C-DNA vorbereiten, um fünf Standards zu erzeugen. Berechnen Sie als Nächstes die Anzahl der Gesamtproben, die die Standardkurve und experimentelle Proben umfassen sollten.

Bereiten Sie dann in sterilen RNase DNase-freien Röhrchen einen Mastermix für jedes experimentelle Gen von Interesse sowie eine interne Kontrolle, wie z. B. gapdh, vor. Bereiten Sie für jede Standard- oder Versuchsprobe eine Testplatte mit einem Mikroliter C-DNase vor. Weisen Sie jeder Primersonde mindestens eine C-DNA-Probe pro Vertiefung zu.

Fügen Sie 19 Mikroliter Mastermix pro Vertiefung für jede Primersonde hinzu. Dieses Biolumineszenz-Experiment zeigt, dass Mauslungen, die mit ACT1 behandelt wurden, das auf das Gap-Junction-Protein Connexin 43 abzielt, negativ für die Luciferase-Aktivität erscheinen, was auf das Fehlen von Tumorzellen im Gewebe hindeutet. Die Analyse von H&E-Schnitten des Lungengewebes zeigt jedoch Mikrometastasen, die nicht durch Luziferase beleuchtet wurden, was darauf hindeutet, dass die Luziferase-Bildgebung nicht empfindlich genug ist, um eine geringe Anzahl von Tumorzellen zu erkennen.

Hier sind die Ergebnisse eines qRT-PCR-Experiments gezeigt, bei dem eine HER2-spezifische Sonde zum Nachweis von humanen HER2- und JIMT1-Tumorzellen im Lungengewebe von Zellen verwendet wurde, die ursprünglich in das Gedächtnisfettpolster der Maus transplantiert wurden. Obwohl in der Lunge keine grob sichtbaren Metastasen beobachtet wurden, wurden in zwei der 11 Proben mittels qRT-PCR Metastasen nachgewiesen. In dieser Abbildung wurde eine Standardkurvenanalyse erstellt, um die relativen HER2-Spiegel zu bestimmen, die in einer Zellzahlreihe auf den Lungenspalt der Maus normalisiert sind.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die qRT-PCR mit der HER2-Sonde sensitiv genug war, um HER2-Spiegel in nur 10 Zellen nachzuweisen. Schließlich zeigt diese Regressionsanalyse die relative Zellzahl in jeder Lungenprobe, einschließlich der Positiv- und Negativkontrollen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs bis acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, um die RNA-Integrität während der RNA-Isolierung und der reversen Transkriptase-Reaktion aufrechtzuerhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Metastasen im gesamten Lungengewebe durch quantitative Echtzeit-PCR nachgewiesen werden können.