2.9: Induzierte Pluripotenz

Induzierte pluripotente Stammzellen können, wie menschliche embryonale Stammzellen, sich in fast jede Zelle des Körpers differenzieren und sind daher auf dem Gebiet der regenerativen Medizin vielversprechend.

Humane embryonale Stammzellen (hESCs) werden aus Präimplantationsembryonen gewonnen, während vollständig differenzierte somatische Zellen zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen verwendet werden, die auch als iPSCs bezeichnet werden.

In diesem Video erfahren Sie mehr über die Grundprinzipien hinter der Erzeugung von iPSCs, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Induktion der Pluripotenz in differenzierten Zellen und einige der vielen nachgelagerten Anwendungen und Modifikationen dieses Protokolls.

Beginnen wir mit der Erörterung der Prinzipien hinter der Erzeugung von iPSCs aus somatischen Zelltypen.

Differenzierte Zellen, wie Hautzellen oder Neuronen, sind diejenigen, deren Schicksal entschieden wird. Sie verpflichten sich, eine bestimmte Funktion zu erfüllen. Auf der anderen Seite sind pluripotente Stammzellen diejenigen, deren Schicksal unentschieden ist, und sie können sich in jeden Zelltyp differenzieren.

Der Prozess der Veränderung der Identität einer bereits differenzierten Zelle in einen pluripotenten Zustand wird als zelluläre Reprogrammierung bezeichnet. Dabei geht es darum, das Muster der Genexpression in der Zelle zu verändern, denn die Anzahl und Art der von einer Zelle produzierten Proteine spielt eine wichtige Rolle bei der Definition der Identität einer Zelle.

Eine der Möglichkeiten, die zelluläre Reprogrammierung zu induzieren, besteht darin, die Expression bestimmter Transkriptionsfaktoren zu induzieren. Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die an regulatorische Sequenzen innerhalb eines Gens binden. Einige dieser Sequenzen werden als "Promotoren" bezeichnet und fördern daher die Transkription eines Gens. Einige wenige Transkriptionsfaktoren können die Expression zahlreicher Gene beeinflussen, was einen großen Einfluss auf die Zellidentität hat.

Die vier klassischen Transkriptionsfaktoren, von denen gezeigt wurde, dass sie Pluripotenz induzieren, sind Oct4, Sox2, cMyc und Klf4. Diese Faktoren sind auch als Yamanaka-Faktoren bekannt, nach dem Forscher, der ihre Reprogrammierungseffekte entdeckte.

Es können mehrere Methoden verwendet werden, um die Expression dieser Transkriptionsfaktoren zu induzieren. Die gebräuchlichste und effizienteste Methode ist die Verwendung eines modifizierten Virus, um die Transkriptionsfaktor-Gene in den Zellkern zu bringen, wo sie sich in das Genom integrieren.

Bei dieser Methode werden die Gene, die für die vier Yamanaka-Faktoren kodieren, einzeln in verschiedene Retroviren verpackt und differenzierten Zellen zugesetzt. Wenn die Zellen modifizierten Viren ausgesetzt werden, infiziert sich ein kleiner Teil der differenzierten Zellen mit allen vier Transkriptionsfaktor-tragenden Viren. Sie beginnen sich zu dedifferenzieren, bis sich große kugelförmige Cluster pluripotenter Stammzellen bilden. Die Clusterbildung hilft iPSCs, eine Mikroumgebung zu schaffen, die In-vivo-Stammzellen ähnelt, und hilft ihnen so, ihre Pluripotenz zu erhalten.

Da Sie nun die Grundprinzipien hinter der Erzeugung von iPSCs verstehen, gehen wir ein allgemeines Protokoll zur Induktion der Pluripotenz in embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus unter Verwendung eines viralen Transduktionssystems durch.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, beachten Sie, dass Viren die Zellen in Ihrem Körper infizieren können, daher ist es äußerst wichtig, die Sicherheitsrichtlinien zu befolgen.

Um den Transfektionsprozess zu starten, wird das Kulturmedium von einer Platte mit einer hohen Dichte an MEFs entfernt und die Zellen werden mit Pufferlösung gewaschen. Als nächstes wird eine Lösung, die ein proteinabbauendes Enzym wie Trypsin enthält, hinzugefügt, um die Zellen vom Boden der Schale zu heben. Anschließend wird das Kulturmedium auf die Platte gegeben, und die abgelösten Zellen werden in ein Zentrifugenröhrchen überführt.

Nach der Zentrifugation wird das Pellet wieder im Nährmedium suspendiert. Als nächstes werden die Zellen gezählt und die Konzentration so angepasst, dass am nächsten Tag eine optimale Anzahl von Zellen mit dem Virus infiziert werden kann. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.

Nachdem sich die Zellen auf ihrer neuen Schale niedergelassen haben, werden alte Medien durch frische Medien ersetzt, und manipulierte Viren, die die gewünschten Transkriptionsfaktoren enthalten, werden auf die Platte gegeben. Die Zellen werden dann so lange mit den Viren inkubiert, dass die Infektion stattfinden kann. Nach der Inkubation wird das Medium, das freie Viren enthält, entfernt und durch frisches embryonales Stammzellmedium ersetzt.

Für 2-3 Wochen nach der Transformation sollten die Zellen mit 37? in einem Inkubator, und die Nährmedien sollten täglich ausgetauscht werden.

Nach dieser Zeit sollten iPS-Kolonien, die embryonalen Stammzellkolonien ähneln, groß genug sein, um entnommen werden zu können. Die Völker können auf eine frische Platte mit Medium mit geeigneten Wachstumsfaktoren umgesiedelt und weiter wachsen gelassen werden. Um die Pluripotenz zu bestätigen, wird ein Teil der Zellpopulation mit Pluripotenzmarkern gefärbt.

Nachdem Sie nun gesehen haben, wie iPS-Zellen aus differenzierten Zellen generiert werden, schauen wir uns einige nachgelagerte Anwendungen und Modifikationen dieser äußerst nützlichen Methode an.

Ein wichtiges Merkmal von iPS-Zellen ist, dass sie zur Erzeugung fast jeder Zelle im Körper verwendet werden können. Dieses Beispiel zeigt die Erzeugung von Herzmuskelzellen, sogenannten Kardiomyozyten, aus iPSCs. Zu diesem Zweck werden die iPS-Zellen auf nicht-adhärente Platten übertragen, die es ihnen ermöglichen, Embryoidkörper zu bilden, bei denen es sich um Aggregate pluripotenter Stammzellen handelt. Die Embryoidkörper werden in einem speziellen Medium kultiviert, das Serum und Ascorbinsäure enthält, was die kardiale Differenzierung verbessert. Eine erfolgreiche Differenzierung kann leicht beobachtet werden, wenn einige Zellen zu schlagen beginnen.

Da sich iPS-Zellen potenziell in jeden Zelltyp differenzieren können, können sie auch einen ganzen Organismus bilden, wie eine Maus. Dies kann mit einem Assay erfolgen, der als tetraploide Komplementation bezeichnet wird. Zunächst wird ein tetraploider Embryo, ein Embryo mit vier Chromosomensätzen, gebildet, indem zwei Zellen eines frühen Embryos mit Hilfe eines elektrischen Feldes miteinander verschmolzen werden. Der tetraploide Embryo darf sich bis zum Blastozystenstadium entwickeln. iPS-Zellen werden dann in die Blastozyste injiziert, die dann zur Schwangerschaft in eine Empfängerin transplantiert wird. Die tetraploiden Zellen sind nur in der Lage, extraembryonale Strukturen wie die Plazenta zu bilden, so dass Tiere, die aus dieser Methode hervorgehen, vollständig von iPSCs abstammen.

Einige Forscher modifizieren das Reprogrammierungsverfahren, um den Prozess der Identifizierung erfolgreich reprogrammierter Zellen effizienter zu gestalten. In diesem Experiment halfen MEFs mit der Fähigkeit, grün fluoreszierendes Protein unter dem Einfluss des Oct4-Promotors zu exprimieren, den Forschern beispielsweise, Zellen, die Pluripotenz erlangt haben, leicht zu identifizieren.

Sie haben gerade das Video von JoVE über die Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen gesehen. Dieses Video gibt einen Überblick über die Prinzipien hinter diesem Verfahren und ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung von iPSCs aus differenzierten Zellen. Wir haben auch untersucht, wie diese Methode für Experimente im Labor angewendet oder modifiziert werden kann.

Die Entdeckung von iPS-Zellen hat einen großen Einfluss auf das Gebiet der Stammzellbiologie, da sie ein enormes Potenzial für die Entwicklung von Therapien bietet, die zur Behandlung degenerativer Erkrankungen eingesetzt werden können. Obwohl bei iPS-Zellen große Fortschritte erzielt wurden, ist die Hürde, die noch überwunden werden muss, das damit verbundene Krebsrisiko. Die derzeitigen Reprogrammierungsverfahren haben das Potenzial, zu einem unregulierten Zellwachstum zu führen, das zu Krebs führen kann. Daher ist mehr Forschung erforderlich, um iPSCs tatsächlich klinisch einzusetzen. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!