Name: Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca 2+ Im Alter von Neuronen im Hippocampus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Erfahren Sie Calcium-Remodelling im alternden Gehirn durch Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung zytosolischer und mitochondrialer Calciumspiegel in Langzeitkulturen von Ratten-Hippocampus-Neuronen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt vom Ministerio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) und der Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 und BIO/VA33/13), Spanien. MCR wurde von der Junta de Castilla y Leòn (Spanien) und dem Europäischen Sozialfonds unterstützt. Wir danken dem verstorbenen Dr. Philippe Brûlet (1947-2013) für das mitochondriale GFP Aequorin Plasmid.

Ethics Statement: Verfahren mit Versuchstieren wurden unter Protokolle, die von der Universität Valladolid Stallanlage in Übereinstimmung mit der Europäischen Konvention 123 / Europarat und der Richtlinie 86/609 / EWG zugelassen abgewickelt. 1. Kurz und Langzeitkultur von Ratten-Hippokampus-Neuronen <ol><li> Herstellung von Poly-D-Lysin-beschichtete 12 mm-Glasdeckgläschen. <ol><li> Sterilisieren, Durchmesser 12 mm Deckgläser in Ethanol für mindestens 24 Stunden. Lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen zu trocknen. </li><li> Verteilen Sie die Deckgläser auf einem Streifen von Parafilm in einer Petrischale. Decken die Oberfläche jedes Deckglas mit 200 ul 1 mg / ml Poly-D-Lysin. Lassen Sie die Behandlung von O / N. </li><li> Am nächsten Tag waschen Sie die Deckgläser mit doppelt destilliertem sterilem Wasser alle 15 min für 90 min unter sterilen Bedingungen. </li><li> Füllen Sie eine vier auch Multischale Platte mit 500 ul Neurobasal Kulturmedium pro Vertiefung. Neurobasal Kulturmedium sollte ergänzt werden,10% fötales Rinderserum, 2% B27, 1 &amp; mgr; g / ml Gentamycin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Legen Sie die Deckgläser in der Multischale Platte. Halten sie in einer angefeuchteten 37 ºC und 5% CO 2 -Inkubator bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Isolierung von Neuronen im Hippocampus von neugeborenen Ratten. <ol><li> Vorbereitung 1,8 ml Papainlösung (direkt erworben) in einem Glasfläschchen (20 ul / ml) unter sterilen Bedingungen: bis zu einer Endkonzentration von 20 &amp; mgr; l zu erhalten / ml etwa 40 &amp; mgr; l Papain in 1,8 ml Hank plus 0,6% BSA hinzuzufügen (ul berechnet werden in Abhängigkeit von den Lieferanten Bedingungen). Hanks 0,6% BSA wird durch Mischen von 85 ml HBSS Medium mit 15 ml 4% iges Rinderserumalbumin (BSA, hergestellt Lösung 4 g BSA in 100 ml HBSS). Bereiten Sie es in einer sterilen Haube. </li><li> Inkubieren Papain in Hank plus 0,6% BSA für 30 Minuten bei 37 ºC vor der Verwendung. Filtern der Lösung unter Verwendung eines 0,22 um Filter vor der Verwendung. </li><li> Vorbereitung Hams F-12-Medium durch Zugabe von Dulbecco-Modifiziertem Eagle-Medium-Pulver (13,5 g pro Liter) in 900 ml doppelt destilliertem sterilem Wasser. Fügen Sie dann 6 g HEPES und 336 mg NaHCO 3 und den pH auf 7,42 mit NaOH 4 N. In sterilem Wasser, um eine 1 L Lösung zu erhalten und filtern es mit einem 0,20 um Polyethersulfon (PES) Flaschenaufsatzfilter. Führen Sie diesen Vorgang in einer sterilen Haube. Schließlich sättigt die Lösung mit CO 2 unter sterilen Bedingungen vor der Verwendung. Shop-Lösungen bei 4 ° C und verwenden Sie sie gekühlt. </li><li> Euthanize Neugeborenen (P0) Rattenjungen durch Enthauptung und waschen Sie den Kopf in sterile HBS Medium. Öffnen Sie den Schädel mit Hilfe einer sterilen Schere. Extrahieren Sie das Gehirn mit einem Spatel und waschen Sie ihn schnell in Hams F-12-Medium. </li><li> Machen Sie einen Schrägschnitt mit Hilfe eines Skalpells in jeder Hemisphäre (1B), und tragen sie zu einer Petrischale mit Ham-F-12-Medium. </li><li> Verwerfen Meningen sorgfältig mit Hilfe von Pinzetten und Dissektion unter einer Lupe. </li> &lt;li&gt; Geben Sie den Hippocampus in einem charakteristischen konkaven Stelle über dem Kortex mit Lupe. Dann trennen den Hippocampus von der Rinde durch vorsichtiges Ziehen von einer Grenze und Entfernen von seiner Position mit Augen Schere. </li><li> Übertragen Sie die Hippocampus-Gewebe bis zu einer 4-Well-Platte mit steriler Hanks Medium ohne Ca 2+ und Mg 2+ und 0,6% BSA aufgefüllt und waschen Hippocampus-Gewebe. Ohne dass die Medien zu schneiden das Gewebe in kleine Stücke (ca. 2 x 2 mm) mit den gleichen Augen Schere. </li><li> Übertragen hippocampalen Stücke zu einer Ampulle, die 1,8 ml vorfiltriert Papainlösung. Dann inkubieren sie bei 37 ° C unter gelegentlichem, leichtem Schütteln. 15 Minuten später, fügen Sie 90 ul DNase I-Lösung (50 ug / ml final) und Inkubation für weitere 15 min. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe mit einem 10 ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Bruchstücke mit frischen Neurobasal Kulturmedium. Erhalten Zellsuspension, indem Gewebefragmente durch eine 5 ml-Kunststoff pipette. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 160 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit einem Kunststoff sterilen Pasteur-Pipette und Pellet auszusetzen vorsichtig mit 1 ml automatisierte Pipette in 1 ml Neurobasal Kulturmedium. </li><li> Messung der Zelldichte unter Verwendung eines Neubauer-Zählkammer. Legen Sie das Deckglas über die Neubauer-Kammer. Zugabe von 10 &amp; mgr; l Zellsuspension. Stellen Sie sicher, die Zellsuspension in die Kammer gleichmäßig und macht keine Blasen. Zählen die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop und führen entsprechenden Berechnungen, um eine geeignete Tropfen 40-80 ul, enthaltend 30 x 10 3 Zellen erhalten. Die Gesamtzahl der Zellen wird von der Anzahl der verwendeten Tiere ab. </li></ol></li><li> Kurzzeit- und Langzeitkultur von Ratten-Hippocampus-Neuronen. <ol><li> Im Laufe der vier auch Multischale Platte mit 500 ul Neurobasal Kulturmedium hergestellt, bevor und in den Inkubator, Platte aufbewahrt ca. 30 x 10 3 Zellen in einem Rückgang von etwa 50 &amp; mgr; l zu jedemauch der Multischale Platte mit einem Poly-D-Lysin-beschichtete, Durchmesser 12 mm Deckglas. </li><li> Pflegen primären Hippocampus-Zellen in einem befeuchteten 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 2-5 Tage in vitro (DIV, kurzfristige, junge Kulturen) oder&gt; 15 DIV (langfristige, im Alter von Kulturen), bevor Experimente ohne die Kultur Medien. </li></ol></li></ol> 2. Fluorescence Imaging der cytosolischen Ca 2+ -Konzentration <ol><li> Herstellung von Testlösungen für Fluoreszenz-Imaging. <ol><li> Vorbereitung eines externen HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) Lösung, die in mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl 2 1, CaCl 2 1, Glucose 10, Natrium-HEPES 10 (pH 7,42). </li><li> Vorbereitung eines externen, Mg 2+ -frei, HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) Lösung, die in mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl 2 1, Glucose 10 und 10 HEPES (pH 7,42). </li><li> Lösen NMDA in Mg 2+ -frei, HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) mit einem FINAl Konzentration von 100 &amp; mgr; M und ergänzen Sie es mit 10 uM Glycin. </li><li> Vorbereitung einer HBS enthaltende Lösung KCl anstelle von NaCl durch die Lösung (in mM): KCl 145, MgCl 2 1, CaCl 2 1, Glucose 10 und 10 HEPES (pH 7,42). </li></ol></li><li> Laden des Hippocampus-Zellen mit fluoreszierenden Calciumsonde Fura2 / AM. <ol><li> Nehmen Sie die Zellkultur enthält Deckgläser aus dem Inkubator und waschen Sie sie mit HBS-Medium bei RT durch Übertragung auf ein neues Vier auch Multischale Platte, die 500 &amp; mgr; l HBS pro Vertiefung. </li><li> Inkubieren Zellen mit Fura2 / AM 4 &amp; mgr; M für 60 min bei RT (25 ° C) an einem dunklen Ort (in der gleichen HBS Medium hergestellt). </li><li> Nach 60 min waschen Deckgläser mit frischen HBS Medium. </li></ol></li><li> Aufnahme von Fluoreszenzbildern von zytosolischen [Ca 2+] in kultivierten Zellen. <ol><li> Schalten Sie die Lampe, Mikroskop, Perfusionssystem, Fluoreszenz-Kamera und Computer. </li><li> Legen Sie die Deckgläser in einem thermostatisierten Plattform fürOpen 12 mm Deckgläser auf der Bühne des inversen Mikroskop und wählen Sie einen mikroskopischen Bereich unter Verwendung eines 40X-Objektiv (Öl, NA: 1,3). Perfundieren Zellen kontinuierlich mit vorgewärmten (37 ° C) HBS Mediums in Abwesenheit oder Anwesenheit von Testsubstanzen. Aufrechterhaltung der Strömung mit einer Rate von ungefähr 5-10 ml / min. Hinweis: Handy Perfusionssystem für lebende Zellen in einem thermostatisierten Plattform für offene 12 mm Deckgläser montiert. 8-Linien schwerkraftgetriebenen Perfusionssystem mit einer Ventilsteuerung ausgerüstet ist, um die Lösungen zu perfundieren. Eine Vakuumpumpe ist für das Entfernen überschüssigen Mediums verantwortlich. Lösungen werden unter Verwendung eines in-Rohr-Heizung erwärmt. </li><li> Nehmen Sie ein Hintergrundbild mit der Verschluss an beiden Anregungswellenlängen geschlossen. </li><li> Epi-Zellen leuchten abwechselnd bei 340 und 380 nm. Record Licht bei 520 nm alle 5-10 s mit einer Fluoreszenzkamera, die von einer Fura-2 dichroitischen Spiegel gefiltert wird emittiert. </li><li> Wenn die Aufzeichnungszeit beendet ist, speichern Sie die vollständige Sequenz of Bilder bei 520 nm emittiert im Computer zur weiteren Analyse. </li></ol></li><li> Analyse von aufgezeichneten Fluoreszenzbilder. <ol><li> Öffnen Sie das Experiment-Datei. Unter Verwendung des Aquacosmos Software, klicken Sie auf &quot;Verhältnis&quot; und wählen Sie die gewünschte Übersetzungsbereich. Berechnung der pixel-Verhältnis in den resultierenden Bildern, um eine Sequenz von Verhältnis Bilder zu erhalten. </li><li> Subtrahieren Hintergrund durch Einstellen der &#39;Hintergrund Beseitigung&#39;. Drücken Sie &quot;Start Berechnung &#39;. </li><li> Drücken Sie &#39;Alle Zeitfolge &quot;Knopf und löschen die alten Regions of Interest (ROIs). Zur quantitativen Analyse von Einzelzellen herzustellen neuen Regionen von Interesse oder ROIs entsprechend einzelnen Neuronen. Durchschnitt alle Verhältniswerte in jedem Pixel entsprechend jedem ROI und jedes Bild, um eine Aufnahme von Verhältnisfluoreszenzwerte für einzelne ROIs (Zellen) zu erhalten. </li><li> Um die einzelnen Aufnahmen anzuzeigen exportieren Verhältnis Fluoreszenzwerte entsprechend jeder ROI auf eine grafische progrbin. </li><li> Stellen die entsprechenden Berechnungen zur Bestimmung der Größe des Anstiegs der Fluoreszenz-Verhältnis in Reaktion auf jede Stimulierung unter Verwendung einer geeigneten Datenanalyse und grafische Software. </li></ol></li></ol> 3. Biolumineszenz-Bildgebung der mitochondrialen Ca2 + -Konzentration <ol><li> Transfektion von kultivierten Hippocampusneuronen mit der mitGAmut Plasmid. HINWEIS: Die Zellen werden zunächst mit dem mitGAmut Plasmid, das ein Mitochondrien-Targeting-Sequenz und eine mutierte Aequorin fehlt ein Ca 2+ Bindungsstelle an das grün fluoreszierende Protein (GFP) fusioniert transfiziert. Diese Konstruktion erkennt große Anstiege in der mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme und ermöglicht die Identifizierung von transfizierten Zellen durch das GFP-Fluoreszenz. Das Plasmid wurde entwickelt und freundlicherweise von P. Brulet und Mitarbeiter 18 (CNRS, Paris) zur Verfügung gestellt. <ol><li> Bereiten Neurobasal TF, enthält Neurobasal Kulturmedium ohne fötales Rinderserum, B27, gentamicin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Bereiten Sie 50 ul Neurobasal TF plus 2,5 ul Transfektionsreagenz in einem Fläschchen (Lösung A). Bereiten Sie 50 ul Neurobasal TF plus 4 ug mitGAmut Plasmid in einem Fläschchen (Lösung B). Sanft hinzufügen Lösung B über Lösung A. Lassen Mischen während 20 min ohne Schütteln. </li><li> Übertragen Sie die Deckgläser haltigen Neuronen im Hippocampus, neue Multischale Platten, enthaltend 200 &amp; mgr; l frisches Neurobasal TF. </li><li> In tropfenweise 100 ul Lösung A + B über jedes Deckglas. Inkubation für 30 min. Entfernen Sie das Medium. Einmal Zellen mit frischem Neurobasal TF waschen. Bringen Sie die Deckgläser auf den ursprünglichen Neurobasal Kulturmedium. </li><li> Kultur Neuronen für zusätzliche 24 h bei 37 ºC und 5% CO 2 nach der Transfektion, um eine effiziente Expression und Ausrichtung der Sonde zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Herstellung von Testlösungen für Biolumineszenz-Bildgebung. <ol><li> Bereiten HBS Lösungen, die NMDA-100 um oder 145 mM KCl alsoben beschrieben (Schritt 2.1). Vorbereitung HBS-Lösung, die 10 mM Ca 2+ und Digitonin 100 uM. </li></ol></li><li> Rekonstitution von Mitochondrien-Targeting Aequorin mit Coelenterazin n. <ol><li> Transferdeck transfiziert Hippocampusneuronen zu einem Vier-Loch-Platte, die 200 &amp; mgr; l HBS. </li><li> In 4 ul Coelenterazin n (200 &amp; mgr; M) zu 200 ul HBS für eine Endkonzentration von 4 &amp; mgr; M und vorsichtig mischen. Inkubation für 2 Stunden bei RT (25 ° C) und bei Dunkelheit. </li></ol></li><li> Aufzeichnungs Biolumineszenz Bilder mitochondriale [Ca 2+]. <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, die Lampe, das Perfusionssystem, Biolumineszenz-Kamera und dem Computer. </li><li> Übertragen rekonstituiert Deckgläser in eine thermostatisierte (37 ° C) Perfusionskammer und perfundieren kontinuierlich mit vorgewärmter HBS-Lösung mit einer Rate von 5-10 ml / min. </li><li> Unter Verwendung eines 40X-Objektiv (Öl, NA: 1,3), wählen Sie eine mikroskopische Feld mit Zellen, die einpoaequorins wie durch Fluoreszenzemission mit der Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) assoziiert mit den FITC-Filter dargestellt. Eine typische Feld kann 1-2 transfizierte Zellen enthalten. Nehmen Sie das GFP-Fluoreszenzbild, mit einer CCD-Kamera. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop Licht. Entfernen Sie die dichroitischen haltigen Box in der Lichtpfad befindet. Schalten Sie das Anregungslicht und schließen Sie die Dunkelfeld für völliger Dunkelheit. </li><li> Perfundieren Zellen in 5-10 ml / min mit HBS Medium mit oder ohne Testlösungen bei 37 ° C vorgewärmt. </li><li> Erfassen Photonenemissions Bilder alle 10 sec mit einer Photonenzählung Kamera mit einem Bildprozessor abgewickelt. </li><li> Am Ende jedes Experiments permeabilisieren Zellen mit 0,1 mM Digitonin in 10 mM CaCl 2 in HBS, um alle verbleibenden Photonenemissionen zu lösen. Hinweis: Diese photonischen Emissionen müssen, um die Gesamtphotonenemissionen, eine für die Kalibrierung in Ca 2+ Konzentrationen erforderlichen Wert zu schätzen hinzugefügt werden &lt;./ li&gt; <li> Speicher Biolumineszenz Bilder in dem Computer mit dem GFP assoziiert Fluoreszenzbild vor der Photonenzählung Bildgebung erfasst. </li></ol></li><li> Analyse der Biolumineszenz Bilder reflektieren mitochondriale [Ca 2+]. <ol><li> Quantifizierung photonischen Emissionen unter Verwendung spezifischer Software. Photonic-Emissionen zu mitochondrialen freien Ca unter Verwendung des von Brini et al. 15 beschriebenen Algorithmus umgewandelt werden 2+ -Konzentration ([Ca 2+] mit). </li><li> Öffnen Sie das Experiment und die GFP-Fluoreszenz Bild. Ausgewählte Bereiche von Interesse (ROIs) mit Hilfe spezifischer Software, indem die Form der transfizierten Zellen nach den Fluoreszenzbildern zu Beginn des Experiments eingefangen. </li><li> Fügen Sie die gleichen ROIs für jedes Bild. Gesamtphotonenemissionen in jedem ROI mit spezifischer Software, die Lumineszenzemission Wert (L) für jede Zelle in jedem Zeitpunkt zu erhalten, berechnet. </li><li> Alle photonischen EMISS hinzufügenIonen in der Biolumineszenz-Bilder, einschließlich der nach der Digitonin Permeabilisierung, mit der spezifische Software, um eine Biolumineszenz-Bild alle photonischen Emissionen zu erhalten, die erhalten diejenigen. </li><li> Exportwerte von Photonenemissionen für jeden Bereich von Interesse zu einer spezifischen Software für die Berechnungen. Um dies zu tun, klicken Sie auf &quot;Grafik&quot;, um die Biolumineszenz-Werte für jeden ROI zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. Wählen Sie &#39;Gesamtwert&#39; und &#39;verwenden aktuelle ROI für alle Bilder. Drücken Sie &#39;berechnen&#39;. Speichern Sie die &#39;txt.file&#39; und Export von Daten auf ein Arbeitsblatt. Für jede ROI, [Ca 2+] mit berechnet wird unter Verwendung des folgenden Algorithmus: [Ca 2+] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; woher, R = [L / (L Gesamt λ)] 1 / n L die Lumineszenz zu dem Zeitpunkt der Messung in jedem interessierenden Bereich emittiert. L Gesamt istdas nach Zugabe der in dem Gewebe zu diesem Zeitpunkt zu dem Zeitpunkt der Messung für jeden interessierenden Bereich vorhanden Zählungen verbleibende Gesamt Lumineszenz. λ, K TR, K R und n Konstanten, dessen Werte auf Kombination von Aequorin (Wildtyp oder mutierte) und coelenterazin verwendet (Wildtyp oder n-Typ) als auch die Aufzeichnungstemperatur 16. Für die hier verwendete Kombination (mutiert AEQ und coelenterzine n), bei 37 ° C, haben wir die folgenden Werte: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 × 10 3, n = 1204 und λ = 0138. </li></ol></li><li> Stellen die entsprechenden Berechnungen zur Bestimmung der Größe des Anstiegs der Biolumineszenz als Antwort auf jeden Stimulus unter Verwendung eines geeigneten Datenanalyse und grafische Software. </li></ol>

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</ol>

Keiner der Autoren hat konkurrierende oder widersprüchliche Interessen.

Der Umbau von intrazellulärem Ca 2+ Homöostase im alternden Gehirn an kognitiven Verluste in Zusammenhang gebracht, erhöhte Anfälligkeit für ischämische Schädigung, Exzitotoxizität und Neurodegeneration. Um diese Hypothese in vitro zu untersuchen, sind Ca 2+ bildgebenden Verfahren zur Verfügung. Leider lebensfähige Kulturen von Hippocampusneuronen alt sind nicht zuverlässig. Vor kurzem wurde beobachtet, dass die Langzeitkulturen von Ratten-Hippocampusneuronen vorliegenden viele der typisch...

Exzitotoxizität ist einer der wichtigsten Mechanismen, der einen Beitrag zur Neuronenschädigung und Zelltod in neurologischen Beleidigungen wie Ischämie und in einigen neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit ein. Diese Art von Neurotoxizität wird hauptsächlich durch Glutamat wirkend auf Ca 2+ vermittelte -durchlässigen, ionotropen NMDA-Rezeptoren (NMDAR) 2. Exposition von kultivierten Neuronen Glutamat kann Exzitotoxizität 3, die neuronale Apoptose 4 verursacht führen. Wir und andere haben bereits berichtet, dass die neuronale Anfälligkeit für NMDA-induzierte Apoptose bei der Entwicklung in vitro und Alterungs 5-8 ändern. Es ist weithin anerkannt, daß eine Erhöhung der cytosolischen freies Ca 2+ -Konzentration ([Ca 2+] cyt) führt zu Zellen-Aktivierung. Allerdings, wenn dieser Anstieg zu hoch ist und / oder genug aufrechterhalten, kann Zelltod 9 auszulösen. Außerdem wurde vorgeschlagen,daß Exzitotoxizität erfordert mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme 10, da die Behandlung von Neuronen mit einem mitochondrialen Entkoppler geschützt Neuronen gegen Glutamat-induzierte Zelltod 11. Wenn Mitochondrien zu viel Ca 2+ kann die Öffnung der mitochondrialen Permeability Transition Pore auftreten, was zu von Cytochrom c und andere pro-apoptotischen Faktoren und Induktion von Apoptose zu lösen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass diese mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme ist direkt mit der altersabhängigen Anfälligkeit Exzitotoxizität verwandte, durch direktes Messen NMDA-induzierten mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme in einzelnen Neuronen des Hippocampus 5, ein Verfahren, das in diesem Artikel berichtet wird. Der Hippocampus, in physiologischen Prozessen, wie Lernen, Gedächtnis und kognitiven Prozessen 12 beteiligt ist, sehr anfällig für Alterung und neurodegenerativen Störungen 13. Hat, die vorgeschlagen, nach mehreren Wochen in vitro kultiviertHippokampus-Neuronen zeigen eine Reihe von typischen Merkmale Alter von 14 Neuronen. Dementsprechend kann langfristige kultivierten Hippokampus-Neuronen bieten ein umfassendes Modell zur Ca 2+ vermittelte Mechanismen der verstärkten Exzitotoxizität in Alterung zu untersuchen. Das übergeordnete Ziel des vorgestellten Verfahrens ist daher die wesentliche Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ Homöostase oder Ca 2+ Umbau im alternden Gehirn untersuchen, einschließlich der Differential Ca 2+ Reaktionen, die durch NMDA-Rezeptor-Agonisten in einer langfristigen kultivierten Hippokampus-Neuronen ausgelöst . Das Verfahren enthält eine detaillierte Beschreibung der Kultur von Ratten-Hippocampus-Neuronen und die Überwachung der cytosolischen und mitochondriale Ca 2+ Konzentrationen von Fluoreszenz und Biolumineszenz-Bildgebung in einzelnen Neuronen auf. Fluoreszenz-Imaging der cytosolischen Ca 2+ in kultivierten Neuronen ist ein Standardverfahren. Jedoch ist dieses Verfahren zum Unter unzuverlässigerzelluläre Ca 2+ Messungen einschließlich mitochondrialen Ca 2+. Gründe dafür sind mangelhafte Ausrichtung der synthetischen Sonden und unangemessen Affinität für Ca 2+ Konzentrationen, die in den Mitochondrien von dem niedrigen Niveau uM sogar zum mM Ebene ändern können. Die Verwendung von Ca 2+ Sonden der Basis von Proteinen, wie zum Beispiel Aequorin, gestattete es dem Targeting subzellulären Organellen und die Verwendung von Derivaten unterschiedlichen Ca 2+ mit unterschiedlichen Affinitäten Coelenterazine oder mutierte Sonden fehlt spezifischen Ca 2+ Bindungsstellen 15. Auf diese Weise können Biolumineszenz-Bildgebung von Zellen Mitochondrien ziel Aequorin Expression der Überwachung der mitochondrialen Ca 2+ -Konzentrationen in einzelnen Neuronen zu ermöglichen. Doch kann dieses Verfahren erfordern die Verwendung von Photonenzählung Kameras oder CCD-Kameras für ultra Biolumineszenz-Bildgebung 16-18. Diese Methode kann neue Ergebnisse, die in mehr establ bestätigt werden sollteIshed Gehirnaltern Modelle wie zum Beispiel Gehirnschnitten von alten Tieren.

<table><tbody><tr><td>Neurobasales Kulturmedium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Medium</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Medium</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (aus der Bauchspeicheldrüse)</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Bobine Serum</td><td>Lonza</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Glasdeckgläser</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Multidish-Plaques</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Petryschalen</td><td>JD Catalan s.l.</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazin n</td><td>Biotium</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 TV Mikroskop</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite Iluminationssystem</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER Fluoreszenzkamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VIM Photonenzählung CCD-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VC-8 Ventilsteuerung</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SH-27B Heizsystem&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquacosmos Software</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszenz- und biolumineszenz-bildgebung subzellulärer ca<sup&gt; 2+</sup&gt; im alter von neuronen im hippocampus

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Anfälligkeit für Neuronen Zelltod zu Neurodegeneration und Ischämie verbunden sind außerordentlich im Alter von Gehirn erhöht, sondern Mechanismen verantwortlich sind schlecht bekannt. Exzitotoxizität, ein Verfahren angenommen, um Neuronenschaden durch beide Beleidigungen induzierte beizutragen, wird durch Aktivierung der Glutamat-Rezeptoren, Ca2 + -Einstrom und mitochondriale Ca 2+ Last fördert vermittelt. Eine wesentliche Änderung der intrazellulären Ca 2+ Homöostase oder Umbau von intrazellulärem Ca 2+ Homöostase kann Neuronenschäden in alten Nervenzellen begünstigen. Zur Untersuchung von Ca 2+ Umbau im Altern haben wir Live Cell Imaging in Langzeitkulturen von Ratten-Hippocampus-Neuronen, die in einigen Aspekten im Alter von Neuronen in vivo ähnlich verwendet. Zu diesem Zweck Hippocampus-Zellen sind, in erster Linie frisch aus neugeborenen Ratten-Hippocampus dispergiert und auf poli-D-Lysin beschichteten Deckgläser plattiert. Dann Kulturen werden in kontrollierten Medien für mehrere Tage aufbewahrt oder mehrere wochen zur Untersuchung von jung und alt Neuronen auf. Zweitens werden kultivierten Neuronen mit Fura2 verladen und nach Messungen des cytosolischen Ca 2+ -Konzentration mit digitalen Fluoreszenzverhältnis Bildgebung unterzogen. Drittens werden kultivierten Neuronen mit Plasmiden ein Tandem von geringer Affinität Aequorin und GFP zu Mitochondrien ziel transfiziert. Nach 24 Stunden wird Aequorin in Zellen mit Coelenterazin rekonstituiert und Neuronen zu Biolumineszenz-Bildgebung für die Überwachung der mitochondrialen Ca 2+ -Konzentration ausgesetzt. Dieses Drei-Schritt-Verfahren erlaubt die Überwachung der cytosolischen Ca 2+ und mitochondriale antwortet relevante Stimuli wie zum Beispiel die Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA und Vergleichen, ob diese und andere Ergebnisse werden durch Alterung beeinflußt. Dieses Verfahren kann neue Erkenntnisse darüber, wie Alterungs Einfluss zytosolischen und mitochondrialen Ca 2+ Antworten auf ausgewählte Stimuli sowie die Prüfung der ausgewählten Medikamente zur Verhinderung von Neuronenzelle gerichtet ergebenTod im altersbedingten Krankheiten.

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um Ca 2+ Umbau und die Effekte von NMDA auf cytosolische und mitochondriale beurteilen [Ca 2+] in gealterten Neuronen. 1 zeigt die schematische Darstellung des Verfahrens zum Isolieren und Kultivieren von hippocampalen Neuronen aus neugeborenen Ratten. Bevor Sie beginnen, müssen wir sterile, Poly-D-Lysin beschichteten Deckgläser vorbereiten und suchen Sie sie in einem 4-Well-Platte. Dann werden neonatalen Ratten getötet und das Gehirn ent...

Intrazellulärer Ca2+-Umbau im Alter kann zu Exzitotoxizität und Neuronenschäden beitragen, Prozesse, die durch Ca2+-Überlastung vermittelt werden. Unser Ziel war es, den Ca2+-Umbau im alternden Gehirn mit Hilfe von Fluoreszenz- und Biolumineszenzbildgebung von zytosolischem und mitochondrialem Ca2+ in Langzeitkulturen von Hippocampus-Neuronen der Ratte, einem Modell der neuronalen Alterung, zu untersuchen.

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kalziumumgestaltung im alternden Gehirn mithilfe von Fluoreszenz- und Biolumineszenzbildgebung von zytosolischem und mitochondrialem Kalzium in Langzeitkulturen von primären hippocampalen Neuronen zu untersuchen, die als Modell für die neuronale Alterung angesehen werden. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Alterungsforschung zu beantworten, beispielsweise wie die Umgestaltung des intrazellulären Kalziums zur Exzitotoxizität und Neuronenschädigung beiträgt, wobei beide Phänomene mit einer Kalziumüberladung in Zusammenhang stehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass es möglich ist, die Kalziumumgestaltung in einzelnen Neuronen genau zu verfolgen, indem Kulturen zu verschiedenen Tagen in vitro (DIV) aus derselben Probe verwendet werden. Die Übertragung dieser Technik könnte sich auf die Therapie eines Schlaganfalls oder einer neurodegenerativen Erkrankung auswirken, da sie ein neuartiges Ziel im Zusammenhang mit Kalziumüberladung bei altersbedingten Erkrankungen darstellt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Fluoreszenz- und Reminiszenz-Bildgebung von zytoplasmatischem und mitochondrialem Kalzium in kurzzeitigen und langzeitigen Kulturen von hippocampalen Neuronen der Ratte durchführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, verteilen Sie die Deckgläser auf einem Streifen aus Paraform in einer Petrischale. Geben Sie dann 200 Mikroliter Poly-D-Lysin mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter auf jedes Deckglas und behandeln Sie sie über Nacht.Am nächsten Tag die Deckgläser unter sterilen Bedingungen alle 15 Minuten über einen Zeitraum von 90 Minuten mit zweifach destilliertem, sterilen Wasser waschen. Die Deckgläser in der Multi-Platte platzieren und bis zur Verwendung in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 aufbewahren. Um die hippokampalen Neuronen zu isolieren, den Schädel der neugeborenen Rattenwelpen mit sterilen Scheren öffnen, das Gehirn mit einem Spatel entnehmen und es schnell in Ham's F12-Medium waschen.Danach mit dem Skalpell in jeder Hemisphäre einen diagonalen Schnitt machen und das Gewebe in die Petrischale mit Hams F 12 Medium unter dem Mikroskop überführen. Die Hirnhäute entsorgen. Den Hippocampus an seiner charakteristischen konkaven Lage über der Großhirnrinde sorgfältig identifizieren.Danach das Hippocampus vorsichtig vom Kortex lösen, indem es behutsam abgezogen und mit Augenscheren entfernt wird. Anschließend die Hippocampus-Stücke in ein Gefäß mit 1,8 Milliliter vorfiltrierter Pepan-Lösung überführen. Diese bei 37 Grad Celsius unter gelegentlichem, sanftem Schütteln 15 Minuten lang inkubieren.Gegeben Sie anschließend 90 Mikroliter der DNA-One-Lösung hinzu. Fügen Sie 50 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie weitere 15 Minuten. Danach überführen Sie das Gewebe in ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und waschen die Fragmente mit frischem Neurobasal-Kulturmedium.Erhalten Sie eine Zellsuspension, indem Sie die Gewebefragmente durch eine fünf Milliliter fassende Plastikpipette pipettieren. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellsuspension bei 160 ×g für fünf Minuten. Entfernen Sie danach den Überstand mit einer sterilen Plastikpipette und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter neurobasalem Kulturmedium mit einer automatischen Ein-Milliliter-Pipette.Messen Sie anschließend die Zelldichte mit einer Neubauer-Zählkammer. Geben Sie 10 Mikroliter Zellsuspension hinzu und zählen Sie die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop. Führen Sie dann entsprechende Berechnungen durch, um 40 bis 80 Mikroliter Zellsuspension zu erhalten, die etwa 30.000 Zellen enthalten.In der Vierer-Platte mit 500 Mikroliter Neurobasal-Medium werden etwa 30.000 Zellen in jede Vertiefung mit Glas-Deckgläsern gegeben. Die Zellen für zwei bis fünf Tage in vitro für junge Neuronen oder mehr als 15 Tage in vitro für alte Neuronen im Inkubator aufbewahren. In diesem Verfahren die Zellen mit weniger 2:00 AM 60 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.Überführen Sie dann die Deckgläser in die Perfusionskammer. Danach platzieren Sie die Perfusionskammer mit dem Deckglas in der Halterung am inversen Mikroskop. Wählen Sie das mikroskopische Feld aus und perfundieren Sie die Zellen kontinuierlich mit vorgewärmtem HBS.Anschließend beleuchten Sie die Zellen bei 340 und 380 Nanometern episch. Registrieren Sie dann abwechselnd alle fünf bis zehn Sekunden das bei 520 Nanometern emittierte Licht mit einer fluoreszenten Kamera, das durch einen Fira-Zwei-Diic-Spiegel gefiltert wird. Um die aufgezeichneten Fluoreszenzbilder zu analysieren, öffnen Sie zunächst die Versuchsdatei mit der Aqua-Cosmos-Software, klicken Sie auf „Ratio“ und wählen den gewünschten Verhältnisbereich aus.Berechnen Sie das Pixel-für-Pixel-Verhältnis in den resultierenden Bildern, um eine Abfolge von Verhältnisbildern zu erhalten. Anschließend subtrahieren Sie den Hintergrund, indem Sie den Hintergrundeliminationsknopf anpassen. Danach drücken Sie auf „Berechnung starten“.Als Nächstes drücken Sie die Schaltfläche für die gesamte Zeitspanne und löschen Sie die alten ROIs für die quantitative Analyse einzelner Zellen. Legen Sie neue ROIs oder die ROIs fest, die den einzelnen Neuronen entsprechen. Um die einzelnen Aufzeichnungen grafisch darzustellen, exportieren Sie die den einzelnen ROIs entsprechenden Verhältnis-Fluoreszenzwerte durch Klicken auf „Grafik“ in das Origin-Lab-Programm.Klicken Sie dann auf Berechnen und speichern Sie die TXT-Datei. Danach führen Sie die entsprechende Berechnung durch, um die Größe des Anstiegs des Fluoreszenzverhältnisses als Reaktion auf jede Stimulation zur Transfektion kultivierter Neuronen mit dem MIT-Mutanten-Plasmid abzuschätzen. Bereiten Sie zunächst 50 Mikroliter Lösung A, die das Transfektionsreagenz enthält, in einem Vial vor.Bereiten Sie anschließend 50 Mikroliter Lösung B, die das MIT-ute-Plasmid in einem Vial enthält, vor. Geben Sie Lösung B zu Lösung A und inkubieren Sie 20 Minuten lang. Danach überführen Sie die Deckgläser mit hippocampalen Neuronen in neue Mehrfachgefäße, die 200 Mikroliter frisches Neurobasal-TF enthalten. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Lösungen A und B tropfenweise über jedes Deckglas und inkubieren Sie 30 Minuten lang.Nach 30 Minuten das Medium entfernen. Die Zellen mit frischem neurobasalem tf waschen. Danach die Deckgläser in das ursprüngliche neurobasalet Kulturmedium zurückgeben und die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion kultivieren, um eine effiziente Expression und gezielte Lokalisation der Sonde zu ermöglichen.Fügen Sie anschließend vier Mikroliter Versiegelungsmittel TEREZIN N zu 200 Mikrolitern HBS hinzu, um eine Endkonzentration von vier Mikromolar zu erhalten. Vorsichtig mischen und zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach zwei Stunden die Deckgläser in die Perfusionskammer überführen und kontinuierlich mit vorgewärmter HBS-Lösung perfundieren.Um die Biolumineszenzbilder der mitochondrialen Kalziumkonzentration aufzuzeichnen, wählen Sie das mikroskopische Feld aus, das die Zellen mit exprimiertem APO-Corin gemäß der Fluoreszenzemission zeigt. Schalten Sie anschließend das Mikroskoplicht aus. Entfernen Sie die im Lichtweg befindliche Box mit dem Dichroik. Schalten Sie dann das Anregungslicht aus und schließen Sie die Dunkelkammer, um völlige Dunkelheit zu gewährleisten. Spülen Sie die Zellen mit HBS-Medium, mit oder ohne Testlösungen, die zuvor auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurden. Erfassen Sie anschließend alle 10 Sekunden die Photonenemissionsbilder mit einer Photonenzählkamera, die über einen Bildprozessor gesteuert wird.Fügen Sie anschließend Digoxin hinzu, um alle verbleibenden Photonen freizusetzen, um biolumineszente Bilder zu analysieren, die das mitochondriale Kalzium widerspiegeln. Öffnen Sie das GFP-Fluoreszenzbild. Wählen Sie einzelne ROIs aus, indem Sie um die transfizierten Zellen herumzeichnen.Kopieren und fügen Sie anschließend dieselben ROIs auf jedes Bild der Sequenz ein. Bildschirmaufnahmen. Danach exportieren Sie die Photonenemissionswerte für jedes ROI zur Berechnung in die spezifische Software, indem Sie auf „Graph“ klicken.Um die Werte für jede ROI zu berechnen, wählen Sie anschließend den Gesamtwert aus und wenden die aktuelle ROI auf alle Bilder an. Drücken Sie danach auf Berechnen, speichern Sie die Textdatei und exportieren Sie die Daten. Führen Sie danach die entsprechenden Berechnungen durch, um die Größe der Anstiege des mitochondrialen Kalziums als Reaktion auf jeden dargestellten Reiz zu schätzen.Hier sind repr&auml;sentative Hellfeld- und Pseudof&auml;rbungsbilder von kurzzeitigen und langzeitigen Kulturen hippocampaler Neuronen vor und nach Stimulation mit 100 Mikromolar und MDA, wobei w&auml;rmere Farben eine erh&ouml;hte zytosolische Kalziumkonzentration widerspiegeln. Diese Spuren zeigen repr&auml;sentative Einzelzell-Aufzeichnungen der zytosolischen Kalziumkonzentration als Reaktion auf 100 Mikromolar und MDA in kurzzeitigen und langzeitigen Kulturen hippocampaler Neuronen. Beachten Sie, dass die Anstiege der zytosolischen Kalziumkonzentration in langzeitig kultivierten Neuronen deutlich st&auml;rker ausgepr&auml;gt sind als in kurzzeitig kultivierten Neuronen.In diesem Experiment wurden kultivierte hippokampale Neuronen mit dem mitochondrienspezifischen, GFP-gekoppelten Korin mit geringer Affinität transfiziert, mit vier Mikromolar Versiegelungsmittel Terezin inkubiert und anschließend einer Biolumineszenzbildgebung der mitochondrialen Kalziumkonzentration unterzogen. Hier sind die Aufnahmen dargestellt, die die Freisetzung von Lichtemissionen zeigen, welche die mitochondriale Kalziumkonzentration in kurz- und langzeitkultivierten hippokampalen Neuronen widerspiegeln. Eine MDA-Konzentration von 100 Mikromolar erhöhte die mitochondriale Kalziumkonzentration in gealterten Neuronen, jedoch nicht in jungen kultivierten hippokampalen Neuronen nach diesem Verfahren.Andere Methoden wie die Beurteilung der gesunden Linkshändigkeit können in denselben Zellen mit Fluoreszenz- und Biolumineszenzbildgebung kombiniert werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der Anfälligkeit für neuronale Zellen, mit dem Altern assoziierte neurodegenerative Prozesse und Ischämie zu beantworten.

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In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

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Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

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