Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca ²⁺ Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Kalziumumbau im alternden Gehirn mittels Fluoreszenz- und Biolumineszenzbildgebung von zytosolischem und mitochondrialem Kalzium in Langzeitkulturen von Hippocampus-Neuronen zu untersuchen, das als Modell der neuronalen Alterung gilt. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich des Alterns zu verstehen, z. B. wie der Umbau von intrazellulärem Kalzium zur Exzitotoxizität und zur Schädigung von Neuronen beiträgt, die beide mit Kalziumüberladung zusammenhängen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es möglich ist, den Kalzium-Umbau in einzelnen Neuronen mit Hilfe von Kulturen bei verschiedenen DYS in vitro aus der gleichen Probenduplikation dieser Technik durch oder Therapie eines Schlaganfalls oder einer Zellkrankheit genau zu verfolgen, da es ein variables neues Ziel im Zusammenhang mit Kalziumüberladung bei diesem Wirkstoff Krankheiten darstellt.

Nachdem er dieses Video gesehen hat, hat Jesus ein gutes Verständnis dafür, wie man Fluoreszenz- und Erinnerungsbildgebung von zytosolischem und mitochondrialem Kalzium in Kurzzeit- und Langzeitkulturen von Hippocampus-Neuronen von Ratten durchführt. Um diesen Vorgang zu starten, verteilen Sie die Deckgläser auf einem Streifen Paraform in einer Petrischale. Dann 200 Mikroliter Poly-D-Lycin zu einem Milligramm pro Milliliter auf jeden Deckglas auftragen und über Nacht behandeln.

Waschen Sie die Deckgläser am nächsten Tag alle 15 Minuten 90 Minuten lang unter sterilen Bedingungen mit doppelt destilliertem sterilem Wasser. Legen Sie die Deckgläser in den Multi und bewahren Sie sie bis zum Gebrauch in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 auf. Um die Neuronen des Hippocampus zu isolieren, öffnet man den Schädel der neugeborenen Rattenbabys mit einer sterilen Schere, extrahiert das Gehirn mit einem Spatel und wäscht es schnell in Schinken F 12 Medium.

Machen Sie dann mit dem Skalpell in jeder Halbkugel einen diagonalen Schnitt und übertragen Sie ihn unter dem Mikroskop in die Petrischale mit Schinken F 12 Medium. Entsorgen Sie die Hirnhäute. Identifizieren Sie vorsichtig den Hippocampus an einer charakteristischen konkaven Stelle über dem Kortex.

Trennen Sie dann den Hippocampus von der Hirnrinde, indem Sie ihn vorsichtig wegziehen und mit einer Augenschere entfernen. Übertragen Sie anschließend die Hippocampusstücke in ein Fläschchen mit 1,8 Millilitern vorgefilterter Pepanlösung. Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius unter gelegentlichem leichtem Schütteln für 15 Minuten.

Fügen Sie dann 90 Mikroliter DNA-Lösung hinzu. Fügen Sie 50 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie sie weitere 15 Minuten. Übertragen Sie danach das Gewebe in ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Fragmente mit frischem Neuro-Basalkulturmedium.

Erhalten Sie eine Zellsuspension, indem Sie die Gewebefragmente durch eine Fünf-Milliliter-Kunststoffpipette führen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 160 g. Entfernen Sie anschließend das Supinat mit einer sterilen Weidepipette aus Kunststoff und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit einer automatischen Ein-Milliliter-Pipette in einem Milliliter Neuro-Basalkulturmedium.

Messen Sie anschließend die Zelldichte mit einer Neubauer-Zählkammer. Fügen Sie 10 Mikroliter Zellsuspension hinzu und zählen Sie die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop. Führen Sie dann entsprechende Berechnungen durch, um 40 bis 80 Mikroliter Zellsuspension zu erhalten, die etwa 30.000 Zellen enthält.

In der Vier-Well-Platte, die 500 Mikroliter neuronales Basalmedium enthielt, spielten etwa 30.000 Zellen in jede Vertiefung mit Glasabdeckfolien. Bewahren Sie sie zwei bis fünf Tage in vitro für junge Neuronen oder mehr als 15 Tage in vitro für gealterte Neuronen im Inkubator auf. Bei diesem Verfahren inkubieren Sie die Zellen mit weniger 2:00 Uhr morgens für 60 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Übertragen Sie dann die Deckgläser in die Profusionskammer. Legen Sie danach die Profusionskammer mit dem Deckglas in die Halterung auf das inverse Mikroskop. Wählen Sie das mikroskopische Feld und perfundieren Sie die Zellen kontinuierlich mit vorwarmem HBS.

Anschließend beleuchten epi die Zellen bei 340 und 380 Nanometern. Alternativ können Sie dann das bei 520 Nanometern emittierte Licht alle fünf bis 10 Sekunden mit einer Fluoreszenzkamera aufnehmen, die von einem fira two diic-Spiegel gefiltert wird. Um die aufgenommenen Fluoreszenzbilder zu analysieren, öffnen Sie zunächst die Experimentdatei mit der Aqua Cosmos-Software, klicken Sie auf Verhältnis und wählen Sie den gewünschten Verhältnisbereich aus.

Berechnen Sie das Pixel-für-Pixel-Verhältnis in den resultierenden Bildern, um eine Abfolge von Verhältnisbildern zu erhalten. Subtrahieren Sie dann den Hintergrund, indem Sie die Schaltfläche zum Entfernen des Hintergrunds anpassen. Drücken Sie danach auf Berechnung starten.

Drücken Sie anschließend die Taste für die gesamte Zeitsequenz und löschen Sie die alten ROIs für die quantitative Analyse einzelner Zellen. Legen Sie neue ROIs fest, d. h. die ROIs, die den einzelnen Neuronen entsprechen. Um die einzelnen Aufnahmen grafisch darzustellen, exportieren Sie die Fluoreszenzwerte des Verhältnisses, die jedem ROI entsprechen, in das Origin-Laborprogramm, indem Sie auf Diagramm klicken.

Klicken Sie dann auf Berechnen und speichern Sie die TXT-Datei. Führen Sie danach die entsprechende Berechnung durch, um die Größe des Anstiegs des Fluoreszenzverhältnisses als Reaktion auf jede Stimulation zur Transfektion kultivierter Neuronen mit dem MIT-mutierten Plasmid abzuschätzen. Bereiten Sie zunächst 50 Mikroliter Lösung A mit Transfektionsreagenz in einem Fläschchen vor.

Bereiten Sie anschließend 50 Mikroliter Lösung B, die das MIT-Plasmid enthält, in einem Fläschchen vor. Geben Sie Lösung B zu Lösung A und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang. Übertragen Sie danach die Deckgläser mit den Hippocampus-Neuronen in neue Multischalen mit 200 Mikrolitern frischem neurobasalem TF. Dann 100 Mikroliter Lösung A und B tropfenweise über jedes Deckglas geben und 30 Minuten inkubieren.

Entfernen Sie nach 30 Minuten das Medium. Waschen Sie die Zellen mit frischem neurobasalem TF. Nach der Rückgabe wird das Deckglas in das ursprüngliche neuro-Basalkulturmedium eingelegt und die Zellen nach der Transfektion 24 Stunden lang kultiviert, um eine effiziente Expression und Ausrichtung der Sonde zu ermöglichen.

Als nächstes fügen Sie vier Mikroliter Dichtstoff TEREZIN N zu 200 Mikrolitern HBS hinzu, um eine Endkonzentration von vier Mikromolaren zu erhalten. Vorsichtig mischen und zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach zwei Stunden die Deckfolien in die Perfusionskammer übertragen und kontinuierlich mit vorgewärmter HBS-Lösung durchblättern.

Um die Biolumineszenzbilder der mitochondrialen Kalziumkonzentration aufzuzeichnen, wählen Sie das mikroskopische Feld aus, das die Zellen enthält, die APO Corin exprimieren, wie durch Fluoreszenzemission gezeigt. Schalten Sie anschließend das Mikroskoplicht aus. Entfernen Sie die dichroitische enthaltende Box, die sich im Lichtweg befindet.

Schalten Sie dann das Erregungslicht aus und schließen Sie die Dunkelbox, um vollständige Dunkelheit zu erhalten. Die Zellen werden mit HBS-Medium perfundiert, mit oder ohne Testlösungen, die bei 37 Grad Celsius vorgewärmt werden. Nehmen Sie dann alle 10 Sekunden die photonischen Emissionsbilder mit einer Photonenzählkamera auf, die mit einem Bildprozessor bedient wird.

Fügen Sie als Nächstes dig toin hinzu, um alle verbleibenden Photonen freizusetzen Um biolumineszierende Bilder zu analysieren, die mitochondriales Kalzium widerspiegeln. Öffnen Sie das GFP-Fluoreszenzbild. Wählen Sie einzelne ROIs aus, indem Sie um die transfizierten Zellen zeichnen.

Kopieren Sie dann die gleichen ROIs und fügen Sie sie auf jedes Bild der Sequenz ein. Screenshots. Exportieren Sie danach die photonischen Emissionswerte für jeden ROI in die spezifische Software, um das Diagramm zu berechnen.

Um die Werte für jeden ROI zu berechnen, wählen Sie den Gesamtwert aus und verwenden Sie den aktuellen ROI für alle Bilder. Drücken Sie anschließend auf Berechnen, speichern Sie die Textdatei und exportieren Sie die Daten. Führen Sie als Nächstes die entsprechenden Berechnungen durch, um die Größe des Anstiegs des mitochondrialen Kalziums als Reaktion auf jeden gezeigten Stimulus abzuschätzen.

Hier sind die repräsentativen Hellfeld- und Pseudofarbbilder von Kurzzeit- und Langzeitkulturen von Hippocampus-Neuronen vor und nach der Stimulation mit 100 Mikromolaren und MDA-wärmeren Farben, die eine erhöhte zytosolische Kalziumkonzentration widerspiegeln. Diese Spuren zeigen die repräsentativen Einzelzellaufzeichnungen der zytosolischen Calciumkonzentration als Reaktion auf 100 Mikromolare und MDA in Kurzzeit- und Langzeitkulturen von Hippocampus-Neuronen. Beachten Sie, dass der Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration langfristig viel größer ist als bei kurzfristig kultivierten Neuronen.

In diesem Experiment wurden kultivierte Hippocampus-Neuronen mit den auf Korin mit niedriger Affinität abzielenden Korin transfiziert, mit GFP inkubiert, mit vier mikromolaren Dichtungsmitteln Terezin inkubiert und einer Biolumineszenz-Bildgebung der mitochondrialen Kalziumkonzentration unterzogen. Hier sind die Aufnahmen, die die Freisetzung von Photoemissionen zeigen, die mitochondriales Kalzium in kurz- und langfristig kultivierten Hippocampus-Neuronen reflektieren. Ein MDA 100 mikromolar erhöhte die mitochondriale Kalziumkonzentration in gealterten Neuronen, jedoch nicht in jungen kultivierten Hippocampus-Neuronen Nach diesem Verfahren.

Andere Methoden wie das Fair-Left-Assessment können mit Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung in denselben Zellen kombiniert werden, um zusätzliche Fragen wie Anfälligkeit für Neuronenzellen, Blei im Zusammenhang mit alternder Neurodegeneration und Ischämie zu beantworten.