Name: Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Erfahren Sie die lasergestützte neuronale Tracing-Methode in Hirn-Explantaten zur präzisen Markierung von Neuronen und axonalen Projektionen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung neuronaler Schaltkreise in der Neurowissenschaft.

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Teilweise durch NIH / NCRR Colorado CTSI Statt Anzahl UL1 RR025780 und den Rocky Mountain Neurlogical Disorders Kernmitte Statt NIH P30NS048154 Unterstützt von NIH / wurden NIDCD R01 DC 011582. Imaging Experimente in der Universität von Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Kerndurchgeführt unterstützt. Dr. Sascha du Lac aus dem Salk Institute hat uns mit den GlyT2-GFP-Mäusen.

1. Optische Genotypisierung 1. Optische Genotypisierung von Maus Pups <ol><li> Check für die Expression des jeweiligen Fluoreszenzmarker mit einem Laserzeiger des geeigneten Anregungswellenlänge (405 nm in den hier beschriebenen Experimenten) und entsprechenden Filterbrille Blockierung der Anregungswellenlänge aber Passieren der Emissionswellenlänge (450 - 700 nm in den hier beschriebenen Experimente) . Richten Sie den Laserpointer auf der Rückseite des Kopfes oder das Rückenmark der Maus pup (siehe Abbildung 1). Vermeiden Aufstrahlen des Lasers in den Augen und langwierige Exposition der Haut mit Laserlicht. </li></ol> 2. Optische Genotypisierung von älteren Tieren <ol><li> Die Maus (im Alter von p14 an p138 in den hier beschriebenen Experimenten) mit einer Überdosis Pentobarbital tief betäuben durch eine intraperitoneale Injektion (120 mg / kg Körpergewicht). Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Überprüfung des Tieres Reflexe (kurz Prise der Spitze the Ohr oder einem der Hinterbeine auf die Rückzugsreflex des Ohres oder Bein) hervorzurufen. </li><li> Hinweis: Trotz der Verwendung einer Überdosis Pentobarbital (120 mg / kg Körpergewicht), verweisen wir auf das Injektionsverfahren als &quot;tiefe Narkose&quot; statt Euthanasie, weil das Tier ist im Idealfall noch am Leben (dh seinen Herz noch schlägt), wenn die Chirurgie und die Durchblutung beginnen. Dies gewährleistet eine effizientere Perfusion der inneren Organe, einschließlich des Gehirns. </li><li> Sobald das Tier keine Reflexe zeigen, aufmerksam, indem sie ein Schnitt in der Haut für den Hinterkopf und Schneiden, um den Mittelteil des Schädels entfernen Sie die Haut über den Schädel (2A). Setzen Sie das aufgedeckt Schädel mit Laserlicht und beobachten die Fluoreszenz durch die Filterbrille, wie oben beschrieben. Wenn eine positive GFP-Signal beobachtet wird, fahren Sie mit Schritt 2 zweite, wenn nicht, zu opfern das Tier durch Enthauptung (/ Gewährleistung Form von Euthanasie nach unsererIACUC Vorschriften). </li></ol> Anmerkung: In noch älteren Mäusen (&gt; 1 Monat) der Fluoreszenz kann durch die Augen der Tiere beobachtet werden. 2. transkardialer Perfusion und Neuro Vorbereitung <ol><li> Perfundieren transkardial mit eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH 2 PO 4 1,76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mm) unter Verwendung einer 30 G-Spritzennadel, um das Blut weitgehend entfernen das Tier. <ol><li> Zunächst öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb mit einer scharfen Schere, und drücken Sie dann die Nadel in die linke Herzkammer. Pumpen die PBS in das Herz und die Aorta und unmittelbar nach diesem Schritt zu öffnen in den rechten Vorhof des Herzens mit der Schere, um die Blut zuzulassen, um den Körper zu verlassen. Hinweis: Perfusion dauert 5 - 10 min in Abhängigkeit von der Größe des Tieres. </li></ol></li><li> Nach dem Ausbluten durch Perfusion, enthaupten, das Tier, sichern Sie den Kopf mit Stift needles (oder 30 G Spritzennadeln) durch Durchstechen sie durch die Augenhöhlen in einer Zubereitung Schale und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel. <ol><li> Verwenden Sie zuerst eine scharfe Schere zu schneiden Sie die Haut, die über der Schädel: einen kleinen Schnitt in der Rückseite des Kopfes, dann entlang der Mittellinie auf der Rückenseite des Kopfes geschnitten, an den Seiten nur kaudal der Augen des Tieres geschnitten und schließlich Kürzung der kaudal vollständig die Klappen der Haut zu entfernen, an der Rückseite des Kopfes. </li><li> Weiter, wiederholen Sie den gleichen Schnittmuster für den Schädel selbst, stellen Sie sicher, beide Kochleas in dem Prozess zu entfernen, da dies wesentlich die Entfernung der Hirnstamm am Ende zu vereinfachen. Nach diesem Vorgang ist die Schwanzgehirnhälfte sollte vollständig ausgesetzt liegen. </li><li> Im nächsten Schritt, mit einem scharfen Rasierklinge oder einem Skalpell durch den gesamten Vorderhirn in einem Winkel von etwa 45 ° und etwa 2 mm rostral aus dem Cerebellum ausgeschnitten. Scoop aus der abgetrennten vorderen Hälfte des Gehirns mit abent Spachtel. </li><li> Verwenden Sie den Spachtel, um den kaudalen Hirnhälfte an seinem rostralen Ende zu erheben und anschließend durch den Hirnnerven, die noch auf den Hirnstamm auf ihrer Bauchseite verbunden sind, geschnitten. Als Ergebnis sollte der kaudalen Hirnhälfte einschließlich des Hirnstamms frei aus dem Rest der präparierten Tier den Kopf fallen. </li><li> Klappen Sie den entfernt kaudale Hälfte des Gehirns, seine Bauchseite freizulegen und entlang der Frontalebene nur rostral geschnitten (für die anterograde Injektionen) oder einfach Schwanz (für die retrograde Injektionen) der ventral gelegen &quot;Birnen&quot;, die die trapezförmige Körper (siehe Schritt 2.3). <ol><li> Verwenden Sie immer eine scharfe Rasierklinge oder einem Skalpell für den Schneidvorgang, um den Zelltod durch übermäßige mechanische Beanspruchung des Gewebes zu minimieren. Als Endergebnis sollte ein Gehirn Explantat spannt etwa 1 cm in der Länge und mit der vollständigen oberen Olivenkomplex entlang anderen Hirnregionen erhalten worden sein. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Hinweis: Dieses Protokoll zeigt die Vorgehensweise für eine Tracerinjektion in die Trapezkörper im auditorischen Hirnstamm befindet. Passen Sie die Position und Ausrichtung der Schnittebenen und Injektionsstellen nach Bedarf. Wenn die fluoreszierende Gehirnregionen von Interesse liegen nahe genug an der Hirnoberfläche, so dass sie identifiziert und ohne Schneiden des Gehirns injiziert werden kann (siehe 2B), kann der koronalen Schneideschritt weggelassen werden. <ol start="3"><li> Identifizieren Sie die trapezförmigen Körper als zwei ventralen prominente &quot;Birnen&quot;, die den ventralen Kern der Trapezkörper (VNTB). </li></ol> Hinweis: Weitere anatomischen Referenz über die ungefähre stereotaktische Position dieser Schnittebenen finden Franklin &amp; Paxinos, 2008 Steuerung 78 des Atlas, Bregma ~ -5,7 mm zeigt die mediale Kern der Trapezkörper (= MNTB) als &quot;Tz markiert &quot;. Panel 69 zeigt die ventralen Kern des Trapezes body (VNTB) als &quot;MVPO&quot; (medioventralen periolivary Kern) 19 bezeichnet. 3. Anterograde / Retrograde Tracing Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte bei RT (25 ° C). <ol><li> Nach dem Schneiden, legen den Hirnstamm Explantat in einer Zubereitung Schale mit oxygeniertem (95% O 2, 5% CO 2) Präparieren Lösung (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 0,1 mM, Glucose : 25 mM NaH 2 PO 4 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM Ascorbinsäure: 0,4 mM, myo-Inosit 3 mM, Brenztraubensäure: 2 mm) und schützt sie mit 30 g Spritzennadeln. Sicherzustellen, dass der Bereich der Injektion nach oben zeigt. </li><li> Pull-Spritzen Pipetten aus Borosilikatglas und füllen sie mit einer der folgenden drei Lösungen: a) einer 1,0 mg / ml Lösung von Choleratoxin-Untereinheit-b konjugierten auf ein Fluorophor Alexa 555 in PBS 12-13 (vor allem für die retrograden Transport verwendet), b ) eine 1% -dilution in 0,9% Salzlösung von Dextran Tetramethylrhodamin 555 (3000 MW, die hauptsächlich für den retrograden Transport verwendet wird) oder c) ein 1% Herkunft des Verdünnungs in 0,9% Salzlösung von 10.000 MW Dextran-TRITC 555 (hauptsächlich für anterograden Transport verwendet wird). <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Injektionspipette Widerstände Bereich von 2,5 bis 3,5 MOhm und dass sie in 3 hergestellt - 4 Ziehen Zyklen. Für die hier beschriebenen Experimente erreichen dies durch Auswahl einer vorprogrammierten Algorithmus Ziehen an der Pipettenzieher. </li></ol></li><li> Beleuchten das Gehirn Explantat mit einem statisch montiert Laserzeiger der geeigneten Wellenlänge (Element No. 2 in 3A; 405 nm Wellenlänge in die hier beschriebenen Experimente). Verwenden Sie den Laserpointer als Leitfaden für die Injektionen, und das Ziel des Laserstrahls an der fluoreszierend markierten Hirnkern oder Zellen von Interesse, die eingespritzt wird. </li><li> Suchen und durch ein Binokular beachten Sie die beleuchtete Zielbereich beim Tragen die kompatiblen Filterbrille (450-700 nm Bandpassfilter in den hier beschriebenen Experimenten). Legen Sie die Injektionselektrode über den Mikromanipulator in das Gebiet von Interesse. </li><li> Spritzen Sie die Tracersubstanz. Die Einspritzungen bestehen aus 2 bis 10 Druckimpulse bei 15 psi für 50 msec, unter Verwendung einer Einspritzvorrichtung, die senkrecht in die Region von Interesse (ROI) gerichtet im Gehirn an. Verwalten jeder Druckimpuls in Intervallen von 10 bis 15 sec, damit der Farbstoff verteilt. </li><li> Im Fall der Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) Injektionen stimulieren zusätzlich elektrisch mit der Farbstoffaufnahme durch Elektroporation mit der Elektrode in dem Bereich des Gehirns von Interesse (MNTB und VNTB in den hier beschriebenen Experimenten) platziert zu verbessern. <ol><li> 8 verwenden TTL-Impulse von 8 Volt für 50 msec 50 msec Impulsintervallen durch einen Stimulator mit einer Stimulationsisolationseinheit (Artikel No. 7 und 9 in 3B) angetrieben wird und mit 55 V verstärkt. Verwenden von 10 bis 20 Wiederholungen dieses Protokolls VerwalNamen über mehrere Minuten 7,8. Stellen Sie sicher, um die Elektrode richtig geschliffen - das Erdungskabel sollte auf die Badlösung angeschlossen werden! </li></ol></li><li> Überprüfen Sie für den Erfolg der Injektion. Da ein fluoreszierender Tracer mit einer längeren Emissionswellenlänge wird auch Emittieren eines Fluoreszenzsignals auf die Laseranregung mit kürzeren Wellenlängen, visuell zu überprüfen, für die Farbstoffaufnahme / der eingespritzten Zielfläche verteilt, während Beleuchten der Fläche mit dem Laser und die Beobachtung durch die Filterbrille. </li></ol> 4. Inkubation <ol><li> Nach der Injektion inkubieren brainstems in oxygeniertem künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 2 mM, Glucose: 25 mM NaH 2 PO 4 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM Ascorbinsäure: 0,4 mM, myo-Inosit 3 mM, Brenztraubensäure: 2 mm, mit 95% O 2 eingeblasen - 5% CO 2) bei Raumtemperatur (RT, 25 ° C) für 1 - 4 Stunden, währendder Farbstoff transportiert wird. Blasen die Lösung während der gesamten Inkubationszeit. </li><li> Anschließend übertragen die brainstems in 4% Paraformaldehyd (PFA), gelöst in PBS (ca. 100 ml;. PH 7 für den PFA / PBS mix) und inkubieren bei 4 ° C, um nach der Fixierung über Nacht ermöglicht (O / N). </li></ol> 5. Tissue Slicing und Montage <ol><li> Am nächsten Tag, waschen Sie den Hirnstamm dreimal in PBS (5 min pro Waschschritt), bedecken Sie es in 4% Agar und dann in 50 geschnitten - 80 &amp; mgr; m dicke Scheiben auf einem Vibratom. Berg Scheiben mit Hilfe eines Montagemedium auf einen Objektträger und Deckglas. </li><li> Wahlweise kennzeichnen die Abschnitte mit fluoreszierenden Nissl für 25 Minuten (zum Beispiel blau Nissl bei einer 1: 100 Verdünnung in AB-Medien). <ol><li> Um AB Medien vorzubereiten, mischen Sie 250 ml von 0,2 M Phosphatpuffer (PB; 51 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml ddH 2 O und 5 g Rinderserumalbumin. </li><li> Precede und erfolgreich die Nissl Kennzeichnung Schritt 3 Waschschritten in PBS (jeweils 10 Minuten). </li></ol></li></ol> Anmerkung: Für den Fall, dickeren Abschnitten montiert werden müssen und analysiert (hier solche Scheiben beschriebenen Experimente wurden 100 bis 500 Mikrometer dick, um Axon-Verbindungen über größere Distanzen zu erhalten), kann die Technik mit Gewebe Clearing kombiniert werden. Wir fanden das ClearT2 12 erfolgreiche 20 zu sein. Wenn ein Gewebe Verrechnungsschritt enthalten ist, führen sie vor der Montage der Teile.

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<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Eine allgemeine Stärke in vitro Tracer Elektroporation, im Gegensatz zu in vivo Darstellung Studien ist, dass es Forschern besseren Zugang zum Gehirn Bereich von Interesse und folglich nicht teuer stereo (und oft elektro) Ausrüstung umfassen. Darüber hinaus ist die für das Gehirn Explantate erforderliche Überlebenszeit erstreckt sich über nur ein paar Stunden (1 - 4) anstelle von Tagen oder sogar Wochen im Fall von in vivo-Tracer Injektionen (siehe eine detaillierte Überprüfung auf der Verwend...

Um eine bestimmte neuronale (Mikro-) Schaltung zu definieren, muß man durch Auffinden der verschiedenen Teilnehmer der Schaltung und ihre Verbindungsstruktur zu beginnen. Seit Wallers Publikation über neurofiber Verfolgung durch Läsion 1 eine Vielzahl von neuroanatomischen Tracing-Techniken hergestellt wurde. Einige dieser Techniken können in festen Gewebe post mortem 2-4 angewendet werden, andere stützen sich auf den aktiven Transport des Farbstoffes in lebenden Neuronen, wie 1971 5-6 entdeckt. Letztere kann weiter in zwei Gruppen Unterscheiden zwischen Methoden unter Ausnutzung der aktiven retrograden unterteilt werden (von der Injektionsstelle zu der Quelle eines gegebenen Vorsprungs, dh. Die Zellkörper von Neuronen, die vorstehen, sind an der Fläche) und aktive anterograde (von der eingespritzten Bereich in den Ziel einer gegebenen Projektion, d. axonalen Vorsprüngen und den axonalen Anschlüssen des markierten Neuronen) transport. Auch in einigen Fällen tracer Material in lebende Tiere, die dann überleben die Injektion von mehreren Tagen oder Wochen (in vivo Tracer Injektionen), während in anderen Fällen explantierten Gehirn injiziert werden und Inkubation für mehrere Stunden nach der Injektion in der künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit injiziert (in vitro Tracer Injektionen) . In diesem Protokoll modifizierten wir ein in vitro Elektroporationstechnik 7-8 bestehende neuronale Zellkörper und Prozesse in anterograden und retrograden Verfolgungsexperimente mit Choleratoxin-Untereinheit B und Tetramethylrhodamin Dextran als Verfolgungssubstanzen zu markieren. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Neurowissenschaftler mit einem effizienten Werkzeug, um neuronale Konnektivität Muster zwischen verschiedenen Hirnkerne verfolgen zu schaffen, und gleichzeitig die Vorteile der verfügbaren transgenen Mauslinien und Grund optische Geräte, um die Zielgenauigkeit beim Tracer Injektionen erhöhen. Obwohl das Verfahren der anterograden und retrograden Verfolgung mitCholeratoxin und Dextran Amin und ihre jeweiligen fluoreszenzmarkierten Konjugaten ist nicht neu 9-13 (ebenso wie die Methode der Elektroporation, z. Haas et al. 14), die Kombination von Tracer-Injektionen mit Elektroporation in einem in vitro-Präparat mit Blöcken von Hirngewebe ist eine neuere Entwicklung 7. Sein Hauptvorteil, neuronale Verfolgungstechniken unter Verwendung der gleichen Art von Tracer Farbstoffe in lebenden Tieren ist die erhöhte Markierungsintensität, wegen der höheren Effizienz, mit der das elektroporierte Farbstoff wird durch Neuronen entnommen. Ein zusätzlicher Vorteil ist die verkürzte Inkubationszeit (für die Farbstofftransport erforderlich) und seine erhöhte Zielgenauigkeit während der Tracerinjektion, weil der Experimentator visuelle Kontrolle über den Zielbereich der Injektion. Letzteres bedeutet, dass auch keine teuren stereo Ausrüstung erforderlich, um den Kern oder Gehirnbereich von Interesse zu finden. Um additional erhöht Zielgenauigkeit, nutzten wir eine transgene Mauslinie, die GFP in seiner glycinergen Subpopulation von Neuronen 15 und optischen Grundausrüstung, bestehend aus einem Hand-Laser-Pointer von 405 nm Wellenlänge und passenden Bandpassfilterung Brille (450 drückt - 700 nm). Somit eine erhebliche weitere Steigerung erzielten wir die Zielgenauigkeit durch die Identifizierung der Injektionsbereich durch seine Fluoreszenzsignals und durch Vorsehen einer feineren Weg für den Farbstoff Streuung in der Injektionsbereich durch Beobachtung der Wechselwirkung zwischen der indigenen GFP-Signals und der Kopierregel Fluoreszenz. Unser Verfahren ermöglicht es auch, die Funktion eines Schaltkreises zusammen mit der Konnektivität durch Identifizieren GFP-positive inhibitorische Neuronen (oder in anderen exzitatorischen Mauslinien), die mit dem Tracer gefüllt waren aufzudecken. Zusammenfassend haben wir weiter verbessert ein leistungsfähiges Werkzeug, um die neuro Connectome des Wirbeltiergehirns zu studieren und zu beurteilen ter verschiedene neuroanatomische Merkmale eines gegebenen neurocircuit. Durch Verwendung von transgenen Mäusen zusammen mit preiswerten und überall erhältlich optische Geräte konnten wir die Zielgenauigkeit der Injektionen deutlich erhöhen. Darüber hinaus konnten wir die transgenen Mäuse, die Art der zurück Verbindungen, die Aufdeckung der Funktionalität einer inhibitorischen Mikroschaltung im auditorischen Hirnstamm geholfen zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Alle Chemikalien stammen von Sigma-Aldrich, sofern nicht anders angegeben.</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid&nbsp;</td><td></td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat einbasisch</td><td></td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td></td><td>S907</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td></td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td></td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td></td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td></td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td></td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Myo-Inositol</td><td></td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td></td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td></td><td>A2153</td><td>optional, für zusätzliche (Immun-)Histochemie</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td></td><td>X100</td><td>optional, für zusätzliche (Immun-)Histochemie</td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol), 8000 MW</td><td></td><td>P2139</td><td>optional, für die Reinigung des Gehirns</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84</td><td>optional, für die Reinigung</td></tr> des <tr><td>Gehirns Choleratoxin subunit-b</td><td>Molekulare Sonden</td><td>C-34776 (Alexa 555)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-Tetramethyl-Rhodamin</td><td>Molekulare Sonden</td><td>D-7162 (Alexa 555)</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Nissl</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479 (blau)</td><td>optional</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbi-tal</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>Fatal-Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas-Filamente</td><td>Harvard Apparatur</td><td>G150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Zeitz Instruments, Deutschland</td><td>DMZ Universal Puller</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionseinrichtung</td><td>Maßgeschneiderte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserpointer&nbsp;</td><td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td><td>HK-88007294 (405 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Filter/Schutzbrille</td><td>Dragon Lasers, China</td><td>LSG09 (Bandpass 450-700 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Bionokulares Mikroskop&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg, Schweiz</td><td>Wild M3</td><td>Ausgestattet mit High-Intensity Illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>PC mit installierter MC Stimulus Software</td><td>Mehrkanalsysteme, Deutschland (Software)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Kanal Stimulator</td><td>Mehrkanal Systeme, Deutschland</td><td>STG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Stimulationsisolationseinheit</td><td>A.M.P.I., Israel</td><td>Iso-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige, Japan</td><td>YOU-1</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Deutschland</td><td>VT1000S</td><td></td></tr></tbody></table>

lasergelenkte neuronale tracing in brain explantate

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Präsentieren wir eine Technik, die eine in vitro-Tracer Injektionsprotokoll, das eine Reihe elektrischer und Druckimpulse verwendet, um die Farbstoffaufnahme durch Elektroporation in Gehirn Explantate mit gezielten Laserbeleuchtung und passende Filterbrille während des Verfahrens zu erhöhen verbindet. Die beschriebene Technik der in vitro-Elektroporation von selbst ergibt eine relativ gute Sichtkontrolle für Targeting bestimmter Bereiche des Gehirns. Durch die Kombination mit Laseranregung fluoreszierender genetischen Markern und deren Auslesen durch Band-Passing-Filterbrille, die abholen können die Emissionen der genetisch markierten Zellen / Kerne und der Fluoreszenz Tracing-Farbstoff, ein Forscher kann im Wesentlichen die Genauigkeit der Einspritzungen zu erhöhen von der Suche nach den interessierenden Bereich und Controlling für das Farbstoff-Ausbreitung / Aufnahme im Injektionsbereich sehr viel effizienter. Außerdem ermöglicht das Laserbeleuchtungstechnik, um die Funktionalität eines gegebenen neurocircuit Prov studierenIding Informationen über die Art von Neuronen auf einen bestimmten Bereich in den Fällen, wo der GFP-Expression in den Typ des Senders von einer Subpopulation von Neuronen verbunden vorsteht.

Die 1 und 2 zeigen, wie der Laserpointer und Laserschutzbrillen verwendet werden, um GFP-positiven Tieren schnell und kostengünstig Genotyp aus einem Wurf werden. In Fällen von jungen Maus Jungtieren kann die Technik verwendet werden, um nicht-invasiv zu identifizieren GFP Label in das Tier Gehirn durch den Schädel und die darüber liegende Haut (1A - D) werden. Emittierte Fluoreszenz durch die Haut und dem Schädel des Maus Welpen mindestens bis zur postnatalen Tag 3 (1C)</strong...

Wir beschreiben eine Technik, um Neuronen und ihre Prozesse über anterograden oder retro Tracer Injektionen in Hirnkernen unter Verwendung eines in vitro-Präparat zu bezeichnen. Wir modifiziert eine vorhandene Methode der i n vitro Tracer Elektroporation durch die Nutzung von fluoreszenzmarkierte Mausmutanten und grundlegende optische Geräte, um die Kennzeichnung Genauigkeit zu erhöhen.

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Neuronen und ihre axonalen Projektionen zu markieren, um deren Verbindungen zu Ziel- oder Ursprungskernen im Gehirn nachzuverfolgen. Diese Methode trägt dazu bei, zentrale Fragen der Neurowissenschaft zu beantworten, wie beispielsweise die Konnektivitätsmuster zwischen verschiedenen Hirnarealen oder neuronalen Subpopulationen sowie deren funktionelle Bedeutung für einen bestimmten neurologischen Schaltkreis. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der erhöhten Zielgenauigkeit während der Tracer-Injektionen.Dies wird erreicht, indem einfache optische Ausrüstung verwendet wird, um fluoreszenzmarkierte Hirnkerne sichtbar zu machen. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass sie eine nichtinvasive Genotypisierung von Mauspopulationen ermöglicht, die fluoreszierende Proteine unter der Kontrolle neuronaler Promotoren exprimieren. Überprüfen Sie bei der Genotypisierung von Welpen die Expression der jeweiligen fluoreszierenden Marker mit einem Laserpointer, der die geeignete Anregungswellenlänge aufweist.Gleichzeitig sollten Sie Filterbrillen tragen, die die Anregungswellenlänge blockieren, aber die Emissionswellenlänge durchlassen.

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt die Manipulation von kultivierten Neuronen mittels Laser-Pinzette in vitro.

Mit Laser-Pinzette zur Manipulation isolierter Neuronen In Vitro

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Kultivierung neuronalen Explantaten aus...

Neural Explantatkulturen aus<em&gt; Xenopus laevis</em

Quelle: Muto, A., et al. Ablation einer neuronalen Population mit einem Zwei-Photonen-Laser und deren Beurteilung mittels Calcium-Bildgebung und Verhaltensaufzeichnung bei Zebrafischlarven. J. Vis. exp. (2018){{}} In diesem Video,  Es wird ein Zwei-Photonen-Laserablationsverfahren demonstriert, das die selektive Zerstörung von fluoreszierenden Neuronen in Agarose-immobilisierten Zebrafischlarven ermöglicht. Die hochauflösende Bildgebung vor und nach dem Eingriff bestätigt eine effiziente...

Gezielte neuronale Ablation mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in einer Zebrafisch-Larve

Menschen neuroprogenitor Zellen (NPCs) wurden unter proliferierenden Bedingungen erweitert. NSC wurden in Neuron-reiche Kulturen in der Gegenwart einer Kombination von Neurotrophinen unterscheiden. Neuronale Marker wurden durch Immunfluoreszenz-Färbung nachgewiesen. Um eine reine Population von Nervenzellen zu isolieren, wurden NPCs auf PEN-Membran-Folien differenziert und Laser-Mikrodissektion durchgeführt wurde.

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Wir beschreiben eine Methode zur Charakterisierung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften von Vorderhirnschaltkreisen unter Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur Photostimulation neuronaler Populationen in vitro.

Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

Zwei-Photonen-Imaging, Laser Nanodissektions gekoppelt ist, sind nützliche Tools, degenerativen und regenerativen Prozessen im zentralen Nervensystem mit subzellulärer Auflösung zu studieren. Dieses Protokoll zeigt, wie beschriften, Bild-und sezieren einzigen Kletterfasern in der Kleinhirnrinde in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, um die zelltypspezifische funktionelle Konnektivität von Ferneingaben aus entfernten Hirnregionen mithilfe optogenetischer Stimulationen in ex vivo Gehirnscheiben zu identifizieren.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injektionen für optogenetische Stimulation von Long-Range-Eingängen in Maus Gehirn Scheiben

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Wir beschreiben die intraparenchymale Transplantation von humanen neuralen Vorläuferzellen, die mit einem dualen Reportervektor transduziert werden, der Luciferase-grün fluoreszierendes Protein (GFP) im Gehirn der Maus exprimiert. Nach der Transplantation wird das Luciferase-Signal wiederholt mit In-vivo-Biolumineszenz und GFP-exprimierenden transplantierten Zellen gemessen, die in Hirnschnitten mittels Fluoreszenzmikroskopie identifiziert wurden.

Intracerebrale Transplantation und In Vivo Biolumineszenz-Tracking von menschlichen neuralen Vorläuferzellen im Gehirn der Maus

Erfahren Sie die lasergestützte neuronale Tracing-Methode in Hirn-Explantaten zur präzisen Markierung von Neuronen und axonalen Projektionen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung neuronaler Schaltkreise in der Neurowissenschaft.

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

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