Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Neuronen und ihre axonalen Projektionen zu markieren, um deren Verbindungen zu Ziel- oder Ursprungskernen im Gehirn nachzuverfolgen. Diese Methode trägt dazu bei, zentrale Fragen der Neurowissenschaft zu beantworten, wie beispielsweise die Konnektivitätsmuster zwischen verschiedenen Hirnarealen oder neuronalen Subpopulationen sowie deren funktionelle Bedeutung für einen bestimmten neurologischen Schaltkreis. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der erhöhten Zielgenauigkeit während der Tracer-Injektionen.

Dies wird erreicht, indem einfache optische Ausrüstung verwendet wird, um fluoreszenzmarkierte Hirnkerne sichtbar zu machen. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass sie eine nichtinvasive Genotypisierung von Mauspopulationen ermöglicht, die fluoreszierende Proteine unter der Kontrolle neuronaler Promotoren exprimieren. Überprüfen Sie bei der Genotypisierung von Welpen die Expression der jeweiligen fluoreszierenden Marker mit einem Laserpointer, der die geeignete Anregungswellenlänge aufweist.

Gleichzeitig sollten Sie Filterbrillen tragen, die die Anregungswellenlänge blockieren, aber die Emissionswellenlänge durchlassen. Richten Sie den Laser auf den Hinterkopf oder das Rückenmark des betreffenden Wurfs. Achten Sie darauf, den Laser nicht in die Augen der P zu richten, und halten Sie die Laserexposition kurz.

Die angeregten fluoreszierenden Marker sollten durch die Haut sichtbar sein. Bei älteren Mäusen können einzelne Neuronen der gewonnenen Gewebe identifiziert werden. Nach der Anästhesie der Maus und Überprüfung des Fehlens von Reflexen entfernen Sie die Haut über dem Schädel und schneiden die Haut entlang der Hinterkopfregion bis zur Mitte des Schädels auf.

Bei noch älteren Mäusen, die älter als einen Monat sind, kann die Fluoreszenz durch die Augen des Tieres beobachtet werden. Anschließend perfundieren Sie das markierte Tier transkardial mit eiskaltem PBS unter Verwendung einer 30-Gauge-Nadel; nach fünf bis zehn Minuten wird der größte Teil des Blutes entfernt sein. Danach entfernen Sie das Gehirn und dissezieren den interessierenden Bereich aus.

Hier enthält der Körper des Nervus trapezoideus, der aus zwei auffälligen Verdickungen im ventralen Bereich des Gehirns besteht, den interessierenden Bereich. Die ventralen Kerne des Nervus trapezoideus oder VNTB beginnen damit, dass das entnommene Gehirnareal von Interesse in eine Schale mit oxygenierter Schnittlösung überführt wird. Befestigen Sie das Präparat dort mit Spritzennadeln der Größe 30 so, dass die zu injizierende Fläche von oben zugänglich ist.

Verwenden Sie für die Injektion Bo-Silikatglas-Injektionspipetten, die in drei oder vier Ziehzyklen hergestellt wurden. Befüllen Sie die Pipette mit der folgenden Lösung: Cholera-Toxin-Subunit B, konjugiert mit Alexa FLUORA 4 5 55, die hauptsächlich für den retrograden Transport verwendet wird.

Wenn der Laserpointer und die Injektionspipetten montiert und einsatzbereit sind, richten Sie den Strahl auf den markierten Hirnbereich oder die zu injizierenden Zellen. Beobachten Sie das Sichtfeld durch die Bandpassfilter-Brille, um festzustellen, welche Neuronen mit der Injektionspipette angepeilt werden sollen. Positionieren Sie die Pipette mithilfe des Mikromanipulators in dem gewünschten Bereich.

Dann injiziere ich mit einem Druckinjektor, der auf die Abgabe von 50 Millisekunden langen Impulsen bei 15 PS eingestellt ist, die Markersubstanz in zwei bis zehn Impulsen. Zwischen den Impulsen sollten 10 bis 15 Sekunden vergehen, damit sich der injizierte Farbstoff ausbreiten kann. Bei der Injektion von Tetraethylrumin elektrisch das Gebiet mit der Stimulations-Elektrode stimulieren, die TTL-Impulse abgibt.

Stellen Sie sicher, dass die Elektrode in der Badlösung geerdet ist. Geben Sie acht TTL-Impulse mit jeweils acht Volt und einer Dauer von 50 Millisekunden mit 50-Millisekunden-Abständen ab. Stimulieren Sie die Region über mehrere Minuten hinweg mit 10 bis 20 Wiederholungen des Impulses.

Hirnkerne unterscheiden sich hinsichtlich Größe, Neuronendichte und Zelltypen. Dies bedeutet, dass Dauer sowie Anzahl der Druck- und/oder elektrischen Impulse möglicherweise angepasst werden müssen, um optimale Markierungsergebnisse für eine bestimmte Hirnregion zu erzielen. Überprüfen Sie mithilfe des Lasers und der Schutzbrille das Signal des fluoreszenten Tracers.

Die Färbung sollte von den Zellen aufgenommen werden und sich um den Injektionsbereich herum ausbreiten. Inkubieren Sie die Hirnstämme nach der Injektion eine bis vier Stunden lang in mit Sauerstoff angereicherter künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit bei Raumtemperatur. Wahren Sie während der Inkubation die Sauerstoffversorgung und fixieren Sie das Gewebe anschließend in 4 % Paraformaldehyd.

Am folgenden Tag kann das Gewebe in PBS über Nacht bei vier Grad Celsius geschnitten und eine intergrade Injektion in den ventralen Kern des Trapezkörpers oder VNTB vorgenommen werden. Mithilfe von Tetraethyl-Rodin-Dextrin lässt sich zeigen, dass Projektionen vom VNTB zum medialen Kern des Trapezkörpers, oder MNTB, reichen. Anschließend wurde der MNTB mit Cholera-Toxin, Untereinheit B, injiziert, wodurch der VNTB retrograd stark markiert wurde.

Genauer betrachtet schienen danach die Somen der glycinergen enterischen VNTB-Zellen markiert zu sein. In das MNTB wurde die retrograde Marke Dextrin tri injiziert. Im Gegensatz zum punktförmigen Muster der CTB-Markierung war die Dextrin-trit-Markierung dicht und gogiartig.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Neuronen und ihre Fortsätze mit erhöhter Genauigkeit markiert werden können. Die gezeigte Technik hilft Ihnen dabei, Gehirnareale und neuronale Subpopulationen, die an einem bestimmten neuroanatomischen Netzwerk beteiligt sind, zu identifizieren. Sobald die Injektionstechnik beherrscht ist, kann der Eingriff bei korrekter Durchführung in etwa 30 Minuten durchgeführt werden. Dieses Verfahren lässt sich leicht mit anderen Methoden wie der Immunchemie oder der Gehirnklarstellung kombinieren, um zusätzliche Fragen zur Morphologie, Richtung oder Funktionalität neuronaler Projektionen und anderer neuronaler Strukturen zu beantworten.