Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Neuronen und ihre axonalen Projektionen zu markieren, um ihre Verbindungen zu den Ziel- oder Quell-Hirnkernen von Interesse zu verfolgen. Diese Methode hilft bei der Beantwortung von Schlüsselfragen der Neurowissenschaften, wie z.B. Konnektivitätsmuster zwischen verschiedenen Bereichen oder neuronalen Subpopulationen des Gehirns sowie deren funktionelle Bedeutung für einen gegebenen Neuroschaltkreis. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die erhöhte Zielgenauigkeit bei der Tracerinjektion.

Dies wird durch den Einsatz grundlegender optischer Geräte zur Visualisierung fluoreszenzmarkierter Hirnkerne erreicht. Ein weiterer Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine nicht-invasive Genotypisierung von Maus-Pops ermöglicht, die fluoreszierende Proteine unter der Kontrolle neuronaler Promotoren exprimieren. Bei der Genotypisierung von Jungtieren wird die Expression der jeweiligen Fluoreszenzmarker mit einem Laserpointer mit der entsprechenden Anregungswellenlänge überprüft.

Sie gleichzeitig eine Filterbrille, die die Anregungswellenlänge blockiert, aber die Emissionswellenlänge durchlässt. Richten Sie den Laser auf den Hinterkopf oder das Rückenmark des betreffenden Welpen. Achten Sie darauf, den Laser nicht in die Augen des P'S zu leuchten und halten Sie die Laserbelichtung kurz.

Die angeregten fluoreszierenden Marker sollten durch die Haut sichtbar sein. Wenn die Maus älter ist, können einzelne Neuronen des entnommenen Gewebes identifiziert werden. Nachdem Sie die Maus betäubt und auf das Fehlen eines Reflexes überprüft haben, entfernen Sie die Haut über dem Schädel und schneiden Sie die Haut entlang des Hinterkopfes bis zur Mitte des Schädels.

Bei noch älteren Mäusen, die älter als einen Monat sind, kann die Fluoreszenz durch die Augen des Tieres beobachtet werden. Als nächstes perfundieren Sie das markerpositive Tier mit einer 30-Gauge-Nadel mit eiskalter PBS trans Cardi, nach fünf bis 10 Minuten wird das meiste Blut entfernt. Entfernen Sie dann das Gehirn und sezieren Sie die interessierende Region.

Hier enthält der Trapezkörper, der aus zwei markanten Bulben in der ventralen Region des Gehirns besteht, die Region von Interesse. Die ventralen Kerne der trapezförmigen Körper oder VNTB beginnen mit der Übertragung der explantierten Hirnregion, die von Interesse ist, in eine Schale mit sauerstoffhaltiger Präparierlösung. Dort. Befestigen Sie den Explan mit 30 Gauge-Spritzennadeln, so dass der Bereich für die Injektion von oben zugänglich ist.

Für die Injektion verwenden Sie gezogene Injektionspipetten aus Bo-Silikatglas, die in drei oder vier Zugzyklen hergestellt werden. Befüllen Sie die Pipette mit der folgenden Lösung. Choleratoxin-Untereinheit B, konjugiert mit Alexa FLUORA 4 5 55, die hauptsächlich für den retrograden Transport bestimmt ist.

Mit dem Laserpointer und den Injektionspipetten, die alle montiert und einsatzbereit sind, richten Sie den Strahl auf die markierte Gehirnregion oder die zu injizierenden Zellen. Beobachten Sie das Feld durch die Bandpassfilterbrille, um zu sehen, auf welche Neuronen die Injektionspipette abzielen soll. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipette in den interessierenden Bereich zu positionieren.

Dann injiziere ich mit einem Druckinjektor, der auf 50-Millisekunden-Impulse bei 15 PS eingestellt ist, die Tracer-Substanz in zwei bis 10 Impulsen. Lassen Sie 10 bis 15 Sekunden zwischen den Impulsen vergehen, damit sich der injizierte Farbstoff ausbreiten kann. Bei der Injektion von Tetraethyl-Pansen wird die Region elektrisch stimuliert, wobei die Stimulationselektrode TTL-Impulse abgibt.

Stellen Sie sicher, dass die Elektrode in der Badlösung geerdet ist. Liefern Sie acht TTL-Impulse mit jeweils acht Volt Länge von 50 Millisekunden in Intervallen von 50 Millisekunden. Stimulieren Sie die Region mit 10 bis 20 Pulswiederholungen über mehrere Minuten.

Hirnkerne variieren in Größe, neuronaler Dichte und Zelltyp. Dies bedeutet, dass die Dauer und die Anzahl der Druck- und/oder elektrischen Impulse angepasst werden müssen, um optimale Markierungsergebnisse für eine bestimmte Gehirnregion zu erzielen. Überprüfen Sie mit dem Laser und der Schutzbrille das fluoreszierende Tracersignal.

Der Farbstoff sollte von den Zellen aufgenommen und um den injizierten Bereich verteilt werden. Nach der Injektion inkubieren Sie die Hirnstämme ein bis vier Stunden lang in sauerstoffhaltiger künstlicher Hirnmarksflüssigkeit bei Raumtemperatur. Halten Sie die Sauerstoffversorgung während der Inkubation aufrecht und fixieren Sie dann das Gewebe in 4%-Paraformaldehyd.

Bei der PBS über Nacht bei vier Grad Celsius am nächsten Tag kann das Gewebe in Scheiben geschnitten und eine intergrade Injektion in den ventralen Kern des Trapezkörpers oder VNTB montiert werden. Die Verwendung von Tetraethyl-Ridinedextrin zeigt, dass sich Projektionen aus dem VNTB bis zum medialen Kern des Trapezkörpers (MNTB) erstrecken. Dann wurde dem MNTB Chole Toin injiziert, Untereinheit B, die retro stark als VNTB bezeichnete.

Im Detail schienen als nächstes die Somata der glykenterischen VNTB-Zellen markiert zu werden. Dem MNTB wurde das retrograde Dextrin tri injiziert. Im Gegensatz zum punktförmigen Muster der CTB-Markierung war die Dextrin-Trit-Markierung dicht und GOGI-ähnlich.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Neuronen und ihre Prozesse mit erhöhter Genauigkeit kennzeichnet. Die demonstrierte Technik hilft Ihnen bei der Identifizierung von Gehirnbereichen und neuronalen Subpopulationen, die an einem bestimmten Neurokreislauf beteiligt sind. Sobald Sie den Injektionsvorgang beherrschen, kann er bei richtiger Durchführung in etwa 30 Minuten durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann leicht mit anderen Methoden wie Immunchemie oder Brain Clearing kombiniert werden, um zusätzliche Fragen zur Morphologie, Richtungalität oder Funktionalität von neuronalen Projektionen und anderen neuronalen Strukturen zu beantworten.