Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu zeigen, wie die Auswirkungen von Wachstumsfaktoren und Inhibitoren auf die Genexpression der Entwicklung von Hühnerembryonen bestimmt werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, etwa wie Signalmoleküle das Wachstum und die Differenzierung von Zellen in vivo beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Methode bietet, um diese Faktoren direkt im Embryo zu testen.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Entwicklung der Gliedmaßen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Nervengewebe, Somiten oder Gastrulation angewendet werden. Das Verfahren wird von Rebeea Mohammed, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Zu Beginn geben Sie einen Milliliter der Kügelchen aus der ursprünglichen Stammlösung in eine frische Tube.

Lassen Sie die Kügelchen absetzen, entfernen Sie dann die Flüssigkeit und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal und lagern Sie die gewaschenen Kügelchen bei vier Grad Celsius als Aufschlämmung in PBS. Wählen Sie die Kügelchen für die Transplantation aus, indem Sie sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette aus der gewaschenen Stammlösung entfernen und in einen Milliliter PBS geben.

Wählen Sie mit einem Stereoskop Kügelchen mit einem Durchmesser von etwa 100 Mikrometern. Übertragen Sie die ausgewählten Kügelchen in zwei Mikrolitern Flüssigkeit in eine neue Petrischale, die einen 20-Milliliter-Tropfen PBS enthält. Entfernen Sie anschließend das PBS von den Kügelchen. Zuerst mit einer 20-Mikroliter-Pipette und dann die Restflüssigkeit durch Kapillarwirkung mit einer Pinzette eines feinen Uhrmachers entfernen.

Es ist wichtig, so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen, damit der Wachstumsfaktor nicht verdünnt wird, wenn er den Kügelchen zugesetzt wird. Pipettieren Sie den Wachstumsfaktor direkt auf die Kügelchen. Für FGF18 fügen Sie 0,5 Mikroliter rekombinantes FGF18 hinzu, rekonstituiert fügen Sie 0,5 Milligramm pro Milliliter in PBS mit 0,1 Prozent BSA hinzu.

Geben Sie dann mehrere Tropfen Wasser um die Ränder der Schale, um zu verhindern, dass die Flüssigkeit verdunstet. Wenn es fertig ist, inkubieren Sie die Kügelchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die Wassertropfen mit einer Pasteur-Pipette aus der Schale nehmen und die Schale auf Eis stellen.

Derivatisieren Sie die Kügelchen, indem Sie die Kügelchen zunächst mit einem Spatel in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Fügen Sie dann einen Milliliter 0,2 normale Ameisensäure hinzu und inkubieren Sie die Kügelchen in der Säure auf einer Schüttelplattform für eine Stunde. Lassen Sie dann die Kügelchen absetzen, entfernen Sie die Ameisensäure und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter Wasser.

Waschen Sie die Kügelchen eine Stunde lang auf der Schüttelplattform und wiederholen Sie den Waschgang sechsmal, um alle Reste von Ameisensäure zu entfernen. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche die restliche Flüssigkeit und lagern Sie die Kügelchen bei vier Grad Celsius. Entferne mit einem Spatel eine kleine Palette von Kügelchen mit einem Volumen von etwa fünf bis zehn Mikrolitern aus dem Vorrat und lege die Kügelchen in eine 30-Milliliter-Petrischale.

Fügen Sie dann einen Milliliter DMSO hinzu. Verwenden Sie als Nächstes eine P2-Pipette, die auf zwei Mikroliter eingestellt ist, um Kügelchen mit einem Durchmesser von etwa 100 Mikrometern auf einen 20-Mikroliter-Tropfen Lösungsmittel in einer weiteren 30-Milliliter-Petrischale zu übertragen. Entfernen Sie den Großteil des Lösungsmittels mit einer 20-Mikroliter-Pipette und alle Lösungsmittelreste mit einer Zwei-Mikroliter-Pipette.

Bedecken Sie dann die Kügelchen mit 20 Mikrolitern des aufzutragenden Arzneimittels, gelöst in DMSO. Inkubieren Sie die Kügelchen eine Stunde lang in der Arzneimittellösung. Schützen Sie die Kügelchen vor Licht, da viele Wirkstoffmoleküle lichtempfindlich sind.

Um die Kügelchen besser sichtbar zu machen, überführen Sie vier bis fünf Kügelchen in zwei Mikroliter Flüssigkeit in 20 Mikroliter zweiprozentiges Phenolrot, das in Wasser gelöst ist. Entfernen Sie eine einzelne Perle mit einer feinen Uhrmacherzange und spülen Sie die Perle in PBS aus. Lassen Sie die Kügelchen nicht länger als 15 Minuten in der Phenolrotlösung, bevor Sie sie ausspülen, da dies zu Aktivitätsverlust führen kann.

Feinen Wolframdraht in drei bis vier Zentimeter Längen schneiden Führen Sie dann ein Stück des Drahtes in das Ende einer Pasteurpipette aus Glas ein und schmelzen Sie ihn in einem Bunsenbrenner, um ihn in Position zu bringen. Bereiten Sie bis zu 10 Nadeln vor, um sicherzustellen, dass Ersatzteile vorhanden sind, falls sie beschädigt sind. Legen Sie dann das Ende des Drahtes in eine Lötlampenflamme und halten Sie es dort, bis das Wolfram weiß glüht und die Spitze scharf ist.

Dies dauert etwa zwei bis drei Minuten. Fügen Sie fünf bis sechs Tropfen Künstlertinte zu 15 Millilitern PBS hinzu, die 100 Einheiten Penicillin und 0,1 Milligramm Streptomycin pro Milliliter enthalten. Um die Hühnerembryonen vorzubereiten, brüten Sie Eier mit dem stumpfen Ende aus, bis sie das gewünschte Stadium für die meisten Manipulationen der Gliedmaßenknospen erreichen, das normalerweise drei bis fünf Tage dauert.

Wenn der gewünschte Zeitpunkt erreicht ist, klopfen Sie mit einer stumpfen Pinzette auf das stumpfe Ende des Eies und brechen Sie die Schale. Verwenden Sie dann die Pinzette, um die Schale zu entfernen und den Embryo freizulegen. Stellen Sie sicher, dass auch die Eizellmembran entfernt wird.

Um den Embryo sichtbar zu machen, injizieren Sie PBS, ergänzt mit einigen Tropfen Künstlertinte, unter den Embryo mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 21-Gauge-Nadel. Die Vitellinmembran, die über dem Embryo liegt, kann dann mit einer feinen Pinzette entfernt werden. Geben Sie als nächstes zwei bis drei Milliliter eines ergänzten PBS mit einem Prozent fötalem Kälberserum, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 0,1 Milligramm pro Milliliter Streptomycin in die Eizelle, um sicherzustellen, dass der Embryo nicht dehydriert.

Öffnen Sie mit einer geschärften Pinzette des Uhrmachers das Amnion über den sich entwickelnden Knospen der Gliedmaßen. In diesen Stadien dreht sich der Embryo in der Regel, so dass die rechte Seite ganz oben ist. Stellen Sie sicher, dass der Embryo nicht austrocknet, indem Sie bei Bedarf mehr von der supplementierten PBS-Lösung hinzufügen.

Das Amnion, das den Embryo umgibt, kann mit einer feinen Wolframnadel geöffnet werden, um die sich entwickelnde Gliedmaße freizulegen. Verwenden Sie dann den geschärften Wolframdraht, um einen Schnitt in die Knospe der Gliedmaßen zu machen, in die die Perle implantiert wird. Vermeide es, wenn möglich, die Knospe der Gliedmaßen ganz durchzuschneiden.

Obwohl in jüngeren Stadien, ist dies schwierig. Nehmen Sie eine Perle, die entweder mit dem Wachstumsfaktor oder dem Medikament beschichtet ist, mit einer extra feinen Uhrmacherzange. Wenn die Perle entweder in DMSO oder Phenolrot getränkt wurde, stellen Sie sicher, dass sie mit PBS gespült wird, bevor Sie sie auf den Embryo auftragen.

Übertragen Sie die Perle mit der Pinzette auf den Embryo und verwenden Sie dann den geschärften Wolframdraht, um die Perle in die Schnittstelle einzuführen. Geben Sie zusätzlich ein bis zwei Milliliter der supplementierten PBS-Lösung in die Eizelle, um sicherzustellen, dass der Embryo hydratisiert bleibt. Vermeiden Sie es, die Lösung direkt auf den Embryo selbst aufzutragen, da dies den Embryo beschädigen und dazu führen kann, dass sich die Perle löst.

Verwenden Sie anschließend eine Zehn-Milliliter-Spritze, die mit einer 19-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um nur so viel Albumin zu entfernen, wie benötigt wird, um sicherzustellen, dass der Embryo nicht mit dem Klebeband in Berührung kommt, mit dem die Eizelle verschlossen wird. Stellen Sie sicher, dass die Nadel das Eigelb nicht beschädigt, indem Sie sie an der Innenseite der Schale nach unten schieben. Zum Schluss verschließen Sie das Ei mit Klebeband und legen es wieder in den Brutkasten.

Um zu bestätigen, dass FGF18 in der Lage ist, über MEK zu phosphorylieren, wurden die Embryonen eine Stunde nach der Bead-Transplantation entnommen und auf das Vorhandensein von phosphoryliertem ERK immungefärbt, das auf dem Bild rechts um die transplantierte Perle herum zu sehen ist. Im HH-Stadium 21 wird MyoD nicht in sich entwickelnden Myoblasten der Gliedmaßen exprimiert. Obwohl eine Färbung im Myotom der sich entwickelnden Somiten zu sehen ist.

Sechs Stunden nach einer FGF18-Bead-Transplantation ist MyoD in Myoblasten in der Nähe der Bead zu sehen. Während es in der kontralateralen Extremität keine Expression gibt. Diese Expression kann durch Co-Transplantation einer Perle, die mit einem MEK-Inhibitor wie U0126 beschichtet ist, gehemmt werden.

In ähnlicher Weise reduziert die Transplantation einer U0126-Perle im HH-Stadium 21 die endogene Expression von MyoD nach 24 Stunden im Vergleich zur unbehandelten kontralateralen Extremität. In den Knospen der Gliedmaßen induziert FGF18 im HH-Stadium 19 kein MyoD. Durch die gemeinsame Transplantation von in FGF18 getränkten Kügelchen und einem Retinsäureantagonisten kann dies jedoch überwunden werden, und ektopisches MyoD wird nachgewiesen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Die Entwicklung dieser Technik ermöglichte es Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, Wachstumsfaktoren zu erforschen, die bei der Embryonalentwicklung Signale geben. Wenn Sie diese Technik ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, den Embryo nicht austrocknen zu lassen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kügelchen in sich entwickelnde Embryonen transplantiert, um festzustellen, wie sich die Signalübertragung von Wachstumsfaktoren auf die Entwicklung auswirkt.