Name: Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Lernen Sie die Pfropfung von Beads in Hühnerembryo-Gliedmaßen zur Untersuchung von Wachstumsfaktoren und Signalwegen. Diese Methode ermöglicht direkte in-vivo-Tests zur Analyse der Genexpression.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Early Career Award der University of Nottingham an DS finanziert. RM wird vom Höheren Komitee für Bildungsentwicklung des Irak finanziert.

Ethics Statement: Alle diese Versuche folgen der Tierpflege und ethischen Richtlinien der University of Nottingham. 1. Herstellung von Heparin-Korne für Pfropfen <ol><li> Waschen Sie Heparin Perlen sorgfältig in PBS vor dem Gebrauch. Hinweis: Die Glasperlen können bei 4 ° C als Aufschlämmung in PBS gelagert werden. <ol><li> Wählen Perlen zum Pfropfen von ihnen aus dem Lager entfernt mit einer 20 ul Pipette in ein 1 ml Tropfen PBS. Dann mit einem Mikropipette bis 2 &amp; mgr; l eingestellt, um die Kügelchen in eine 20 &amp; mgr; l Tropfen PBS in einer 3 cm Petrischale übertragen. Wählen Perlen basierend auf Größe und mit einem Stereo-Binokular, Transfer ausgewählten Perlen mit einem P2 Pipettenspitze; die um 100 &amp; mgr; m Durchmesser sind ideal. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das PBS aus den Perlen. Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit mit einer 20 ul Pipette und der Restflüssigkeit durch Kapillarwirkung mit feinen Uhrmacher Pinzette. Anmerkung: Es ist wichtig, so viel wie möglich, damit das Wachstum facto entfernenR nicht verdünnt, wenn es an den Beads zugegeben. </li><li> Pipettieren den Wachstumsfaktor direkt auf die Perlen. Für FGF18 werden 0,5 ul rekombinanter FGF18 bei 0,5 mg / ml in 0,1% BSA in PBS rekonstituiert. Einige Tropfen von Wasser um die Ränder der Schale, um die Flüssigkeit verflüchtigt. </li><li> Inkubieren der Kügelchen für 1 h bei RT. Nehmen Sie die Tropfen von Wasser aus der Schale mit einer Pasteurpipette und auf Eis bereit für die Transplantation. </li><li> Bei Bedarf (für transparente Kügelchen) Transfer 4-5 Kügelchen bis 2% Phenolrot vor dem Pfropfen zu helfen, zu visualisieren. Spülen in PBS vor der Übertragung auf den Embryo. </li></ol> 2. Herstellung der AG 1-X2 Perlen zum Pfropfen <ol><li> Vor derivatisieren Perlen mit 0,2 N Ameisensäure verwenden. <ol><li> Verwenden Sie hierzu einen Spachtel, um die Kügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. In 1 ml 0,2 N Ameisensäure und waschen auf einem Schütteltisch für 1 Stunde. </li><li> Entfernen Sie dann die Ameisensäure mit einer Pipette p1000 und ersetzen 1ml Wasser. Waschen für 1 Stunde und wiederholen Sie sechs Mal zu entfernen restlichen Ameisensäure. </li><li> Entfernen Sie verbleibende Flüssigkeit mit einer Pipette p1000 und die Perlen lagern bei 4 ° C. Anmerkung: Es ist nicht notwendig, alle das Restwasser in dieser Stufe zu entfernen. </li></ol></li><li> Entfernen Sie ein kleines Pellet von Kügelchen von etwa 5-10 &amp; mgr; l Volumen aus dem Bestand mit einem kleinen Spatel in eine 3 cm Petrischale und 1 ml DMSO (oder je nachdem, was Lösungsmittel der Wirkstoff gelöst in). Hinweis: Diese sollten mehrere hundert Perlen, von denen diejenigen, die richtige Größe zu wählen ist. </li><li> Dann mit einem P2 Pipette 2 ul eingestellt, um die Kügelchen von etwa 100 &amp; mgr; m Durchmesser zu einem 20 ul Tropfen Lösungsmittel in einem anderen 3 cm Petrischale übertragen. </li><li> Entfernung des Lösungsmittels mit einem 20 ul-Pipette und einer restlichen Lösungsmittels mit einem 2 &amp; mgr; l-Pipette. Ersetzen mit 20 ul des Arzneimittels angewandt werden. HINWEIS: Konsistenz auflösen das Medikament in einer Konzentration von 100 uM in DMSO (oder die überhaupt Lösungsmittel verwendet wird),Aliquot in 20 &amp; mgr; l und bei -80 ° C nach einigen niedermolekularen Inhibitoren sind instabil und es ist am besten wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Gegebenenfalls anschließend die verdünnte Medikament auf die gewünschte Konzentration vor dem Einweichen Perlen. Wirksame Konzentrationen müssen am besten empirisch für jedes Arzneimittel bestimmt. </li><li> Inkubation für 1 Std. Vor Licht, da viele dieser Moleküle Licht empfindlich sind. </li><li> Vor der Transplantation Transfer 4-5 Perlen mit einer p2 Pipette 2 ul in 20 ul 2% Phenolrot in Wasser gelöst gesetzt. Führen Sie diesen Schritt mit Hilfe eines Stereo Binokular, um die Perlen zu visualisieren. Entfernen Sie eine einzelne Perle mit feinen Uhrmacher Pinzette oder eine Drahtschleife und spülen in PBS vor der Übertragung auf den Embryo. NOTleave Kügelchen in 2% Phenolrot für mehr als 15 min vor der Verwendung, da dies zu Aktivitätsverlust führen. </li></ol> 3. Vorbereitung Tungsten Nadeln <ol><li> Fein geschnitten Wolframdraht in 3-4 cm Länge. Stecken Sie ein Stück Draht in das Endeein Glas Pasteurpipette und Schmelze in einem Bunsenbrenner in Position zu fixieren. Vorbereitung bis zu 10 Nadeln, um sicherzustellen, dass es Ersatzteile, wenn sie während des Gebrauchs beschädigt werden. </li><li> Legen Sie das Ende des Drahtes in einer Lötlampe Flamme und halten Sie ihn dort, bis die Wolfram leuchtet weiß und die Spitze ist scharf (ca. 2-3 min). Hinweis: Während der Verwendung kann die Nadel gereinigt werden und in der Lötlampe nach Bedarf neu geschärft. HINWEIS: Diese Nadeln können auch verwendet werden, um Schleifen für die Übertragung von Perlen zu machen. Berühren Sie leicht die Nadel auf der Bank, und es wird zu biegen, um eine Schleife zu bilden. </li></ol> 4. Vorbereitung Embryonen für Bead Grafts <ol><li> Eier auszubrüten mit dem stumpfen Ende, bis sie die gewünschte Stufe (3-5 Tage für die meisten Gliedmaßenknospe Manipulationen) zu erreichen. Verwendung stumpfen Pinzette Hahn auf dem stumpfen Ende, um die Schale zu brechen und verwenden Sie dann die Zange, um die Schale zu entfernen und setzen den Embryo. Sicherstellen, dass die Eierschalenmembran wird ebenfalls entfernt. HINWEIS: 1-2 ml PBS mit einer Pasteur-Pipette, um mit Unterstützungs hinzugefügt werdenDies, wenn die Membran klebt an den Dotter. Gently Pipette den PBS auf die Oberfläche des Dotters, fassen Sie die Membran mit der Zange, kümmert sich nicht um das Eigelb beschädigen, und ziehen Sie sie vorsichtig aus dem Ei. </li><li> Entfernen Sie bis zu 5 ml Albumin aus dem Ei mit einer 10-ml-Spritze und einer 19 G-Nadel. Sich nur so weit wie notwendig, um den Embryo nicht Kontakt mit dem Band verwendet wird, um das Ei die Entfernung von größeren Volumina abdichten kann Embryoüberlebensraten zu reduzieren gewährleisten. </li><li> Zur Visualisierung der Embryo fügen Sie ein 5-6 Tropfen Künstler Tusche 15 ml PBS mit 100 U Penicillin und Streptomycin 0,1 mg / ml. Injizieren 0,5-1 ml direkt nach dem Embryo mit einer 1 ml Spritze und einer 25 G-Nadel. </li><li> Hinzuzufügen 2-3 ml PBS mit 1% fötalem Kälberserum und 100 U Penicillin und Streptomycin 0,1 mg / ml in das Ei, um den Embryo nicht austrocknen zu gewährleisten. Verwendung geschärft Uhrmacher Pinzette entfernen Sie die Dotterhaut und öffnen Sie das Amnion über die Entwicklung von Extremitätenknospen. Stellen Sie sicher, der Embryo nicht austrocknet und, Falls erforderlich, fügen Sie mehr PBS / FCS. HINWEIS: Die Extremitätenknospen deutlich als gepaart Auswüchse an der Flanke des Embryos sichtbar. In diesen Stadien der Embryo wird sich solche auf der rechten Seite ist in der Regel nach oben. Als Ergebnis ist es normalerweise einfacher, Perlen in die rechten Schenkel Transplantat mit den Links- als diejenigen kontralateralen Kontrollen. </li><li> Verwenden Sie einen geschärften Wolfram-Draht, um einen Einschnitt in die Gliedmaßenknospe, wo der Wulst wird implantiert werden zu machen. Vermeiden Sie das Schneiden den ganzen Weg durch die Gliedmaßenknospe, wo möglich, obwohl in jüngeren Stadien ist dies schwierig. HINWEIS: Bei älteren Embryonen (HH-Stufe 22 und höher) ist es möglich, bestimmte Regionen der Extremitätenknospe zum Pfropfen aber in jüngeren Stadien ist dies schwieriger, wenn die Extremitätenknospe selbst klein zu wählen. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass der Extremitätenknospe wird über die gepfropft Perle wachsen so, besonders bei jüngeren Stadien, die Perle in der proximalen Extremitäten bleiben. </li><li> Pick-up ein Wulst entweder von der Wachstumsfaktor oder Drogen entweder extra fein watchmakers Zange oder eine Schleife aus einer Wolfram Nadel gemacht. Wenn die Raupe hat entweder DMSO oder Phenolrot getränkt gründlich in PBS vor dem Auftragen auf den Embryo. Übertragen Sie die Perle auf den Embryo mit der Zange / Drahtschleife. Dann nutzen Sie die geschärften Wolfram-Draht, um den Wulst in den Einschnitt einzufügen. </li><li> Fügen Sie 1-2 ml PBS / FCS auf das Ei sicher, dass der Embryo hydratisiert gehalten, aber vermeiden, die Anwendung direkt auf den Embryo selbst, da dies die Embryonen schädigen und die Wulst zu verdrängt werden. Dichten Sie das Ei mit Band und zurück in den Inkubator. </li></ol>

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<li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li>
<li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li>
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<li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63(2008).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Verwendung von Transplantaten Wulst unmittelbar entwickelnden Geweben in ovo angelegt ist ein mächtiges Werkzeug, um die Rolle von Wachstumsfaktor-Signalweges während der Entwicklung geben beispiellose Kontrolle über die Entwicklungsstufe, bei der sie angewendet werden, und die Dauer der Exposition zu sezieren. Die Wahl der Wulst für jede Art von Molekülen ist wichtig. Kleinen hydrophoben Molekülen, wie den hier beschriebenen Inhibitoren und Retinsäure, normalerweise gut binden derivatis...

Vogelembryonen haben ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Entwicklung seit vielen Jahren 1 vorgesehen. Eines ihrer nützlichen Eigenschaften ist, dass sie relativ einfach zu manipulieren sind. Externe Entwicklung macht es möglich, das Ei zu öffnen, um den Embryo zugreifen und verschiedene Mikromanipulationen mit Beispielen wie dem klassischen Wachtel-Küken Chimärensystem zur Untersuchung des Zellschicksals 2,3, die Injektion von Retroviren für die Überexpression in bestimmten Geweben während der Entwicklung 4,5 und Explantatkultur entwicklungsSignalQuellen 6 zu identifizieren. Jüngerer Chimären zwischen unmarkiertem Hosts mit Transplantaten von einem transgenen Huhn Linie, die GFP generiert hat gezeigt, dass die Kombination von klassischen Pfropfen und genetische Modifikation kann wichtige Einsichten in die Entwicklung 7,8 bereitzustellen. Die Leichtigkeit, mit der der Vogelembryo kann manipuliert werden, ist es ein hervorragendes Modell für die Untersuchung des Körpers gemachtEntwicklungs 9. Anwendung spezifischer Wachstumsfaktoren auf die Entwicklung Gliedmaßen in vivo war maßgeblich an der Identifizierung von Faktoren, die Gliedmaßen Musterung 10,11 verändern und weiterhin Einblicke in diesen Prozess 12 bereitzustellen. Dieser Ansatz ist auch verwendet worden, um die Faktoren, die die Entwicklung der Muskulatur regulieren zu studieren und hat Rollen für zahlreiche Signale wie Wnts 13, 14 und BMPs HGF 15 freigelegt. Kürzlich wurde diese Technik verwendet, um die Signale, die myogene Genexpression in der Extremitätenknospe untersuchen und zu zeigen, dass Interaktionen zwischen FGF18 und Retinsäure kann das Timing MyoD Expression 16 zu steuern. Mit einer Kombination von Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle, die auf Kügelchen geladen werden kann und dann direkt in spezifischen Geweben in bestimmten Entwicklungsstadien gepfropft die Möglichkeit gibt, zu fast jeder Zeit und Region bei der Entwicklung einzugreifen. Dies wurde verwendet, um INVEstigate viele Prozesse einschließlich Somiten Musterung 17,18, neuronale Spezifikation 19, Neuralleiste Migration 20 und Achse Verlängerung 21. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Pfropfen von Kügelchen in entweder Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren in der Entwicklung Hühnerschenkel eingeweicht. Dies kann genutzt werden, um die Auswirkungen dieser Signale auf myogenesis durch Analysieren muskelspezifische Genexpression in situ-Hybridisierung zu bestimmen. Wir beschreiben Transplantate unter Verwendung von entweder Heparin getränkten Kügelchen, die für Wachstumsfaktoren oder AG 1-X2 Perlen für kleine hydrophobe Moleküle, wie Retinsäure oder Kleinmolekül-Inhibitoren spezifischer Signalwege verwendet. Aber auch andere Perlen sind ebenfalls verfügbar, die verwendet wurden, um sowohl FGFs und Shh 23 22 zu liefern.

<table><tbody><tr><td>Heparin Acrylkügelchen</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>Die verwendeten Acryl-Heparinkügelchen wurden abgekündigt. Es ist jedoch ein Ersatzprodukt erhältlich, Heparin-Agarose-Kügelchen, Kat.-Nr. H6508. Diese sind transparent, so dass sie schwieriger zu verarbeiten sind, können aber auf die gleiche Weise mit Phenolrot gefärbt werden wie AG 1-X2 Kügelchen,</td></tr> <tr><td>AG 1-X2 Kügelchen</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Affi Gel blaue Kügelchen</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301; 153-7302</td><td>Diese Kügelchen wurden mit einer Reihe von Wachstumsfaktoren verwendet, einschließlich Shh und FGFs, und können verwendet werden, um Heparinkügelchen</td></tr><tr><td>zu ersetzen FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>Resuspendieren Sie in PBS mit 0/1 % BSA, bereiten Sie Einweg-Aliquots von 0,5-1 ul vor und lagern Sie sie bei -80 °C. Chargen und Lieferanten können variieren, daher sollten unterschiedliche Konzentrationen getestet werden, um eine wirksame Dosis zu bestimmen.</td></tr><tr><td>U0126</td><td>Cell Signalling</td><td>9903</td><td>Auf 20 mM Lagerbestand in DMSO herstellen und in Einmal-Aliquoten bei -80 °C aufbewahren. Vor Licht schützen.</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td> In <td>DMSO resuspendieren und in Einmal-Aliquoten bei -80 °C aufbewahren. Vor Licht schützen.</td></tr><tr><td>Schwarze Tusche</td><td>Windsor and Newton</td><td>5012572003384 (30 ml)</td><td>Obwohl Alternativen zu diesem Produkt verfügbar sind, ist Vorsicht geboten, da einige Tinten für Embryonen giftig sind</td></tr><tr><td>Wolframdraht, Ø 0,1 mm 99,95</td>%<td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>100X in PBS/Tinte und PBS/FCS verdünnen</td></tr></tbody></table>

pfropfen von beads in die entwicklung von hühnerembryo-glieder zu identifizieren signaltransduktionswegen beeinflussung der genexpression

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Mit Hühnerembryonen es möglich ist, zur direkten Prüfung der Wirkung von entweder Wachstumsfaktoren oder spezifische Inhibitoren von Signalwegen auf die Gen-Expression und Aktivierung von Signaltransduktionswegen. Diese Technik ermöglicht die Abgabe von Signalmolekülen an genau definierten Entwicklungsstadien für bestimmte Zeiten. Nach dieser Embryonen können geerntet werden und Genexpression untersucht, beispielsweise durch in situ Hybridisierung oder Aktivierung des Signals mit der Immunfärbung beobachtet Übertragungswegen. In diesem Video-Heparin-Perlen in FGF18 getränkt oder AG 1-X2 Perlen in U0126, ein MEK-Inhibitor eingeweicht, in die Gliedmaßenknospe in ovo gepfropft. Dies zeigt, dass FGF18 induziert die Expression von MyoD und ERK Phosphorylierung und sowohl endogene als auch FGF18 induziert MyoD Expression durch U0126 gehemmt. Perlen in einer Retinsäure Antagonisten getränkt können vorzeitige MyoD Induktion durch FGF18 potenzieren. Dieser Ansatz kann unsed mit einer Vielzahl von verschiedenen Wachstumsfaktoren und Inhibitoren und wird leicht auf andere Gewebe in den sich entwickelnden Embryo angepasst.

HH Stufe 21 MyoD ist nicht in sich entwickelnden Gliedmaßen Myoblasten obwohl Färbung kann myotome der Entwicklungs Somiten (1A) zu sehen ist, ausgedrückt. 1B zeigt in situ Hybridisierung für MyoD 6 h nach einer FGF18 Wulst Transplantats. MyoD in Myoblasten dicht an dem Wulst induzierten während es keinen Ausdruck in der kontralateralen Extremität. Co-Pfropfen eines Wulstes in U0126 getränkt, einen spezifischen Inhibitor von MEK, Blöcke FGF18 Induktion von MyoD (Abbildu...

Durch das Pfropfen von Kügelchen, die mit Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren von Signalwegen getränkt sind, in sich entwickelnde Embryonen ist es möglich, ihre Wirkung direkt in vivo zu testen. Bei diesem Protokoll werden Kügelchen in die Knospe der Gliedmaßen transplantiert, um die Auswirkungen dieser Moleküle auf die Genexpression und Signaltransduktion zu bestimmen.

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu zeigen, wie die Auswirkungen von Wachstumsfaktoren und Inhibitoren auf die Genexpression sich entwickelnder Hühnerembryonenextremitäten bestimmt werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie Signalmoleküle das Wachstum und die Differenzierung von Zellen in vivo beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine Möglichkeit bietet, diese Faktoren direkt im Embryo zu testen.Obwohl diese Methode Einblicke in die Gliedmaßenentwicklung ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie zum Beispiel Nervengewebe, Somiten oder die Gastrulation. Die Durchführung des Verfahrens wird Rebeea Mohammed, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Zunächst überführen Sie ein Milliliter der Kügelchen aus der ursprünglichen Stammlösung in ein frisches Gefäß.Lassen Sie die Kügelchen absetzen, entfernen Sie dann die Flüssigkeit und ersetzen Sie sie durch ein Milliliter PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal und lagern Sie die gewaschenen Kügelchen bei vier Grad Celsius als Suspension in PBS. Wählen Sie die Kügelchen für die Pfropfung aus, indem Sie sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette aus der gewaschenen Stammlösung entnehmen und in ein Milliliter PBS geben.Wählen Sie mithilfe eines Stereomikroskops Perlen aus, die etwa 100 Mikrometer im Durchmesser betragen. Überführen Sie die ausgewählten Perlen in zwei Mikroliter Flüssigkeit in eine neue Petrischale, die einen Tropfen von 20 Milliliter PBS enthält. Entfernen Sie anschließend den PBS von den Perlen. Zunächst mit einer 20-Mikroliter-Pipette und danach das restliche Flüssigkeitsvolumen durch Kapillarwirkung mit einer feinen Uhrmacherpinzette.Es ist wichtig, so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen, damit der Wachstumsfaktor nicht verdünnt wird, wenn er zu den Kügelchen gegeben wird. Pipettieren Sie den Wachstumsfaktor direkt auf die Kügelchen. Für FGF18 geben Sie 0,5 Mikroliter rekombinantes FGF18 hinzu, das in PBS mit 0,1 Prozent BSA auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter rekonstituiert wurde.Danach mehrere Tropfen Wasser am Rand der Petrischale verteilen, um eine Verdunstung der Flüssigkeit zu verhindern. Anschließend die Kügelchen eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die Wassertröpfchen mit einer Pasteurpipette aus der Schale entfernen und die Schale auf Eis stellen.Derivatisieren Sie die Kügelchen, indem Sie zunächst mit einem Spatel die Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Geben Sie dann ein Milliliter 0,2 Normal-Formi­­säure hinzu und inkubieren Sie die Kügelchen eine Stunde lang unter Schütteln auf einer Schüttelplattform in der Säure. Anschließend lassen Sie die Kügelchen absinken, entfernen die Ameisensäure und ersetzen sie durch ein Milliliter Wasser.Waschen Sie die Kügelchen eine Stunde lang auf der Schüttelplattform und wiederholen Sie den Waschschritt sechsmal, um sämtliche Reste von Ameisensäure zu entfernen. Nach dem letzten Waschschritt entfernen Sie die restliche Flüssigkeit und lagern die Kügelchen bei vier Grad Celsius. Entnehmen Sie mithilfe eines Spatels eine kleine Portion der Kügelchen mit einem Volumen von etwa fünf bis zehn Mikrolitern aus dem Vorrat und geben Sie die Kügelchen in eine 30-Milliliter-Petri-Schale.Dann fügen Sie ein Milliliter DMSO hinzu. Verwenden Sie anschließend eine auf zwei Mikroliter eingestellte P2-Pipette, um Perlen mit einem Durchmesser von etwa 100 Mikrometern in einen 20-Mikroliter-Tropfen Lösungsmittel in einer anderen 30-Milliliter-Petri-Schale zu überführen. Entfernen Sie den größten Teil des Lösungsmittels mit einer 20-Mikroliter-Pipette und jegliches restliche Lösungsmittel mit einer zwei-Mikroliter-Pipette.Anschließend die Kügelchen mit 20 Mikroliter des in DMSO gelösten zu applizierenden Wirkstoffs bedecken. Die Kügelchen eine Stunde lang in der Wirkstofflösung inkubieren. Die Kügelchen vor Licht schützen, da viele Wirkstoffmoleküle lichtempfindlich sind.Um die Beads besser sichtbar zu machen, überführen Sie vier bis fünf Beads in zwei Mikrolitern Flüssigkeit in 20 Mikroliter zweiprozentiger Phenolrot-Lösung in Wasser. Entfernen Sie ein einzelnes Bead mit feinen Uhrmacherpinzetten und spülen Sie das Bead in PBS ab. Lassen Sie die Beads nicht länger als 15 Minuten in der Phenolrot-Lösung, bevor Sie sie abspülen, da dies zu einem Verlust der Aktivität führen kann.Schneiden Sie feinen Wolframdraht in drei bis vier Zentimeter lange Stücke. Stecken Sie dann ein Stück des Drahts in das Ende einer Glas-Pasteurpipette und schmelzen Sie es mit einem Bunsenbrenner fest, um es zu befestigen. Bereiten Sie bis zu 10 Nadeln vor, um Ersatz zur Verfügung zu haben, falls diese beschädigt werden. Danach halten Sie das Ende des Drahts in eine Brennerflamme und lassen Sie es so lange darin, bis der Wolframdraht weiß glüht und die Spitze scharf ist.Dies dauert etwa zwei bis drei Minuten. Geben Sie fünf bis sechs Tropfen Künstler-Tusche zu 15 Milliliter PBS, das 100 Einheiten Penicillin und 0,1 Milligramm Streptomycin pro Milliliter enthält. Um die Hühnerembryonen vorzubereiten, inkubieren Sie die Eier mit dem stumpfen Ende nach oben, bis sie den gewünschten Entwicklungsstadium für die meisten Eingriffe an der Gliedmaßenanlage erreicht haben, was typischerweise drei bis fünf Tage beträgt.Wenn der gewünschte Zeitpunkt erreicht ist, verwenden Sie stumpfe Pinzette, um auf das stumpfe Ende des Eies zu klopfen und die Schale zu brechen. Entfernen Sie dann mit der Pinzette die Schale und legen Sie das Embryo frei. Stellen Sie sicher, dass auch die Eizellmembran entfernt wird.Um das Embryo sichtbar zu machen, injizieren Sie PBS, das mit einigen Tropfen Künstler-Tusche versetzt wurde, mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 21-Gauge-Nadel unter das Embryo. Anschließend kann die das Embryo überlagernde Vitellinmembran mit feinen Pinzetten entfernt werden. Danach geben Sie zwei bis drei Milliliter eines ergänzten PBS, das ein Prozent fetalen Kälberserum, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 0,1 Milligramm pro Milliliter Streptomycin enthält, in das Ei, um sicherzustellen, dass das Embryo nicht austrocknet.Öffnen Sie mit einer geschärften Uhrmacherpinzette das Amnion über den sich entwickelnden Gliedmaßenanlagen. In diesen Stadien dreht sich das Embryo typischerweise so, dass die rechte Seite oben liegt. Stellen Sie sicher, dass das Embryo nicht austrocknet, indem Sie bei Bedarf mehr der supplementierten PBS-Lösung hinzufügen.Das den Embryo umgebende Amnion kann mit einer feinen Wolframnadel geöffnet werden, um die sich entwickelnde Extremität freizulegen. Anschließend mit dem geschärften Wolframdraht einen Schnitt in die Extremitätenanlage machen, an der die Kugel implantiert werden soll. Wenn möglich, vermeiden Sie es, die Extremitätenanlage vollständig zu durchtrennen.Obwohl dies in jüngeren Stadien schwierig ist, nehmen Sie eine Perle, die entweder mit dem Wachstumsfaktor oder dem Wirkstoff beschichtet ist, mit extrafeinen Uhrmacherpinzetten auf. Wenn die Perle zuvor in DMSO oder Phenolrot getaucht wurde, spülen Sie sie vor der Anwendung am Embryo unbedingt mit PBS ab.Übertragen Sie die Bead mit der Pinzette auf das Embryo und verwenden Sie dann den geschärften Wolframdraht, um die Bead an der Einschnittstelle einzusetzen. Geben Sie ein bis zwei Milliliter der supplementierten PBS-Lösung hinzu, um sicherzustellen, dass das Embryo ausreichend befeuchtet bleibt. Vermeiden Sie es, die Lösung direkt auf das Embryo aufzutragen, da dies das Embryo beschädigen und die Bead lösen kann.Verwenden Sie anschließend eine 10-mL-Spritze mit einer 19-Gauge-Nadel, um nur so viel Albumin zu entnehmen, wie erforderlich ist, um sicherzustellen, dass das Embryo nicht mit dem Klebeband in Berührung kommt, das zum Verschließen des Eies verwendet wird. Achten Sie darauf, dass die Nadel das Eigelb nicht beschädigt, indem Sie sie an der Innenseite der Schale entlangführen. Versiegeln Sie das Ei abschließend mit Klebeband und stellen Sie es zurück in den Inkubator.Um zu bestätigen, dass FGF18 über MEK wirken kann, um ERK zu phosphorylieren, wurden die Embryonen eine Stunde nach der Bead-Transplantation gewonnen und auf das Vorhandensein phosphorylierten ERKs immunhistochemisch gefärbt, das im Bild rechts um die transplantierte Bead herum sichtbar ist. Im HH-Stadium 21 wird MyoD in den sich entwickelnden Extremitätenmyoblasten nicht exprimiert. Obwohl eine Färbung im Myotom der sich entwickelnden Somiten sichtbar ist.Sechs Stunden nach einer FGF18-Perlen-Transplantation kann MyoD in Myoblasten nahe der Perle induziert werden, während im kontralateralen Extremität keine Expression zu beobachten ist. Diese Expression kann durch gleichzeitige Transplantation einer Perle, beschichtet mit einem MEK-Inhibitor wie U0126, gehemmt werden.Ebenso verringert die Transplantation einer U0126-Perle im HH-Stadium 21 die endogene Expression von MyoD nach 24 Stunden im Vergleich zum unbehandelten kontralateralen Gliedmaßenanlage. In Gliedmaßenanlagen induziert FGF18 im HH-Stadium 19 keine MyoD-Expression. Durch gleichzeitige Transplantation von Perlen, die mit FGF18 und einem Retinsäure-Antagonisten getränkt wurden, kann dies jedoch überwunden werden, und eine ektope MyoD-Expression ist nachweisbar.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in drei bis vier Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Die Entwicklung dieser Technik ermöglichte es Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, die Signalübertragung durch Wachstumsfaktoren bei der Embryonalentwicklung zu untersuchen. Bei der Anwendung dieser Technik ist es wichtig, darauf zu achten, dass der Embryo nicht austrocknet.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kügelchen in sich entwickelnde Embryonen einpflanzt, um zu untersuchen, wie die Signalübertragung durch Wachstumsfaktoren die Entwicklung beeinflusst.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Den Hühnerembryo während der Entwicklung zu betrachten und darauf zuzugreifen, kann eine Herausforderung sein. Wir haben eine Ex-Ovo-Methode entwickelt, die einfach und kostengünstig ist und problemlos in einem Klassenzimmer oder in der Forschung eingesetzt werden kann. Diese Methode ermöglicht den Zugang zum Embryo bis in die späten Stadien der Embryonalentwicklung (HH 40).

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Dual-Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen innerhalb von Hühnerembryonen mit ChickGFP Neural Tube Grafting und Carbocyanin Dye DiI Injektion

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Microbead Implantation im Zebrafischembryo

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Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

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Der durchnässte Perlenassay beinhaltet die gezielte Abgabe von Testreagenzien zu jedem Entwicklungszeitpunkt, um die Regulation der Zelldifferenzierung und Morphogenese zu untersuchen. Es wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das auf jedes Versuchstiermodell anwendbar ist, um drei verschiedene Arten von getränkten Perlen herzustellen und diese in die Zwischenziffer eines Hühnerembryos zu implantieren.

Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay

Lernen Sie die Pfropfung von Beads in Hühnerembryo-Gliedmaßen zur Untersuchung von Wachstumsfaktoren und Signalwegen. Diese Methode ermöglicht direkte in-vivo-Tests zur Analyse der Genexpression.

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression (Video) | JoVE Journal

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

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