Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Organoide zu generieren und sie als dreidimensionales Modell für die Infektionsbiologie zu nutzen. Vor einigen Jahren entdeckte mein Labor LDR fünf als Marker für Stammzellen in einer Reihe verschiedener erwachsener Organe von Mäusen. Und der Mensch, da wir gelernt haben, einzelne Stammzellen aus diesen Organen zu entnehmen und sie in Form von Organoiden zu kultivieren, kleine Versionen dieser Organe, und mit der Organoid-Technologie haben wir jetzt gezeigt, dass wir Krebs bis ins kleinste Detail untersuchen können, aber auch Probleme mit Infektionskrankheiten.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Modellierung der Infektionsbiologie anhand von Krebszelllinien besteht darin, dass es sich hier um primäre, nicht transformierte Epithelzellen handelt und dass eine dreidimensionale Struktur erhalten bleibt, beginnend mit etwa einem Quadratzentimeter frischem Magengewebe. In einer trockenen 10 Zentimeter großen Petrischale den Schleim und die Muskelschicht vorsichtig mit einer Pinzette entfernen. Waschen Sie das Tuch im kalten Chelatpuffer mit sanften Hin- und Herbewegungen.

Legen Sie das gewaschene Taschentuch in eine neue, trockene 10-Zentimeter-Schale. Schneiden Sie das Gewebe in 25 bis 50 kleine Stücke, die etwa zwei bis fünf Quadratmillimeter groß sind, und übertragen Sie sie mit einer Pinzette in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie eine 10-Milliliter-Pipette mit Chelatpuffer benetzt haben, geben Sie 10 Milliliter des Puffers in das 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Stücke, indem Sie 10 Mal kräftig auf und ab pipettieren.

Lassen Sie die Stücke absetzen und entfernen Sie das Supra natant. Wiederholen Sie den Waschvorgang, bis die Überwindung klar ist. Pipettieren Sie anschließend 20 Milliliter eines X Chelatpuffers.

Mit 10 millimolar EDTA auf die Gewebestücke geben und 10 Minuten inkubieren. Bei Raumtemperatur das Röhrchen nach dieser Inkubation alle zwei Minuten vorsichtig umdrehen und vorsichtig auf und ab pipettieren. Lassen Sie die Stücke einmal mit einer 10-Milliliter-Pipette absetzen und entfernen Sie den Überstand.

Gib die Stücke dann in eine saubere 10 Zentimeter große Schüssel und entferne die gesamte Flüssigkeit. Legen Sie einen Objektträger auf die Gewebestücke und betrachten Sie das Gewebe mit 10-facher Vergrößerung an einem inversen Mikroskop. Nehmen Sie die Schüssel und üben Sie leichten Druck auf das Glas aus.

Beim Gleiten erscheint der Rand des Gewebes trüb, was auf eine Drüsenfreisetzung hinweist. Sammeln Sie die freigesetzten Drüsen und Gewebestücke in 30 Millilitern kaltem Basalmedium. Lassen Sie die Gewebefragmente sich absetzen und sammeln Sie die Schlinge, die nun die Drüsen enthält, in zwei 15-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200-fachem G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie das Supinat und lagern Sie die entstandenen Kügelchen auf Eis, um die Drüsen zu sehen. Suspendieren Sie das Pellet in 60 Mikrolitern Kellermatrix auf Eis.

Bereiten Sie fünf sterile 1,5-Milliliter-Röhrchen separat vor. Jeweils mit 50 Mikrolitern Grundstoffmatrix. Übertragen Sie 10 Mikroliter der suspendierten Drüsen in eines der Röhrchen mit 50 Mikrolitern Basalmatrix.

Führen Sie eine serielle Verdünnung durch, indem Sie 10 Mikroliter von dieser ersten Verdünnung in das nächste 1,5-Milliliter-Röhrchen übertragen und für die restlichen Röhrchen wiederholen. Pipettieren Sie nun 50 Mikroliter der suspendierten Drüsenverdünnung aus jedem 1,5-Milliliter-Röhrchen in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Der Tropfen sollte vorsichtig eine Kuppel bilden.

Legen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator und lassen Sie die Basalmatrix 10 Minuten lang erstarren. Nach der Vorbereitung des entsprechenden Nährmediums wird die Platte mit der nun erstarrten Basalmatrix vorsichtig entfernt und jeweils 500 Mikroliter des Mediums zugesetzt. Nun, stellen Sie die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator.

Frischen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage auf, um sich auf die Passage vorzubereiten. Die Organoidkulturen. Halten Sie die Spitze einer Weidepipette in die Flamme des Überflusses und des Brenners und lassen Sie sie abkühlen.

Die Spitze sollte von 1,5 Millimetern auf etwa 0,5 Millimeter verjüngt werden. Nach der Inkubation nehmen Sie die Platte, die nun Organoide enthält, aus dem Zellkultur-Inkubator. Saugen Sie das Medium aus eins an.

Nun, geben Sie einen Milliliter kaltes Basalmedium in die Vertiefung und pipettieren Sie kräftig auf und ab, um die Basalmatrix aufzubrechen. Den Inhalt der Vertiefung in ein 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen und auf Eis legen. Befeuchten Sie die Pipette mit einer basalen, mittleren und optimal verengten Pipette, die das Medium sichtbar langsamer aufnimmt als eine unverengte Pipette.

Brechen Sie dann die Organoide auf, indem Sie 10 Mal kräftig auf und ab pipettieren. Fügen Sie neun Milliliter kaltes Basalmedium hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang. 200 mal G und vier Grad Celsius hinzufügen.

Nachdem Sie das Snat entsorgt haben, suspendieren Sie das Pellet vorsichtig wieder in 250 Mikrolitern Kellermatrix und legen Sie das Rohr auf Eis. Geben Sie einen 50-Mikroliter-Tropfen der Basalmatrix, die Zellen enthält, in jede Vertiefung einer vorgewärmten Zellkulturplatte mit vier Vertiefungen. Legen Sie die Platte vorsichtig wieder in den Inkubator und lassen Sie die Kellermatrix 10 Minuten lang erstarren.

Nehmen Sie nun die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 500 Mikroliter Basalmedium hinzu, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt ist. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator und tauschen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage aus. Um mit der Mikroinjektion von Organoiden zu beginnen, ernten Sie h pylori I Bakterien und waschen Sie sie in Basalmedium gemäß den Standardprotokollen.

Nach optischen Dichtemessungen zur Bestimmung der Bakterienzahl verdünnen Sie die Kultur auf eins mal 10 bis das neunte Bakterium pro Milliliter. Ziehen Sie im Basalmedium mit einem Mikropipettenabzieher eine Glaskapillare in zwei Injektionsnadeln und bewahren Sie sie in einer sauberen Petrischale auf. Brechen Sie dann mit einer Pinzette die Spitze einer Injektionsnadel, um eine etwa 10 Mikrometer breite Öffnung zu erzeugen, die an einem Stereomikroskop arbeitet.

Aufgestellt in einer sterilen Kulturhaube. Führen Sie die Nadel in den Injektionshalter ein und befestigen Sie sie am Mikromanipulator. Nehmen Sie ca. 10 Mikroliter der Bakterienlösung in die Nadel auf.

Legen Sie dann die Vier-Well-Zellkulturplatte mit den Magenorganoiden unter das Stereomikroskop. Positionieren Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator in der Nähe eines Organoids, führen Sie die Nadel mit einer schnellen Bewegung in das Organoid ein und injizieren Sie dann etwa 0,2 Mikroliter Bakterienlösung in die Mitte des Organoids. Mit viel Erfahrung können etwa 30 der größten Organoide in einer Vertiefung in fünf Minuten injiziert werden.

Inkubieren Sie die injizierten Organoide für die gewünschte Zeit in einem Zellkultur-Inkubator. Oft haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, weil sie es schwierig finden, die Organoide effizient zu behandeln. Daher kann die Injektion von Magenorganoiden aus der Maus, z. B. mit einem Farbstoff, eine gute Praxis für diese Technik sein. Magenorganoide werden in Kultur nach Isolierung der Magendrüsen und Wachstum in der Basalmembran gebildet, die geeignete Wachstumsfaktoren enthält.

Die hier zu sehenden menschlichen Magenorganoide beginnen typischerweise als kleine Zysten und dehnen sich zu Kugeln mit einem Durchmesser von 50 bis 300 Mikrometern aus. Nach der Injektion von Organoiden mit h pylori I-Zellen zeigt die immunhistochemische Färbung für das bakterielle Protein, das mit Zytotoxizität assoziierte Gen A oder CAG A ist, eine spiralförmige Form h pylori in unmittelbarer Nähe der Epithelzellen, die das Organoid bilden. Nun ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass funktionelle Wachstumsfaktoren und Inhibitoren für das Wachstum von Organoiden entscheidend sind.

Insbesondere der Wind sollte für jede einzelne Charge in einem separaten Assay getestet werden. Nach diesem Verfahren können nun verschiedene Assays durchgeführt werden. Zum Beispiel die Immunfluoreszenz ganzer Hügel, die RNA-Analyse oder auch die Proteinanalyse.

Organoide sind auch anfällig für genetische Veränderungen.