Name: Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Lernen Sie die Messung von Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen anhaftenden und internalisierten viralen Partikeln.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Schweizerischen Nationalfonds (31003A_135278) SST unterstützt. MOP ist der Begünstigte einer Promotionsstipendium der AXA Forschungsfonds. Wir bedanken uns bei Patricia Nigg für die Hilfe bei der Gestaltung der Figur 1.

Beachten Sie vor dem Start: Verwenden Sie Laminarströmungshaube und geeignete biocontainment bei der Arbeit mit Lebendvirus. Hier beschreiben wir das Wachstum geeigneten Bedingungen, um Kulturinfluenzavirusstamm A / WSN / 33. Multiplizität der Infektion (MOI) und Inkubationszeiten können je nach Virusstamm variieren. 1. Herstellung von biotinyliertem A / WSN / 33-Virus <ol><li> Samen Madin-Darby canine kindey Zellen (MDCK) in eine T175 cm 2 -Kolben mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen / Strep) ergänzt. Kulturzellen bei 37 ° C bis ungefähr 70% Konfluenz erreicht wird. </li><li> Vor der Infektion zu entfernen Medium und wäscht die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH7.0-7.3) durch Zugabe einer ausreichend großen Volumen, um die Zellschicht zu bedecken. </li><li> Entfernen PBS und infizieren Zellen mit A / WSN / 33 mit einer MOI von 10 -4. Verdünnte Virus in PBS, ergänzt mit 0,02 mg Mg 2+, 0,01 mg Ca 2+ &lt;/ sup&gt;, 0,3% Rinderserumalbumin (BSA) und 1% Pen / Strep (Infektion-PBS). Verwenden Sie ein Inokulum von 4 ml für eine T175 cm 2-Kolben. </li><li> Inkubiere Zellen 1 h bei 37 ° C. Entfernen Inokulum durch Aspiration und Pipette 10 ml DMEM mit 0,3% BSA, 20 mM HEPES und 1% Pen / Strep in den Kolben ergänzt. </li><li> Zellen bei 37 ° C für etwa 3 Tage bis cytopathischen Effekt (CPE) zu sehen ist, und dann Ernte Standes. CPE als Aufrundung der Zellen, gefolgt von Ablösung und Tod von Zellen 14 erkannt werden. </li><li> Spinüberstand bei 450 · g für 5 min, um die Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Überstand in ein neues Falcon-Röhrchen und ein weiteres Mal wiederholen Sie diesen Schritt. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Transfer-Überstände in Ultrazentrifugenröhrchen und Unterstände mit 5 ml 30% Saccharose in NTE-Puffer (10 mM Tris [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) verdünnt. Balancieren Rohre vor Ultrazentrifugation und füllen sich mit PBS, um ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen. Spin supernanern bei 112.398 xg (entsprechend 25.000 rpm für einen SW28 Rotor) für 90 min in einer Ultrazentrifuge. </li><li> Überstand vorsichtig abnehmen durch Pipettieren und genießen Viruspellet über Nacht bei 4 ° C in 250 ul PBS. Pellet durch Auf- und Abpipettieren. Messen Proteingehalt des gereinigten Virus durch Bradford-Assay 15. </li><li> Verwenden Sie einen Biotinylierungskit an biotinylierte A / WSN / 33 zu erzeugen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Kurz gesagt, fügen Sie die entsprechende Menge an Biotin zu dem gereinigten Virus und Inkubation für 2 Stunden auf Eis. Übertragen Virus ein Ultrazentrifugenröhrchen und das Füllrohr mit PBS auf ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen. Spin Virus bei 112.389 × g für 90 min in einer Ultrazentrifuge. Überstand entfernen durch Pipettieren und fügen Sie 250 ul PBS. Soak Pellet über Nacht bei 4 ° C. Aliquot und speichert das biotinylierte Virus bei -80 ° C gelagert wird, wo sie für mindestens 24 Monate stabil. HINWEIS: Es könnte hilfreich sein, um den Titer des biotinylierten p bestimmen,Reparatur von IAV durch Standard-Plaque-Test. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die nachfolgenden Protokoll nur biotinylierte Viruspartikeln zu messen. Restlichen biotinylierten Partikel aufgrund unvollständiger Biotinylierung wird dem Infektionstiter mittels Plaque-Assay, aber nicht zu dem Signal in dem Befestigungs- / Internalisierung Assay gemessen bei. </li></ol> 2. Bestimmen Sie die erforderliche Menge an biotinyliertem Virus Hinweis: Vor dem Anschließen / Internalisierung Assay durchgeführt wird, ist es wichtig, die Menge an biotinyliertem Virus benötigt, um alle Zellen einer Probe zu infizieren bestimmen. <ol><li> Kultur und trypsinize A549 Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Zellenkammer. Pipette 200.000 A549-Zellen in FACS Deepwell Rohre. Spin 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet mit 200 ul PBS. Coole Zellen nach unten auf Eis für 10 min. </li><li> Bereiten Sie das 5-fache serielle Verdünnungen der biotinylated Virusstamm in infektions PBS. </li><li> Spin Röhrchen mit den Zellen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet mit 100 ul virushaltigen Infektion-PBS. Wie Mock Steuer Verwendung infektions PBS ohne biotinyliertes Virus. Röhrchen auf Eis für 1 Stunde inkubiert. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 200 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. </li><li> Zur Fixierung, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 100 ul 3,7% Paraformaldehyd (PFA). Inkubation für 10 min bei RT. Wiederholen Sie dann in 2.4 beschriebenen Waschschritt). </li><li> Zur Permeabilisierung, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 100 ul PBS, das 0,5% Triton X-100. Inkubation für 6 min bei RT. Wiederholen Sie dann in 2.4 beschriebenen Waschschritt). </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und resuspendieren pellet in 50 &amp; mgr; l 2% BSA in PBS, das STV-Cy3 verdünnt. (Bitte beachten Sie, sollte die entsprechende Konzentration des STV-Cy3 vor dem Start des Experiments bestimmt werden Beginnen Sie mit einer Konzentration von 1:. 200 und Test 2-fache Verdünnungen bis zu 1:. 2400 In unseren Händen, eine Verdünnung von 1: 1000 bewiesen optimal zu sein.) </li><li> Inkubieren 1 Stunde im Dunkeln bei RT. Dann wiederholen Sie die Waschschritt in 2.4 beschrieben, aber das Pellet in 200 ul 2% BSA in PBS verdünnt. </li><li> Analyse Proben mittels Durchflusszytometrie 16. Tor auf der Cy3-positiven Population. Wählen, die niedrigste Konzentration an biotinyliertem Virus was zu der maximalen Anzahl von Cy3-positiven Zellen in der A549 Bevölkerung. </li></ol> 3. Bestimmen Sie die erforderliche Menge an Streptavidin HINWEIS: Die Effizienz der Blockierung der von extrazellulärem Virus abgeleitete Signal bestimmt den Erfassungsbereich des Assays. Daher ist es wichtig, den STV-Cy3-Signal so weit wie möglich aufheben. The erforderliche Menge an STV benötigt wird, hängt von der Menge an biotinyliertem Virusstamm verwendet (in Abschnitt 2 bestimmt). <ol><li> Führen Sie die Schritte 2,1 bis 2,4, aber verwenden Sie in Abschnitt 2 festVirusKonzentration. </li><li> Vorbereitung Fünffache Serienverdünnungen STV in PBS, enthaltend 2% BSA und 0,1% Natriumazid verdünnt. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 50 &amp; mgr; STV Verdünnung. Wie Mock Steuer Verwendung PBS mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid ohne STV. Röhrchen für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wiederholen Sie die Waschschritt in 2.4 beschrieben. </li><li> Führen Sie die Schritte 2,5-2,9. Für die Internalisierung Assay, wählen Sie die niedrigste Konzentration des STV, was zu einem starken Block der Cy3-Signals (im Vergleich zu der Probe, in der kein STV war vorhanden). Hierzu kann der Prozentsatz von Cy3-positiven Zellen oder der mittleren Fluoreszenzintensität des Cy3-Signal verwendet werden. Idealerweise sollte das Cy3 Signal STV-behandelten Proben so nahe an dem Signal von mock-infiziertZellen wie möglich. </li></ol> 4. Befestigung / Internalisierung Assay HINWEIS: Sicherstellen, dass alle Reagenzien vor Testbeginn vorzubereiten. Für die drei Kontrollgruppen im Ergebnisteil (mock-infizierten Zellen, Neuraminidase vorbehandelt Zellen und Natriumazid Zellen) präsentiert kleine Änderungen an dem Protokoll erforderlich. <ol><li> Bereiten Sie 16 Deepwell Rohre jeweils 200.000 A549-Zellen enthält. Neben der experimentellen Set bestehend aus 4 Röhren gibt es 3 Kontrollbedingungen, die jeweils benötigt 4 Röhren: mock-infizierten Zellen, Neuraminidase (NA) -pretreated Zellen und Natriumazid behandelten Zellen. Jede Gruppe besteht aus 4 Röhren als &quot;0 min&quot;, &quot;0 min + STV &#39;, &#39;30 Minuten&#39;, &#39;30 min + STV &#39;beschriftet. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 200 ul PBS. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C bei 450 x g. Überstand entfernen und resuspendieren pellet in 200 ul DMEM, enthaltend 0,3% BSA, 20 mM HEPES und 1% Penicillin-Streptomycin (Inkubationsmedium). Inkubation für 30 min bei 37 ° C. HINWEIS: Für die Neuraminidase Steuerung: Verwenden Sie bakterielle Neuraminidase (zB Sialidase aus Vibrio cholera) in einer Konzentration von 200 mU / ml in Inkubationsmedium verdünnt, um die Zellen zu resuspendieren. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 200 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, dann kühlen Rohre nach unten auf Eis für 10 min. </li><li> Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand und Pellet in 100 ul biotinyliertes Virus zu entfernen (verwenden Sie die Viruskonzentration in Abschnitt 2 in infektions PBS bestimmt). Inkubieren Sie 1 Stunde auf Eis. Dann wiederholen Sie die Waschschritt in 2.4 beschrieben. HINWEIS: Für den Mock-infizierten Kontroll: Verwendung Infektion-PBS ohne Virus. Für Natriumazids Control: Nutzung Virus in Infektions-PBS verdünnt, ergänzt mit 0,1% Natriumazid. </li><li> ProfiBearbeitung der Proben nach der Infektion auf Eis: <ol><li> Für die &quot;0 min&quot; Proben, folgen Sie Schritt 2,5 und Lagerung von Proben bei 4 ° C, bis die anderen Proben werden fixiert. </li><li> Für die &quot;0 min + STV&quot; Proben, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 50 &amp; mgr; STV (verwenden Sie die in Abschnitt 3 fest Konzentration) in PBS mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid verdünnt (zur Internalisierung zu verhindern, während der Handhabung der Probe). Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Folgen Sie Schritt 2,4 bis 2,5 und die Proben bei 4 ° C. </li><li> Für die &#39;30 min &quot;Proben, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 200 ul PBS, das 2% BSA. Inkubieren 30 min bei 37 ° C. Folgen Sie Schritt 2,4 bis 2,5 und die Proben bei 4 ° C. ANMERKUNG: Die Natriumazid Kontrolle: Mit PBS, ergänzt mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid für 30 min Inkubation bei 37 ° C. </li><li> Für die &quot;30 min + STV Proben der Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 200 ul PBS, das 2% BSA. Inkubieren 30 min bei 37 ° C. Dann Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 50 &amp; mgr; STV (verwenden Sie die in Abschnitt 3 fest Konzentration) in PBS mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid verdünnt (zur Internalisierung zu verhindern, während der Handhabung der Probe). Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Folgen Sie Schritt 2,4 bis 2,5 und die Proben bei 4 ° C. ANMERKUNG: Die Natriumazid Kontrolle: Mit PBS, ergänzt mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid für 30 min Inkubation bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Führen Sie die Schritte 2,6-2,8 und Proben zu analysieren mittels Durchflusszytometrie. Bestimmen Sie den Prozentsatz der Cy3-positiven Zellen in jeder Probe. </li><li> Der prozentuale Anteil befestigt Virus und die relative Menge der internalisierten Virus. <ol><li> Um die Menge der beigefügten Virus zu berechnen verwenden Sie den Prozentsatz der Cy3-positive geschlossene Zellen oder die mittlere Fluoreszenzintensität der Cy3-Signal. Zum Vergleich gesetzt unbehandelten Zellen auf 100% (4B). HINWEIS: Der Prozentsatz der beigefügten Virus wird durch die &quot;0 min&quot; Probe beschrieben. </li><li> Um die Menge der internalisierten Virus zu berechnen, nehmen Sie das Verhältnis der &quot;30 min + STV&quot; Probe auf die &quot;30 Minuten&quot; Probe (5B). HINWEIS: Wie oben erwähnt, kann der Prozentsatz von Cy3 positive gated Zellen oder der mittleren Fluoreszenzintensität des Cy3-Signal verwendet werden. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Unser Protokoll beschreibt eine einfache Möglichkeit zur Messung der Virus-Bindung und Internalisierung durch Durchflusszytometrie. Es erlaubt die Verwendung von markierten Wildtyp-Virus, das imitiert enger Virus-Infektionen im Vergleich zur Verwendung von virusähnlichen Partikeln (VLP). Während unsere Protokoll wurde optimiert, um Bindung und Internalisierung von IAV messen, kann es leicht für andere Viren angepasst werden. Darüber hinaus, wie Durchflusszytometrie ist zum Auslesen verwendet, aufeinander Färbungen könne...

Der Eintrag von Influenza-A-Virus (IAV) ist ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Bindung des Virus an Rezeptoren auf der Plasmamembran von Zielzellen 1 beginnt. Der Rezeptor für die IAV Sialinsäure, die auf einer Vielzahl von Glykoproteinen und Glykolipiden vorliegt. Das Hämagglutinin (HA) Proteins der IAV, die in der Virushülle vorhanden ist bindet an Sialinsäure und vermittelt so die Befestigung der viralen Partikel in der Plasmamembran von Zielzellen 2. Das Virus tritt in die Zellen über Clathrin-vermittelte Endozytose, sondern auch alternative Eintrittswege wie Makropinozytose, beschrieben worden, 3-6. Die Wechselwirkung zwischen HA und Sialinsäure ausreichend erscheint zum Vermitteln sowohl Befestigung und Auslösen Internalisierung von Viruspartikeln 7 sein. Dennoch alternative Eingabe Rezeptoren wurden vorgeschlagen und ihre Rollen in IAV Eintrag werden derzeit untersucht 1,8,9. CurBeauty Preis werden Anstrengungen unternommen, um Wirtsfaktoren, die im viralen Lebenszyklus mit dem Ziel der Entwicklung von dringend benötigten neuen antiviralen Therapien 10-12 beteiligt sind, zu identifizieren. Virus Eintrag würde eine günstige Schritt für die Ausrichtung IAV Wachstum, um eine virale Infektion in seinen frühesten Zeitpunkt zu blockieren. Mess verschiedenen Stadien der IAV Eintrag experimentell ist anspruchsvoll wie in der Regel große Mengen des Virus erforderlich sind, um eingehende Virus zu erkennen. Zusätzlich kann der Erfassungsbereich für Änderungen in den Eintritt des Virus ist nur linear durch das Fehlen der viralen Replikation. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von Tests mit hoher Empfindlichkeit. Der Test wir hier erlaubt den Nachweis gebunden Virus an der Zelloberfläche als auch internalisiert Nachweis von Viren in Bezug auf die Gesamtmenge der Zell-assoziierten Virus. Die Verwendung von biotinylierten Wildtyp-Virus ermöglicht die bequeme Messung durch Färbung mit STV-Cy3 und Auslesen mittels Durchflusszytometrie. Biotinylierte Virus ist kalt gebunden an Zells, um die Befestigung zu ermöglichen, sondern verhindern, Internalisierung von Viruspartikeln. Die Zellen können fixiert werden, permeabilisiert und mit STV-Cy3 gefärbt, um die angeschlossenen Virus zu messen. Das Signal von extrazellulären, befestigt Virionen können aufgehoben werden, wenn ein Blockierungsschritt vor der Fixierung in dem die Zellen mit nicht-markiertem Streptavidin (STV) inkubiert aufgetragen. In einem nächsten Schritt, nach Bindung von biotinyliertem IAV, Temperatur wird auf 37 ° C verschoben und Internalisierung von viralen Partikeln stattfinden darf. Internalisierten Partikel von Bindung von STV dadurch die Unterscheidung zwischen extra- und intrazellulärer Viren so geschützt. Pro Versuchsbedingung werden vier Proben erforderlich: &#39;0 min &quot;: Die erste Probe, bezeichnet mit&quot; 0 min &quot;zu kalt gebundenen Virus an der Zelloberfläche zu messen. &#39;0 min + STV&#39;: Die zweite Probe, &#39;0 min + STV&#39; markiert sind, gibt die Basissignalintensität des Experiments. Befestigt Virus blockiert with STV und das Signal nach Färbung mit STV-Cy3 sollte viel niedriger im Vergleich zu den &quot;0 min&quot; Probe sein. &#39;30 Min &quot;: Die dritte Probe, &#39;30 min &#39;enthält befestigt und internalisiert Virus infolge der Temperaturverschiebung auf 37 &amp; deg; C für 30 min. &#39;30 Min + STV &#39;: Die vierte Probe, &#39;30 min + STV &quot;Maßnahmen der intrazelluläre Anteil von Viren. STV Blockierungsschritt nach dem 30 min Inkubationszeit aufgetragen. Als Ergebnis werden Viruspartikel an der Zelloberfläche durch STV wobei nur internalisiert Viren zur Verfügung Färbung mit STV-Cy3 gebunden. Die relative Menge internalisiert Virus kann als das Verhältnis der internalisierten Virus (im &#39;30 min + STV &#39;gemessene Probe) dividiert durch die Gesamtvirusmenge (von der &#39;30 min beschriebenen &quot;Probe) berechnet werden. Als Kontrollen schlagen wir vor, mock-infizierten Zellen enthalten. Das Signal nach STV-Cy3-Färbung von mock-infizierten Zellen gibt den Hintergrunddie sich aus dem Färbungsprotokoll. Eine Steuerung für IAV Befestigung ist die Vorbehandlung von Zellen mit bakteriellen Neuraminidase (NA). NA abspaltet Sialinsäure von zellulären Glykoproteine, wodurch Befestigungs Rezeptoren von der Zelloberfläche zu entfernen. Natriumazid (SA) ist ein potenter Inhibitor metabolischen und dadurch blockiert Endozytose 13. Zellen mit Natriumazid sollte positiv für Virusbindung, aber negativ für die Internalisierung sein.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Saccharose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Deepwell-Röhrchen (1,2 ml Mikroröhrchen)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&nbsp; Lucerna chem&nbsp; Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>bakterielle Neuraminidase/ sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

mess bindung und internalisierung von influenza a-virus in a549-zellen mittels durchflusszytometrie

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Die Bindung an Zielzellen, gefolgt von der Internalisierung, sind die allerersten Schritte im Lebenszyklus des Influenza-A-Virus (IAV). Wir stellen hier ein detailliertes Protokoll zur Messung relativer Veränderungen in der Menge an Viruspartikeln zur Verfügung, die an A549-Zellen, einer menschlichen Lungenepithelzelllinie, anlagern, sowie in der Menge der Partikel, die in die Zelle internalisiert werden. Wir verwenden biotinylierte Viren, die nach einer Färbung mit Cy3-markiertem Streptavidin (STV-Cy3) leicht nachgewiesen werden können. Wir beschreiben das Wachstum, die Reinigung und die Biotinylierung von A/WSN/33, einem weit verbreiteten IAV-Laborstamm. Kaltgebundene biotinylierte IAV-Partikel auf A549-Zellen werden mit STV-Cy3 gefärbt und mittels Durchflusszytometrie gemessen. Um die Aufnahme von Viruspartikeln zu untersuchen, lässt man kältegebundene Viren bei 37 °C internalisieren. Um zwischen externen und internalisierten Viruspartikeln zu unterscheiden, wird ein Blockierungsschritt angewendet: Freie Bindungsstellen auf dem Biotin des angehefteten Virus auf der Zelloberfläche werden durch unmarkiertes Streptavidin (STV) gebunden. Die anschließende Zellpermeabilisierung und Färbung mit STV-Cy3 ermöglicht dann den Nachweis internalisierter Viruspartikel. Wir stellen eine Berechnung vor, um die relative Menge an internalisierten Viren zu bestimmen. Dieser Assay ist geeignet, um die Auswirkungen von medikamentösen Behandlungen oder anderen Manipulationen auf die Bindung oder Internalisierung von IAV zu messen.

Ein Cartoon beschreiben die vier verschiedenen experimentellen Bedingungen ist in Figur 1 gezeigten Ergebnissen eines repräsentativen Experiments sind in den 2 vorgelegt. - 5. In der &quot;0 min&quot; Probe ist biotinyliertes Virus Kalt verpflichtet, Zellen, die durch STV-Cy3-Färbung sichtbar gemacht werden können, zielen (Abbildungen 1 und 2). Wenn ein Blockierungsschritt (in der &quot;0 min + STV&quot; Probe) angewend...

Wir präsentieren ein Protokoll, das eine semiquantitative Methode zur Messung sowohl der Bindung von Influenza-A-Viren an A549-Zellen als auch der Internalisierung von Viruspartikeln in die Zielzellen durch Durchflusszytometrie beschreibt.

Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Anheftung und Internalisierung von Influenza-A-Viruspartikeln an 549-Lungenepithelzellen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kaltbindung von Influenza-A-Viren an die 549-Zellen durchgeführt wird, was die Anheftung ermöglicht, aber die Aufnahme der Viruspartikel verhindert.Anschließend wird die Virusinternalisierung durch Erhöhung der Temperatur auf 37 Grad Celsius ermöglicht. Danach folgt ein Blockierschritt, bei dem unlabeled strp Aden an die Zelloberfläche bindet. Angeheftete Viren werden detektiert, um zwischen angehefteten und internalisierten Viruspartikeln zu unterscheiden.Schließlich werden die zellgebundenen, biotinylierten Viren mit CY3-markiertem Streptavidin inkubiert, und die Färbung der Viren wird mittels Durchflusszytometrie detektiert. Abschließend wird die relative Menge der angehefteten und internalisierten Viren berechnet. Obwohl diese Methode Einblicke in die relative Menge von Influenza-Viren ermöglicht, die an 5 0 9-Zellen anheften und in diese internalisieren.Sie kann auch auf andere Systeme angewendet werden, die unterschiedliche Zelllinien oder andere Viren verwenden. Nachdem biotinylierte Viren erzeugt und die erforderlichen Mengen des markierten Virus, Streptavidin und SI3-markiertes Streptavidin gemäß dem Textprotokoll bestimmt wurden, bereiten Sie vier Deep-Well-Röhrchen vor, die jeweils 200.000 A549-Zellen enthalten. Beschriften Sie die Röhrchen als „Null Minuten“, „Null Minuten plus STV“, „30 Minuten“ und „30 Minuten plus STV“. Zentrifugieren Sie anschließend die Röhrchen.Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 200 Mikroliter PBS, um die Pellets erneut in Suspension zu bringen. Anschließend die Röhrchen erneut zentrifugieren und 200 Mikroliter eines 5 49 Standard-Wachstumsmediums verwenden, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen; 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Proben zentrifugieren und die Pellets in 200 Mikroliter PBS resuspendieren. Nachdem der Waschschritt einmal wiederholt wurde, kühlen Sie die Röhrchen 10 Minuten auf Eis ab. Sobald die Röhrchen abgekühlt sind, zentrifugieren Sie erneut und verwenden Sie 100 Mikroliter biotinyliertes Virus, das in Infektions-PBS verdünnt ist, um die Pellets erneut in Suspension zu bringen. Nach einer einstündigen Inkubation auf Eis den Zentrifugationsschritt erneut durchführen und zweimal mit PBS waschen, wobei die folgenden Proben parallel zueinander so weit wie möglich verarbeitet werden, insbesondere die Null-Minuten-Proben.Nach dem Zentrifugieren 100 µL 3,7 % Paraformaldehyd oder PFA verwenden, um das Zellpellet erneut in Suspension zu bringen. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, anschließend zentrifugieren und die Zellen nach der Fixierung zweimal mit PBS waschen. Bis zur vollständigen Verarbeitung aller Proben bei vier Grad Celsius lagern.Um die Proben der Null-Minuten-Plus-STV-Behandlung zu verarbeiten, zentrifugieren Sie die Röhrchen, entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 15&nbsp;µL STV mit 2&nbsp;%&nbsp;BSA und 0,1&nbsp;% Natriumazid in PBS, um das Zellpellet aufzusuchen. Inkubieren Sie die Probe 30&nbsp;Minuten lang auf Eis. Anschließend zentrifugieren und die Zellen zweimal mit PBS waschen, nachdem die Fixierung mit PFA wie gerade gezeigt durchgeführt wurde. Lagern Sie die Proben für die 30-Minuten-Proben bei vier Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren und Entfernen des Überstandes lösen Sie die Proben mit PBS mit 2&nbsp;%&nbsp;BSA auf.Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, bevor Sie mit PBS waschen und mit PFA fixieren. Danach bewahren Sie die Proben bei vier Grad Celsius für 30 Minuten plus STV-Proben auf. Nach dem Pelletieren suspendieren wir die Proben in 200 µL PBS mit 2 % BSA, nach einer Inkubation bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in 50 µL STV mit 2 % BSA und 0,1 % Natriumazid in PBS. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang auf Eis, bevor Sie die Zellen waschen und fixieren. Danach permeabilisieren und färben Sie alle Proben mit STV SI drei, gemäß den im schriftlichen Protokoll beschriebenen Details, und lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius. Schließlich analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie.Bestimmen Sie den Prozentsatz der CY-three-positiven Zellen in jeder Probe. Berechnen Sie den Prozentsatz des gebundenen Virus und die relative Menge an internalisiertem Virus. Gemäß dem Textprotokoll, wie hier in der Probe mit null Minuten gezeigt, ist das gebundene Virus kalt an die Zielzellen gebunden, sichtbar gemacht durch St.V.SI-three-Färbung.Wenn STV als blockierender Schritt angewendet wird, kann Virus an der Zelloberfläche nicht mehr durch S St.V.SI nachgewiesen werden, was die Färbung stark reduziert. Wenn die Temperatur auf 37 Grad Celsius erhöht wird, wird das angeheftete Virus in die Zellen aufgenommen. Das internalisierte Virus ist gegenüber der Blockade mit unmarkiertem STV nicht empfindlich, was zu einem weniger starken Abfall der Signalintensität in den Proben mit STV nach 30 Minuten führt.Hier sind die Prozentsätze der SI-positiven Zellen für alle in diesem Video beschriebenen experimentellen Bedingungen. Als Mock-infizierte Zellen erzeugen sie die Hintergrundsignalintensität für das Experiment und dienen als negative Kontrolle für die Virusbindung. Eine weitere Kontrolle, Neuraminidase, verringert die IAV-Bindung im Vergleich zu unbehandelten Zellen um 90 % stark.Natriumazid, das ATP verbraucht und dadurch die Endozytose hemmt, inhibierte die Internalisierung von Viruspartikeln sowohl während als auch nach der Infektion, wie hier gezeigt: Nach Behandlung mit Natriumazid zeigten Zellen, die 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden, im Vergleich zu unbehandelten Zellen unter gleichen Bedingungen eine dramatische Abnahme der Internalisierung. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Anheftung und Internalisierung von Influenza, einem Virus, in 5 0 9-Zellen gemessen werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht eine einfache Auswertung mittels Durchflusszytometrie und kann leicht an andere experimentelle Bedingungen angepasst werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

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Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

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Lernen Sie die Messung von Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen anhaftenden und internalisierten viralen Partikeln.

Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

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