Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bindung und Internalisierung der Influenza zu messen. Ein Virus partikelt in 5 49 Lungenepithelzellen. Dies wird durch die erste Kältebindung eines Virus durch eine infizierte Influenza an 5 49 Zellen erreicht, die eine Anheftung ermöglicht, aber die Aufnahme von Viruspartikeln verhindert.

Als nächstes lässt man das Virus verinnerlichen, indem man die Temperatur auf 37 Grad Celsius verlagert. Dann folgt ein Blockierungsschritt, bei dem unmarkiertes strp Aden an die Zelloberfläche gebunden wird. Attached viruses wird durchgeführt, um zwischen angehängten und internalisierten Viruspartikeln zu unterscheiden.

Schließlich wird das zellassoziierte biotinylierte Virus mit CY 3-markiertem Streptavidin inkubiert und die Durchflusszytometrie wird verwendet, um die gefärbten Viren nachzuweisen. Letztendlich wird die relative Menge an angehängten und internalisierten Viren berechnet. Diese Methode kann jedoch einen Einblick in die relative Menge der Influenza geben, eines Virus, das sich an 5 0 9 Zellen anheftet und in diese internalisiert.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, die andere Zelllinien oder andere Viren verwenden. Nach der Erzeugung biotinylierter Viren und der Bestimmung der erforderlichen Mengen des markierten Virus Streptokokken Din und SI drei markierter Streptokokken Din gemäß dem Textprotokoll werden vier Deep-Well-Röhrchen mit jeweils 200.000 A 5 49 Zellen vorbereitet, die die Röhrchen als null Minuten markierten. Null Minuten, plus STV, 30 Minuten und 30 Minuten plus STV. Als nächstes drehen Sie die Röhren.

Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 200 Mikroliter PBS, um die Pellets wieder zu suspendieren. Nachdem Sie die Röhrchen erneut gedreht haben, verwenden Sie 200 Mikroliter eines 5 49 Standard-Wachstumsmediums, um die Zellen zu resuspendieren, inkubieren Sie nach der Inkubation 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, zentrifugieren Sie die Proben und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern PBS. Nachdem Sie den Waschgang noch einmal wiederholt haben, kühlen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis ab. Wenn die Röhrchen abgekühlt sind, drehen Sie sich erneut und verwenden Sie 100 Mikroliter biotinylierte Viren, die in Infektions-PBS verdünnt sind, um die Pellets nach einer einstündigen Inkubation auf Eis wieder zu suspendieren, wiederholen Sie das Schleudern und waschen Sie zweimal mit PBS, wobei Sie die folgenden Proben so weit wie möglich parallel für die Null-Minuten-Proben verarbeiten.

Verwenden Sie nach dem Schleudern 100 Mikroliter 3,7 % Paraformaldehyd oder PFA, um das Zellpellet zu resuspendieren. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie es schleudern und verwenden Sie PBS, um die Zellen nach der Fixierung zweimal zu waschen. Bei vier Grad Celsius lagern, bis alle Proben verarbeitet sind.

Um die Null-Minuten-plus-STV-Proben zu behandeln, drehen Sie die Röhrchen, entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 15 Mikroliter STV 2 % BSA und 0,1 % Natriumazi in PBS, um das Zellpellet 30 Minuten lang auf Eis zu inkubieren. Zentrifugieren Sie dann und verwenden Sie PBS, um die Zellen nach der Fixierung mit PFA zweimal zu waschen, wie gerade gezeigt, bei vier Grad Celsius für die 30-minütigen Proben. Nach dem Schleudern und Entfernen des Supernats wird PBS 2%BSA verwendet, um die Proben aufzulösen.

Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie es mit PBS waschen und mit PFA fixieren. Lagern Sie die Proben dann für die 30 Minuten plus STV-Proben bei vier Grad Celsius. Nach der Pelletierung suspendieren wir die Proben in 200 Mikrolitern PBS 2%BSA, nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius.

Schleudern und resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern STV 2 % BSA 0,1 % Natriumazi in PBS und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, bevor Sie sie waschen und fixieren. Nach der Durchlässigkeit und Färbung aller Proben mit STV SI three, gemäß den Angaben im Textprotokoll, wurden die Proben bei vier Grad Celsius gelagert. Analysieren Sie abschließend die Proben mittels Durchflusszytometrie.

Bestimmen Sie den Prozentsatz von CY drei positiven Zellen in jeder Probe. Berechnen Sie den prozentualen Anteil des angehängten Virus und die relative Menge des internalisierten Virus. Gemäß dem Textprotokoll, wie es hier in der Null-Minuten-Probe gezeigt wird, ist das atisierte Virus kalt an Zielzellen gebunden, wie durch St.V.SI drei Färbungen sichtbar gemacht wird.

Wenn STV als Blockierungsschritt appliziert wird, können Viren an der Zelloberfläche nicht mehr durch S St.V.SI drei Färbungen nachgewiesen werden, wodurch das Signal stark reduziert wird. Wenn die Temperatur auf 37 Grad Celsius angehoben wird, wird das angeheftete Virus in die Zellen aufgenommen. Das internalisierte Virus reagiert nicht empfindlich auf eine Blockierung mit unmarkiertem STV, was zu einem weniger dramatischen Abfall der Signalintensität in den gezeigten STV-Proben von mehr als 30 Minuten führt.

Hier sind die Prozentsätze von SI drei positiven Zellen für alle experimentellen Bedingungen, die in diesem Video beschrieben werden. Mock-infizierte Zellen liefern die Hintergrundsignalintensität für das Experiment und fungieren als Negativkontrolle für die Virusanhaftung. Eine andere Kontroll-Neuraminidase hebt die IAV-Bindung im Vergleich zu unbehandelten Zellen um 90% stark auf.

Natriumazi, das ein TP abreichert und somit die Endozytose hemmt, hemmte die Internalisierung von Viruspartikeln sowohl während als auch nach der Infektion, wie hier gezeigt wurde, nachdem Natriumazi-Behandlungszellen, die 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden, einen dramatischen Abfall der Internalisierung im Vergleich zu unbehandelten Zellen zeigten, die unter den gleichen Bedingungen inkubiert wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Anheftung und Internalisierung von Influenza, einem Virus, in 5 0 9 Zellen misst. Dieses Protokoll ermöglicht ein bequemes Auslesen durch Durchflusszytometrie und kann leicht an andere experimentelle Umgebungen angepasst werden.