Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Das übergeordnete Ziel dieser auf Nanostruktur-Chips basierenden Plattform ist es, die Funktion von Membranproteinen auf der Ebene einzelner Moleküle auf hochparallele Weise zu analysieren. Durch seine Fähigkeit, einzelne Proteine aufzulösen, werden neue Einblicke in den Membrantransport und -fluss gewonnen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Membranproteine zu beantworten, wie z.B. die Leitfähigkeit oder das Transportverhalten einzelner Kanäle oder Transporter, insbesondere bei nicht-elektrogener Fracht.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre hohe Parallelität, die sich aus dem Nanostruktur-Chipdesign mit Hunderttausenden von Nanoporen und der Fluoreszenzauslesung von Transportereignissen ergibt. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Erstellung der besten Assays für effektive Bibliotheken für Membranproteine. Denn die chipbasierte Plattform ermöglicht eine hochparallele und automatische Transportaufzeichnung.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, schnell lernen, wie sie mit der vorgestellten Technik umgehen können. Der Fokus lag immer darauf, einen benutzerfreundlichen Assay zu erstellen, den alle Interessierten übernehmen können. Bei diesem Membrantransport-Assay wird ein Silizium auf einem isolierten Wafer verwendet, das durch Reaktionsionenätzen hergestellt wurde.

Aus jedem Wafer werden etwa 1.000 Assay-Chips hergestellt. Jeder Chip enthält 250.000 Mikrokavitäten. Diese Hohlräume werden durch Lipiddoppelschichten versiegelt, die die interessierenden Transportproteine enthalten.

Die Membran bildet die Sensorschnittstelle. Zu Beginn sind fluoreszierende Materialien auf einer Seite der Lipiddoppelschicht enthalten, die dem Inneren der Liposomen entspricht, aus denen sie zusammengesetzt sind. Jeder Resonator ist über eine multispektrale Fluoreszenzanzeige adressierbar.

Eine undurchsichtige Deckschicht blockiert die Fluoreszenzsignale aus dem Pufferreservoir, wodurch der Biochip mit inversen Fluoreszenzmikroskopen kompatibel ist. Mittels Rasterkraftmikroskopie wurden die gleichmäßig angeordneten Porenöffnungen und die Oberflächenrauheit der Siliziumdioxidschicht bei 3,6 Nanometern gemessen, optimal für die Vesikelfusion. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt einen Querschnitt durch eine Nanopore, die Zugang zu den Femtoliter-Hohlräumen im Inneren des Siliziumchips bietet.

Dieses Video zeigt die Präparation der Proteoliposomen, die Vorbereitung der Chips für den Assay und die grundlegende Durchführung des Assays. Verbinden Sie einen mit Ethanol gewaschenen Rundkolben mit einem Rotationsverdampfer. Trocknen Sie den Lipidfilm 40 Minuten lang bei 300 Millibar, 30 Grad Celsius Wasserbadtemperatur und maximaler Rotationsgeschwindigkeit, um einen homogenen Lipidfilm auf der Glaswand des Kolbens zu bilden.

Anschließend trocknet der Lipidfilm mit einer Hochvakuumpumpe weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes gibst du fünf Milliliter Puffer und acht mit Ethanol gewaschene Glasperlen in den Kolben, um die mehrlamellaren Vesikel herzustellen. Schließen Sie den Kolben an den Rotationsverdampfer an und drehen Sie sich ohne Vakuum bei 50 Grad Celsius bei maximaler Drehzahl.

Nach 45 Minuten erscheint die Lösung milchig, ohne Rückstände von Lipidfilmen an den Wänden. Der Kolben wird unter einem Inertgas in ein Ultraschallbad überführt und vier Minuten lang bei Raumtemperatur beschallt. Die Beschallung zerstört die Liposomen und macht sie unilamellar.

Teilen Sie nun die LUV-Lösung in ein Milliliter-Aliquot und führen Sie fünf Gefrierauftauzyklen mit flüssigem Stickstoff und einem 40 Grad Celsius warmen Wasserbad durch. Dies führt zum Reißen, Umlagern und Wachstum der Liposomen. Beim letzten Gefrierschritt lagern Sie alle Proben bei minus 80 Grad Celsius.

Vor der Rekonstitution eines LUV-Aliquots extrudieren Sie die Liposomen, indem Sie das Aliquot mit einem Mini-Extruder 17 Mal durch eine 400-Nanometer-Polycarbonat-Filtermembran leiten. Destabilisieren Sie dann die LUVs, indem Sie 4%Triton X-100 für 0,25%ige Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 50 Grad Celsius.

Mischen Sie nun einen Teil gereinigtes, modifiziertes MscL in 20 Teile der mit Waschmitteln getränkten Liposomen und setzen Sie die Inkubation für 30 Minuten fort. Nehmen Sie nach der Inkubation ein 100-Mikroliter-Aliquot und fügen Sie ein Volumen von 30 Millimolar Calcin hinzu. Inkubieren Sie diese Mischung fünf Minuten lang bei 50 Grad Celsius.

Entfernen Sie nun das Reinigungsmittel von der mit Kalzin behandelten und unbehandelten Probe. Fügen Sie jedem nasse Biokügelchen in Tris-Puffer hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer rotierenden Platte. Vor dem Experiment ist ein Präparat mit einem Aktivitätsassay zu testen.

Mischen Sie zunächst die Elastomerbasis in das Härter und trocknen Sie die Mischung vollständig aus, so dass sie entsetzt ist. Der Kleber muss innerhalb von 30 Minuten verwendet werden, wenn er fertig ist. Reinigen Sie in der Zwischenzeit einen Objektträger mit fünf Millilitern Chloroform, das aus einer Glasspritze aufgetragen wird, und lassen Sie den Objektträger trocknen.

Tragen Sie nun mit einer 10-Mikroliter-Pipette den vorbereiteten Klebstoff auf das Deckglas auf. Entfernen Sie dann vorsichtig mit einer feinen Pinzette einen Chip von der Waferplatte. Tragen Sie den beschichteten Chip mit der beschichteten Seite nach oben auf den Klebstoff auf und reiben Sie ihn vorsichtig in die Folie, um den Klebstoff gleichmäßig zu verteilen.

Lassen Sie keine Luftblasen darunter eingeschlossen werden oder Klebstoff von oben auf den Chip gelangen. Nehmen Sie außerdem die Montage so vor, dass sie in den Achtkammer-Diahalter passt. Nun trocknen Sie die Baugruppen für zwei Stunden bei 65 Grad Celsius in einem Schranktrockner aus.

Später entfernen Sie die Schutzschicht auf den Chips mit ein paar Lösemittelwäschen bei 54 Grad Celsius. Legen Sie zunächst die montierten Späne in einen Diahalter. Inkubieren Sie sie dann in drei Lösungsmittelbädern für jeweils 10 Minuten.

Isopropanol, Aceton und Isopropanol. Waschen Sie anschließend die Chips vorsichtig und gründlich mit Reinstwasser. Schließen Sie den Vorgang ab, indem Sie die Späne unter einem sanften Strom von Stickstoffgas trocknen.

Bereiten Sie nun eine Acht-Well-Klebefolie vor und legen Sie sie rückwärts auf die Bank. Heben Sie dann die Objektträger vorsichtig an und drücken Sie sie mit den Spänen zu den Vertiefungen auf den klebrigen Objektträger. Lassen Sie die Montage einige Minuten ruhen, bevor Sie fortfahren.

Bevor Sie mit dem Translokationsassay fortfahren, waschen Sie die Chipanordnung gründlich, wie im Textprotokoll beschrieben, und schließen Sie sie mit einem Tris-Pufferbad ab. Tauschen Sie anschließend die Badlösung gegen DOPEd Tris-Puffer aus, der fünf millimolare Calciumchloride und einen mikromolaren Farbstoff Oy647 enthält. Geben Sie anschließend Proteoliposomen in die Chipkammer für eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter und warten Sie eine Stunde.

Spülen Sie die Chips nach einer Stunde viermal mit 400 Mikrolitern kalziumfreiem Tris-Puffer ab. Geben Sie nun den kontrollierten Farbstoff in jede Vertiefung bis zu fünf Mikromolaren und fahren Sie mit dem Assay fort. Montieren Sie als Nächstes den Chiphalter am Epifluoreszenzmikroskop und fokussieren Sie sich auf den Rand des Nanoporenchips, um die Mikrokavitäten zu finden.

Sobald die Mikrokavitäten scharf sind, scannen Sie das Nanoporen-Array nach einem Bereich mit dem höchsten Deckenverhältnis. Einzelheiten finden Sie im Textprotokoll. Liposomen wurden präpariert und auf ihre Größenverteilung und Dispersion überprüft.

Die präparierten Liposomen waren größer als der Porendurchmesser für den Assay, was essentiell ist. Monodispergierte Liposomen sind ebenfalls wünschenswert. Vor dem Experiment wurde das modifizierte MscL-Protein in der Präparation des Liposoms mit einem Fluoreszenz-Dequenching-Assay überprüft.

Das Verhältnis der Liposomen, die aktives modifiziertes MscL beherbergen, war ausreichend, um mit dem Translokationsexperiment fortzufahren. Auf dem Biochip wurde die Translokation eines fluoreszierenden Ziels über den modifizierten MscL-Kanal beobachtet. Der chemische Modulator MTSET wurde verwendet, um die technisch hergestellten MscL-Kanäle durch elektrostatische Abstoßung zu öffnen.

Die anschließende Abnahme der Fluoreszenz im Hohlraum wurde überwacht. Dieser Prozess erwies sich als sehr reproduzierbar, mit sehr konsistenten Ausflussereignissen. Die resultierenden Effluxkurven gruppierten sich in zwei unterschiedlichen Populationen, die Einkanal- oder Mehrkanal-Translokationsereignissen entsprachen.

Das System war in der Lage, bis zu drei einzigartig fluoreszierende Farbstoffe mit Echtzeitanalyse zu verfolgen. Dies ermöglicht die präzise Unterscheidung von positiven Ergebnissen, monoexponentiellen Effluxereignissen, komplexen Kinetiken, Lipidintrusionen und Membranbrüchen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in aufeinanderfolgenden Schritten ausgeführt werden, nämlich Chipvorbereitung, Probenvorbereitung, Bildgebung und Analyse, wodurch das gesamte Protokoll modular wird.