Name: Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Erfahren Sie, wie Membranproteinfunktionen auf Einzelmolekülebene mit einem hochparallelen Nanopore-Chip-System analysiert werden. Diese Methode ermöglicht neue Erkenntnisse über Membrantransportdynamiken.

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Wir danken Barbara Windschiegl für ihre Hilfe bei der Erstellung von SOPs; Dennis Remme für seine Arbeit an der Software NanoCalcFX und Alina Kollmannsperger, Markus Braner und Milan Gerovac für hilfreiche Anregungen zum Manuskript. Die Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) der DFG und des Bundesministeriums für Bildung und Forschung an R.T. sowie das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (ZIM F&E Projekt) an R.T. und die Nanospot GmbH unterstützten diese Arbeit.

<ol><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+%CE%B1-hemolysin+nanopore+array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li>
<li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li>
<li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+transporters+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li>
<li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li>
<li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins%3A+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li>
<li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymer-supported+phospholipid+bilayer%3A+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li>
<li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates%3A+Rupture+process+and+lateral+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li>
<li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a(2014).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li>
<li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li>
<li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li>
<li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li>
<li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li>
<li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-on-a-Chip%3A+Microstructured+Silicon%2FSilicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li>
<li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li>
<li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li>
<li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li>
<li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li>
<li>Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Die hier vorgestellte Technik ermöglicht eine hochparallele Analyse von Membranproteintransport. Rekonstituierten Membranprotein-Systeme können direkt auf dem Biochip aufgebracht werden, so dass die Anpassung der theoretisch jeder Membrantransporter oder möglichen Kanal. Transport-Analyse wird durch die Einrichtung eines fluoreszierenden Auslesesystem, entweder durch direkte Fluoreszenzänderung (Translokation von Fluorophore oder fluoreszenzmarkierte Substrate) oder indirekte Fluoreszenzänderung (pH-sensitiven Farbstoff...

Die Analyse von Membranproteinen ist von Interesse in den letzten 20 Jahren für die Grund- und pharmazeutischen Forschung erhöht werden. Die Entwicklung neuer Medikamente ist abhängig von der Identifizierung und detaillierte Charakterisierung neuer Ziele, die derzeit einer der limitierenden Faktoren zu sein. Die Tatsache , dass etwa 60% aller drug targets sind Membranproteine ​​1, macht die Entwicklung von Techniken , um ihre Funktion wichtigsten aufzuklären. 4 - In der Vergangenheit wurden in 2 Vielzahl entwickelten Techniken für die Untersuchung von elektrogenen Kanäle und Transporter. Nicht elektrogener Substrate im Gegensatz eine schwierige Aufgabe darstellen. Sie sind jedoch von besonderem Interesse als Hauptangriffspunkte für Medikamente, da sie den Fluss von gelösten Stoffen und Nährstoffen durch die Zellmembran und die Funktion als Schlüsselrezeptoren in Signalkaskaden 5 steuern. Beträchtliche Anstrengungen wurden in die Entwicklung von t gesetztechniques die Funktion von Membrantransportproteinen 6, 7 zu untersuchen. 10, darunter auch feste unterstützten Lipid - Doppelschichten, tethered Bilayer 11, 12, microblack Lipidmembranen 13, 14 und nativen Vesikel - Arrays 15, 16 ein paar zu nennen - Systeme festen Träger unter Verwendung von Membranen wurden als vielversprechendsten Instrumente auf diesem Gebiet 8 entstanden. Einige von ihnen sind sogar als Handelsaufbauten 17, 18. Einige Beispiele wurden veröffentlicht Kombination die Fähigkeit einzelne Membranproteine ​​in einer hochparallelen Weise 14 zu studieren, 19, Voraussetzung für Screening - Anwendungen. Allerdings überbrücken diese Methoden nur selten aus der Grundlagenforschung zur industriellen Umfeld. Die Schwierigkeiten liegen oft in der Fähigkeit des Systems, automatisierbar zu sein, die kostenintensive Herstellung und / oder aufwendige Vorbereitung. Ein Ansatz overcoming alle oben erwähnten Hindernisse ist das Endziel. Die Technik , die hier vorgestellt wurde entwickelt Membrankanäle und Transporter in vitro in einer kontrollierten Umgebung auf dem einzelnen Protein - Ebene 20 zu studieren - 22. Die Rekonstitution von gereinigten Membranproteinen in LUVs ist viel mehr etabliert als vergleichbare Ansätze für GUVs 23-26 oder schwarzen Lipidmembranen 27. Sie können direkt auf die Chipoberfläche aufgebracht werden, in dem Doppelschichtbildung erfolgt über eine Selbstorganisationsprozess stattfindet. Der Glasboden Design des nanoporösen Chip (Fig. 1) ermöglicht eine Luft Mikroskopie, die die einfache Automatisierung des Systems ermöglicht. In Kombination mit einer motorisierten Stufe kann mehrere Chips gleichzeitig gemessen werden, wobei jedes Sichtfeld Tausende von abgedichteten Hohlräumen zur Analyse enthält. Abbildung 1. Design von gemultiplexten Nanopore Biochips. A) A silicon-on-insulator (SOI) Wafers durch reaktives Ionenätzen strukturiert. Ungefähr 1.150 einzelne Chips werden von jedem Wafer hergestellt mit identischen Eigenschaften und Qualität. B) Jeder Chip umfasst 250.000 einzelne Mikrokavitäten mit Nano - Öffnungen. Maßstabsbalken:. 200 &amp; mgr; m C) Jeder Hohlraum ist adressierbar über multispektrale Fluoreszenz ausgelesen. Eine undurchsichtige Deckschicht blockiert die Fluoreszenzsignale aus dem Pufferspeicher, so dass der Biochip kompatibel mit invertierten Fluoreszenzmikroskop. D) Rasterkraftmikroskopie (AFM) Bildgebung Porenöffnungen und Oberflächenrauhigkeit der Siliziumdioxid - Schicht von 3,6 nm gleichmäßig angeordnet enthüllt (n = 40) optimal für Vesikelfusion. Maßstabsbalken:. 5 um E) Rasterelektronen microscopy (SEM) Aufnahme zeigt einen Querschnitt durch die Nanopore die den Zugang zu den Femtoliter Hohlräume innerhalb des Siliziumchips. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis wiederverwendet werden von 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Alle Datenanalyse wird mit Freeware durchgeführt uneingeschränkten Zugriff für Endanwender zu gewährleisten. Zeitreihen sind mit dem kostenlosen Bildverarbeitungssoftware analysiert und eine benutzerdefinierte Build-Kurvenanalyse-Software ermöglicht die Stapelverarbeitung und einfache Korrelation von großen Datensätzen mit mehreren Fluoreszenzkanälen und Tausende von Kurven. Das Modellprotein in diesem Protokoll wird die mechanosensitive Kanal von großer Leitfähigkeit (MscL) Kanalproteins von E. abgeleitet coli. Es fungiert als ein Ventil in der Natur osmotischen Schock freizusetzen, wurde aber derart modifiziert, dass synt rational entworfenhetic Funktionalitäten können kovalent an die Kanäle Einschnürung Seite angebracht werden. Via Ladungs ​​Abstoßung des kovalent gebundenen Aktivator (MTSET) der Kanal ausgelöst wird, zu öffnen, die Schaffung eines Nano-Ventil. Kleine Moleküle, wie Ionen, Wasser, kleine Proteine, aber auch kleine Fluorophore können durch den Kanal zu durchdringen. Hierbei wird das Protein als ein Modell verwendet, um die Fähigkeit des Systems zu demonstrieren Protein-vermittelte Translokation zu detektieren.

<table><tbody><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[2-(Trimethylammonium)ethyl] Methanethiosulfonat</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET; hydrolysiert durch Wasser. Als trockenes Pouder aliquot bei -80 °C aufbewahren. Sofort (30 Minuten) nach der Solubilisierung in Puffer verwenden.</td></tr><tr><td>1 ml gasdichte Spritze</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Rundkolben</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,7 mm Glasperlen</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanole</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 cm Luer-Lock</td><td>Verlängerungstube Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorptionsmittel</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>muss vor dem ersten Gebrauch aktiviert werden</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td> dunkel <td>lagern bei -20 & Grad; C</td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td> in<td>Chloroform-Reagenzqualität</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPEATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td> dunkel <td>bei -20 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt Einmalspritze</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F Einmalspritze</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Keck Clips</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-Phosphatidylcholin, 20% (Soja)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>5416016</td><td>unter Inertgas bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>NaCl 99,5 % p.a.</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 Wafer/Chips</td><td>Micromotive (Mainz/Deutschland)</td><td></td><td>auf Anfrage</td></tr><tr><td>erhältlich Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 &micro; m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>dunkel lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&uuml; nster/Germany)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>dunkel lagern bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>Rotilabo-Spritzenfiltration, unsteril, Porengröße 0,22 & Mikro; m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>Säulenmaterial für die Leimausschlusschromatographie</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Härter für die Chipfixierung auf Deckglasträger</td></tr><tr><td>sticky-Slide 8-well</td><td>ibidi</td><td>80828</td><td>Multiwell-Kammer für die Montage auf Glasobjektträgern (Chiphalter)</td></tr><tr><td>Dreiwegehahn blau</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &micro; m Zellulosenitrat-Membranfilter</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi 461 Wasserbad</td><td>B&uuml; </td><td></td><td></td>chi</tr><tr><td>B&uuml; chi Rotavapor RE 111</td><td>B&uuml; </td><td></td><td></td>chi</tr><tr><td>Cary Eclipse Fluoreszenz-Spektrophtometer&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini Extruder</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranpumpe</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight Nanoparticle Tracking Mikroskop</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>NyONE Mikroskop</td><td>Synentec</td><td></td><td>auf Anfrage erhältlich</td></tr><tr><td>Pumpensteuerung</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Bad Sonorex RK100H</td><td>Brandelin electronic</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger PDC-37G</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Open Source</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>wissenschaftliche Bildverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>Freeware</td><td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/</td> <td>Datenanalyse-/Auswertungssoftware für massive transportkinetische Datensätze</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Analysesoftware</td><td>Nanosight</td><td></td><td>Datenerfassungs- und Analysesoftware für die Verfolgung von Nanopartikeln Mikroskop</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Temperature Comms</td><td>Nanosight</td><td></td><td>Temperaturregelungssoftware für Nanopartikel-Tracking-Mikroskop</td></tr></tbody></table>

membrantransportprozesse durch eine hochparallele nanopore chip-system bei einzel protein resolution analysierte

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membranproteintransport auf dem einzelnen Proteinebene ausweicht noch detaillierte Analyse, wenn das transloziert Substrat nicht elektrogener ist. Erhebliche Anstrengungen wurden in diesem Bereich, sondern Techniken ermöglicht automatisierte Hochdurchsatz-Transport-Analyse in Kombination mit lösemittelfreien Techniken Lipid-Doppelschicht für die Analyse von Membrantransportern sind erforderlich selten. Diese Klasse von Transportern ist jedoch von entscheidender Bedeutung in der Zelle Homöostase und daher ein zentrales Ziel in der Medikamentenentwicklung und Methoden neue Erkenntnisse dringend benötigt zu gewinnen. Die hier präsentierten Handschrift beschreibt den Aufbau und die Handhabung eines neuartigen Biochips für die Analyse von Membranprotein-vermittelte Transportprozesse auf Einzel transporter Auflösung. Der Biochip besteht aus Mikrokavitäten durch Nanoporen eingeschlossen, die stark parallel in seiner Gestaltung und kann in Industriequalität und Menge hergestellt werden. Protein-tragende Liposomen können direkt angewendet werdendie Chipoberfläche bilden selbstorganisierende poren Spanning Lipid-Doppelschichten SSM-Techniken (feste Lipidmembranen unterstützt). Pore-Spanning Teile der Membran sind freistehend, Bereitstellen der Schnittstelle für das Substrat Translokation in den oder aus dem Hohlraum, die durch multispektrale Fluoreszenzanzeige in Echtzeit verfolgt werden können. Die Einrichtung von Standard Operating Procedures (SOPs) ermöglicht die einfache Einrichtung von Protein-tragenden Lipid-Doppelschichten auf der Chipoberfläche praktisch jeder Membranprotein, das funktionell wiederhergestellt werden kann. Einzige Voraussetzung ist die Schaffung eines Fluoreszenzlesesystem für Nicht-elektrogener Transportgründen. High-Content-Screening-Anwendungen sind erfüllbar durch den Einsatz von automatisierten inversen Fluoreszenzmikroskope mehrere Chips parallel aufzuzeichnen. Große Datenmengen können mit dem frei verfügbaren anwendungsspezifische Analyse-Software analysiert werden. Drei-Farben-Mehrspektrale FluoreszenzAuslesen erlaubt darüber hinaus für unvoreingenommene Daten Diskriminierung in verschiedenen Ereignisklassen, falsch positive Ergebnisse zu beseitigen. Die Chip - Technologie basiert derzeit auf SiO 2 -Oberflächen, aber weitere Funktionalisierung goldbeschichteten Spanflächen ist ebenfalls möglich.

Pore-Spanning Membranen können leicht auf der Oberfläche nanostrukturierten Chip in einer selbstorganisierenden Weise erstellt werden. Doch der zugrunde liegende Prozess ist noch zart und von vielen Parametern wie Liposomgröße, Monodispersität der Liposomen-Population, Lamellarität, Lipid- und Salz-Konzentration und chemischen Oberflächeneigenschaften beeinflusst. Die meisten dieser Parameter sind in dem obigen Protokoll sorgfältig charakterisiert und standardisiert. Andere Parameter sol...

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Analyse des Membranprotein-vermittelten Transports auf Einzeltransporterebene unter Verwendung von porenübergreifenden, lösungsmittelfreien Lipiddoppelschichten. Dies wird durch die Herstellung von in großen Mengen hergestellten Nanoporen-Array-Chips in Kombination mit einer hochparallelen Datenerfassung und -analyse erreicht, die die zukünftige Etablierung von Membranprotein-Effektor-Screenings ermöglicht.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Das übergeordnete Ziel dieser auf Nanostrukturen basierenden Chip-Plattform besteht darin, die Funktion von Membranproteinen auf einzelnen Molekülebene hochparallel zu analysieren. Durch die Fähigkeit, einzelne Proteine aufzulösen, werden neue Erkenntnisse über den Membrantransport und den Stofffluss gewonnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Membranproteine zu beantworten, beispielsweise zur Leitfähigkeit oder zum Transportverhalten einzelner Kanäle oder Transporter, insbesondere solcher mit nicht-elektrogenen Substraten.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer hohen Parallelität, die sich aus dem nanostrukturierten Chip-Design ergibt und Hunderttausende von Nanoporen sowie die fluoreszente Erfassung von Transportsignalen umfasst. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Entwicklung optimaler Assays für effektive Bibliotheken von Membranproteinen, da die chipbasierte Plattform eine hochgradig parallele und automatisierte Aufzeichnung von Transportvorgängen ermöglicht.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, schnell lernen, wie man mit der vorgestellten Technik umgeht. Es stand stets im Vordergrund, einen benutzerfreundlichen

membrane-transport-processes-analyzed-highly-parallel-nanopore-chip

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Biologie

Einzel-Molekül-Mikroskopie approch neue Einblicke in atomare Transport.

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Eine Methode der Verwendung von Solid-State-Nanoporen, die unspezifische Adsorption von Proteinen auf einer anorganischen Oberfläche überwachen beschrieben. Die Methode nutzt die resistive-Puls-Prinzip, so dass für die Adsorption in Echtzeit und in der Einzel-Molekül-Ebene untersucht werden. Da der Prozess der einzelnen Protein-Adsorption ist fern vom Gleichgewicht, schlagen wir den Einsatz von parallel Arrays von synthetischen Nanoporen, so dass für die quantitative Bestimmung der scheinbaren...

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Eine Methodik zur Herstellung von Festkörper-Nanoporen in Lösung für biomolekulare Translokation Experimente vorgestellt. Durch Anlegen kurzer Impulse hoher elektrischer Felder kann die Nanoporendurchmesser steuerbar mit Sub-Nanometergenauigkeit vergrößert und seine elektrischen Rauscheigenschaften deutlich verbessert. Dieses Verfahren wird in situ unter Verwendung von Standard-Laborausrüstung unter experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Feinabstimmung der Größe und Minimierung der Lärm von Solid-State-Nanoporen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Detektion diskreter Metallsauerstoffcluster, Polyoxometallate (POMs) an der Grenze zu einzelnen Molekülen, mithilfe einer biologischen Nanoporen-basierten elektronischen Plattform vor. Die Methode bietet einen komplementären Ansatz zu traditionellen analytischen Chemiewerkzeugen, die bei der Untersuchung dieser Moleküle verwendet werden.

Physikalische Charakterisierung einzelner metallischer Nanopartikel in hoher Auflösung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um den molekularen Mechanismus der Protonen-Translokation über Lipidmembranen der einzelnen Liposomen, studieren mit Cytochrom Bo3  als Beispiel. Kombination von Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie, pH-Änderungen in das Lumen der einzelne Vesikel, mit einzelnen oder mehreren Enzym können individuell erkannt und analysiert werden.

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Die Nanopore-Sequenzierung ist eine neuartige Technologie, die eine kostengünstige Sequenzierung an entfernten Orten und ressourcenarmen Umgebungen ermöglicht. Hier stellen wir ein Protokoll zur Sequenzierung von mRNAs aus Vollblut vor, das mit solchen Bedingungen kompatibel ist.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung an Rezeptoren in Echtzeit in einer zellulären Umgebung vor. Die Bindung wird als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Trinitrophenylnukleotidderivaten und Proteinen, die mit einer nicht-kanonischen, fluoreszierenden Aminosäure markiert sind, gemessen.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Erfahren Sie, wie Membranproteinfunktionen auf Einzelmolekülebene mit einem hochparallelen Nanopore-Chip-System analysiert werden. Diese Methode ermöglicht neue Erkenntnisse über Membrantransportdynamiken.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

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