Name: Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Erfahren Sie, wie Membranproteinfunktionen auf Einzelmolekülebene mit einem hochparallelen Nanopore-Chip-System analysiert werden. Diese Methode ermöglicht neue Erkenntnisse über Membrantransportdynamiken.

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Wir danken Barbara Windschiegl für ihre Hilfe bei der Erstellung von SOPs; Dennis Remme für seine Arbeit an der Software NanoCalcFX und Alina Kollmannsperger, Markus Braner und Milan Gerovac für hilfreiche Anregungen zum Manuskript. Die Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) der DFG und des Bundesministeriums für Bildung und Forschung an R.T. sowie das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (ZIM F&E Projekt) an R.T. und die Nanospot GmbH unterstützten diese Arbeit.

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Die hier vorgestellte Technik ermöglicht eine hochparallele Analyse von Membranproteintransport. Rekonstituierten Membranprotein-Systeme können direkt auf dem Biochip aufgebracht werden, so dass die Anpassung der theoretisch jeder Membrantransporter oder möglichen Kanal. Transport-Analyse wird durch die Einrichtung eines fluoreszierenden Auslesesystem, entweder durch direkte Fluoreszenzänderung (Translokation von Fluorophore oder fluoreszenzmarkierte Substrate) oder indirekte Fluoreszenzänderung (pH-sensitiven Farbstoff...

Die Analyse von Membranproteinen ist von Interesse in den letzten 20 Jahren für die Grund- und pharmazeutischen Forschung erhöht werden. Die Entwicklung neuer Medikamente ist abhängig von der Identifizierung und detaillierte Charakterisierung neuer Ziele, die derzeit einer der limitierenden Faktoren zu sein. Die Tatsache , dass etwa 60% aller drug targets sind Membranproteine ​​1, macht die Entwicklung von Techniken , um ihre Funktion wichtigsten aufzuklären. 4 - In der Vergangenheit wurden in 2 Vielzahl entwickelten Techniken für die Untersuchung von elektrogenen Kanäle und Transporter. Nicht elektrogener Substrate im Gegensatz eine schwierige Aufgabe darstellen. Sie sind jedoch von besonderem Interesse als Hauptangriffspunkte für Medikamente, da sie den Fluss von gelösten Stoffen und Nährstoffen durch die Zellmembran und die Funktion als Schlüsselrezeptoren in Signalkaskaden 5 steuern. Beträchtliche Anstrengungen wurden in die Entwicklung von t gesetztechniques die Funktion von Membrantransportproteinen 6, 7 zu untersuchen. 10, darunter auch feste unterstützten Lipid - Doppelschichten, tethered Bilayer 11, 12, microblack Lipidmembranen 13, 14 und nativen Vesikel - Arrays 15, 16 ein paar zu nennen - Systeme festen Träger unter Verwendung von Membranen wurden als vielversprechendsten Instrumente auf diesem Gebiet 8 entstanden. Einige von ihnen sind sogar als Handelsaufbauten 17, 18. Einige Beispiele wurden veröffentlicht Kombination die Fähigkeit einzelne Membranproteine ​​in einer hochparallelen Weise 14 zu studieren, 19, Voraussetzung für Screening - Anwendungen. Allerdings überbrücken diese Methoden nur selten aus der Grundlagenforschung zur industriellen Umfeld. Die Schwierigkeiten liegen oft in der Fähigkeit des Systems, automatisierbar zu sein, die kostenintensive Herstellung und / oder aufwendige Vorbereitung. Ein Ansatz overcoming alle oben erwähnten Hindernisse ist das Endziel. Die Technik , die hier vorgestellt wurde entwickelt Membrankanäle und Transporter in vitro in einer kontrollierten Umgebung auf dem einzelnen Protein - Ebene 20 zu studieren - 22. Die Rekonstitution von gereinigten Membranproteinen in LUVs ist viel mehr etabliert als vergleichbare Ansätze für GUVs 23-26 oder schwarzen Lipidmembranen 27. Sie können direkt auf die Chipoberfläche aufgebracht werden, in dem Doppelschichtbildung erfolgt über eine Selbstorganisationsprozess stattfindet. Der Glasboden Design des nanoporösen Chip (Fig. 1) ermöglicht eine Luft Mikroskopie, die die einfache Automatisierung des Systems ermöglicht. In Kombination mit einer motorisierten Stufe kann mehrere Chips gleichzeitig gemessen werden, wobei jedes Sichtfeld Tausende von abgedichteten Hohlräumen zur Analyse enthält. Abbildung 1. Design von gemultiplexten Nanopore Biochips. A) A silicon-on-insulator (SOI) Wafers durch reaktives Ionenätzen strukturiert. Ungefähr 1.150 einzelne Chips werden von jedem Wafer hergestellt mit identischen Eigenschaften und Qualität. B) Jeder Chip umfasst 250.000 einzelne Mikrokavitäten mit Nano - Öffnungen. Maßstabsbalken:. 200 &amp; mgr; m C) Jeder Hohlraum ist adressierbar über multispektrale Fluoreszenz ausgelesen. Eine undurchsichtige Deckschicht blockiert die Fluoreszenzsignale aus dem Pufferspeicher, so dass der Biochip kompatibel mit invertierten Fluoreszenzmikroskop. D) Rasterkraftmikroskopie (AFM) Bildgebung Porenöffnungen und Oberflächenrauhigkeit der Siliziumdioxid - Schicht von 3,6 nm gleichmäßig angeordnet enthüllt (n = 40) optimal für Vesikelfusion. Maßstabsbalken:. 5 um E) Rasterelektronen microscopy (SEM) Aufnahme zeigt einen Querschnitt durch die Nanopore die den Zugang zu den Femtoliter Hohlräume innerhalb des Siliziumchips. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis wiederverwendet werden von 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Alle Datenanalyse wird mit Freeware durchgeführt uneingeschränkten Zugriff für Endanwender zu gewährleisten. Zeitreihen sind mit dem kostenlosen Bildverarbeitungssoftware analysiert und eine benutzerdefinierte Build-Kurvenanalyse-Software ermöglicht die Stapelverarbeitung und einfache Korrelation von großen Datensätzen mit mehreren Fluoreszenzkanälen und Tausende von Kurven. Das Modellprotein in diesem Protokoll wird die mechanosensitive Kanal von großer Leitfähigkeit (MscL) Kanalproteins von E. abgeleitet coli. Es fungiert als ein Ventil in der Natur osmotischen Schock freizusetzen, wurde aber derart modifiziert, dass synt rational entworfenhetic Funktionalitäten können kovalent an die Kanäle Einschnürung Seite angebracht werden. Via Ladungs ​​Abstoßung des kovalent gebundenen Aktivator (MTSET) der Kanal ausgelöst wird, zu öffnen, die Schaffung eines Nano-Ventil. Kleine Moleküle, wie Ionen, Wasser, kleine Proteine, aber auch kleine Fluorophore können durch den Kanal zu durchdringen. Hierbei wird das Protein als ein Modell verwendet, um die Fähigkeit des Systems zu demonstrieren Protein-vermittelte Translokation zu detektieren.

<table><tbody><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[2-(Trimethylammonium)ethyl] Methanethiosulfonat</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET; hydrolysiert durch Wasser. Als trockenes Pouder aliquot bei -80 °C aufbewahren. Sofort (30 Minuten) nach der Solubilisierung in Puffer verwenden.</td></tr><tr><td>1 ml gasdichte Spritze</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Rundkolben</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,7 mm Glasperlen</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanole</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 cm Luer-Lock</td><td>Verlängerungstube Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorptionsmittel</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>muss vor dem ersten Gebrauch aktiviert werden</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td> dunkel <td>lagern bei -20 & Grad; C</td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td> in<td>Chloroform-Reagenzqualität</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPEATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td> dunkel <td>bei -20 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt Einmalspritze</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F Einmalspritze</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Keck Clips</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-Phosphatidylcholin, 20% (Soja)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>5416016</td><td>unter Inertgas bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>NaCl 99,5 % p.a.</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 Wafer/Chips</td><td>Micromotive (Mainz/Deutschland)</td><td></td><td>auf Anfrage</td></tr><tr><td>erhältlich Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 &micro; m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>dunkel lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&uuml; nster/Germany)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>dunkel lagern bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>Rotilabo-Spritzenfiltration, unsteril, Porengröße 0,22 & Mikro; m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>Säulenmaterial für die Leimausschlusschromatographie</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Härter für die Chipfixierung auf Deckglasträger</td></tr><tr><td>sticky-Slide 8-well</td><td>ibidi</td><td>80828</td><td>Multiwell-Kammer für die Montage auf Glasobjektträgern (Chiphalter)</td></tr><tr><td>Dreiwegehahn blau</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &micro; m Zellulosenitrat-Membranfilter</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi 461 Wasserbad</td><td>B&uuml; </td><td></td><td></td>chi</tr><tr><td>B&uuml; chi Rotavapor RE 111</td><td>B&uuml; </td><td></td><td></td>chi</tr><tr><td>Cary Eclipse Fluoreszenz-Spektrophtometer&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini Extruder</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranpumpe</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight Nanoparticle Tracking Mikroskop</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>NyONE Mikroskop</td><td>Synentec</td><td></td><td>auf Anfrage erhältlich</td></tr><tr><td>Pumpensteuerung</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Bad Sonorex RK100H</td><td>Brandelin electronic</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger PDC-37G</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Open Source</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>wissenschaftliche Bildverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>Freeware</td><td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/</td> <td>Datenanalyse-/Auswertungssoftware für massive transportkinetische Datensätze</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Analysesoftware</td><td>Nanosight</td><td></td><td>Datenerfassungs- und Analysesoftware für die Verfolgung von Nanopartikeln Mikroskop</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Temperature Comms</td><td>Nanosight</td><td></td><td>Temperaturregelungssoftware für Nanopartikel-Tracking-Mikroskop</td></tr></tbody></table>

membrantransportprozesse durch eine hochparallele nanopore chip-system bei einzel protein resolution analysierte

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membranproteintransport auf dem einzelnen Proteinebene ausweicht noch detaillierte Analyse, wenn das transloziert Substrat nicht elektrogener ist. Erhebliche Anstrengungen wurden in diesem Bereich, sondern Techniken ermöglicht automatisierte Hochdurchsatz-Transport-Analyse in Kombination mit lösemittelfreien Techniken Lipid-Doppelschicht für die Analyse von Membrantransportern sind erforderlich selten. Diese Klasse von Transportern ist jedoch von entscheidender Bedeutung in der Zelle Homöostase und daher ein zentrales Ziel in der Medikamentenentwicklung und Methoden neue Erkenntnisse dringend benötigt zu gewinnen. Die hier präsentierten Handschrift beschreibt den Aufbau und die Handhabung eines neuartigen Biochips für die Analyse von Membranprotein-vermittelte Transportprozesse auf Einzel transporter Auflösung. Der Biochip besteht aus Mikrokavitäten durch Nanoporen eingeschlossen, die stark parallel in seiner Gestaltung und kann in Industriequalität und Menge hergestellt werden. Protein-tragende Liposomen können direkt angewendet werdendie Chipoberfläche bilden selbstorganisierende poren Spanning Lipid-Doppelschichten SSM-Techniken (feste Lipidmembranen unterstützt). Pore-Spanning Teile der Membran sind freistehend, Bereitstellen der Schnittstelle für das Substrat Translokation in den oder aus dem Hohlraum, die durch multispektrale Fluoreszenzanzeige in Echtzeit verfolgt werden können. Die Einrichtung von Standard Operating Procedures (SOPs) ermöglicht die einfache Einrichtung von Protein-tragenden Lipid-Doppelschichten auf der Chipoberfläche praktisch jeder Membranprotein, das funktionell wiederhergestellt werden kann. Einzige Voraussetzung ist die Schaffung eines Fluoreszenzlesesystem für Nicht-elektrogener Transportgründen. High-Content-Screening-Anwendungen sind erfüllbar durch den Einsatz von automatisierten inversen Fluoreszenzmikroskope mehrere Chips parallel aufzuzeichnen. Große Datenmengen können mit dem frei verfügbaren anwendungsspezifische Analyse-Software analysiert werden. Drei-Farben-Mehrspektrale FluoreszenzAuslesen erlaubt darüber hinaus für unvoreingenommene Daten Diskriminierung in verschiedenen Ereignisklassen, falsch positive Ergebnisse zu beseitigen. Die Chip - Technologie basiert derzeit auf SiO 2 -Oberflächen, aber weitere Funktionalisierung goldbeschichteten Spanflächen ist ebenfalls möglich.

Pore-Spanning Membranen können leicht auf der Oberfläche nanostrukturierten Chip in einer selbstorganisierenden Weise erstellt werden. Doch der zugrunde liegende Prozess ist noch zart und von vielen Parametern wie Liposomgröße, Monodispersität der Liposomen-Population, Lamellarität, Lipid- und Salz-Konzentration und chemischen Oberflächeneigenschaften beeinflusst. Die meisten dieser Parameter sind in dem obigen Protokoll sorgfältig charakterisiert und standardisiert. Andere Parameter sol...

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Analyse des Membranprotein-vermittelten Transports auf Einzeltransporterebene unter Verwendung von porenübergreifenden, lösungsmittelfreien Lipiddoppelschichten. Dies wird durch die Herstellung von in großen Mengen hergestellten Nanoporen-Array-Chips in Kombination mit einer hochparallelen Datenerfassung und -analyse erreicht, die die zukünftige Etablierung von Membranprotein-Effektor-Screenings ermöglicht.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Das übergeordnete Ziel dieser auf Nanostrukturen basierenden Chip-Plattform besteht darin, die Funktion von Membranproteinen auf einzelnen Molekülebene hochparallel zu analysieren. Durch die Fähigkeit, einzelne Proteine aufzulösen, werden neue Erkenntnisse über den Membrantransport und den Stofffluss gewonnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Membranproteine zu beantworten, beispielsweise zur Leitfähigkeit oder zum Transportverhalten einzelner Kanäle oder Transporter, insbesondere solcher mit nicht-elektrogenen Substraten.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer hohen Parallelität, die sich aus dem nanostrukturierten Chip-Design ergibt und Hunderttausende von Nanoporen sowie die fluoreszente Erfassung von Transportsignalen umfasst. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Entwicklung optimaler Assays für effektive Bibliotheken von Membranproteinen, da die chipbasierte Plattform eine hochgradig parallele und automatisierte Aufzeichnung von Transportvorgängen ermöglicht.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, schnell lernen, wie man mit der vorgestellten Technik umgeht. Es stand stets im Vordergrund, einen benutzerfreundlichen Assay zu entwickeln, damit sich jeder Interessierte diesen aneignen kann. Dieser Membrantransport-Assay nutzt einen Silizium-auf-Isolator-Wafer, der mittels reaktiver Ionenätzung hergestellt wurde.Aus jedem Wafer werden etwa 1.000 Testchips hergestellt. Jeder Chip enthält 250.000 Mikrohöhlen. Diese Höhlen werden durch Lipiddoppelschichten versiegelt, die die gewünschten Transportproteine enthalten.Die Membran bildet die Sensoroberfläche. Anfangs sind fluoreszierende Materialien auf einer Seite der Lipiddoppelschicht enthalten, was dem Inneren der Liposome entspricht, aus denen sie bestehen. Jede Kavität ist über eine multiskpektrale Fluoreszenzabfrage adressierbar.Eine undurchsichtige Deckschicht blockiert die fluoreszenten Signale aus dem Pufferreservoir und macht den Bio-Chip somit kompatibel mit invertierten Fluoreszenzmikroskopen. Mithilfe der Rasterkraftmikroskopie wurden die gleichmäßig angeordneten Porenöffnungen sowie die Oberflächenrauhigkeit der Siliziumdioxidschicht mit 3,6 Nanometern gemessen, was optimal für die Vesikelfusion ist. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt einen Querschnitt durch eine Nanopore, die Zugang zu den Femtoliter-Hohlräumen innerhalb des Siliziumchips bietet.Dieses Video zeigt die Herstellung der Proteoliposomen, die Vorbereitung der Chips für den Assay sowie die grundlegende Durchführung des Assays. Verbinden Sie einen mit Ethanol gespülten Rundkolben mit einem Rotationsverdampfer. Trocknen Sie den Lipidfilm 40 Minuten lang bei 300 Millibar, einer Wassertemperatur von 30 Grad Celsius und maximaler Rotationsgeschwindigkeit, um einen homogenen Lipidfilm an der Glaswand des Kolbens zu bilden.Danach das Lipidfilm mit einer Hochvakuum-Pumpe weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Anschließend fünf Milliliter Puffer und acht mit Ethanol gewaschene Glasperlen zum Kolben hinzufügen, um multilamelläre Vesikel herzustellen. Den Kolben an den Rotationsverdampfer anschließen und ohne Vakuum bei 50 Grad Celsius mit maximaler Drehzahl rotieren lassen.Nach 45 Minuten erscheint die Lösung trüb, ohne verbleibenden Lipidfilm an den Wänden. Überführen Sie das Gefäß unter einer Inertgasatmosphäre in ein Ultraschallbad und behandeln Sie es vier Minuten lang bei Raumtemperatur mit Ultraschall. Die Beschallung zerstört die Liposomen und führt zu unilamellaren Vesikeln.Teilen Sie nun die LUV-Lösung in Aliquots zu je einem Milliliter auf und führen Sie fünf Gefrier-Tau-Zyklen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff und einem 40 Grad Celsius warmen Wasserbad durch. Dies führt zum Platzen, zur Umordnung und zum Wachstum der Liposomen. Speichern Sie alle Proben im letzten Gefrierschritt bei minus 80 Grad Celsius.Bevor ein LUV-Aliquot rekonstituiert wird, werden die Liposomen durch Passage des Aliquots 17-mal durch eine 400 Nanometer große Polycarbonatfiltermembran mit einem Mini-Extruder extrudiert. Anschließend werden die LUVs durch Zugabe von 4 % Triton X-100 auf 0,25 % in Lösung destabilisiert. Das Gemisch wird fünf Minuten bei 50 Grad Celsius inkubiert.Nun eine Portion gereinigtes, modifiziertes MscL mit 20&nbsp;Teilen der detergenzges&auml;ttigten Liposomen mischen und die Inkubation f&uuml;r 30&nbsp;Minuten fortsetzen. Nach der Inkubation ein 100&nbsp;Mikroliter gro&szlig;es Aliquot entnehmen und ein Volumen von 30&nbsp;Millimolar Calcine zugeben. Dieses Gemisch f&uuml;nf Minuten bei 50&nbsp;Grad Celsius inkubieren.Entfernen Sie nun das Detergens aus der calcinatbehandelten und unbehandelten Probe. Geben Sie nasse Bio-Beads in Tris-Puffer zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer rotierenden Platte. Testen Sie vor dem Experiment eine Probe mittels eines Aktivitätsassays.Mischen Sie zunächst die Elastomer-Grundmasse mit dem Härter und entziehen Sie der Mischung vollständig die Feuchtigkeit, sodass sie trocken ist. Der Klebstoff muss innerhalb von 30 Minuten verwendet werden, sobald er bereit ist. Reinigen Sie unter Einhaltung von Vorsichtsmaßnahmen eine Deckglasplatte mit fünf Millilitern Chloroform, das aus einer Glasspritze aufgetragen wird, und lassen Sie die Platte trocknen.Tragen Sie nun mit einer 10-Mikroliter-Pipette den vorbereiteten Klebstoff auf das Deckglas auf. Entfernen Sie anschließend vorsichtig einen Chip von der Waferplatine mit feinen Pinzetten. Legen Sie den Chip mit der beschichteten Seite nach oben auf den Klebstoff und reiben Sie ihn sanft in die Objektträgerfläche ein, um den Klebstoff gleichmäßig zu verteilen.Vermeiden Sie, dass Luftblasen darunter eingeschlossen werden, oder dass Klebstoff nach oben auf den Chip gelangt. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Montage in den Acht-Kammer-Objektträgerhalter passt. Trocknen Sie die Montagen nun zwei Stunden lang bei 65 Grad Celsius in einem Trockenschrank. Entfernen Sie später die Schutzschicht auf den Chips durch mehrere Lösungsmittelwäschen bei 54 Grad Celsius. Bringen Sie die montierten Chips zunächst in einen Objektträgerhalter ein und inkubieren Sie sie anschließend nacheinander in drei Lösungsmittelbädern jeweils zehn Minuten lang.Isopropanol, Aceton und Isopropanol. Anschließend spülen Sie die Chips vorsichtig und gründlich mit ultrareinem Wasser aus. Beenden Sie den Vorgang, indem Sie die Chips unter einem schwachen Strom von Stickstoffgas trocknen.Bereiten Sie nun eine achtlochige Klebeplatte vor und legen Sie sie verkehrt herum auf den Arbeitsplatz. Heben Sie anschließend vorsichtig die Deckgläser an und drücken Sie sie mit den Chips in Richtung der Vertiefungen auf die Klebeplatte. Lassen Sie die Montage einige Minuten ruhen, bevor Sie fortfahren.Bevor Sie mit dem Translokationsassay fortfahren, spülen Sie die Chip-Baugruppe gründlich aus, wie im Textprotokoll beschrieben, und schließen Sie mit einem Tris-Pufferbad ab. Danach tauschen Sie die Badlösung gegen DOTAP-enthaltenden Tris-Puffer, der fünf Millimolar Calciumchlorid und ein Mikromolar Oy647-Farbstoff enthält. Fügen Sie anschließend Proteoliposomen in die Chipkammer hinzu, um eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu erreichen, und warten Sie eine Stunde.Nach einer Stunde spülen Sie die Chips viermal mit jeweils 400 Mikrolitern kalziumfreiem Tris-Puffer. Geben Sie nun den kontrollierten Farbstoff auf jede Vertiefung auf eine Konzentration von fünf Mikromolar und führen Sie den Assay fort. Befestigen Sie danach den Chip-Halter am Epifluoreszenzmikroskop und fokussieren Sie auf den Rand des Nanoporenchips, um die Mikrocavities zu finden.Sobald die Mikrokavit&auml;ten scharf gestellt sind, scannen Sie das Nanoporen-Array nach einem Bereich mit dem h&ouml;chsten Deckelverh&auml;ltnis. Einzelheiten sind im Textprotokoll angegeben. Liposomen wurden hergestellt und auf ihre Gr&ouml;&szlig;enverteilung und Dispersion &uuml;berpr&uuml;ft.Die hergestellten Liposomen waren größer als der Porendurchmesser für den Assay, was entscheidend ist. Auch monodisperse Liposomen sind erwünscht. Vor dem Experiment wurde das modifizierte MscL-Protein in der Liposomenpräparation mittels eines Fluoreszenz-Dequenching-Assays überprüft.Das Verhältnis von Liposomen, die aktives modifiziertes MscL enthielten, war ausreichend, um mit dem Translokationsversuch fortzufahren. Auf dem Biochip wurde die Translokation eines fluoreszierenden Zielmoleküls über den modifizierten MscL-Kanal beobachtet. Der chemische Modulator MTSET wurde verwendet, um die konstruierten MscL-Kanäle durch elektrostatische Abstoßung zu öffnen.Der anschließende Abfall der Fluoreszenz innerhalb des Hohlraums wurde überwacht. Dieser Prozess erwies sich als hochgradig reproduzierbar mit sehr konsistenten Efflux-Ereignissen. Die resultierenden Efflux-Kurven gruppierten sich in zwei deutlich unterscheidbare Populationen, die einzelnen oder mehreren Kanaltranslokationsereignissen entsprachen.Das System konnte bis zu drei eindeutig fluoreszierende Farbstoffe mit Echtzeitanalyse verfolgen. Dies ermöglicht eine präzise Unterscheidung positiver Ergebnisse, monoexponentieller Effluxereignisse, komplexer Kinetiken, Lipidintrusionen und Membranrupturen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt werden, und zwar Chip-Präparation, Probenpräparation, Bildgebung und Analyse, wodurch der gesamte Protokollablauf modular wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

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