Name: Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Lernen Sie ein effizientes Protokoll zur Isolation von B- und T-Lymphozyten aus menschlichen Gaumenmandeln für virologische Studien. Diese Methode ermöglicht Forschern, die Rolle von Lymphozyten bei viralen Infektionen zu untersuchen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Schwedischen Krebsgesellschaft (11 0253, 13 0469), dem Schwedischen Forschungsrat (K2012-99X-21959-01-3), der Marcus Borgströms Stiftung und dem Schwedischen Forschungsrat durch einen Zuschuss an das Uppsala RNA Research Centre (2006-5038-36531-16). Wir sind der BioVis-Kerneinrichtung an der Universität Uppsala für viel Hilfe bei der FACS-Analyse zu Dank verpflichtet.

Das Protokoll beschreibt die Isolierung von lymphatischen Zellen, die aus menschlichen Patienten, Material und erfordert deshalb eine ethische Genehmigung. Die Arbeit in der vorliegenden Studie durchgeführt wurde von der Uppsala Ethical Review Board (DNR. 2013/387) gewährt. 1. Isolierung von mononukleären Zellen (MNC) aus humanen Gaumenmandeln ACHTUNG: Alle ungeschirmten Material menschlichen Ursprungs wie Blut, Gewebe oder Körperflüssigkeiten sind als potenziell infiziertem Material betrachtet werden. Daher sollte empfohlen Biosicherheit Praktiken zur Handhabung der menschlichen Geweben folgen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, müssen alle Lösungen und Zellkulturgeräte steril sein. Alle Puffer und Lösungen sollten vorgekühlt werden und auf Eis gehalten. Tonsillen und Geweben isolierten Zellen sollten aufbewahrt und auf Eis behandelt werden. <ol><li> Erhalten frischen Mandeln von Patienten, die eine Tonsillektomie oder Tonsillotomie (Abbildung 2). Tauchen Sie ein in das Gewebe clumps in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit eiskalter steriler Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) gefüllt mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM Glutamin, 0,05 mg / ml Gentamicin und 1% Antibiotika-Antimykotische Mix (Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B). </li><li> Halten Sie die Rohre mit den untergetauchten Tonsillen Gewebeproben zu jeder Zeit auf Eis. Versuchen Sie, die Mandeln so schnell wie möglich zu bearbeiten, und nicht später als 3 Stunden nach der operativen Entfernung. </li><li> Legen Sie die Mandeln auf einem 60 mm Kunststoff-Zellkulturplatte auf Eis und halten Sie die mit HBSS angefeuchteten Tuch. Entfernen Sie sichtbaren Blutgerinnseln, Fett- und Bindegewebe mit einer sauberen Pinzette aus der Tonsillen Oberfläche. </li><li> Verwenden Sie eine neue 60 mm-Zellkulturplatte, die 5 ml HBSS. Schneiden Sie das Mandelgewebe Klumpen in 3-10 mm Fragmente mit einer sterilen Schere und / oder einem Skalpell. </li><li> Bereiten Sie eine neue 60 mm-Zellkulturplatte mit 10 ml HBSS und legen Sie eine 100 &amp; mgr; Kunststoff Zellsieb in der HBSS-Lösung. </li><li> Übertragen Sie die dissreflektierte Tonsillen-Fragmente in die Zelle Sieb mit einer sterilen Zange. Mit dem Kolbenende einer Plastikspritze, reibungslos den Gewebefragmenten zu quetschen durch die Zelle Sieb. Stellen Sie sicher, dass die Tonsillen Fragmente werden völlig in der HBSS eingetaucht. </li><li> Entsorgen Sie die Zellsieb mit den Geweberesten und übertragen Sie die erhaltene Zellsuspension aus dem 60 mm-Zellkulturplatte in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis, während Sie fortfahren mit den Schritten 1.8 und 1.9. </li><li> Im Fall von großen Tonsillen, die größer als 2 cm groß (Figur 2), quetschen die Tonsillen-Fragmente in zwei Zellsiebe, um ein Verstopfen des Siebs in das Sieb zu vermeiden. </li><li> Besorgen Sie sich die endgültigen Volumen von 35 ml der Zellsuspension. Anmerkung: In diesem Schritt ist es möglich, die Zellsuspension zur Kryokonservierung (siehe Abschnitt 2) herzustellen. </li><li> 10 ml der Dichtegradientenlösung wie Ficoll in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen. Vorsichtig überlagern die Zell suspensIon (Schritt 1.9) auf der Oberseite der Dichtegradient-Lösung. Sollte das Mischen der Zellsuspension und der Dichtegradient-Lösung. Anmerkung: Der Dichtegradient Lösung auf RT erwärmen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension in einem Ausschwingrotor bei 700 × g für 20 min bei RT. Den Bremsfunktion an der Zentrifuge so schnell Bremsen kann die Steigung stören nicht zu aktivieren. Verwenden Sie außerdem die niedrigste Beschleunigungsfunktion an der Zentrifuge zur Verfügung. Anmerkung: Nach diesem Zentrifugationsschritt beobachten MNCs als flockigen weißen Schicht an der Grenzfläche, und die roten Blutkörperchen (Erythrozyten), Fibroblasten und Zelltrümmer als Sediment am Boden des Röhrchens. </li><li> Sorgfältig sammeln MNCs Schicht unter Verwendung eines 10 ml-Pipette. Legen Sie die Zellsuspension in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> 25 ml eiskaltem PBS zu der Zellsuspension und drehe das Röhrchen bei 300 xg für 5 min in einem Ausschwingrotor bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer 25 ml Pipetteund Zellpellet Waschstufe zwei weitere Male wiederholen. Schließlich Zellpellet in 15 ml PBS. Hinweis: Nach dem letzten Waschschritt ist es möglich, die Zellsuspension (siehe Abschnitt 2) Kryokonservierung. </li><li> Übernehmen 10 ul der Zellsuspension in Hämocytometer Zell Zählkammer und zählen die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop. Abgeben der geeigneten Menge der Zellen (beispielsweise 2-3 x 10 7) in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen für eine nachfolgende magnetische Perle Trennung. Bewahren Sie dieses aliquoten auf Eis, bis der Schritt 3.2. </li></ol> 2. Kryokonservierung von Tonsilläre Cells <ol><li> Bereiten Gefriermedium (90% FBS und 10% DMSO) und bewahren Sie es auf Eis. Für langfristige Lagerung halten die gefrierenden Medien bei -20 ° C. </li><li> Bestimmung der Gesamtzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers Zelle Zählkammer (Schritt 1.15). Berechnung der erforderlichen Menge an Gefriermedium nach dem gewünschten gefrorenen Zelldichte (beispielsweise 10 7 Zellens / ml Gefriermedium). </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 xg für 5 min. Den Überstand umfüllen, ohne das Zellpellet zu stören und Zellpellet in eiskaltem Einfriermedium (aus Schritt 2.1). </li><li> Verzichtet werden 1 ml Aliquots der Zellsuspension in sterilen Ampullen zur langfristigen Lagerung in flüssigem Stickstoff ausgelegt. Frieren Sie die Fläschchen in einem Isopropanol Kammer und lagern Sie sie bei -80 ° CO / N. Für die Langzeitarchivierung übertragen Sie die Vials in einen flüssigen Stickstoff enthaltenden Speicherbehälter oder ein 140 ° C Zell Gefrierschrank. </li><li> Um Durchstechflaschen mit eingefrorenen Zellen auftauen, erwärmen sie sich schnell in einem 37 ° C Wasserbad. Unmittelbar nach dem Auftauen, Dispergieren der Zellsuspension in 10 ml vorgewärmtem HBSS (mit Ergänzungen, Schritt 1.1) in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Drehe das Röhrchen bei 300 xg für 5 min, zu entfernen HBSS und Zellpellet bei der gewünschten Zelldichte in HBSS (mit Ergänzungen, Schritt 1.1). Hinweis: Die Funktionsfähigkeit des MNU after Auftauen von Bedeutung ist, da das Vorhandensein von toten Zellen, die die endgültige Ausbeute an gereinigtem B und T-Lymphozyten zu verringern. Hinweis: Nach unserer Erfahrung die Lebensfähigkeit der Zellen weniger als 80% wird die Zellisolationseffizienz zu reduzieren. </li></ol> 3. Positive Selektion von T-Lymphozyten-Population aus Tonsilläre MNCs Hinweis 1: Dieses Protokoll wird auf positive Selektion von menschlichen CD3 + T-Lymphozyten von Tonsillen MNCs mit magnetischen Kügelchen an den CD3-Antikörper gekoppelt basiert. Es ist möglich, diesen Abschnitt aus frischen (Abschnitt 1) ​​oder den gefrorenen (Abschnitt 2) MNU starten. Anmerkung 2: Beginnen Sie mit 3 x 10 7 MNCs. Nehmen Sie dieses Zellzahl nicht überschreiten, da die Trennsäulen können verstopfen, und dies wird die Isolationseffizienz zu reduzieren. Verwenden größere Spalten, wenn mehr Zellen behandelt werden. Die in diesem Protokoll verwendeten Mengen sind experimentell für die Anzahl der Zellen, wir optimiertin unserem Versuchsaufbau ed. <ol><li> Vorbereitung der Trennpuffer [PBS (pH 7,2), 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA]. Filtern Sie die Trennungspuffer durch ein 0,45 um-Filter und bei 4 ° C. </li><li> Spin der MNC-Suspension (Schritt 1.14) bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren der resultierenden Zellpellets in 240 &amp; mgr; l (80 &amp; mgr; l pro 10 7 Zellen) eiskaltem Trennpuffer. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 2 ml-Tube. </li><li> Mit 20 ul magnetischen CD3-Antikörper zu der Zelllösung. Die Röhrchen für 1 h bei 4 ° C inkubieren unter kontinuierlichem leichtem Mischen mit Zellen in Suspension zu halten. </li><li> Übertragen Sie alle der Zellsuspension in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml eiskaltem Trennpuffer, um die Zellen zu waschen. </li><li> Zentrifugieren der Röhre bei 300 g 10 min bei 4 ° C in einem Ausschwingrotor. </li><li> In der Zwischenzeit die Magnetscheider und Spalte. Befestigen Sie den Magnetscheider in den Stand und legen Sie die Spalte in der separator. Indem 500 ul eiskaltem Trennpuffer Die Säule. Die Durchströmung zu verwerfen. </li><li> Legen Sie ein neues 15 ml Sammelröhrchen unter der Spalte. Halten Sie das Sammelröhrchen auf Eis. </li><li> Überstand verwerfen (Schritt 3.5) mit einer Pipette und sanft Zellpellet in 500 ul Trennpuffer. Übernehmen Sie die Zellsuspension auf der Oberseite des vorgewaschen Spalte und lassen Sie es durchlaufen. Hinweis: Zellklumpen können die Spalte verstopfen und damit die Durchflussrate zu reduzieren. Um dieses Problem zu vermeiden, legen Sie einen 40 &amp; mgr; Kunststoff Zellsieb am oberen Ende der Säule. Vorbei an den Zellen durch diese Masche wird in hohem Grade verbessern die Effizienz dieser Methode. </li><li> 4-mal mit 1,5 ml Trennpuffer (500 &amp; mgr; l für 10 &amp; sup7; Zellen) Waschen der Säule. Warten Sie auf den Spalten Reservoir leer sein (keine Flüssigkeit in der Spalte eingehalten werden), bevor die nächste Waschschritt. Anmerkung: Beziehen Sie die CD3 unmarkierten Zellen, wie B-Lymphozyten-Fraktion betrachtet, wie sie sind,in den Sammelröhrchen eluiert. </li><li> Entfernen Sie die Säule aus dem Abscheider und Ort in eine neue 15 ml Sammelröhrchen. Pipette 2 ml Trennpuffer auf die Säule. Unter Verwendung der mit der Säule zugeführt Stößel eluieren die positiv ausgewählten T-Lymphozyten, die als die T-Lymphozyten-Anteil gelten. </li><li> Bestimmen die Anzahl der gereinigten Zellen (Schritt 1.15), falls erforderlich. Zellsuspensionen sind nun bereit für nachgeschaltete Experimente. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie Analyse von isolierten Tonsilläre B- und T-Lymphozyten ACHTUNG: Paraformaldehydlösung ist reizend und vermutetes Karzinogen. Geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille / Gesichtsschutz tragen. Anmerkung 1: Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur direkten Färbung der isolierten B-und T-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Der Hauptzweck dieses Schrittes ist es, die Reinheit des isolierten Zellpopulationen af ​​beurteilenter CD3-Antikörper magnetische Trennung. Zu diesem Zweck gegründet B- und T-Zell-Marker, fluorophorkonjugierten monoklonale Antikörper CD20-FITC und CD2-APC, verwendet. Auch die Einbeziehung der Isotypkontrolle Antikörper ist sehr zu empfehlen, um die nicht-spezifische &quot;Hintergrund&quot; Bindung der CD2 und CD20-Antikörper (siehe Schritt 4.8) zu unterscheiden. Anmerkung 2: Es ist möglich, die gereinigten Zellfraktionen in eine 1% Paraformaldehyd (PFA) Lösung im Dunkeln bei 4 ° C bis zum Zeitpunkt der Färbung zu halten (beispielsweise am nächsten Tag.). Auch die gleiche Vorgehensweise gilt, wenn es eine Zeitlücke zwischen Anfärbung und FACS-Analyse. Erinnern, dass in beiden Fällen Zellen sollten richtig mit PBSA (PBS enthaltend 0,2% BSA), vor der Färbung oder FACS-Analyse gewaschen werden. <ol><li> Nehmen 6 x 10 6 Zellen der MNCs aus Schritt 1.15 (vor dem Aufbringen auf die Säule), B-Lymphozyten-Fraktion aus Schritt 3.9 und T-Lymphozyten-Fraktion von Schritt 3.10. </li><li> Drehen Sie das HandySuspensionen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C unter Verwendung eines ausschwenkbaren Rotors. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie das Zellpellet einmal mit 1 ml eiskaltem PBSA. Dreh die Zellsuspensionen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette resuspendieren und die Zellen in 600 &amp; mgr; l eiskaltem PBSA Puffer. </li><li> Zugabe von 100 ul der Zellsuspension auf den Boden eines FACS-Röhrchen. </li><li> Geben Sie 100 ul PBS, das 10% hitzeinaktiviertem Humanserum in jedes Röhrchen, gut mischen und Inkubation für ca. 1 min bei RT oder 20 Minuten auf Eis. Hinweis: B-Lymphozyten tragen Fc-Rezeptoren. Um die Fc-Rezeptoren blockieren die gereinigten Zellfraktionen werden mit 10% hitzeinaktiviertem Humanserum inkubiert. Das Humanserum wird Wärme durch Inkubation bei 56 ° C für 1 Stunde inaktiviert. Teilen Sie die Hitze inaktiviert Serum in kleinen Portionen und bei -20 ° C eingefroren. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C in einem swing-out-Rotor. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie das Zellpellet mit 1 ml PBSA. Wiederholen der Zentrifugation (300 · g für 5 min bei 4 ° C). </li><li> 100 l PBSA in jedes Röhrchen auf Eis. Die geeignete Menge von fluorophorkonjugierten monoklonalen Antikörper gemäß den Empfehlungen des Herstellers (beispielsweise 20 &amp; mgr; l Anti-CD20-und / oder 5 &amp; mgr; l anti-CD2-Antikörper in 100 ul PBSA). Hinweis: Vergessen Sie nicht, genügend Kontrollröhrchen für die FACS-Analyse zuweisen. In diesem Protokoll sind die folgenden Kontrollen eingeschlossen: 1) Zellen, die mit Anti-CD2 und Anti-CD20-Antikörper einzeln gefärbten, 2) Zellen, die mit Anti-CD2 und Anti-CD20 Isotypkontrolle Antikörper einzeln und, 3) Zellen, die ohne Zugabe gefärbten von Antikörpern. </li><li> Vortexen Sie das Röhrchen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Mit PBSA waschen 2 mal. 2 ml 1% PFA-Lösung zu den Proben. Lassen Sie die Zellen bleiben in der PFA-Lösung bei 476; C im Dunkeln bis zur Zeit des FACS-Analyse. </li><li> Unmittelbar bevor Sie die Proben in der FACS-Maschine, Waschen Sie die Zellen 2 mal mit PBSA (300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C). Resuspendieren Proben in 1 ml PBS und Halten bei 4 ° C (oder auf Eis), vor Licht geschützt, vor der Trennung auf dem Durchflußzytometer. </li><li> Haben die FACS-Sortierung nach dem Protokoll vom Durchflusszytometer Hersteller. </li></ol> 5. PCR-Nachweis von Adenovirus DNA in getrennter Tonsilläre B und T-Lymphozyten Anmerkung 1: Die Adenovirus-Hexon-Gen-Primer AdRJC1 (5&#39;-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 &#39;) und AdRJC2 (5&#39;-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3&#39;) 11. Diese Primer erzeugen ein Amplikon von 139 bp. Der Host 18S rRNA-Gen kann mit Primern tp206 (5&#39;-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 &#39;) und TP207 (5&#39;-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3&#39;) detektiert werden. Der Erwartete Fragmentlänge von 300 bp. Anmerkung 2: Jeder PCRLauf umfasst eine negative Kontrolle (destilliertes H 2 O) und einer aus menschlichen B-Zelllinie (BJAB) erhaltenen positiven DNA-Steuerung mit menschlichen Adenovirus Typ 5 12 infiziert. <ol><li> Extrahieren DNA (mindestens 1 x 10 6 Zellen, Stufe 3.11) unter Verwendung von Silica-Membran anhand Säulenreinigungsverfahren. Auszug RNA mit Phenol und Guanidinisothiocyanat Lösung 13. </li><li> Werden 100 ng DNA von B- und T-Lymphozyten zu einer Reaktionsmischung, enthaltend 1x HF-Puffer, 0,2 mM Desoxynukleotidtriphosphat-Mix (dNTP), 0,25 &amp; mgr; M von jedem Primer und 1 U der High-Fidelity-DNA-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 20 ul. </li><li> Zuführen PCR-Amplifikation unter folgenden Zyklusbedingungen: 30 sec Denaturierung bei 98 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 67 ° C (Hexon) bzw. 58 ° C (18S rRNA) für 30 sec und 72 ° C für 30 sek. Die PCR-Reaktion wurde mit einem letzten Verlängerungsschritt von 7 min bei 72 ° C beendet. </li><li> Trennen Sie die resultierende PCR Amplification Produkte auf einem 1,5% Agarose-Gel in 1x TBE-Puffer und visualisieren die erwarteten Banden durch Färbung mit Nukleinsäurefärbung. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Einer der wichtigsten Faktoren, die die Ergebnisse dieses Protokolls ist die Verwendung von frischen tonsillar Material wie das Ausgangsmaterial. Daher sollten die Tonsillenproben innerhalb von 3 h nach der Operation verarbeitet werden. Mandeln können von Erwachsenen und Kindern erhalten werden. Rachen Materials von den Kindern der Regel kleiner ist durch die teilweise operative Entfernung der Mandeln (Tonsillotomie). Daher ist die Anzahl der MNCs aus Tonsillotomie Proben (1 x 10 7 -1 x 10 8) erhal...

Mandeln sind Ansammlungen von unvollständig verkapseltem lymphatischem Gewebe, das unter dem Epithel im oberen aero-digestive Trakt liegt und mit ihm in Kontakt steht. In der Regel bezieht sich der Begriff "Mandeln" auf die Gaumenmandeln, die sich an den Seitenwänden des Mundbereichs des Rachens befinden. Die paarigen Gaumenmandeln bilden zusammen mit der Nasen-Rachen-Mandel (Adenoid), den paarigen Eileitermandeln und den Zungenmandeln den sogenannten "Waldeyer-Ring". Letzteres ist für den Erstkontakt zwischen eingeatmeten oder verschluckten Krankheitserregern und dem lymphatischen Gewebe des aerodigestive Trakts verantwortlich1,2. In der Tat haben zahlreiche Berichte gezeigt, dass sowohl bakterielle als auch virale Antigene in den Gewebeproben der Gaumenmandeln nachgewiesen werden können2-6.
Die Gaumenmandeln bestehen aus dichtem lymphatischem Gewebe, das von einem geschichteten Plattenepithel, nicht keratilisierendem Epithel bedeckt ist. Die Mandeln haben zahlreiche Krypten, epitheliale Einstülpungen, die das Parenchym durchdringen und die Oberfläche vergrößern. Histologisch enthalten die Gaumenmandeln zahlreiche lymphoide Follikel mit Keimzentren, die die Orte für die B-Zell-Reifung und -Differenzierung sind (B-Zell-Bereiche). Ebenso umfassen die Gaumenmandeln T-Zellen, die sich hauptsächlich in den extrafollikulären Regionen (T-Zell-Bereichen) befinden. Neben den B- und T-Zellen können auch verschiedene follikuläre dendritische Zellen in den Gaumenmandeln nachgewiesen werden1,2. 
Aufgrund ihrer anatomischen Lage sind die Gaumenmandeln durch chirurgische Eingriffe leicht zugänglich. So wird beispielsweise die chirurgische Entfernung von Mandeln, die sogenannte Tonsillektomie, weltweit routinemäßig durchgeführt7. Bei Kindern mit Mandelhyperplasie wird manchmal eine teilweise chirurgische Entfernung der Mandeln (Tonsillotomie) angewendet, die bei den Patienten weniger postoperative Schmerzen verursacht. Unter Berücksichtigung der Akkumulation verschiedener Erreger in den Mandeln bieten operativ entnommene Mandeln eine einzigartige Möglichkeit, den Einfluss viraler und bakterieller Erreger auf die Funktionen der tonsillären Lymphozyten zu untersuchen2,8. Darüber hinaus kann untersucht werden, ob einige Krankheitserreger es vorziehen, sich in bestimmten Zellsubpopulationen aufzuhalten9. Da die Mandeln eine reichhaltige Quelle für B-Lymphozyten sind, können isolierte tonsilläre B-Lymphozyten effizient verwendet werden, um die Aktivität verschiedener B-Zell-Subpopulationen zu untersuchen10. Da die Gaumenmandeln jedoch eine Mischung von Zelltypen enthalten, ist eine effiziente Methode zur Trennung der verschiedenen Zellsubpopulationen erforderlich. 
Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur effizienten und schnellen Isolierung von tonsillären B- und T-Zellpopulationen aus menschlichen Gaumenmandeln unter Verwendung einer magnetisch aktivierten Zelltrennungstechnik (Abbildung 1). Die hier beschriebene Methode ist nützlich für Wissenschaftler, die die Rolle verschiedener Infektionserreger in menschlichen lymphatischen Organen wie den Gaumenmandeln beurteilen wollen.

<table><tbody><tr><td>Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>Enthält 5% fötales Rinderserum (FBS), 10 mM Glutamin,&nbsp; &nbsp; 0,05 mg/ml Gentamicin und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum-Mischung</td></tr><tr><td>Gefriermedium</td><td></td><td></td><td>90 % FBS und 10 % DMSO</td></tr><tr><td>MACS-Puffer</td><td></td><td></td><td>PBS (pH 7,2), 0,5 % BSA und 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>PBSA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS mit 0,2 % BSA</td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td>PBS mit 1 % Paraformaldehyd (PFA). Frisch machen. PFA steht im Verdacht, krebserregend zu sein. Tragen Sie Handschuhe und eine Schutzbrille.</td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum-Mischung</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petridish</td><td>Nunc</td><td>150326</td><td></td></tr><tr><td>Präparieren von Foreceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381241</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Irisschere&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12912055</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Skalpelle</td><td>Swann-Morton</td><td>REF 0501</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m Kunststoff-Zellsieb</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M Kunststoff-Zellsiebe&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Kunststoffspritze</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>300185</tr><tr><td>15 ml konische Zentrifugenröhrchen</td><td>SARSTEDT</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Zentrifugenröhrchen</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td></td></tr><tr><td>Langsamlaufende Zentrifuge mit Festwinkel- oder Ausschwingrotor</td><td>Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&ndash; Hypaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415-50ML</td><td>Ficoll Lösung</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Biologische Industrie</td><td>040071A</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>SIGMA</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Säulen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS humane CD3-Mikrobeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-881</td><td></td></tr><tr><td>MACS-Separator (Octo MACS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1120180100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AnalaR NORMAPUR</td><td>20302.293</td><td></td></tr><tr><td>CD2 konjugiert mit Allophycocyanin ( CD2-APC)&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td>560642</tr><tr><td>CD20, konjugiert mit Fluorescein-Isothiocyanat (CD20-FITC)&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td>556632</tr><tr><td>Humanserum&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D119-0100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>SARSTEDT</td><td>72379</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRII Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 4.1 Software</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nukleospin Blut&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740951.50</td><td>DNA-Isolationskit</td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp; Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>15596</td><td>RNA-Isolationsreagenz</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>0610030</td><td>Zellzähler</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Nukleinsäure-Gel-Färbung&nbsp;</td></tr></tbody></table>

effiziente isolation protokoll für die b- und t-lymphozyten von menschengaumenmandeln

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Mandeln sind ein Teil des Immunsystems und bilden die erste Verteidigungslinie gegen eingeatmete Krankheitserreger. In der Regel bezieht sich der Begriff "Mandeln" auf die Gaumenmandeln, die sich an den Seitenwänden des Mundbereichs des Rachens befinden. Operativ entfernte Gaumenmandeln stellen eine leicht zugängliche Quelle für B- und T-Lymphozyten dar, um das Zusammenspiel zwischen fremden Krankheitserregern und dem Immunsystem des Wirts zu untersuchen. Dieses Videoprotokoll beschreibt die Dissektion und Aufbereitung von chirurgisch entfernten humanen Gaumenmandeln, gefolgt von der Isolierung der einzelnen B- und T-Zellpopulationen aus derselben Gewebeprobe. Wir stellen eine Methode vor, die tonsilläre B- und T-Lymphozyten mithilfe eines Antikörper-abhängigen Affinitätsprotokolls effizient trennt. Darüber hinaus verwenden wir die Methode, um zu zeigen, dass humane Adenoviren spezifisch die tonsilläre T-Zellfraktion infizieren. Das etablierte Protokoll ist allgemein anwendbar, um tonsillare B- und T-Zellpopulationen effizient und schnell zu isolieren und die Rolle verschiedener Arten von Krankheitserregern bei der tonsillären Immunantwort zu untersuchen.

Eine effiziente Trennung von Tonsillen MNCs zu hochgradig gereinigten Subpopulationen von B und T-Lymphozyten. Dies wurde durch FACS-Analyse unter Verwendung von anti-CD20 und anti-CD2-Antikörper an B und T-Lymphozyten-Populationen, bzw. (3A) zu detektieren bestätigt. Im Gegensatz dazu eine ineffiziente Abscheidung von MNCs Ergebnisse in Zellfraktionen, die eine Mischung von Zellen von sowohl B als auch T-Lymphozyten-Subpopulationen (3B) sind. Die isolierte ...

Gaumenmandeln sind eine reichhaltige Quelle für B- und T-Lymphozyten. Hier bieten wir ein einfaches, effizientes und schnelles Protokoll zur Isolierung von B- und T-Lymphozyten aus menschlichen Gaumenmandeln. Die beschriebene Methode wurde speziell für Studien zur viralen Ätiologie der Mandelentzündung, der sogenannten Mandelentzündung, angepasst.

Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, BNT-Lymphozyten-Fraktionen aus menschlichen Mandelproben zu gewinnen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Virologie zu beantworten, beispielsweise welche Rolle BT-Lymphozyten-Fraktionen bei der Pathogenese viraler Erkrankungen spielen. Innerhalb von drei Stunden nach der chirurgischen Entfernung transportieren Sie das Mandelgewebe in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zum Labor, das mit eiskaltem, sterilen HBSS mit Zusätzen gefüllt ist.Dann unter Verwendung der geeigneten Biosicherheitsverfahren, die für den Umgang mit menschlichem Gewebe empfohlen werden. Das Gewebe mit frischem, Supplement enthaltendem HBSS befeuchten und die Mandeln in eine 60 Millimeter große Kunststoffzellkulturplatte auf Eis überführen. Mit einer Pinzette alle sichtbaren Blutgerinnsel sowie fetthaltiges und Bindegewebe entfernen und anschließend die Mandeln in eine neue 60 Millimeter große Platte überführen, die fünf Milliliter HBSS mit Supplementen enthält.Schneiden Sie als Nächstes das Tonsillengewebe in Fragmente von drei bis zehn Millimetern und überführen Sie diese Fragmente mithilfe des Kolbens einer Plastikspritze vorsichtig in einen 100-Mikrometer-Plastikzellsieb in einer neuen 60-Millimeter-Zellkulturplatte, die 10 Milliliter frisches HBSS mit Zusätzen enthält. Pressen Sie die Gewebefragmente durch den Zellsieb, wobei sichergestellt werden muss, dass die Tonsillenfragmente während des gesamten Zerkleinerungsvorgangs vollständig in HBSS eingetaucht bleiben. Entsorgen Sie danach den Sieb und überführen Sie die erhaltene Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Plastikzentrifugenröhrchen auf Eis.Bringen Sie die Zellsuspension mit frischem HBSS, das Zusatzstoffe enthält, auf ein Endvolumen von 35 Milliliter und geben Sie anschließend 10 Milliliter der dichtegradienten Lösung mit Raumtemperatur in mehrere 50-Milliliter-Konischgefäße. Überlagern Sie die Zellsuspensionen vorsichtig auf die Dichtegradienten, wobei darauf zu achten ist, dass die Lösungen nicht vermischt werden, und trennen Sie die Zellen anschließend durch Zentrifugation. Die mononukleären Zellen sammeln sich als lockere weiße Schicht an der Grenzfläche, während die roten Blutkörperchen, Fibroblasten und Zelltrümmer im Sediment am Boden des Gefäßes verbleiben.Unter Verwendung einer 10-Milliliter-Pipette sammeln Sie vorsichtig die mononukleäre Zellschicht und überführen die mononukleären Zellen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal mit jeweils 25 Millilitern eiskalter PBS und resuspendieren das endgültige Pellet in 15 Millilitern PBS. Nach der Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen stellen Sie die Zellen auf Eis, um die Tonsor-T-Zellen mittels magnetischer Säulentrennung zu isolieren.Zentrifugieren Sie die Suspension der mononukleären Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in 80 µL eiskaltem Trennpuffer pro 1 × 10⁷ Zellen. Überführen Sie anschließend die Zellsuspension in ein steriles 2-mL-Röhrchen und inkubieren Sie sie mit 20 µL CD3-Magnetantikörper eine Stunde lang bei 4 °C unter kontinuierlichem, sanftem Mischen. Um die Zellen am Ende der Inkubation in Suspension zu halten, überführen Sie die Zellen in ein 15-mL-Röhrchen, das 5 mL eiskalten Trennpuffer enthält, und waschen Sie sie. Während des Waschschritts befestigen Sie den Magnetseparator am Stativ und setzen eine Säule auf den Magneten.Waschen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern eiskaltem Trennpuffer und setzen Sie dann einen 40-Mikrometer-Filter auf die Säule. Resuspendieren Sie das Zellpellet nun in 500 Mikrolitern frischem Trennpuffer und geben Sie die Zellen durch den Filter auf die Säule, wobei Sie das B-Zellen-enthaltende EIT in einem 15-Milliliter-Kegelröhrchen sammeln. Zwei bon Eis, wenn alle Zellen in das Sammelröhrchen übergegangen sind.Spülen Sie die Säule viermal mit jeweils 500 Mikrolitern Separationspuffer pro 1 × 10⁷ Zellen, wobei Sie warten, bis das Säulenreservoir leer ist, bevor Sie die nächste Spülung hinzufügen. Nach der letzten Spülung überführen Sie die Säule in ein neues 15-Milliliter-Sammelröhrchen. Drücken Sie dann mit Hilfe des Säulenstößels 2 Milliliter Separationspuffer durch die Säule in das Röhrchen, um die CD3-positive T-Zell-Fraktion zu sammeln.Um die isolierten B- und T-Zell-Fraktionen zu analysieren, pelletieren Sie die CD3-positiven und CD3-negativen Zellfraktionen und waschen Sie beide Zellproben nach der zweiten Zentrifugation mit einem Milliliter PBS, ergänzt mit 0,2 % BSA oder PBSA. Geben Sie 100 µL-Aliquote der Zellen in PBSA in die entsprechende Anzahl an Röhrchen für die Färbung und fügen Sie in jedes Röhrchen die geeignete Menge an mit Fluoro 4 konjugiertem monoklonalem oder Kontroll-Antikörper hinzu. Vortexen Sie die Röhrchen anschließend kurz und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Am Ende der Inkubation führen Sie den nächsten Schritt durch.Waschen Sie die Röhrchen zwei Mal mit frischem PBSA und fixieren Sie die Zellfärbung anschließend mit 1 % Paraformaldehyd, um das Vorhandensein von Adenovirus-DNA in den Zellen mittels PCR nachzuweisen. Führen Sie die PCR-Amplifikation unter geeigneten Zyklenbedingungen durch und trennen Sie die resultierenden PCR-Amplifikationsprodukte in einem 1,5 %igen Agarosegel im EDTA-Puffer. Visualisieren Sie schließlich die entstandenen Banden mit einem geeigneten Nukleinsäurefarbstoff.Entsprechend Standardprotokollen führt eine erfolgreiche Trennung der tonsoralen mononukleären Zellen zu hochreinen Teilpopulationen von B- und T-Lymphozyten, wie durch die Durchflusszytometrie mit Anti-CD20- und Anti-CD2-Antikörpern zur Detektion der B- und T-Lymphozytenpopulationen bestätigt wurde. Im Gegensatz dazu ergibt eine ineffiziente Trennung der mononukleären Zellen Zellfraktionen, die eine Mischung aus B- und T-Lymphozyten darstellen. Teilpopulationen, DNA und RNA können aus den mittels magnetischen Kügelchen getrennten B- und T-Lymphozyten für nachgeschaltete Analysen extrahiert werden, wie soeben gezeigt.Beispielsweise wird hier die spezifische Detektion von Adenovirus-DNA in TONSOR-T-Lymphozyten, die mittels PCR nachgewiesen wurde, mit qualitativ hochwertigem zytoplasmatischem RNA-Extrakt gezeigt. RNA kann ebenfalls aus isolierten TONSOR-B-NT-Lymphozyten gewonnen werden. Sobald zwei Mandelproben vorliegen, können diese innerhalb von sechs Stunden verarbeitet werden, sofern die Technik korrekt durchgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Mandelproben so schnell wie möglich zu verarbeiten. Die Anzahl der Waschschritte und das Volumen des Waschpuffers sind ebenfalls kritische Parameter für ein gutes Ergebnis. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie QPCR und R-T-Q-P-C-R durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur quantitativen Präsenz von viraler DNA und mRNA nach ihrer Entwicklung zu beantworten.Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Virologie den Weg, um die Pathogenese und Latenz verschiedener viraler Spezies in menschlichem lymphatischem Gewebe zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man BT-Lymphozyten-Fraktionen aus menschlichen Mandelproben isoliert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ungeprüften Materialien menschlichen Ursprungs wie Blut und Geweben äußerst gefährlich sein kann.Daher sollten angemessene Sicherheitsmaßnahmen befolgt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Isolation von Lymphozyten mit der Miltenyi MACs Kit ist eine zuverlässige Methode, um Zellen aus ganzen lymphatischen Gewebe-Homogenaten zu reinigen. Cells unter Verwendung der Miltenyi-System sind in der Regel ≥ 96% rein. Hier zeigen wir, welche Schritte unternommen wurden, um CD4 + T-Zellen, einer der vielen Kits von Miltenyi angeboten isolieren.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von hochreinem Populationen von Leukozyten, die Tumore infiltrieren. Dieses Protokoll wird aus der Miltenyi Biotech-Protokoll geeignet ist, Ausbeute und Reinheit zur Isolierung von Zellen aus komplexen Tumorgewebe zu verbessern.

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut mit biotinylierten Antikörpern, die spezifisch für Nicht-B-Zellen sind, und Streptavidin-konjugierten magnetischen Mikrokügelchen.

Isolierung und Reinigung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut

Mit Effektor-Funktionen deutlich von anderen T-Zell-Untergruppen, Th17-Zellen wurden zentral bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Diese in vitro-Differenzierung Th17-Protokoll bietet die Möglichkeit, festzustellen, ob naiven CD4 +-T-Lymphozyten in Th17-Zellen zu differenzieren und ihre Rolle in der Autoimmun-und Wirtsantwort weiter zu prüfen.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Klonierung der seltenen T-Zell-Einheit von peripheren Vδ1+CD4+ T-Zellen zur Verfügung, die, wie wir kürzlich gezeigt haben, ein extrathymer αβ T-Zell-Vorläufer ist. Diese Technik ermöglicht es, diese Zellen in ex vivo-Kulturen quantitativ zu isolieren, zu klonen und effizient zu expandieren.

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

In dieser Studie präsentieren wir eine neue und effektive Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus Peyer Patches (PPs), die anschließend für in Vivo und in Vitro funktionelle Assays sowie Flow durchflusszytometrischen Studien des follikulären T verwendet werden können Helfer und germinal Center B-Zellen.

Entwirren Key Player der humoralen Immunität: erweiterte und optimierte Lymphozyten isoliert Protokoll von Murine Peyer Patches

Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Tonbandzellen von gesunden Menschen, die sich einer partiellen chirurgischen Tonsillektomie unterziehen, leicht verarbeitet und kultiviert, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen.

Isolierung von Tonsillar Mononukleären Zellen zur Untersuchung von Ex-Vivo-angeborenen Immunantworten in einem menschlichen Mukosal-Lymphgewebe

Lernen Sie ein effizientes Protokoll zur Isolation von B- und T-Lymphozyten aus menschlichen Gaumenmandeln für virologische Studien. Diese Methode ermöglicht Forschern, die Rolle von Lymphozyten bei viralen Infektionen zu untersuchen.

Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

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