Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, BNT-Lymphozytenfraktionen aus menschlichen Mandelproben zu gewinnen. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Virologie zu beantworten, wie z.B. welche Rolle BT-Lymphozytenfraktionen bei der Pathogenese von Viruserkrankungen innerhalb von drei Stunden nach ihrer chirurgischen Entfernung spielen. Transportieren Sie das Mandelgewebe in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das mit eiskalten, sterilen HBSS-haltigen Nahrungsergänzungsmitteln gefüllt ist, ins Labor.

Dann unter Verwendung der geeigneten Biosicherheitsverfahren, die für den Umgang mit menschlichem Gewebe empfohlen werden. Befeuchten Sie das Gewebe mit frischem Nahrungsergänzungsmittel, das HBSS enthält, und übertragen Sie die Mandeln auf eine 60 Millimeter große Zellkulturplatte aus Kunststoff auf Eis. Entfernen Sie mit einer Pinzette sichtbare Blutgerinnsel oder Fett- und Bindegewebe und übertragen Sie die Mandeln dann in eine neue 60-Millimeter-Platte, die fünf Milliliter HBSS mit Nahrungsergänzungsmitteln enthält.

Als nächstes schneiden. Das Mandelgewebe verklumpt in drei bis 10 Millimeter große Fragmente, gefolgt von der Überführung der Fragmente in ein 100 Mikrometer großes Zellsieb aus Kunststoff in einer neuen 60-Millimeter-Zellkulturplatte, die 10 Milliliter frisches HBSS mit Zusätzen enthält, wobei das Kolbenende einer Kunststoffspritze reibungslos verwendet wird. Drücken Sie die Gewebefragmente durch das Zellsieb und stellen Sie sicher, dass die Mandelfragmente vollständig in das HBSS eingetaucht bleiben, wenn das gesamte Gewebe mazeriert wurde, entsorgen Sie das Sieb und überführen Sie die resultierende Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff auf Eis.

Bringen Sie die Zelllösung mit frischen HBSS-haltigen Nahrungsergänzungsmitteln auf ein Endvolumen von 35 Millilitern und geben Sie dann 10 Milliliter Lösung mit Dichtegradienten bei Raumtemperatur in einige konische 50-Milliliter-Röhrchen. Überlagern Sie die Zellsuspensionen vorsichtig mit den Dichtegradienten, achten Sie darauf, die Lösungen nicht zu vermischen, und trennen Sie die Zellen dann durch Zentrifugation. Die mononukleären Zellen trennen sich in eine flauschige weiße Schicht an der Grenzfläche zu den roten Blutkörperchen, Fibroblasten und Zelltrümmern, die sich im Sediment am Boden des Röhrchens befinden.

Entnehmen Sie mit einer 10-Milliliter-Pipette vorsichtig die mononukleäre Zellschicht und ziehen Sie die mononukleären Zellen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie dann die Zellen dreimal in 25 Millilitern eiskaltem PBS pro Waschgang und resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 15 Millilitern PBS. Nachdem Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen gezählt haben, legen Sie die Zellen auf Eis, um die Tonsor-T-Zellen durch magnetische Bead-Trennung zu isolieren.

Schleudern Sie die mononukleäre Zellsuspension herunter und resuspendieren Sie das Pellet in 80 Mikrolitern eiskaltem Trennpuffer pro einmal 10 auf die sieben Zellen. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein steriles Zwei-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in 20 Mikrolitern CD-3-Magnetantikörper mit kontinuierlichem sanftem Mischen, um die Zellen und die Suspension am Ende der Inkubation zu halten, übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern eiskaltem Trennpuffer und waschen Sie sie während des Waschvorgangs. Befestigen Sie den Magnetabscheider am Ständer und laden Sie eine Säule auf den Magneten.

Waschen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern eiskaltem Trennpuffer und legen Sie dann ein 40-Mikrometer-Sieb auf die Säule. Suspendieren Sie nun das Zellpellet wieder in 500 Mikrolitern frischem Trennpuffer und laden Sie die Zellen durch das Sieb auf die Säule, in der die B-Zelle, die EIT enthält, in einem konischen 15-Milliliter-Behälter gesammelt wird. Zwei Boneis, wenn alle Zellen in das Sammelröhrchen gelangt sind.

Waschen Sie die Säule viermal mit 500 Mikrolitern Trennpuffer pro einmal 10 bis zu den sieben Zellen, die darauf warten, dass das Säulenreservoir leer ist, bevor Sie die nächste Wäsche durchführen. Füllen Sie die Säule nach dem letzten Waschen in ein neues 15-Milliliter-Auffangröhrchen um. Drücken Sie dann mit dem Säulenkolben zwei Milliliter Trennpuffer durch die Säule in das Röhrchen, um die drei positiven T-Zellfraktionen der CD zu sammeln.

Um die isolierten B- und T-Tonsor-Zellfraktionen zu analysieren, pelletieren Sie die drei positiven und drei negativen CD-Zellfraktionen und waschen Sie beide Zellgruppen in einem Milliliter PBS, ergänzt mit 0,2 % BSA oder PBSA nach dem zweiten Spin. Verteilen Sie 100 Mikroliter Aliquots der Zellen und PBSA auf die entsprechende Anzahl von Röhrchen für die Faxmarkierung und geben Sie die entsprechende Menge an Fluor-4-konjugiertem monoklonalem oder Kontrollantikörper in jedes Röhrchen. Anschließend die Röhrchen kurz durchwirbeln und am Ende der Inkubation 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.

Waschen Sie die Röhrchen zweimal mit frischem PBSA und fixieren Sie dann die Zellfärbung mit 1%Paraform-Aldehyd, um das Vorhandensein von Adenovirus-DNA in den Zellen durch PCR nachzuweisen. Führen Sie die PCR-Amplifikation unter den entsprechenden Zyklusbedingungen durch, indem Sie die resultierenden PCR-Amplifikationsprodukte auf einem 1,5%igen AGROS-Gel und einem EDTA-Puffer trennen. Visualisieren Sie abschließend die resultierenden Banden mit der entsprechenden Nukleinsäurefärbung.

Gemäß den Standardprotokollen führt eine erfolgreiche Trennung der mononukleären Tonsorzellen zu hochgereinigten Subpopulationen von BNT-Lymphozyten, was durch durchflusszytometrische Analyse mit anti CD 20 und anti CD zwei Antikörpern zum Nachweis der b- bzw. t-Lymphozytenpopulationen bestätigt wurde. Im Gegensatz dazu führt eine ineffiziente Trennung der mononukleären Zellen zu Zellfraktionen, die eine Mischung von Zellen sowohl aus dem b- als auch aus dem t-Lymphozyten sind. Subpopulationen, DNA und RNA können aus den durch Magnetbeads getrennten b- und t-Lymphozyten für die nachgelagerte Analyse extrahiert werden, wie gerade gezeigt.

So wird hier z.B. der spezifische Nachweis von Adenovirus-DNA in TONSOR T-Lymphozyten, wie er mittels PCR nachgewiesen wurde, von zytoplasmatischer Qualität gezeigt. RNA kann auch aus isolierten Tonsor B NT-Lymphozyten extrahiert werden. Einmal Monster-Zwei-Mandel-Proben können innerhalb von sechs Stunden verarbeitet werden, wenn die Technik richtig angewendet wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Mandelproben so schnell wie möglich zu verarbeiten. Auch die Anzahl der Waschschritte und das Volumen des Waschpuffers sind entscheidende Parameter für ein gutes Ergebnis. Im Anschluss an dieses Verfahren könnten weitere Methoden wie QPCR und R-T-Q-P-C-R durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum quantitativen Vorhandensein von viraler DNA und mRNA nach ihrer Entwicklung zu beantworten.

Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Virologie den Weg, um die Pathogenese und Latenz verschiedener Virusspezies im menschlichen lymphatischen Gewebe zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie BT-Lymphozytenfraktionen aus menschlichen Mandelproben isoliert werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit nicht gesiebten Materialien menschlichen Ursprungs wie Blut und Gewebe äußerst gefährlich sein kann.

Daher sollten angemessene Sicherheitspraktiken befolgt werden.