Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, BNT-Lymphozyten-Fraktionen aus menschlichen Mandelproben zu gewinnen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Virologie zu beantworten, beispielsweise welche Rolle BT-Lymphozyten-Fraktionen bei der Pathogenese viraler Erkrankungen spielen. Innerhalb von drei Stunden nach der chirurgischen Entfernung transportieren Sie das Mandelgewebe in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zum Labor, das mit eiskaltem, sterilen HBSS mit Zusätzen gefüllt ist.

Dann unter Verwendung der geeigneten Biosicherheitsverfahren, die für den Umgang mit menschlichem Gewebe empfohlen werden. Das Gewebe mit frischem, Supplement enthaltendem HBSS befeuchten und die Mandeln in eine 60 Millimeter große Kunststoffzellkulturplatte auf Eis überführen. Mit einer Pinzette alle sichtbaren Blutgerinnsel sowie fetthaltiges und Bindegewebe entfernen und anschließend die Mandeln in eine neue 60 Millimeter große Platte überführen, die fünf Milliliter HBSS mit Supplementen enthält.

Schneiden Sie als Nächstes das Tonsillengewebe in Fragmente von drei bis zehn Millimetern und überführen Sie diese Fragmente mithilfe des Kolbens einer Plastikspritze vorsichtig in einen 100-Mikrometer-Plastikzellsieb in einer neuen 60-Millimeter-Zellkulturplatte, die 10 Milliliter frisches HBSS mit Zusätzen enthält. Pressen Sie die Gewebefragmente durch den Zellsieb, wobei sichergestellt werden muss, dass die Tonsillenfragmente während des gesamten Zerkleinerungsvorgangs vollständig in HBSS eingetaucht bleiben. Entsorgen Sie danach den Sieb und überführen Sie die erhaltene Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Plastikzentrifugenröhrchen auf Eis.

Bringen Sie die Zellsuspension mit frischem HBSS, das Zusatzstoffe enthält, auf ein Endvolumen von 35 Milliliter und geben Sie anschließend 10 Milliliter der dichtegradienten Lösung mit Raumtemperatur in mehrere 50-Milliliter-Konischgefäße. Überlagern Sie die Zellsuspensionen vorsichtig auf die Dichtegradienten, wobei darauf zu achten ist, dass die Lösungen nicht vermischt werden, und trennen Sie die Zellen anschließend durch Zentrifugation. Die mononukleären Zellen sammeln sich als lockere weiße Schicht an der Grenzfläche, während die roten Blutkörperchen, Fibroblasten und Zelltrümmer im Sediment am Boden des Gefäßes verbleiben.

Unter Verwendung einer 10-Milliliter-Pipette sammeln Sie vorsichtig die mononukleäre Zellschicht und überführen die mononukleären Zellen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal mit jeweils 25 Millilitern eiskalter PBS und resuspendieren das endgültige Pellet in 15 Millilitern PBS. Nach der Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen stellen Sie die Zellen auf Eis, um die Tonsor-T-Zellen mittels magnetischer Säulentrennung zu isolieren.

Zentrifugieren Sie die Suspension der mononukleären Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in 80 µL eiskaltem Trennpuffer pro 1 × 10⁷ Zellen. Überführen Sie anschließend die Zellsuspension in ein steriles 2-mL-Röhrchen und inkubieren Sie sie mit 20 µL CD3-Magnetantikörper eine Stunde lang bei 4 °C unter kontinuierlichem, sanftem Mischen. Um die Zellen am Ende der Inkubation in Suspension zu halten, überführen Sie die Zellen in ein 15-mL-Röhrchen, das 5 mL eiskalten Trennpuffer enthält, und waschen Sie sie. Während des Waschschritts befestigen Sie den Magnetseparator am Stativ und setzen eine Säule auf den Magneten.

Waschen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern eiskaltem Trennpuffer und setzen Sie dann einen 40-Mikrometer-Filter auf die Säule. Resuspendieren Sie das Zellpellet nun in 500 Mikrolitern frischem Trennpuffer und geben Sie die Zellen durch den Filter auf die Säule, wobei Sie das B-Zellen-enthaltende EIT in einem 15-Milliliter-Kegelröhrchen sammeln. Zwei bon Eis, wenn alle Zellen in das Sammelröhrchen übergegangen sind.

Spülen Sie die Säule viermal mit jeweils 500 Mikrolitern Separationspuffer pro 1 × 10⁷ Zellen, wobei Sie warten, bis das Säulenreservoir leer ist, bevor Sie die nächste Spülung hinzufügen. Nach der letzten Spülung überführen Sie die Säule in ein neues 15-Milliliter-Sammelröhrchen. Drücken Sie dann mit Hilfe des Säulenstößels 2 Milliliter Separationspuffer durch die Säule in das Röhrchen, um die CD3-positive T-Zell-Fraktion zu sammeln.

Um die isolierten B- und T-Zell-Fraktionen zu analysieren, pelletieren Sie die CD3-positiven und CD3-negativen Zellfraktionen und waschen Sie beide Zellproben nach der zweiten Zentrifugation mit einem Milliliter PBS, ergänzt mit 0,2 % BSA oder PBSA. Geben Sie 100 µL-Aliquote der Zellen in PBSA in die entsprechende Anzahl an Röhrchen für die Färbung und fügen Sie in jedes Röhrchen die geeignete Menge an mit Fluoro 4 konjugiertem monoklonalem oder Kontroll-Antikörper hinzu. Vortexen Sie die Röhrchen anschließend kurz und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Am Ende der Inkubation führen Sie den nächsten Schritt durch.

Waschen Sie die Röhrchen zwei Mal mit frischem PBSA und fixieren Sie die Zellfärbung anschließend mit 1 % Paraformaldehyd, um das Vorhandensein von Adenovirus-DNA in den Zellen mittels PCR nachzuweisen. Führen Sie die PCR-Amplifikation unter geeigneten Zyklenbedingungen durch und trennen Sie die resultierenden PCR-Amplifikationsprodukte in einem 1,5 %igen Agarosegel im EDTA-Puffer. Visualisieren Sie schließlich die entstandenen Banden mit einem geeigneten Nukleinsäurefarbstoff.

Entsprechend Standardprotokollen führt eine erfolgreiche Trennung der tonsoralen mononukleären Zellen zu hochreinen Teilpopulationen von B- und T-Lymphozyten, wie durch die Durchflusszytometrie mit Anti-CD20- und Anti-CD2-Antikörpern zur Detektion der B- und T-Lymphozytenpopulationen bestätigt wurde. Im Gegensatz dazu ergibt eine ineffiziente Trennung der mononukleären Zellen Zellfraktionen, die eine Mischung aus B- und T-Lymphozyten darstellen. Teilpopulationen, DNA und RNA können aus den mittels magnetischen Kügelchen getrennten B- und T-Lymphozyten für nachgeschaltete Analysen extrahiert werden, wie soeben gezeigt.

Beispielsweise wird hier die spezifische Detektion von Adenovirus-DNA in TONSOR-T-Lymphozyten, die mittels PCR nachgewiesen wurde, mit qualitativ hochwertigem zytoplasmatischem RNA-Extrakt gezeigt. RNA kann ebenfalls aus isolierten TONSOR-B-NT-Lymphozyten gewonnen werden. Sobald zwei Mandelproben vorliegen, können diese innerhalb von sechs Stunden verarbeitet werden, sofern die Technik korrekt durchgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Mandelproben so schnell wie möglich zu verarbeiten. Die Anzahl der Waschschritte und das Volumen des Waschpuffers sind ebenfalls kritische Parameter für ein gutes Ergebnis. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie QPCR und R-T-Q-P-C-R durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur quantitativen Präsenz von viraler DNA und mRNA nach ihrer Entwicklung zu beantworten.

Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Virologie den Weg, um die Pathogenese und Latenz verschiedener viraler Spezies in menschlichem lymphatischem Gewebe zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man BT-Lymphozyten-Fraktionen aus menschlichen Mandelproben isoliert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ungeprüften Materialien menschlichen Ursprungs wie Blut und Geweben äußerst gefährlich sein kann.

Daher sollten angemessene Sicherheitsmaßnahmen befolgt werden.