Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mausspermatiden in vier unterschiedliche Populationen zu trennen, um die molekulare Untersuchung der Spermiogenese zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der reproduktiven Biologie zu beantworten, beispielsweise welchen Einfluss die chromatische Modellierung auf die genomische Integrität hat. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine Trennung der Spermien in reinen Zellpopulationen ohne Kreuzkontamination ermöglicht.

Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir wichtige Unterschiede in der DN-Färbungsintensität während der Chromatin-Umgestaltung in haplo-Parametern beobachteten. Am Tag vor der Zellsortierung geben Sie ein bis zwei Milliliter hitzeinaktiviertes FBS zu einem fünf Milliliter fassenden Polypropylen-Rundbodengefäß sowie 15- und 50-Milliliter-Polypropylen-Konischgefäßen hinzu. Anschließend beschichten Sie die Gefäße am nächsten Tag langsam durch Inversion über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rotator.

Das FBS vorsichtig mit einer P-200-Pipette dekantieren, um jegliches restliches FBS aus den 15- und 50-Milliliter-Röhrchen zu entfernen, und ein kleines Restvolumen von 100 bis 200 Mikrolitern FBS in den 5-Milliliter-Röhrchen belassen, um die gereinigten Zellen am Tag der Zellsortierung aufzusammeln. Die verkapselten Teststücke in 500 Mikrolitern Sortierpuffer zerkleinern. Anschließend die Gewebefragmente mit einer abgeschnittenen Mikropipettenspitze in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen.

Spülen Sie die Keimzellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren aus den Samenkanälchen, gefolgt von einem Spülvorgang mit einer intakten Pipettenspitze. Danach verwenden Sie einen 40-Mikron-Zellfilter, um Partikel und Zellklumpen zu entfernen, und sammeln das Filtrat in einem mit FBS beschichteten 50-Milliliter-Konischrohr. Waschen Sie den Filter einmalig mit Sortierpuffer bis zu einem Gesamtvolumen von drei Millilitern aus und überführen Sie das Filtrat in ein mit FBS beschichtetes 15-Milliliter-Konischrohr.

Gegeben Sie anschließend 16 Mikroliter EDTA pro Milliliter Zellsuspension zu den Zellen hinzu und fixieren Sie die Zellen langsam unter leichtem Vortexen mit geringer Geschwindigkeit über eine Minute hinweg mit dem Dreifachen des Volumens eiskalten, 100 %igen Ethanol unter Verwendung einer 10-Milliliter-Pipette; nach der Fixierung wird die Suspension milchig. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten auf Eis, wobei gelegentlich eine Inversion erfolgt. Zentrifugieren Sie danach die Zellsuspension, resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter Sortierpuffer und färben Sie die Keimzellen unmittelbar vor dem Sortieren mit vier Mikrolitern Cyto 16 DNAD.

Filtern Sie die Zellen durch einen 50-Mikron-Filter in ein mit FBS beschichtetes Sammelröhrchen und spülen Sie den Filter gründlich mit ein bis zwei Milliliter Sortierpuffer aus. Geben Sie die fixierten Keimzellen auf einen mit einem 488-Nanometer-Laser ausgestatteten Zellsortierer. Stellen Sie als Nächstes alle Ereignisse in einem Histogramm dar, das die Anzahl der Ereignisse gegenüber der Alexa Fluor 488-Fläche zeigt, und markieren Sie die Zellen mit positiver DNA-Färbung.

Danach werden die Zellen aus diesem Tor in einem Seitenstreuungs-Areal gegen ein Vorwärtsstreuungs-Areal-Diagramm dargestellt und selektioniert. Die entsprechend gekennzeichneten Zellen werden anschließend in einem Vorwärtsstreuungs-Areal gegen ein Alexa Fluor 488-Areal-Diagramm dargestellt und selektioniert. Anschließend werden diese Tore in getrennte Diagramme aus Alexa Fluor 488-Breite gegen Alexa Fluor 488-Areal aufgeteilt.

Die Spermiogenese-Schritte eins bis neun sowie zehn bis zwölf. Anschließend können die Spermatiden zur Sortierung über ein Gatter für die Sammlung der Schritte 13 bis 14 und 15 bis 16 geleitet werden. Die Spermatiden zeigen die Zellen aus dem ersten Gatter in einem Streulichtvorwärtsbereich gegen ein EXOR 4 88 Bereichsdiagramm und Gatter.

Die angegebenen Zellpopulationen. Anschließend diese Tore in einzelnen Alexa Floor 4 88 Breite gegen Alexa Floor 4 88 Flächen-Diagrammen anzeigen und ein Tor setzen.

Die Schritte 13 bis 14 und 15 bis 16 dienen der Spermien-Sortierung. Sammeln Sie abschließend die gereinigten Fraktionen in 100 bis 200 Mikroliter FBS in einzelnen, mit FBS beschichteten 5-Milliliter-Rundbodentuben auf Eis. In diesen Abbildungen ist die DAPI-Färbung der mittels Flusszytometrie sortierten Populationen dargestellt.

Die Spermiogenese-Schritte eins bis neun zeigen typischerweise spermatidäre Kerne mit runder Form, die in der Spermiogenese oval erscheinen. Spermatide im Schritt neun sowie die in den Schritten 10 bis 12 beobachteten zeigen sich als verlängerte Haken. Spermatide in den Spermiogenese-Schritten 13 bis 14 und 15 bis 16 weisen Kerne mit ähnlicher Form auf, jedoch mit leicht unterschiedlicher DNA-Färbungsintensität, wodurch diese verschiedenen Spermienpopulationen während ihrer Sortierung per Durchflusszytometrie identifiziert werden können.

Nach dem dargestellten Protokoll kann die Reinheit der einzelnen experimentellen S-Populationen zwischen 95 und 100 % liegen. Diese Technik kann in sechs bis acht Stunden abgeschlossen werden, sofern jeder Schritt ordnungsgemäß befolgt wird. Es ist darauf zu achten, die Zellen während des gesamten Verfahrens stets auf Eis zu halten. Durch Befolgung dieses Verfahrens können getrennte Populationen von Spermien erhalten werden, was eine ausreichende Menge an Material für molekularbiologische Analysen bereitstellt, beispielsweise zur Charakterisierung des dramatischen Umbauprozesses der Spermien oder zur Untersuchung der genetischen Auswirkungen dieses Übergangs.