Name: Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Sortierung von Maus-Spermatiden in vier reine Populationen. Diese Methode ermöglicht molekulare Studien zur Spermiogenese ohne Kreuzkontamination.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Dr. Leonid Volkov und Éric Bouchard für ihre anwendungstechnische Beratung über Epifluoreszenzmikroskopie danken. Finanzielle Unterstützung Finanziert von der kanadischen Institutes of Health Research (Zuschuss # MOP-93781) zu GB

Tierpflege war in Übereinstimmung mit der Université de Sherbrooke Animal Care und Verwenden Ausschuss. 1. Rohrvorbereitung <ol><li> Am Tag vor der Zellsortierung, 1-2 ml hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) zu 5 ml-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden und auf 15 ml und 50 ml-Polypropylen-konischen Röhrchen. Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass jedes Rohr in der Protokoll ist beschichtet. Hinweis: FBS Beschichtung verhindert Keimzellen vom Kleben an Rohrwänden. </li><li> Langsam Einmischen O / N durch Inversion bei 4 ° C zur Beschichtung der Rohre gleichförmig unter Verwendung eines Rotators. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen FBS aus beschichteten Röhrchen durch Dekantieren. <ol><li> * Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass die 5-ml-Polypropylenrundrohre und die 15 und 50-ml-Röhrchen für Zellzubereitung verwendet (Protokoll Schritte 2,1-2,11) vollständig von FBS zu entleeren, um Fanning (dh ungenaue Abweichung der Seitenströme) zu verhindern. Verwenden Sie ein P200-Pipette, um die FBS zu entfernen. <br/&gt; Hinweis: Rest FBS in Rohren vor dem Sortieren kann zu einem Verlust von Zellen oder Kontamination anderer Rohre während der Zellsortierung verwendet werden, führen, </li><li> Lassen Sie eine kleine Restvolumen von FBS (etwa 100-200 &amp; mgr; l) in der 5 ml-Polypropylen-Rundbodenröhrchen zum Sammeln gereinigten Zellen verwendet. </li></ol></li></ol> 2. Zellpräparation <ol><li> Opfern eine männliche Maus unter Narkose mit O 2 / Isofluran (Induktion bei 5% dann bei 2% gehalten), gefolgt von CO 2 Ersticken. </li><li> Verbrauchsteuern und decapsulate beide Hoden und Hackfleisch mit einer kleinen Schere in 500 ul Sortierpuffer in ein 1,5-ml-Tube. </li><li> Flush Keimzellen aus Samenleiter durch leichtes nach oben und unten Pipettieren in der 1,5-ml-Röhrchen, zuerst mit einer abgeschnittenen 100-1000 ul Spitze, und dann mit einem intakten 100-1000 ul Spitze. </li><li> Entfernen Sie die Ablagerungen und Klumpen von einem Filtrationsschritt unter Verwendung eines 40 &amp; mgr; m Zellsieb und sammeln Filtrat in das 50 ml konischen Röhrchen zurückiously mit FBS in Schritt 1 überzogen. </li><li> Das Filter einmal zu waschen mit Sortierpuffer bis zu einem Gesamtvolumen von 3 ml und Transfer Filtrat in 15 ml konischen Röhrchen zuvor in Schritt 1 beschichtet. </li><li> 16 ul 50 mM EDTA pH 8 pro ml Zellsuspension (48 &amp; mgr; l für 3 ml), um eine Endkonzentration von 0,8 mM EDTA erhalten. </li><li> Um dies zu beheben Keimzellen, langsam 3 Volumina eiskaltem 100% Ethanol mit einem 10-ml-Pipette unter leichtem Schütteln (Vortex bei niedriger Geschwindigkeit), die eine milchige Suspension erzeugt. Kritischer Schritt: Langsame Zugabe Ethanol ist entscheidend und wichtig, um die Integrität der Zellpräparation zu erhalten. Wir haben festgestellt, dass eine schnelle Zugabe von Ethanol verursacht Zelllyse was zu einer großen Abnahme der Sortiereffizienz. Für einen 3 ml Zellsuspension sollte 9 ml Ethanol in ca. 1 min zugefügt werden. </li><li> Inkubieren Zellen auf Eis für 15 min unter gelegentlichem Mischen durch Umdrehen. </li><li> Centrifuge Zellsuspension bei 800 xg für 5 min und entfernen Sie die klareÜberstand. </li><li> Vorsichtig resuspendieren festen Keimzellen in 2 ml Sortierpuffer. </li><li> In 4 ul SYTO16 DNA-Farbstoff (1 mM Lösung in DMSO) und Inkubation für mindestens 30 min (lichtgeschützt). Hinweis: Die besten Ergebnisse werden mit Sortier SYTO16 da es eine durchlässige DNA-Farbstoff, der leicht in die stark verdichteten Kerne von Spermatiden eingebaut erhalten. </li></ol> 3. Cell Sorter einrichten Hinweis: Hier ein 4-Laser (405 nm - violett, 488 nm - blau, 561 nm - gelb-grün, 633 nm - rot) 20-Parameter BDFACSAria III Zellsortierer verwendet. Der BD FACSDiva 6.1.3 Software dient zur Visualisierung und Analyse der Daten. Die Einstellungen können abhängig von der Art von Sortierer variieren. <ol><li> Sterilisieren Sie die FACS-Sorter, indem Sie 70% Ethanol als Mantelflüssigkeit während der Fluidik Shutdown-Vorgang (Menü &quot;Cytometer&quot; in der Software) vor der Sortierung. Wählen Sie &quot;Cytometer&quot; in der Werkzeugleiste der Software und wählen Sie &quot;Fluidic shutdown &quot;. Folgen Sie den durch die Prozesse genannten Schritte. </li><li> Vorzubereiten und zu filtern 1x PBS mit einem 0,22 um-Filter, um jegliche Kristalle und Verunreinigungen zu beseitigen. Füllen der Hülle mit dem oberen Tank Schweißlinie auf der Innenseite des Tanks. </li><li> Starten Sie die Software und melden Sie sich an. Starten Sie den FACS-Sorter, um vor der Sortierung Aufwärmen der Laser für mindestens 30 min. Führen Sie zwei fluidische Startprozesse von den Fluidik spülen, die Ethanol. Wählen Sie &quot;Cytometer&quot; in der Werkzeugleiste der Software und wählen Sie &quot;Fluidic startup&quot;. Befolgen Sie die von den Prozessen genannten Schritte. Hinweis: Diese stellt Fluidik mit normaler Hüllflüssigkeit (1x PBS). </li><li> Reinigen Sie die Sortierblock und die Ablenkplatten mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie gründlich. Beschallen eine 100 &amp; mgr; m Düse in einem Rohr aus destilliertem Wasser für 2 Minuten in einem Ultraschallbad gestellt. Wischen Sie die Düse gründlich. </li><li> Legen Sie die 100 &amp; mgr; m Düse in die Durchflusszelle und drehen Sie die Düse-Verriegelungshebel im Uhrzeigersinn, um die 12-hr Position. Stellen Sie den Mantel Druck auf 20 psi. </li><li> Schalten Sie den Strom und stellen Sie die Amplitude, um Zielwerte für Frequenz (rund 30) zu erhalten, Tropfen 1 (um 150) und Gap (rund 12) und um eine stabile Tröpfchenabbruchmuster (einige Satellitentropfen) zu etablieren. Schalten Sie Dämpfung. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Strom ist gerade und mittig auf dem Abfall Absauger durch Veränderung des Winkels der Art Block. Hinweis: Eine 130 &amp; mgr; m Düse bei 10 psi wurde ebenfalls getestet und kein offensichtlicher Unterschied gefunden wurde. </li><li> Set Laserverzögerung auf 0 für den blauen, -77,39 für den roten, 37,33 für die violetten und -39,85 für die gelb-grünen Lasern. </li><li> Set Bereichen Skalierung auf 1,14 für die blaue, 1,0 für den roten, 0,75 für die violetten und 0,96 für die gelb-grünen Lasern. </li><li> Verwendung eines Test Sort (im Fenster &quot;Nebenstrom&quot; der Software), stellen Sie sicher, dass die Nebenströme nicht schüren. Im Fenster &quot;Nebenstrom&quot;, passen Sie die Schieberegler, Spannungs jeder Nebenstrom, so dass sie die middl getroffene von Testsammelröhrchen. Wenn die Mitte-Stream ist nicht fest, passen Sie die 2., 3., und 4. Tropfen-Einstellungen, um das Zentrum Strom zu begrenzen. </li><li> Starten Sie das Setup-Cytometer und Tracking (CS &amp; T) Anwendung in der Software (Menü &quot;Cytometer&quot;). </li><li> Verwenden Sie die Zytometer Einrichtung und Tracking-Kügelchen bei 1 Tropfen je 350 &amp; mgr; l, um die Charakterisierung und Verfolgung der Zytometer Leistung durch Herstellerangaben zu automatisieren. </li><li> Beenden Sie das CS &amp; T-Anwendung. Übernehmen CS &amp; T-Einstellung sicher, dass die Stromparameter eine stabile Tröpfchenabbruchmuster immer noch erlauben, und schalten Sie den Sweet Spot-Taste nach Herstellerangaben (in der &quot;Abbruchfenster&quot;). </li><li> Optimieren Sie die Tropfen-Verzögerungswert unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen (siehe Tabelle der Materialien). <ol><li> Installieren Sie die Sammelröhrchen in den Halter. Öffnen Sie die Art Blocktür. Im Fenster &quot;Nebenstrom&quot;, schalten Sie Spannung wählen Sie dann &quot;Test-Art &quot;und klicken Sie auf den Aspirator Drawer-Taste, um die Lade zu öffnen und Zugang zu den Sammelröhrchen. </li><li> Optimieren Sie die Seitenströme, so dass sie in die Mitte des Rohres zu gehen. Einstellen von Werten und Schieberegler nach Bedarf. </li><li> Schließen Sie die Art Blocktür und stellen Sie sicher, um die Messuhr anpassen, um die hellsten Perle Ort in der Mitte zu erhalten. Unselect Abfallschublade, Test Art und Spannung. Die Sammelröhrchen zu entfernen. </li><li> Optimieren Sie das Drop-Verzögerung nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Kurz schütteln Wulst Fläschchen kräftig und verdünnter 1 Tropfen Perlen in 0,5 ml PBS. </li><li> Verwenden von Anweisungen des Herstellers, setzen Sie das Drop-Verzögerung mit der Tröpfchenverzögerungs Experiment Vorlage in der Software verfügbar. Alternativ können Sie die Auto-Tropfen-Verzögerungsfunktion, um die Drop Verzögerung einstellen. </li><li> Legen Sie das Rohr des fluoreszierenden Kügelchen und stellen Sie die Durchflussrate, bis die Schwellenwertrate ist ~ 3000 bis 4000 Ereignisse / Sekunde. Legen Sie die Sortiergenauigkeit zu &quot;Initial&quot; und letztely zur &quot;Feinabstimmung&quot; im Fenster &quot;Layout Sortieren&quot;. Wählen Sie das optische Filter und Sortier Perlen. Stellen Sie die Drop-Verzögerung, bis ~ 100% werden nach links sortiert. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass Zellen von Interesse Art in einem Seitenstrom. Die Kügelchen und das optische Filter verwendet Nähe einer 100% Tröpfchenabweichung zu erzielen. </li></ol></li></ol></li><li> Legen Sie eine FSC 1.5 ND (Neutraldichte-Filter) am linken Ende des FSC Detektorblock. Stellen Sie das Fenster-Erweiterung bis 2,00 &amp; mgr; s und der FSC Bereich Skalierung auf 1,00 (im Register &quot;Laser&quot; im Fenster &quot;Cytometer&quot;). </li><li> Vor dem Laden Probenröhrchen, legen Sie eine Probe Filterlinie von 50 um am Ende der Probenleitung, um Klumpenbildung zu vermeiden. Um dies zu tun, wählen Sie &quot;Ändern Probe Filter&quot; im Menü &quot;Cytometer&quot;. </li><li> Testen der Zusammensetzung der Probenflüssigkeit, um eine gute Trennung ohne Auffächern zwischen den Seitenstrom zu erreichen und um die Zellen ein Anhaften an die Polypropyle verhindernne Rohre. <ol><li> Laden Sie das Probenröhrchen, schalten Sie den Ablenkplatten und wählen Sie &quot;Test Art&quot; mit die Schublade geschlossen ist. Schauen Sie sich Seitenströme, wenn die Trennung erfolgt, ohne zu viel Fanning. Anmerkung: Fanning wahrscheinlich aufgrund einer hohen Proteinkonzentration in der Probenpuffer. </li></ol></li><li> Laden Sie das Probenröhrchen in die FACS-Instrument. Wählen einer Probe Rühren mit 300 Umdrehungen pro Minute und einer Probentemperatur von 4ºC. Wählen Sie &quot;Acquire Data&quot; in der &quot;Acquisition-Dashboard&quot;. </li><li> Wenn nötig, verdünnen die Probe, um einen geeigneten Ereignisrate auf maximal 5.000 Veranstaltungen / s (bei einer maximalen Durchflussrate von 3,0) zu erreichen. Streng an diese Grenzen, so daß die Reinheit der sortierten Zellen aufrechtzuerhalten. </li><li> Zu analysieren und zu sortieren, die Zellen, die Optimierung der FSC Schwellenwert, um Schmutz, ohne sich mit der Bevölkerung von Interesse zu beseitigen. Im logarithmischen Maßstab, damit Einstellung der Spannung der Photomultiplierröhre (PMT) Detektor mit dem 530/30 Filtersicher, dass das Fluoreszenzsignal der Gesamtbevölkerung passt innerhalb der Skala und Gate auf dem positiven Population (Abbildung 1, Gate 1). </li><li> Produzieren eine Forward Scatter-Bereich (FSC-A) / Side Scatter-Bereich (SSC-A) Plot des SYTO16 positive Bevölkerung und stellen Sie die FSC-A auf etwa 110 V im linearen Skala und die SSC-A auf etwa 150 V im logarithmischen Maßstab, um alle Ereignisse zu visualisieren, während ohne sehr große Zellen und Zellaggregate. </li><li> Im Fenster &quot;Sortieren Layout&quot;, stellen Sie den &quot;Sortieren Präzisionsmodus&quot; auf &quot;4-Wege-Reinheit&quot; (Yield Maske: 0, Reinheit Maske: 32, Phasenmaske: 0). Wählen Sie aus dem Menü &quot;Ziel-Events&quot; für die kontinuierliche Sortierung &quot;Continuous&quot;. </li><li> Hinzufügen Populationen auf dem Gebiet entsprechend den Rohren zu sortieren (im Fenster &quot;Sort Layout&quot;). Stelle Populationen mit höheren Frequenzen in der Mitte und die mit niedrigeren Frequenzen an den Enden. Stellen Sie die Spannungsplatten bis 2500 V. Bei Sortierung, halten Sie die Probensammlung tUBEs auf Eis. </li></ol> 4. Zellsortierung <ol><li> Unmittelbar vor dem Sortieren, Filterzellen unter Verwendung eines Filters 50 &amp; mgr; m in einem zuvor beschichteten 5 ml Polypropylen-Rundrohr. </li><li> Den Filter ausgiebig waschen mit 1-2 ml Sortierpuffer. </li><li> Sortieren festen Keimzellen unter Verwendung eines 488 nm-Laser ausgestattetes Zellsortierer nach dem Gating-Schema in Abbildung 1 beschrieben. Collect gereinigten Fraktionen in 5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen zuvor in Abschnitt 1 auf Eis überzogen. <ol><li> Sicherstellen, dass 100-200 ul FBS in den Sammelröhrchen gehalten werden, um ein Verkleben der sortierten Zellen an der Rohrwand zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Konzentration von SYTO16 wird sättigen, um Fluoreszenzfluktuationen während des Sortierzeit zu vermeiden. SYTO16 wird sättigt, wenn es keine weitere Veränderung der Zellfärbung Intensität am Alexa Fluor 488-Parameter (DNA-Färbung) in den Sortier Grafik. Falls erforderlich, fügen 1 ulSYTO16 zur Sortierrohr, um eine Sättigung zu erreichen. </li><li> Zeigen Sie die Gesamt Veranstaltungen auf einer grafischen Anzeige der folgenden Parameter: Anzahl der Ereignisse vs Alexa Fluor 488-A. </li><li> Wählen Sie die positive DNA-Färbung Zellen mit Gate 1, wie in Abbildung 1 dargestellt. <ol><li> Anzeigezellen von Tor 1 auf einer Grafik mit SSC-A vs FSC-A als Parameter <ol><li> Markieren Sie die Zellen mit Gate 2, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li><li> Display-Zellen von Gate 2 auf einer Grafik mit FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als Parameter. </li><li> Wählen Sie Zellen mit Gate 5 und Gate 6 am Gate 2 grafik, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li><li> Separat Gate 5 und Gate 6 Anzeige auf Grafiken mit Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als Parameter. </li><li> Wählen Spermiogenese Schritte 1-9 Spermatiden auf dem Gate 5 Grafik und Spermiogenese Schritte 10-12 Spermatiden auf dem Gate 6 Grafiken, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li></ol></li><li> AnzeigenZellen von Tor 1 auf einer Grafik mit FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als Parameter <ol><li> Wählen Sie Zellen mit Tor 3 und Tor 4, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li><li> Separat Tor 3 und Tor 4 Zeigen Sie auf Grafiken mit Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als Parameter. </li><li> Wählen Spermiogenese Schritte 13-14 Spermatiden auf dem Gate 3 Grafik und Spermiogenese Schritte 15-16 Spermatiden auf dem Gate 4 grafik, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+fertile+sperm+from+murine+spermatogonial+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines.</a> Nat. Commun. 2, 472(2011).</li>
<li>Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+actin+and+myosin+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">The role of actin and myosin during spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+junction+dynamics+in+the+testis%3A+Sertoli-germ+cell+interactions+and+male+contraceptive+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development.</a> Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).</li>
<li>Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+the+murine+testis+during+the+first+wave+of+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+during+chromatin+remodeling+in+elongating+spermatids+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice.</a> Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).</li>
<li>Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+transition+nuclear+proteins+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis.</a> Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).</li>
<li>Grégoire, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-driven+de+novo+mutations+in+haploid+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Male-driven de novo mutations in haploid germ cells.</a> Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).</li>
<li>Simard, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+trinucleotidic+repeats+during+chromatin+remodeling+in+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids.</a> Hum. Mutat. , (2014).</li>
<li>Wykes, S. M., Krawetz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+spermatogenic+cells+from+adult+transgenic+mouse+testes+using+unit-gravity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation.</a> Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).</li>
<li>Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+throughout+the+first+wave+of+spermatogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat.</a> Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+specific+stages+of+spermatids+from+vitamin+A-synchronized+rat+testes+for+assessment+of+nucleoprotein+changes+during+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis.</a> Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).</li>
<li>van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+the+seminiferous+epithelium+after+vitamin+A+replacement+in+vitamin+A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice.</a> Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Kovtun, I. V., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+expansion+in+haploid+germ+cells+by+gap+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair.</a> Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).</li>
<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li>
<li>Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+method+to+isolate+round+spermatids+from+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis.</a> Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Spermatogenen Zellen waren schon immer eine Herausforderung, angesichts der Komplexität der Keimepithel sowie den begrenzten Erfolg der In-vitro-Kultur zu studieren. Im Laufe der Jahre sind viele Ansätze zur Reinigung von Keimzellen aus verschiedenen Spezies entwickelt. Sedimentation Techniken unter Verwendung von Schwerkraftaufbereitung mit Percoll oder Rinderserumalbumin Gradienten bieten in der Regel eine gute Ausbeute an intakten Keimzellen, aber nicht über angemessene Definition zwischen einigen Zelltypen ...

Haploide runde Spermatiden differenzieren sich durch einen Prozess, der Spermiogenese genannt wird, zu Spermien. Dies umfasst viele verschiedene Schritte, darunter die Anschaffung eines Flagellums, den Umbau des Chromatins und des Zytoskeletts, die Kondensation des Zellkerns sowie den Verlust des größten Teils des Zytoplasmas. Diese einzigartigen zellulären Ereignisse müssen fein reguliert werden, um einen reifen funktionsfähigen Gameten mit einem intakten Genom zu erzeugen, das für die Befruchtung geeignet ist. Die Spermiogenese kann in vitro kaum untersucht werden, da kein zuverlässiges Zellkultursystem bisher in der Lage ist, das Fortschreiten durch die verschiedenen Prozessschritte zu unterstützen. Darüber hinaus führen die derzeitigen In-vitro-Techniken zu einer schlechten Ausbeute1,2. In vivo sind korrekte Übergänge durch die verschiedenen Schritte der Spermiogenese entscheidend für die natürliche funktionelle Integrität der männlichen Gameten. Eine erfolgreiche Reinigung der Spermatiden nach ihren Differenzierungsschritten wurde noch nie mit einem ausreichenden Anreicherungsgrad erreicht, um eine molekulare Charakterisierung der Spermiogenese zu ermöglichen. Zum Beispiel wäre die Reinigung von Schlüsselschritten der spermatiden Differenzierung besonders nützlich, um das sich entwickelnde Akrosom, die Bildung des Mittelstücks3, die Zellübergangsdynamik4, die RNA-Dynamik5, den Chromatin-Umbauprozess6,7 oder die genomische Stabilität8 zu untersuchen. Die Reinigung der Spermatiden wurde durch ihre fortschreitende morphologische Transformation, das Fehlen bekannter stadienspezifischer externer Biomarker und ihre eigentümliche Form und Größe behindert. 
Obwohl die meisten männlichen Keimzellen eine direkte Beziehung zwischen DNA-Färbung und Ploidie (DNA-Gehalt) aufweisen, haben wir festgestellt, dass eine solche positive Korrelation nicht mehr auf Spermatiden anwendbar ist. Dies beruht auf unserer frühen Beobachtung, dass Schnitte aus Samenkanälchen eine unterschiedliche Intensität der DNA-Färbung über die verschiedenen Schritte der Spermiogenese hinweg aufweisen. Obwohl die DNA-Färbung mit ihrem haploiden Chromosomensatz aus den Spermiogenese-Schritten 1 bis 7 (runde Spermatiden) übereinstimmt, beobachteten wir einen starken Anstieg der Fluoreszenzintensität mit DAPI oder SYTO 16 um den Beginn der Kernreorganisation und des Chromatin-Remodells (Spermiogenese Schritt 8), der einen Höhepunkt zu Beginn der Kernkondensation erreichte (Spermiogenese Schritte 11-12). Nach der Kondensation des Zellkerns nimmt die Intensität der DNA-Färbung bis zur Spermierung ab (Spermiogenese Schritt 16). Wir vermuteten, dass dies wahrscheinlich mit der Bildung ihres eigentümlichen Chromatinstrukturübergangs zusammenhängt, bei dem Histone durch Protamine ersetzt werden. Wir haben daher eine zuverlässige Durchflusszytometrie-Methode entwickelt, die die Trennung von Spermatiden ermöglicht, wobei die Variation der DNA-Intensität der Spermatiden als Hauptselektionsparameter verwendet wird.
Ein einfacher Durchflusszytometrie-Ansatz wird beschrieben, um Mausspermatiden mit hoher Reinheit (95-100%) basierend auf ihrem scheinbaren DNA-Gehalt (SYTO16-Färbung), ihrer Größe und Granulosität zu trennen. Die Spermatiden werden in vier Populationen unterteilt; Spermiogenese Schritte 1-9, 10-12, 13-14 und 15-16. Aufgereinigte Spermatide eignen sich sowohl für genetische/genomische Analysen als auch für proteomische Anwendungen, wie in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung unserer Gruppe9 beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Isofluran</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>Für die Mausanästhesie vor der Euthanasie</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>Für die Tubenbeschichtung</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>Für die Sortierpuffervorbereitung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>Für die Sortierpuffervorbereitung</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td></td><td>092-09-11N</td><td>Für die Zellfixierung</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>DNA-Färbung</td></tr><tr><td>5 ml Röhrchen aus Polypropylen mit rundem Boden</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Sammlung von sortierten Zellen</td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>TEC4 Anästhesie-Vaporizer</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>Für die Euthanasie von Mäusen</td></tr><tr><td>CO2 Gastank</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>Für die Euthanasie von Mäusen</td></tr><tr><td>O2 Gastank</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>Für die Euthanasie von Mäusen</td></tr><tr><td>Hausgemachte Mäusegaskammer</td><td></td><td></td><td>Für die Euthanasie von Mäusen</td></tr><tr><td>40 & micro; m Falcon Zellsieb</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m Probenleitungsfilter</td><td>BD Biosciences</td><td>649049 Vortex-Mischer</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>Für die Zellfixierung</td></tr><tr><td>Dynac Zentrifuge</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &micro; m Filter</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser-euipped Zellsortierer</td><td>BD</td><td>Biosciences FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Fluoreszierende Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Sortierpuffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8,0, 25 mM HEPES pH 7,0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS ist hitzeinaktiviert. Frische Lösung herstellen, 0,22 &mu; m filtriert und bei 4°C aufbewahren.</td></tr></tbody></table>

schritt spezifische sortierung der maus spermatiden durch durchflusszytometrie

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Die Differenzierung der Maus Spermatiden eines kritischen Verfahren zur Herstellung einer funktionellen männlichen Keimzellen mit intakter Genoms auf die nächste Generation übertragen werden. Bisher wurden molekulare Studien dieser morphologischen Übergang durch das Fehlen eines Verfahrens ermöglicht eine angemessene Trennung dieser wichtigen Schritte spermatid Differenzierung für nachfolgende Analysen behindert. Frühere Versuche zur richtigen Gating dieser Zellen mittels Durchflusszytometrie kann schwierig gewesen, weil der eine eigentümliche Steigerung der DNA-Fluoreszenz in Spermatiden unterziehen Chromatin-Remodeling. Basierend auf dieser Beobachtung, bieten wir die Details eines einfachen Durchflusszytometrie Schema, wodurch reproduzierbare Reinigung von vier Populationen mit Ethanol fixiert Maus Spermatiden, die jeweils einen anderen Zustand in der Kernumbauprozess. Bevölkerung Anreicherung mit Schritt-spezifische Marker und morphologischen Kriterien bestätigt. Die gereinigten Spermatiden für Genom- und Proteom verwendet werdenic-Analysen.

Gating-Strategie mit der Durchflusszytometrie verwendet Abbildung 1 stellt die Gating-Strategie in der Durchflusszytometrie verwendet werden, um vier hochreine spermatid Populationen zu sortieren. Kurz gesagt, Zellen mit positiven DNA-Färbung (Alexa Fluor 488-A) zunächst mit Tor 1. Spermatiden von Spermiogenese Schritte 1-12 ausgewählt sind (Tor 2) auf einer Punkt-Diagramm, das die granulosity (SSC-A) vs Größe...

Wir beschreiben eine Sortierstrategie für Mausspermatiden mittels Durchflusszytometrie. Die Spermatiden werden in vier hochreine Populationen eingeteilt, darunter runde (Spermiogenese-Schritte 1-9), früh-elongierende (Spermiogenese-Schritte 10-12), spät-elongierende (Spermiogenese-Schritte 13-14) und längliche Spermatiden (Spermiogenese-Schritte 15-16). DNA-Färbung, Größe und Granulosität werden als Selektionsparameter verwendet.

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mausspermatiden in vier unterschiedliche Populationen zu trennen, um die molekulare Untersuchung der Spermiogenese zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der reproduktiven Biologie zu beantworten, beispielsweise welchen Einfluss die chromatische Modellierung auf die genomische Integrität hat. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine Trennung der Spermien in reinen Zellpopulationen ohne Kreuzkontamination ermöglicht.Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir wichtige Unterschiede in der DN-Färbungsintensität während der Chromatin-Umgestaltung in haplo-Parametern beobachteten. Am Tag vor der Zellsortierung geben Sie ein bis zwei Milliliter hitzeinaktiviertes FBS zu einem fünf Milliliter fassenden Polypropylen-Rundbodengefäß sowie 15- und 50-Milliliter-Polypropylen-Konischgefäßen hinzu. Anschließend beschichten Sie die Gefäße am nächsten Tag langsam durch Inversion über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rotator.Das FBS vorsichtig mit einer P-200-Pipette dekantieren, um jegliches restliches FBS aus den 15- und 50-Milliliter-Röhrchen zu entfernen, und ein kleines Restvolumen von 100 bis 200 Mikrolitern FBS in den 5-Milliliter-Röhrchen belassen, um die gereinigten Zellen am Tag der Zellsortierung aufzusammeln. Die verkapselten Teststücke in 500 Mikrolitern Sortierpuffer zerkleinern. Anschließend die Gewebefragmente mit einer abgeschnittenen Mikropipettenspitze in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen.Spülen Sie die Keimzellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren aus den Samenkanälchen, gefolgt von einem Spülvorgang mit einer intakten Pipettenspitze. Danach verwenden Sie einen 40-Mikron-Zellfilter, um Partikel und Zellklumpen zu entfernen, und sammeln das Filtrat in einem mit FBS beschichteten 50-Milliliter-Konischrohr. Waschen Sie den Filter einmalig mit Sortierpuffer bis zu einem Gesamtvolumen von drei Millilitern aus und überführen Sie das Filtrat in ein mit FBS beschichtetes 15-Milliliter-Konischrohr.Gegeben Sie anschließend 16 Mikroliter EDTA pro Milliliter Zellsuspension zu den Zellen hinzu und fixieren Sie die Zellen langsam unter leichtem Vortexen mit geringer Geschwindigkeit über eine Minute hinweg mit dem Dreifachen des Volumens eiskalten, 100 %igen Ethanol unter Verwendung einer 10-Milliliter-Pipette; nach der Fixierung wird die Suspension milchig. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten auf Eis, wobei gelegentlich eine Inversion erfolgt. Zentrifugieren Sie danach die Zellsuspension, resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter Sortierpuffer und färben Sie die Keimzellen unmittelbar vor dem Sortieren mit vier Mikrolitern Cyto 16 DNAD.Filtern Sie die Zellen durch einen 50-Mikron-Filter in ein mit FBS beschichtetes Sammelröhrchen und spülen Sie den Filter gründlich mit ein bis zwei Milliliter Sortierpuffer aus. Geben Sie die fixierten Keimzellen auf einen mit einem 488-Nanometer-Laser ausgestatteten Zellsortierer. Stellen Sie als Nächstes alle Ereignisse in einem Histogramm dar, das die Anzahl der Ereignisse gegenüber der Alexa Fluor 488-Fläche zeigt, und markieren Sie die Zellen mit positiver DNA-Färbung.Danach werden die Zellen aus diesem Tor in einem Seitenstreuungs-Areal gegen ein Vorwärtsstreuungs-Areal-Diagramm dargestellt und selektioniert. Die entsprechend gekennzeichneten Zellen werden anschließend in einem Vorwärtsstreuungs-Areal gegen ein Alexa Fluor 488-Areal-Diagramm dargestellt und selektioniert. Anschließend werden diese Tore in getrennte Diagramme aus Alexa Fluor 488-Breite gegen Alexa Fluor 488-Areal aufgeteilt.Die Spermiogenese-Schritte eins bis neun sowie zehn bis zw&ouml;lf. Anschlie&szlig;end k&ouml;nnen die Spermatiden zur Sortierung &uuml;ber ein Gatter f&uuml;r die Sammlung der Schritte 13 bis 14 und 15 bis 16 geleitet werden. Die Spermatiden zeigen die Zellen aus dem ersten Gatter in einem Streulichtvorw&auml;rtsbereich gegen ein EXOR 4 88 Bereichsdiagramm und Gatter.Die angegebenen Zellpopulationen. Anschließend diese Tore in einzelnen Alexa Floor 4 88 Breite gegen Alexa Floor 4 88 Flächen-Diagrammen anzeigen und ein Tor setzen.Die Schritte 13 bis 14 und 15 bis 16 dienen der Spermien-Sortierung. Sammeln Sie abschließend die gereinigten Fraktionen in 100 bis 200 Mikroliter FBS in einzelnen, mit FBS beschichteten 5-Milliliter-Rundbodentuben auf Eis. In diesen Abbildungen ist die DAPI-Färbung der mittels Flusszytometrie sortierten Populationen dargestellt.Die Spermiogenese-Schritte eins bis neun zeigen typischerweise spermatidäre Kerne mit runder Form, die in der Spermiogenese oval erscheinen. Spermatide im Schritt neun sowie die in den Schritten 10 bis 12 beobachteten zeigen sich als verlängerte Haken. Spermatide in den Spermiogenese-Schritten 13 bis 14 und 15 bis 16 weisen Kerne mit ähnlicher Form auf, jedoch mit leicht unterschiedlicher DNA-Färbungsintensität, wodurch diese verschiedenen Spermienpopulationen während ihrer Sortierung per Durchflusszytometrie identifiziert werden können.Nach dem dargestellten Protokoll kann die Reinheit der einzelnen experimentellen S-Populationen zwischen 95 und 100 % liegen. Diese Technik kann in sechs bis acht Stunden abgeschlossen werden, sofern jeder Schritt ordnungsgemäß befolgt wird. Es ist darauf zu achten, die Zellen während des gesamten Verfahrens stets auf Eis zu halten. Durch Befolgung dieses Verfahrens können getrennte Populationen von Spermien erhalten werden, was eine ausreichende Menge an Material für molekularbiologische Analysen bereitstellt, beispielsweise zur Charakterisierung des dramatischen Umbauprozesses der Spermien oder zur Untersuchung der genetischen Auswirkungen dieses Übergangs.

step-specific-sorting-of-mouse-spermatids-by-flow-cytometry

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine effiziente Methode, um hochreine lebensfähig meiotischen Fraktionen aus Maus Hoden zu erhalten, ist beschrieben, die vereint ein raffiniertes Zelle Dissoziation Protokoll mit fluoreszierenden activated cell sorting (FACS). Diese Methode nutzt die Unterschiede in der DNA-Gehalt und nukleare Dichte der diskreten meiotischen Fraktionen.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

Ein neuartiges Protokoll für die mechanische Aufbereitung von Hoden Zellsuspensionen von Nagetier Material, die Vermeidung Enzyme und Reinigungsmittel, beschrieben. Das Verfahren ist sehr einfach, schnell, reproduzierbar und macht gute Qualität Zellsuspensionen, die sich für Durchfluss Sortier-und RNA-Extraktion sind.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Die STA-PUT Verfahren ermöglicht die Trennung der verschiedenen Populationen von Zellen spermatogenic basierend auf Größe und Dichte.

Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation

Meiose ist der Entwicklungsprozess durch den Gameten durch eine einzelne Runde der DNA-Replikation und zwei aufeinanderfolgenden Runden Chromosom Segregation gebildet werden. Säugetier-Meiose kann untersucht werden, durch die Verwendung einer Technik um meiotische Chromosomen breitet sich vorzubereiten. Hier zeigen wir einen Weg der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.

Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten

Diese Arbeit beschreibt die Standardisierung eines Verfahrens, um gereinigte Keimzellpopulationen aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten zu erhalten. Es ist ein einfaches Protokoll, das mechanische Hodendissoziation, Färbung mit Hoechst-33342 und Propidiumjodid und FACS-Sortierung kombiniert, mit breiten Anwendungen in vergleichenden Studien der männlichen Fortpflanzungsbiologie.

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Präsentiert hier ist ein Protokoll zur Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten, runden Spermaatien und lästigen Spermaatiden aus erwachsenen Maushoden mit einem diskontinuierlichen Rinderserum-Albumin-Dichtegradienten mit Standard-Laborgeräten.

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Dieser Artikel berichtet über eine in vivo Hemmung von CENP-E durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK923295, einem wertvollen Modell für die männliche meiotische Teilung. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Durchflusszytometrie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Assays zeigen wir, dass die CENP-E-Hemmung zu Chromosomenfehlstellungen und Genominstabilität in Mausspermatozyten führt.

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Hier stellen wir eine Methode zur Durchführung der runden Spermatideninjektion (ROSI) bei Mäusen vor, eine Technik mit vielversprechenden klinischen Anwendungen und Nutzen für die Untersuchung der Mechanismen, die der Embryonalentwicklung zugrunde liegen.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Sortierung von Maus-Spermatiden in vier reine Populationen. Diese Methode ermöglicht molekulare Studien zur Spermiogenese ohne Kreuzkontamination.

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

Weitere Videos entdecken