Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Spermatiden der Maus in vier verschiedene Populationen zu unterteilen, was die molekulare Untersuchung der Spermiogenese ermöglicht. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Spiegelreproduktion zu beantworten, wie z.B. welchen Einfluss die chromatische Modellierung auf die genomische Integrität hat. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Trennung der Spermien in reine Zellpopulationen ohne Kreuzkontamination ermöglicht.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir am Tag vor der Zellsortierung wichtige Schwankungen in der Intensität der DN-Färbung während des Chromatin-Remodeling in Haplo-Parametern beobachteten. Geben Sie ein bis zwei Milliliter hitzeinaktiviertes FBS in Fünf-Milliliter-Polypropylen-Rundboden-Röhrchen und 15- und 50-Milliliter-Polypropylen-Konusröhrchen. Als nächstes beschichten Sie die Röhren langsam durch Inversion über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rotator am nächsten Tag.

Dekantieren Sie das FBS vorsichtig mit einer P 200-Pipette, um alle FBS-Reste aus den 15- und 50-Milliliter-Röhrchen zu entfernen, und lassen Sie ein kleines Restvolumen von 100 bis 200 Mikrolitern FBS in den fünf Milliliter-Röhrchen, um die gereinigten Zellen am Tag der Zelle zu sammeln. Sortieren, die verkapselten Prüflinge in 500 Mikrolitern Sortierpuffer zerkleinern. Übertragen Sie dann die Gewebefragmente mit einer abgeschnittenen Mikropipettenspitze in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie die Keimzellen aus den Samenkanälchen durch sanftes Auf- und Ab-Pipettieren, gefolgt von einer Spülung mit intakter Spitze. Verwenden Sie anschließend ein 40-Mikron-Zellsieb, um die Ablagerungen und Klumpen zu entfernen, die das Filtrat in einem FBS-beschichteten konischen 50-Milliliter-Röhrchen sammeln. Waschen Sie den Filter einmal mit Sortierpuffer bis zu einem Gesamtvolumen von drei Millilitern und füllen Sie das Filtrat in ein FBS-beschichtetes 15 Milliliter konisches Rohr um.

Geben Sie dann 16 Mikroliter EDTA pro Milliliter Zellsuspension zu den Zellen und fixieren Sie die Zellen mit einer 10-Milliliter-Pipette langsam über eine Minute mit drei Volumina eiskaltem, 100%igem Ethanol, während Sie bei niedriger Geschwindigkeit vortexen, die Suspension wird nach der Fixierung milchig. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis mit gelegentlicher Inversion. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension, resuspendieren Sie die Palette in zwei Millilitern Sortierpuffer und färben Sie die Keimzellen unmittelbar vor der Sortierung mit vier Mikrolitern Cyto 16 DNAD.

Filtern Sie die Zellen durch einen 50-Mikron-Filter in ein FBS-beschichtetes Faxrohr und waschen Sie den Filter ausgiebig mit ein bis zwei Millilitern Sortierpuffer. Laden Sie die fixierten Keimzellen auf einen mit 488 Nanometern Laser ausgestatteten Zellsortierer. Zeigen Sie als Nächstes die Gesamtzahl der Ereignisse mit einem Histogramm an, das die Anzahl der Ereignisse im Bereich der Alexa-Etage 4 88 darstellt, und blenden Sie die positiven DNA-Färbezellen ein.

Zeigen Sie dann die Zellen von diesem Gate in einem seitlichen Streubereich gegen ein Verteilungsflächendiagramm und -gate nach vorne an. Die Zellen, wie angegeben, zeigen diese Gated Cells in einem Vorwärtsstreubereich gegen einen Alexa-Floor 4 88 Bereich, Plot und Gate an. Die Zellen zeigen diese Gatter dann wieder in separaten Alexa-Etage 4 88 Breite gegen Alexa-Etage 4 88 Flächendiagramme an.

Die Spermiogenese verläuft in den Schritten eins bis neun und 10 bis 12. Die Spermatiden können dann für die Sortierung gesperrt werden, um die Schritte 13 bis 14 und 15 bis 16 zu sammeln. Spermatiden zeigen die Zellen vom ersten Gate in einen Vorwärtsstreubereich vor einem EXOR 4 88 Flächendiagramm und -gate.

Die Zellpopulationen wie angegeben. Zeigen Sie diese Tore dann in der individuellen Alexa an. Etage 4 88 Breite gegen Alexa Etage 4 88 Fläche Grundstücke und Tor.

Die Schritte 13 bis 14 und 15 bis 16 Spermien zum Sortieren. Sammeln Sie abschließend die gereinigten Fraktionen in 100 bis 200 Mikrolitern FBS in einzelnen FBS-beschichteten fünf Milliliter Rundbodenröhrchen auf Eis. In diesen Bildern ist die Färbung der strömungssortierten Smitted-Populationen zu sehen.

Die Spermiogeneseschritte eins bis neun weisen typischerweise runde Kerne auf, die in der Spermiogenese oval erscheinen. Schritt neun Spermatiden, die in den Schritten 10 bis 12 als längliche Haken beobachtet werden. Spermatiden Spermiogenese Schritte 13 bis 14 und 15 bis 16 Spermatiden weisen Zellkerne mit ähnlicher Form auf, jedoch mit einer leicht unterschiedlichen DNA-Färbeintensität, was es ermöglicht, diese unterschiedlichen Sper-Populationen bei ihrer Sortierung durch Durchflusszytometrie zu identifizieren.

Nach dem demonstrierten Protokoll kann mit einer Reinheit der einzelnen S-experimentierten Populationen zwischen 95 und 100 % gerechnet werden. Diese Technik kann in sechs bis acht Stunden abgeschlossen werden. Wenn jeder Schritt richtig befolgt wird. Es ist daran zu denken, die Zellen während des gesamten Verfahrens immer auf Eis zu halten, indem man dieses Verfahren befolgt, um unterschiedliche Populationen von Spermien zu erhalten, die eine ausreichende Menge an Material für die molekulare Analyse bereitstellen, wie z.B. die Charakterisierung des dramatischen Umbauprozesses oder die Untersuchung der genetischen Auswirkungen dieses Übergangs.