Quantifizierung der Lebensspanne von Wirbellosen

Experimente zur Quantifizierung der Lebensdauer ermöglichen es Wissenschaftlern, die genetischen und umweltbedingten Einflüsse auf die Lebensdauer eines Organismus zu untersuchen. Wirbellose Modellorganismen wie die Fruchtfliege Drosophila melanogaster und der Fadenwurm Caenorhabditis elegans haben sich in dieser Hinsicht als äußerst nützlich erwiesen. Durch Experimente, die die Lebensdauer in diesen Organismen messen und manipulieren, haben Wissenschaftler begonnen, die Faktoren herauszuarbeiten, die den Alterungsprozess beeinflussen.

In diesem Video erfahren Sie mehr über einige Prinzipien der Lebensdauer und des Alterns, grundlegende Protokolle zur Messung der Lebensdauer des Wurms und der Fruchtfliege und die Art und Weise, wie diese Experimente angewendet werden.

Bevor wir uns die experimentellen Verfahren zur Messung der Lebensdauer ansehen, ist es wichtig, zunächst zu verstehen, was Lebensdauer und Alterung ist.

Die Lebensspanne ist die Zeitspanne, die ein Organismus zwischen Geburt und Tod lebt und funktioniert. Einige Organismen, wie viele Pflanzen, könnten theoretisch ewig leben. In der Zwischenzeit würden die meisten Tiere auf natürliche Weise aufhören zu wachsen, selbst unter idealen Bedingungen, danach altern sie oder “altern” bis zum Tod.

Wissenschaftler verstehen noch nicht ganz, warum Organismen altern. Es wird vermutet, dass verschiedene Faktoren, darunter Strahlung und chemische Schäden aus der Umwelt sowie giftige Nebenprodukte aus unseren eigenen Stoffwechselprozessen, eine Rolle beim Altern spielen.

Um diese Faktoren zu untersuchen, haben sich die Forscher die kurzen Generationszeiten von wirbellosen Modellorganismen wie Würmern und Fliegen zunutze gemacht, die es den Wissenschaftlern ermöglichen, mehrere Generationen über Tage oder Wochen zu beobachten, anstatt wie im Fall von Säugetiermodellen wie Mäusen. Sie sind auch sehr anfällig für genetische Manipulationen, mit vielen verfügbaren Werkzeugen, die es ermöglichen, bestimmte Gene einfach ein- oder auszuschalten, um ihre Auswirkungen auf den Alterungsprozess zu beobachten.

Nachdem wir nun gelernt haben, warum wirbellose Modelle sehr gut für Alterungsstudien geeignet sind, schauen wir uns an, wie Experimente zur Messung der Lebensdauer bei Würmern durchgeführt werden. Kurz gesagt, diese Experimente umfassen das Sammeln von Elternwürmern, die Synchronisierung des Alters ihrer Nachkommen, die Behandlung von Larvenwürmern mit einem Medikament, um die Fortpflanzung zu hemmen, und schließlich das Übertragen von Würmern auf Testplatten und das Zählen von Würmern, die tot oder lebendig sind.

Zu Beginn des Verfahrens ist es notwendig, eine ausreichende Anzahl von Tieren im gleichen Alter zu erhalten, indem eine Charge von Würmern mit allen Eiern gleichzeitig synchronisiert wird. Zu diesem Zweck werden die ersten Würmer etwa eine Woche lang auf derselben Kulturplatte belassen, so dass sie alle verfügbare Nahrung zu sich nehmen können und dadurch Hunger auslösen. Einige der Wurmlarven, die ausgehungert werden, geraten in einen robusten, wachstumsgehemmten Zustand, der “Dauer” genannt wird. Dann werden diese Dauerlarven auf eine frische Platte gebracht. In dieser nahrungsreichen Umgebung nehmen die Dauerlarven ihren Lebenszyklus wieder auf und werden zu fortpflanzungsreifen jungen Erwachsenen.

Schließlich, nach zwei Tagen, werden diese erwachsenen Würmer auf eine andere frische Platte umgefüllt und dürfen bis zu 24 Stunden lang Eier legen. Sobald eine ausreichende Anzahl von Eiern entnommen wurde, werden die erwachsenen Tiere vom Teller genommen und die Eier mit 20 bebrütet? C für 2-3 Tage, damit die Würmer schlüpfen und bis zum Larvenstadium L4 heranwachsen können.

Um die Lebensdauer der Würmer zu messen, werden diese Larven auf Platten übertragen, die das Medikament FUDR enthalten, das die Wurmfortpflanzung unterdrückt, ohne die Lebensdauer der Erwachsenen zu beeinträchtigen. Im Laufe des Experiments kann die Platte angeklopft werden, um festzustellen, ob die Würmer lebendig oder tot sind, um die Bewegung der Würmer zu beobachten. Bei älteren Würmern kann es notwendig sein, den Kopf des Wurms sanft anzustupsen, um eine Reaktion hervorzurufen. Entfernen Sie tote Würmer und notieren Sie die Anzahl der toten und lebenden Würmer. Die Tiere sollten alle 2-3 Tage auf frische Teller umgefüllt werden, um Hunger zu vermeiden.

Nachdem wir Ihnen nun gezeigt haben, wie die Lebensdauer von Würmern quantifiziert wird, wollen wir uns ansehen, wie dies bei Fruchtfliegen geschieht. Kurz gesagt, das Verfahren besteht darin, den Weibchen zu erlauben, Eier in einen speziellen Käfig zu legen, Eier zu sammeln, Larven zu Fliegen entwickeln zu lassen, Fliegen nach Geschlecht zu sortieren und schließlich tote Fliegen zu zählen, die im Laufe der Zeit auftauchen.

Um altersgerechte Fliegen zu erhalten, werden erwachsene Fliegen in einen Eiersammelkäfig gesetzt, der Fruchtsaft-Agar-Platten enthält, die mit Hefepaste bestrichen sind. Die gesammelten Eier werden gewaschen, in Larvenwachstumsflaschen gelegt und etwa 10 Tage lang inkubiert, damit sich die Fliegen entwickeln können. Ein Tag alte erwachsene Fliegen werden dann in erwachsene Futterflaschen umgefüllt und zwei Tage lang inkubiert, damit sie die Geschlechtsreife erreichen können.

Diese Fliegen werden dann gesammelt, betäubt und in Männchen und Weibchen sortiert, um eine Verwechslung der Lebensspanne mit geschlechtsspezifischen Faktoren zu vermeiden. Als nächstes werden die eingeschlechtlichen Fliegen in Wachstumsfläschchen gegeben. Alle zwei Tage sollten die Fliegen in neue Fläschchen mit frischem Futter “gewendet” werden. Tote Fliegen werden gewertet, indem die Fliegen gezählt werden, die noch in der alten Phiole verbleiben, sowie die Fliegen, die in die neue Phiole gefallen sind.

Nachdem Sie nun die grundlegenden Protokolle zur Messung der Lebensdauer in Wirbellosenmodellen kennengelernt haben, schauen wir uns an, wie Wissenschaftler diese Techniken an die Erforschung der Biologie des Alterns und der Langlebigkeit anpassen.

Forscher untersuchen die Auswirkungen verschiedener Faktoren wie Temperatur und Medikamente auf die Lebensdauer. In dieser speziellen Studie kultivierten die Wissenschaftler Würmer in flüssigen Medien in 96-Well-Mikrotiterplatten, so dass die Wirkung mehrerer Substanzen und Wachstumsbedingungen gleichzeitig getestet werden kann. Sie fanden heraus, dass zum Beispiel das Wachstum der Würmer im Alter von 25? C statt 20? C, verringerte die Lebensdauer der Würmer, ebenso wie hohe Konzentrationen des Antidepressivums Mirtazepin.

Lebensdauer-Assays können auch mit Techniken wie RNA-Interferenz oder RNAi kombiniert werden, um Gene zu identifizieren, die das Überleben von Tieren beeinflussen. RNAi ist eine leistungsstarke experimentelle Technik, bei der kurze RNAs verwendet werden, um das Expressionsniveau eines Zielgens zu verringern oder “umzuwerfen”. Hier behandelten die Wissenschaftler Würmer mit RNAi gegen das bec-1-Gen, infizierten sie dann mit dem pathogenen Bakterium Salmonellen und führten einen Überlebenstest durch. Würmer mit bec-1 knockdown zeigten eine deutliche Verkürzung der Lebensdauer im Vergleich zu Würmern, bei denen das Gen normal exprimiert wird.

Schließlich werden Experimente zur Quantifizierung der Lebensspanne verwendet, um die Auswirkungen verschiedener Wachstumsbedingungen auf die Langlebigkeit von Tieren zu bewerten. In diesem Experiment kultivierten die Wissenschaftler altersgerechte Würmer auf einer Reihe von Platten mit unterschiedlichen Mengen an bakterieller Nahrung. Es wurde beobachtet, dass dieses Wachstumsschema, das als Kalorien- oder Ernährungseinschränkung bezeichnet wird, einen signifikanten Einfluss auf die Lebensdauer der Würmer hat.

Sie haben gerade das Video von JoVE über die Quantifizierung der Lebensdauer in wirbellosen Modellen gesehen. In diesem Video wurden einige der Prinzipien hinter dem Altern und der Lebensdauer, die Protokolle zur Messung der Lebensdauer bei Würmern und Fliegen und einige Anwendungen von Experimenten zur Lebensdauermessung erläutert. Letztendlich besteht die Hoffnung, dass diese Experimente den Wissenschaftlern helfen werden, die Faktoren und Wege zu finden, die das Altern kontrollieren, und die Entwicklung von Therapien zur Behandlung altersbedingter Krankheiten wie Alzheimer und Herz-Kreislauf-Erkrankungen ermöglichen. Danke fürs Zuschauen!