Name: Bereicherung der Bruch-Membran von menschlichen Spender Augen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Lernen Sie die Bereicherung der Bruch-Membran aus postmortalen menschlichen Augen für biochemische Analysen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinen und Kohlenhydraten zur Erforschung altersbedingter Makuladegeneration.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Die Autoren danken Dr. Isaac Zambrano und das Personal an der Manchester-Augenklinik Eye Bank für die Lieferung von menschlichen Spender Augengewebes, und Mr. Pete Walker der Fakultät für Lebenswissenschaften Histologie Anlage für die H &amp; E gefärbten Bildern erkennen. Besonderer Dank geht an Herrn Roger Meadows für seine Hilfe bei der Mikroskopie. SJC ist ein Empfänger einer Medical Research Council (MRC) Career Development Fellowship (MR / K024418 / 1), und die Autoren auch andere aktuelle Forschungsförderung von MRC (G0900538 und K004441) anzuerkennen, Fight for Sight (1866) und der Makula Society.

Menschliche Auge Gewebe zu Forschungszwecken eingewilligt wurde von der Manchester Königlichen Eye Hospital Eye Bank nach dem Entfernen der Hornhaut zur Transplantation erhalten. Die Verwendung von menschlichem Gewebe für die Forschung wurde in Übereinstimmung mit der Human Tissue Act (2004) Richtlinien, mit Zustimmung University Research Ethics Committee (Referenz 11305). 1. Anreicherung von Whole Bruch-Membran <ol><li> Reinigen Sie den Arbeitsbereich um und unter dem Binokular mit 1% Desinfektionsmittel (v / v) und dann wischen Sie mit 70% (v / v) Ethanol. </li><li> Achten Sie darauf, das Folgende zu Hand: eine neue Einweg-Skalpell, zwei sterilen Zellschaber (üblicherweise in Gewebekultur verwendet werden) und drei Paare von Pinzetten (hier als A, B, und C aufgeführt sind, siehe Materialliste). </li><li> Setzen Sie die Augenkugel in eine Einweg-Petrischale, Halten des Deckels für die spätere Verwendung. Mit Hilfe einer neuen Einweg-Skalpell, entfernen Sie alle Rest Sehnerv, die stören können mit der Erstellung einer flachen mount des Gewebes. Als nächstes stellen vier Schnitte gleichmäßig beabstandet um vier Quadranten zu erstellen, wenn Sie fortfahren, Teil 3 (Anreicherung von Makula Bruch-Membran) nicht durch die Makula-Region geschnitten. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Einschnitte erstrecken sich durch die gesamte Tiefe des Augengewebes - vom innersten neurosensorischen Netzhaut (NSR), durch die Aderhaut und Lederhaut (Weiß des Auges). Fahren Sie den Einschnitt den ganzen Weg um das Auge von dem Rand der Augenmuschel des Sehnervs. Damit wird die Augenmuschel aus abgeflacht werden (siehe Abbildung 1B). </li></ol></li><li> Halten eines Quadranten des abgeflachten Augenmuschel mit Pinzette A (bis Aderhaut Ablösung zu verhindern), verwenden Sie den größeren Pinzette B zu greifen den Glaskörper und die zugrunde liegenden NSR und ziehen dieses Gewebe aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE), beginnend an der Peripherie, Bewegung in Richtung Zentrum der geöffneten Augenmuschel und dann an der gegenüberliegenden Seite. In der Regel, aber nicht immer beide Glaskörper und NSR lösen als einer. Verwenden Sie die scalpel, um restliche NSR an der Papille verankert herauszuschneiden. </li><li> Wieder, während, einen Quadranten von Gewebe an Ort und Stelle mit Pinzette A, verwenden Sie den sterilen Zellschaber, um sanft zu entfernen die RPE-Monoschicht von der gesamten Innenfläche der Augenmuschel. Diese Zellen leicht lösen und als dunkelbraun pigmentierter Klumpen zu sehen. Spülen mit PBS vorsichtig waschen weg verdrängt RPE-Zellen aus der Augenmuschel. </li><li> Als Nächstes verwenden Pinzette A vorsichtig schälen die darüber liegende dunkelrote Gewebe (die sowohl Bruch-Membran und der Aderhaut) von allen 4 Quadranten Auge. Legen Sie die ausgeschnittenen Gewebe in eine saubere Schüssel. </li><li> Unter Verwendung der abgeflachten Kante von einem Zellschaber, um die herausgeschnittenen Gewebe in Position zu halten, verwenden Sie die zweite Schaber, um sanft kratzen das Gewebe. Drehen Sie das Gewebe über und wiederholen, die Beseitigung so viel überschüssiges Material wie möglich. Schließlich wird eine lichtdurchlässige Membran bleibt: dies ist die grob angereicherten Bruchmembran. Die Verwendung des Präpariermikroskop bei einem Minimum von 20-facher Vergrößerung istunerlässlich bei der Unterstützung der Entfernung der Aderhaut und Bereicherung der Bruch-Membran. </li><li> Mit einer Pasteurpipette, kurz die Bruch-Membran mit ultrareinem Wasser spülen, um Restaderhaut und Blut, bevor die Membran in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen. </li><li> Hängen Sie das angereicherte Bruch-Membran in etwa 1 ml Reinstwasser und kurz vortexen (ca. 15 sec) zu helfen, zu lysieren keine verunreinigenden Zellsubstanz (siehe Abbildung 2). Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 xg für 30 Sekunden, um die Membran zu pelletieren und absaugen des Überstandes. Hinweis: Die verbleibenden bereichert Bruch-Membran ist nun bereit für die Solubilisierung oder Lagerung bei -80 ° C für die spätere Verwendung (wie in Abschnitt 2 unten beschrieben). </li></ol> 2. Solubilisierung von Whole Enriched Bruch-Membran und Western Blot-Analyse <ol><li> Extrahieren Sie Protein aus angereicherten Bruch-Membran durch Eintauchen des Gewebes in 500 ul 8 M urea für 6 h bei RT in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (3A). </li><li> Zentrifuge solubilisierten Proben bei 10.000 × g für 10 min, um alle verbleibenden extrazellulären Materie zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und überträgt es auf 3.500 Da MWCO Dialysemembran, dann legen Sie die Probe in 1 l PBS zu 16 Stunden bei 4 ° C dialysiert. </li><li> Für jede Probe werden 40 ul der Proteinisolierung Perlen, und drehen Probe / Perlenmix (20 UpM auf einer rotierenden Mischer) bei RT für 30 min. </li><li> Zentrifuge Proben bei 10.000 × g für 5 min pelletiert der Wülste. Überstand abnehmen und solubilisieren Proteins an Kügelchen gebunden in 30 ul 2x Probenbeladungspuffer (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w / v) Glycerol, 0,01% Bromphenolblau, 3% β-Mercaptoethanol). </li><li> Inkubieren der Proben bei 100 ° C für 10 min und dann bei 10.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert werden, um die verbleibenden Kügelchen zu pelletieren. </li><li> Laden der Überstand, der die freigesetzten Proteine ​​auf einen vorgegossenen enthält SDS-Seite Gradienten-Gel (siehe Materialliste) zur Proteintrennung. </li><li> Visualisieren getrennten Proteinbanden mit einem gemeinsamen Färbeprotokoll zB Coomassie-Blau. <ol><li> Kurz gesagt, 20 ml des strahlend blauen Fleck (0,1% Brilliantblau (w / v), 50% Methanol, 10% Essigsäure, 40% Wasser) auf das Gel, und Inkubation für 30 min bei RT unter leichtem Schütteln . </li><li> Entsorgen Sie die Farblösung und waschen Sie die gefärbten Gels mit entionisiertem Wasser, bis die Hintergrundfärbung ausreichend reduziert, um Buntproteinbande Visualisierung zu ermöglichen. </li><li> Alternativ Übertragung getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulose für die Western-Analyse, wie unten beschrieben. </li></ol></li><li> Übertragungs getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulosemembran bei 80 mA für 2,5 h unter Verwendung halbtrockenen Übertragungsvorrichtung in Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 10% [v / v] Methanol). </li><li> Blockieren der Membran in 10 ml PBS, 10% (w / v) Milch und 0,02% (w / v) BSA für 16 Stunden bei 4 ° C vor the Zugabe der gewünschten primären Antikörper zum Nachweis von Proteinen. Hinweis: Als Beispiel hier zeigt 3C einen repräsentativen Immunoblot solubilisiert Bruch-Membran aus drei verschiedenen Spendern untersucht für einen Regler der Komplementkaskade, Faktor H-like protein 1 (FHL-1). </li></ol> 3. Anreicherung von Makula-Bruch-Membran <ol><li> Führen Sie die Schritte 1,1 bis 1,3, wie zuvor beschrieben. </li><li> Während die NSR noch vorhanden ist, suchen Sie die gelbe Fovea-Färbung, die das zentrale Makula-Bereich (siehe Abbildung 4) darstellt. Mit einem sterilen 6 mm Stanzbiopsie, legen Sie sie über der fovealen Region und fest schneiden in der Makula. <ol><li> Halten die Biopsie-Stanze an Ort und Stelle, stellen Sie eine separate Inzision mit einem Skalpell aus dem Rand der Augenmuschel an den Rand der Biopsie Stanzmesser, und dann mit Pinzette B, abziehen der umgebenden Augenmaterial, um einen sauberen Biopsie zu erreichen. </li></ol></li><li> Verwendung Pinzette C, zu entfernendie 6-mm-Scheibe von Gewebe aus dem Stempel und auf den sauberen Petrischale Deckel. Legen Sie die Petrischale Deckel und Makula-Punch unter dem Binokular. </li><li> Entfernen Sie die dünne NSR Scheibe (nach gelben Fovea-Färbung, um die Genauigkeit der Biopsie entnehmen). Verwenden Sie eine sterile Zellschaber zur schonenden Entfernung der RPE-Zellen. </li><li> Sichern Sie die Makula-Disk über der Lederhaut mit den Spitzen der Pinzette ein, und langsam ziehen Sie die Aderhaut und der Bruch-Membran-Komplex mit Pinzetten C. Auch hier verwenden Sie den Zellschaber, um unerwünschte Aderhaut und Blutstoffe aus Bruch-Membran zu entfernen. </li><li> Legen Sie die Makula-Bruch-Membran in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Aussetzung in 1 ml ultrareinem Wasser. Vortex kurz (ca. 15 sec) zu helfen, zu lysieren keine verunreinigenden Zellsubstanz. Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 xg für 30 Sekunden, um die Membran zu pelletieren und absaugen des Überstandes. Hinweis: Das angereicherte Bruch-Membran von der Makula isoliert kann jetzt verwendet werden, ein Proteom-alysis mit bevorzugten Verdauung Protokollen des Benutzers. </li></ol>

<ol><li>Coleman, H. R., Chan, C. -C., Ferris, F. L., Chew, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> Lancet. 372, 1835-1845 (2008).</li>
<li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li>
<li>Coleman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age-related+macular+degeneration+on+vision-specific+quality+of+life%3A+Follow-up+from+the+10-year+and+15-year+visits+of+the+study+of+osteoporotic+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).</li>
<li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+haplotype+in+the+complement+regulatory+gene+factor+H+%28HF1%2FCFH%29+predisposes+individuals+to+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).</li>
<li>Klein, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+factor+H+polymorphism+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 385-389 (2005).</li>
<li>Haines, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+factor+H+variant+increases+the+risk+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 419-421 (2005).</li>
<li>Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+factor+H+polymorphism+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 421-424 (2005).</li>
<li>Fritsche, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li>
<li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula%2C+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li>
<li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+nature+of+Bruch%E2%80%99s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The dynamic nature of Bruch’s membrane.</a> Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+factor+H-like+protein+1+as+the+predominant+complement+regulator+in+Bruch%E2%80%99s+membrane%3A+implications+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch’s membrane: implications for age-related macular degeneration.</a> J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).</li>
<li>Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+complement+control+protein+factor+H+%28beta+1+H%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H).</a> Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).</li>
<li>Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+amino+acid+sequence+of+human+complement+factor+H%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The complete amino acid sequence of human complement factor H.</a> Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).</li>
<li>Moore, D. J., Clover, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+age+on+the+macromolecular+permeability+of+human+Bruch%E2%80%99s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci.+I%22%5BJournal%5D)">The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch’s membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).</li>
<li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Hier beschreiben wir die Bereicherung der Bruch-Membran für die weitere Analyse ermöglicht nachfolgenden Analysen einschließlich Western-Blot 11, Massenspektrometrie und die Diffusionseigenschaften der Bruch-Membran unter Verwendung von modifizierten Ussing-Kammern 11,14. Kritischer Schritte umfassen a) die gründliche Abschaben und Waschen der inneren Oberfläche des Auges um alle RPE-Zellen b) die wiederholte und vorsichtiges Abkratzen der darunterliegenden Aderhaut, ohne dass das Bruch-zu zerfallen zu entfernen, und c) Waschen des entfernten Bruch&#39;sche in Reinstwasser zur Lyse von Rest Zellen sicherzustellen. Außerdem, wenn der Bruch-Membran angereichert ist, für Proteomanalyse verwendet werden, Proteinextraktion durch die Harnstoff-Behandlung ist am wirksamsten in der Aufteilung dieses elastischen Gewebes im Vergleich zu anderen Verfahren, wie mechanische Homogenisierung. Histologie von angereichertem Bruch-Membran zeigt das ECM des Choriokapillaris nicht entfernt. Dies ist ex seinsichtlichen als äußere Schicht der pentilaminar Bruch-Membran wird durch Choriokapillaris Endothelzellen Basalmembranen gebildet. Tatsächlich kann es vorteilhaft sein, dass das ECM des Choriokapillaris bleibt als Änderungen dies auftreten in AMD einschließlich der Ablagerung von terminalen Komplementkomplex / Membran-Angriffskomplex (MAC) 15. Es sollte beachtet werden, dass für eine detaillierte histologische Analyse der Bruch-Membran, ihre Struktur besser erhalten, wenn in Gegenwart von der Sklera, Aderhaut, und Bruch-Membran geschnitten werden kann. Tatsächlich ist die Histologie in 2 präsentiert ausschließlich zur Deckung der Anreicherungsgrad von der in dieser Handschrift beschriebenen Technik resultierenden demonstrieren. Anreicherung von Makula Bruchs erfordert eine sorgfältige Präparation der Augenmuschel, sicherzustellen, dass der NSR und insbesondere die Fovea nicht beschädigt werden; andernfalls Identifikation und somit die Isolierung des Makula nicht möglich. Die Integrität der tissue ist auch wichtig, zu diesem Prozess und es wird daher empfohlen, alle Proben unter 48 Stunden post mortem Zeit verwendet werden. Der Grad der Anreicherung erforderlich variiert zwischen Gebern und durch Spenderalter, Post-mortem-Zeit, und die Anwesenheit von jedem Auge Pathologie betroffen sein. Die Verwendung des Begriffs angereichert ist gewollt in Anerkennung einer Einschränkung der Technik, wobei dies, dass &quot;Reinigung&quot; oder &quot;Trennung&quot; der Bruch-Membran mit dieser Methode ist einfach nicht möglich. Aufgrund der Tatsache, dass der ECM des Choriokapillaris geht in Bruch-Membran gibt es eine vollständige Trennung nicht möglich ist. Das Verständnis der biochemischen Veränderungen der jeweiligen Augengewebe ist von wesentlicher Bedeutung für das Verständnis Augenfortschreiten der Krankheit. Diese einzigartige Bereicherung der Bruch-Membran erleichtert dieses Verständnis; laufende Studien untersuchen das Proteom von angereichertem Makula-Bruch-Membran unter Verwendung von Massenspektrometrie in verschiedenen Stadien der AMDund in Proben von Patienten mit verschiedenen Genotypen Ursprung um das Verständnis der molekularen Pathologie von AMD zu verbessern. Bereits die hier beschriebene Technik wurde verwendet, um FHL-1 erfolgreich zu identifizieren als die vorherrschende Ergänzung Regler in Membran 11 und weitere Studien Bruchs auf angereicherten Bruch-Membran sind wahrscheinlich in mehr neue Einblicke in die molekulare Pathologie von AMD führen.

Der Einsatz von post mortem menschliche Auge Gewebe in der Augenforschung ist eine unschätzbare Ressource für das Verständnis der Pathogenese Augenkrankheit. Analyse von menschlichen Spenderaugen hat wichtige Beiträge, um die Mechanismen zugrunde altersbedingten Makuladegeneration (AMD), die die Hauptursache für Erblindung in der westlichen Welt 1 anspruchsvollen gemacht. Weltweit entfallen AMD für rund 8,7% aller Blindheit und mit einer zunehmend alternden Bevölkerung wird vorhergesagt, bis 196 Millionen Menschen bis zum Jahr 2020 2. AMD führt zum Verlust des zentralen Sehvermögens beeinträchtigen und hat eine tief greifende Auswirkungen auf die Patienten Unabhängigkeit und Lebensqualität 3. Frühen AMD wird durch die Bildung von Drusen gekennzeichnet und es kann zu geographische Atrophie (manchmal als &quot;trockene&quot; AMD bezeichnet) oder CNV (auch als neovaskulären oder &quot;nasse&quot; AMD bezeichnet) fortschreiten. Während Anti-VEGF-Injektionen können stabilisieren oder Sehvermögen von neovaskulärer AMD es is nicht heilende und derzeit für geographische Atrophie existiert keine Behandlung. Während bestimmte genetische Varianten haben gezeigt, dass AMD Risiko 4 ändern - 8 wird weniger darüber, wie diese Varianten beeinflussen die Makula bei einer biochemischen Ebene bekannt. Ein wichtiger Standort in AMD Pathogenese ist der Bruch-Membran. Drusen Form innerhalb dieser Struktur und verschiedene Studien haben Beweise der Komplementaktivierung in und um Bruch-Membran in AMD 9 vorgesehen. Bruch-Membran ist ein Blatt von der extrazellulären Matrix, die die retinale Pigmentepithel (RPE) Zellen aus der Aderhaut trennt, und ist etwa 4 &amp; mgr; m dick. Bruch-Membran geht in die Aderhaut, einer Schicht aus der Aderhaut, die gefensterte Kapillaren und extern zu diesem enthält, sind Schichten mit größeren Blutgefäße 10 (Figur 1A). Bruch-Membran ist ein pentilaminar Blatt Extrazellulären Matrix (ECM), und diese Methode beschreibt, wie der Bruch-Membran zu isolieren, zusammen mit der ECM der zugrunde liegenden Choriokapillaris (nachfolgend bezeichnet Bruch-Membran angereichert), die weitgehend dezellularisierte und frei von roten Blutkörperchen ist. Enriched Bruch-Membran wurde dann für die Western-Blot und Histologie Experimente verwendet. Weiterhin Methode zur Anreicherung der Bruch-Membran allein aus der Makula Bereich des Auges beschrieben, die von besonderem Interesse für die Untersuchung der biochemischen Aspekte des AMD sein wird.

<table><tbody><tr><td>Hilfsobjektiv 0,5X</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>3638</td><td>Nützlich (aber nicht wesentlich) für die Bildgebung des ganzen Auges mit flacher Aufnahme</td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze 6 mm</td><td>Oncall Medical Supplies</td><td>SCH-33-36</td><td>6-mm-Biopsie-Stanzen</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Zelle Schaber</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td>Zur Membrananreicherung</td></tr><tr><td>CyroPure Cyrovials</td><td>Sarstedt</td><td>72.38</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Skalpelle</td><td>Fisher Scientific</td><td>12387999</td><td>Sterile, einzeln verpackte Swann-Morton Skalpelle.</td></tr><tr><td>Duale Schwanenhals-LED-Scheinwerfer an 30 cm langen Armen</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>0153</td><td>Flexible Lichtquelle, die für die Dissektion und Bildgebung unerlässlich</td></tr> ist <tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8537</td><td>Wird verwendet, um das Austrocknen der Makula zu verhindern und während der Membrananreicherung.</td></tr><tr><td>(A) Pinzetten</td><td>Wissenschaftliches Laborzubehör</td><td>INS4280</td><td>(A) Fein (100 mm) und gerade</td></tr> <tr><td>(B) Pinzetten</td><td>Wissenschaftliches Laborzubehör</td><td>INS4272</td><td>(B) Breit und stumpf (150 mm). Nützlich zum Heben großer Portionen von Proben</td></tr><tr><td>(C) Pinzetten</td><td>Wissenschaftliches Laborzubehör</td><td>INS4323</td><td>(C) Gerade feine Spitzen</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>GXCAM 5 digitale Farbkamera & GT-Vision Software</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>1122</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gele</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Sterilin</td><td>101VR20</td><td>90 mm, wird als Schale für Proben verwendet</td></tr><tr><td>Proteinisolationskügelchen (Strataclean-Harz)</td><td>Agilent</td><td>400714-61</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Stereozoom-Mikroskop GXMXTL3T (Vergrößerungsbereich 7X - 45X)</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>5595</td><td>Stereozoom-Mikroskop, das an einem Galgenstativ befestigt ist, um die Bedienung während der Dissektion zu erleichtern</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

bereicherung der bruch-membran von menschlichen spender augen

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine führende Ursache für Sehbehinderung in der entwickelten Welt. Die Krankheit manifestiert sich durch die Zerstörung der Mitte der Retina, Makula genannt, was zum Verlust der zentralen Sehschärfe. Frühen AMD ist durch die Anwesenheit von kleinen, gelblichen Läsionen genannt weiche Drusen, dass der Fortschritt auf späten AMD wie geographische Atrophie (trockene AMD) oder Gefäßneubildung (feuchte AMD) gekennzeichnet. Obwohl die klinischen Veränderungen sind gut beschrieben, und das Verständnis der genetischen Einflüsse auf verleiht AMD Risiko werden immer detaillierter, ist ein Bereich, fehlen wichtige Fortschritte das Verständnis der biochemischen Auswirkungen der genetischen Risiko. Dies ist teilweise auf Grund von Schwierigkeiten beim Verständnis der Biochemie der Bruch-Membran, einer sehr dünnen extrazellulären Matrix, als biologischer Filter von Material von der Durchblutung und ein Gerüst, auf dem retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellmonoschicht liegt dient. Drusen form im Bruch-Membran und ihre Anwesenheit stört Nährstofffluss in den RPE-Zellen. Nur durch die Untersuchung der Proteinzusammensetzung der Bruch-Membran, und in der Tat, wie andere Proteine ​​mit ihm interagieren, können die Forscher hoffen, dass die biochemischen Mechanismen zugrunde Drusen Bildung, Entwicklung von AMD und anschließende Verlust der Sehkraft zu entwirren. Dieses Papier Details Methoden zur Anreicherung von entweder ganzen Bruch-Membran, oder einfach von der Makula Region, so dass es für nachfolgende biochemische Analyse verwendet werden, und Beispiele dafür, wie diese ändert sich bereits das Verständnis der Bruch-Membran Biochemie.

Das oben beschriebene Protokoll zur Membran Ergebnisse Bruchs bereichert in der Isolierung des Bruch-Membran, der ECM des Choriokapillaris produzieren und entfernt die meisten der Zellen / Zelltrümmer einschließlich all des RPE (Abbildung 2). Das Waschen der angereicherten Bruch-Membran in Wasser ist ein wichtiger Schritt in Lyse alle verbleibenden Aderhautzellen. Die während der Verschrottung der Aderhaut ausgeübte Druck scheint eine der wenigen verbliebenen Zellkerne in den definiert als Bruch-Membran (2B) Region verdichten. Die Solubilisierung von angereichertem Bruch-Membran ermöglicht die nachgeschaltete Analyse der Proteingehalt. Die Trennung von Proteinbanden von solubilisierten angereichert Bruch-Membran unter Verwendung einer 4-12% -Gradienten-SDS-PAGE-Gel, während nicht nützlich in seinem eigenen Recht um den Proteingehalt zu ermitteln, tut zeigen die Fähigkeit dieser Technik, um verunreinigende Proteine, Blut ar minimierene unspezifisch gebundene (3B). In dieser Hinsicht ist eine bemerkenswerte Brief aus dem Proteingel Lauf ist eine beträchtliche Gruppe von Humanserumalbumin (~ 66 kDa), die sonst machen können anschließenden Western-Blot schwieriger zu interpretieren: Die histologische Analyse von angereichertem Bruch-Membran in Abbildung 2 auch Stützen Dies. Tatsächlich als Teil des Arbeits zuvor beschriebenen 11, solubilisiert Bruch-Membran aus einer Serie von einzelnen Spendern wurden für eine Reihe von Proteinen mit spezifischen Antikörpern mittels Western Blot (Figur 3C) sondiert. In dem hier gezeigten Fall ein Antikörper (bezeichnet OX23) 12 gegen ein 155 kDa Regulator der angeborenen Immunität gerichtet, genannt Komplementfaktor H (FH), verwendet wurde, und zeigte die Anwesenheit eines unteren molekulare Bande in der Bruch-Membran-Proben von drei getrennten Spender (3C). Diese anschließend stellte sich heraus, Faktor H-like protein 1 sein (FHL-1)Der 49 kDa-Proteins an FH ergeben und von einem Spleiß Variation des gleichen Gens 13. FHL-1 scheint in der Bruch-Membran 11 die Haupt vorliegenden Ergänzung Regler sein. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> Abbildung 1. Dissection des menschlichen Auges und Anreicherung der Bruch-Membran. (A) Bruch-Membran ist eine extrazelluläre Matrix-Schranke. Die Aderhaut enthält eine Schicht aus gefensterten Kapillaren, die kontinuierlich in der Bruch-Membran verschmelzen (das so genannte Choriokapillaris) und diese zu trennen den Rest der Aderhaut (die großen Blutgefäße) aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellschicht, die physiologisch unterstützt die Photorezeptorzellen der neurosensorischen Netzhaut (NSR). (B) Vier Einschnitte in den menschlichen Augenmuschel gemacht so dass sie geöffnet werden, um eine flache Halterung zu schaffen. DasGlaskörper können bei der Verwendung von Pinzetten entfernt werden. Der NSR kann off zusammen mit dem Glaskörper, sind aber auch mit einer Pinzette entfernt werden. Einem Zellschaber verwendet, um die RPE-Zellschicht von Bruch-Membran zu entfernen, während es noch an der Aderhaut und der Sklera verankert. Der Bruch-Membran / Choroidea Komplex kann von der Lederhaut abgeschält werden und mit einer neuen Zellschaber kann die äußere Choroidea entfernt werden. Eine letzte Waschung in ultrareinem Wasser lysiert restliche Zellmaterial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> Abbildung 2. Histologie der Bruch-Membran und der Aderhaut. H &amp; E-gefärbten Schnitten vor (A) und nach (B) Abschaben der äußeren Aderhautstrukturen aus Bruch-Membran und Waschen in ultrareinem water angereichert Bruch-Membran zu erzeugen. Skalenbalken stellen 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> Abbildung 3 Solubilisierung Enriched Bruch-Membran für Protein Content Analysis. (A) Protein kann aus angereichertem Bruch-Membran durch Inkubation in 8 M Harnstoff für 6 h bei RT extrahiert werden, bevor sie gegen PBS dialysiert. Für Western-Analyse, können Proteine, die aus der ganzen Bruch-Membran Dialysat mit Proteinisolierung Perlen isoliert und eluiert durch Kochen mit Laemmli-reduzierendem Probenladepuffer. (B) Ein Vertreter Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gel, das sowohl saubere und verwässert Bruch-Membran solubilisiert (BM) mit der Methode d. in (A) escribed (C) Eine repräsentative Western Blot von solubilisiert Bruch-Membran aus 3 einzelnen Spendern (Spuren 1-3). für Faktor H-like protein 1 (FHL-1) sondiert <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Figur.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> Figur 4. Isolierung von angereichertem Bruch-Membran von der Makula. Die Makula Bereich der Netzhaut ist ein 5 mm-Bereich, die sich leicht durch die Gelbfärbung der überlagernden Fovea identifiziert werden kann, und die Nähe zu der benachbarten Papille. Unter Verwendung der Fovea als Leitfaden, legen Sie ein 6 mm Biopsie-Stanze auf der flachen montiert menschliche Auge, um eine 6 mm Makula Gewebeblock herauszuschneiden. Entfernen Sie die darüberliegenden NSR und abkratzen RPE-Zellen aus dem herausgeschnittenen Makula. Die übrigen Bruch-Membran / Aderhaut-Komplex kann dien von der Lederhaut schälen und gründlich abgekratzt, um Aderhaut zu entfernen, lysieren restlichen Zellmaterial durch Eintauchen in ultrareines Wasser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die Identifizierung von Proteinen, die spezifisch mit der Bruch-Membran im menschlichen Auge assoziiert sind, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der biochemischen Mechanismen hinter Augenkrankheiten wie der altersbedingten Makuladegeneration. Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Schicht extrazellulärer Matrix für die nachgelagerte biochemische Analyse angereichert werden kann.

Bereicherung der Bruch-Membran von menschlichen Spender Augen

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

Das übergeordnete Ziel dieser Gewebedissektionstechnik besteht darin, die Brooks-Membran aus einem postmortalen menschlichen Auge anzureichern und Wissenschaftlern das spezifische Material bereitzustellen, das zur Analyse ihres Protein- und Kohlenhydratgehalts erforderlich ist. Diese Methode kann uns helfen, Mechanismen wie die Immunregulation an der Brooks-Membran zu verstehen, die einer Reihe von Augenerkrankungen zugrunde liegen, einschließlich der häufigsten Form von Erblindung in der westlichen Welt, der altersbedingten Makuladegeneration. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Analyse allein der akzellulären Brooks-Membran ermöglicht, ohne Kontamination durch Blutbestandteile oder retinale Pigmentepithelzellen, die andernfalls zu irreführenden Ergebnissen führen könnten.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der Umgang mit menschlichem Gewebe schwierig ist und die Isolierung einer intakten Bruch-Membran allein anhand einer schriftlichen Methodik schwer vorstellbar ist. Die Durchführung der Prozedur wird Dr. Selena Mcca, eine Postdoktorandin aus unserem Labor, übernehmen. Zunächst den Arbeitsbereich um und unter dem Mikroskop mit Desinfektionsmittel reinigen und anschließend mit 70 % Ethanol abwischen. Danach die für den Eingriff benötigten Werkzeuge zusammensuchen. Sobald alles bereit ist, das Augapfelpräparat in eine Einweg-Petrischale legen und den Deckel für die spätere Verwendung aufbewahren.Verwenden Sie ein neues Einweg-Scalpell, um eventuell verbliebene Reste des Sehnervs zu entfernen, die die Erstellung einer flachen Präparation des Gewebes beeinträchtigen könnten. Anschließend führen Sie vier gleichmäßig verteilte Einschnitte durch, um vier Quadranten zu erzeugen. Vermeiden Sie es, den makulären Bereich durchzuschneiden, wenn Sie die Bruch-Membran der Makula anreichern, während Sie durch die gesamte Augentiefe eindringen.Setzen Sie den Schnitt vollständig vom Rand der Augenschale bis zum Sehnerv fort. Dadurch kann die Augenschale flach ausgebreitet werden. Halten Sie anschließend ein Viertel der flach liegenden Augenschale mit einer Pinzette fest, während Sie mit einer größeren Pinzette das Glaskörpergewebe und das darunterliegende Gewebe greifen.Ziehen Sie dieses Gewebe ausgehend vom Rand und in Richtung Mitte zur gegenüberliegenden Seite vom retinalen Pigmentepithel oder RPE weg. Wenn Glaskörper und neurosensorisches Retinagewebe nicht gemeinsam ablösen, verwenden Sie ein Skalpell, um verbliebenes Gewebe, das am Sehnervenaustritt verankert ist, zu entfernen, während Sie ein Viertel des Gewebes an Ort und Stelle halten. Verwenden Sie einen sterilen Zellabstreifer, um die RPE-Monoschicht vorsichtig von der gesamten Innenfläche der Augentasse zu lösen.Diese Zellen lösen sich leicht ab und sind als dunkelbraune, pigmentierte Klumpen sichtbar. Spülen Sie mit PBS, um gelöste RPE-Zellen vorsichtig zu entfernen. Danach wird das daraufliegende dunkelrote Gewebe vorsichtig aus allen vier Augenquadranten abgezogen.Legen Sie das entnommene Gewebe in eine saubere Schale. Geben Sie einige Tropfen PBS hinzu und glätten Sie das Gewebe gegebenenfalls mit einer Zellabstreiferzelle und einer Pinzette. Halten Sie das entnommene Gewebe mit der abgeflachten Kante eines Zellabstreichers fest und verwenden Sie den zweiten Abstreifer, um das Gewebe vorsichtig abzustreichen. Drehen Sie das Gewebe um und wiederholen Sie den Vorgang, um so viel überschüssiges Material wie möglich zu entfernen.Legen Sie das Gewebe in eine saubere Petrischale. Nachdem das Material entfernt wurde, ist die durchscheinende Membran, die zurückbleibt, die grob angereicherte Brooks-Membran. Arbeiten Sie unter einem Stereomikroskop, um die Aderhaut zu entfernen und die Membran weiter anzureichern.Spülen Sie die Bruchs-Membran kurz mit ultrareinem Wasser, um Reste der Aderhaut und des Blutes zu entfernen, bevor Sie die Membran in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben. Nachdem die Membran in etwa einem Milliliter ultrareinem Wasser suspendiert wurde, kurz verwirbeln, um anhaftende zelluläre Bestandteile zu lösen. Die Probe zentrifugieren, um sie zu pelletieren, und den Überstand absaugen.Die angereicherte Brooks-Membran, die verbleibt, ist nun bereit zur Solubilisierung oder kann zur späteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Um Protein aus der angereicherten Brooks-Membran zu extrahieren, das Gewebe sechs Stunden lang in 500 Mikroliter acht molarer Harnstofflösung eintauchen.Zentrifugieren Sie die solubilisierten Proben bei Raumtemperatur, um jegliches verbleibende extrazelluläre Material zu pelletieren. Entfernen Sie das Überstand und überführen Sie es in eine Dialysmembran. Stellen Sie die Probe für 16 Stunden in ein Liter PBS zur Dialyse bei vier Grad Celsius.Fügen Sie für jede Probe 40 µL Proteinisolationsperlen hinzu und rotieren Sie die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur. Pelletieren Sie die Perlen durch Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand. Lösen Sie das an die Perlen gebundene Protein in 30 µL zweifachem Probeladepuffer auf.Nach einer 10-minütigen Inkubation pelletieren Sie die Kügelchen und sammeln Sie das Überstand. Laden Sie die freigesetzten Proteine auf ein vorgefertigtes SDS-Page-Gradienten-Gel für die Proteinseparation auf.Führen Sie gegebenenfalls Standardverfahren durch, um die getrennten Proteinbänder sichtbar zu machen. Führen Sie eine Westernblot-Analyse gemäß den üblichen Laborverfahren durch, um die Membrana limitans posterior (Brooks-Membran) anzureichern. Wenden Sie dieselben Verfahren wie zuvor gezeigt an, mit der Ausnahme, dass Sie bei noch intakter neurosensorischer Retina die gelbe Foveafärbung lokalisieren, die die zentrale makuläre Region darstellt.Platzieren Sie eine sterile sechs Millimeter große Biopsiepunch über der Fovea-Region und schneiden Sie fest in die Makula, wobei Sie den Biopsiepunch an Ort und Stelle belassen. Führen Sie einen separaten Schnitt mit einem Skalpell von der Kante der Augentasse bis zur Kante der Biopsiepunch-Klinge durch. Lösen Sie das umgebende Augenmaterial ab, um eine saubere Biopsie zu erhalten.Entfernen Sie die sechs Millimeter große Gewebescheibe aus dem Punch und legen Sie sie auf den zuvor beiseitegelegten sauberen Petrischalen-Deckel. Stellen Sie den Petrischalen-Deckel und den Makulapunch unter das Stereomikroskop. Überprüfen Sie das Vorhandensein einer gelben Foveafärbung, um die Genauigkeit der Biopsie abzuleiten.Verwenden Sie anschließend einen sterilen Zellabstreifer, um die Pigmentepithelzellen der Netzhaut vorsichtig zu entfernen. Fixieren Sie die makuläre Scheibe über die Sklera mit Hilfe von Pinzetten und lösen Sie langsam den Chorioidea- und Bruch-Membran-Komplex ab. Falls erforderlich, verwenden Sie eine Skalpellklinge, um die Bruch-Membran von der Sklera zu trennen.Verwenden Sie erneut den Zellabstreifer, um unerwünschtes Chorioide- und Blutmaterial von der Bruchschen Membran zu entfernen. Geben Sie die makuläre Bruchsche Membran in ein Röhrchen und suspendieren Sie sie in einem Milliliter ultrareinem Wasser. Vortexen Sie kurz, um anhaftende zelluläre Bestandteile zu lösen. Zentrifugieren Sie die Probe, um die Membran zu pelletieren, und aspirieren Sie das Überstand. Die angereicherte Bruch-Membran, isoliert aus der Makula, kann nun mithilfe der gewünschten Verdauungsprotokolle für die proteomische Analyse verwendet werden. Diese mit h und d gefärbten Gewebeschnitten menschlichen Makulagewebes vor und nach dem Abschaben der äußeren choroidalen Strukturen zeigen die Anreicherung der Bruch-Membran und der azellulären Chorio-capis aus dem choroidalen Stroma. Dieses SDS-PAGE-Gel zeigt bei den unverdünnten und verdünnten Proben der Bruch-Membran einen Mangel an Albumin-Kontamination durch Blut. Diese repräsentative Westernblot-Analyse wurde durchgeführt, um das immunregulatorische Faktor-H-ähnliche Protein nachzuweisen, jeweils von einem von drei einzelnen Spendern. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Bruchsmembran aus einem menschlichen Auge anreichern kann, um so eine wertvolle Grundlage für die anschließende biochemische und biophysikalische Untersuchung dieser einzigartigen zellfreien Struktur zu schaffen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe und scharfen Instrumenten äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung vollständiger persönlicher Schutzausrüstung sowie eine Impfung gegen Hepatitis B.Bevor mit dem menschlichen Gewebe umgegangen wird, muss immer eine Einwilligung eingeholt werden.

enrichment-of-bruch-s-membrane-from-human-donor-eyes

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Dissektionstechnik zeigt Enukleation der Maus Auge für Gewebefixierung um Phänotypisierung in Hochdurchsatz-Screening durchzuführen.

Maus Eye Enukleation für Remote High-throughput Phänotypisierung

Dieses Video zeigt die Entwicklung eines ex vivo-Modells der Aderhautkeimung zur Untersuchung der okulären mikrovaskulären Angiogenese. Der Assay umfasst die Kultivierung von Mausaugen-Explantaten, die das Aderhautgewebe enthalten, das an der Sklera und dem retinalen Pigmentepithel befestigt ist, unter bestimmten Bedingungen, die das keimende choroidale mikrovaskuläre Keimen fördern.

Aderhaut-Keimungs-Assay zur Ex-vivo-Untersuchung der okulären mikrovaskulären Proliferation

Retinalen Pigment Epithelzellen könnte als eine Zelle-Ersatz-Therapie für die fortgeschrittene Form der trockene altersbedingte Makuladegeneration dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen Modells der geografischen Atrophie und die subretinale Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment Epithelzellen auf dieses Modell der Krankheit.

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Das Ziel dieses Protokolls ist, demonstrieren die Kultivierung der retinalen Pigment (RPE) Epithelzellen auf Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran. Diese Methode ist geeignet, RPE Zellen Verhalten auf einem kompromittierten extrazelluläre Matrix zu studieren.

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Wir beschreiben eine Methode um eine netzhautgewebe bestehend aus retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gezüchtet auf menschliche amniotic Membranen und deren Vorbereitung für die Verpflanzung in Tiermodellen zu konstruieren.

Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Wir haben ein Protokoll entwickelt, um primäre menschliche Pigmentepithelzellen durch Elektroporation mit dem Gen, das für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) kodiert, unter Verwendung des Sleeping Beauty (SB) Transposon-Systems zu transfizieren. Die erfolgreiche Transfektion wurde durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Immunoblotting und enzymgebundenen Immunassay (ELISA) nachgewiesen.

Elektroporationsbasierte genetische Veränderung von primären menschlichen Pigmentepithelzellen mit dem Dornröschen-Transposon-System

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Transinfektion primärer Iris- und retinaler Pigmentepithelzellen aus verschiedenen Säugetieren (Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schweine und Rinder) vorgestellt. Die Methode eignet sich ideal, um okuläre Gentherapieansätze in verschiedenen Setups für Ex-vivo-Analysen und auf den Menschen übertragbare In-vivo-Studien zu untersuchen.

Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie

Der nicht-menschliche Primat (NHP) ist aufgrund der anatomischen und genetischen Ähnlichkeiten ein ideales Modell für die Untersuchung der zellulären Therapeutika der menschlichen Netzhaut. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur submakulären Transplantation von retinalen Pigmentepithelzellen im NHP-Auge und Strategien zur Verhinderung intraoperativer Komplikationen im Zusammenhang mit der Makulamanipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Wir beschreiben eine Methode, um retinales Pigmentepithel (RPE) effizient von der Netzhaut im menschlichen Auge zu trennen und ganze RPE/Aderhaut-Flatmounts für histologische und morphometrische Analysen des RPE zu generieren.

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

Labortests können den prognostischen Wert der auf der longitudinalen optischen Kohärenztomographie (OCT) basierenden multimodalen Bildgebung der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) nutzen. Menschliche Spenderaugen mit und ohne AMD werden vor der Gewebeschnittierung mittels OCT, Farbe, Nahinfrarot-Reflexions-Scanning-Laser-Ophthalmoskopie und Autofluoreszenz bei zwei Anregungswellenlängen abgebildet.

Ex Vivo OCT-basierte multimodale Bildgebung menschlicher Spenderaugen zur Erforschung der altersbedingten Makuladegeneration

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung der menschlichen Limbus-Nischenzellen vor.

Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen

Lernen Sie die Bereicherung der Bruch-Membran aus postmortalen menschlichen Augen für biochemische Analysen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinen und Kohlenhydraten zur Erforschung altersbedingter Makuladegeneration.

Bereicherung der Bruch-Membran von menschlichen Spender Augen

Weitere Videos entdecken