Generation und Kultur der Blut Outgrowth Endothelzellen aus menschlichen peripheren Blut-

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zuverlässig Endothelzellen aus dem Blutwachstum aus dem menschlichen peripheren Blut zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Gefäßbiologie zu beantworten, z. B. wie die Dysfunktion von Endothelzellen zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie der pulmonalen arteriellen Hypertonie oder der von-Willebrand-Krankheit beiträgt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie konsistent eine stabile Population von Endothelzellen aus dem Blutwachstum aus einem kleinen Volumen an peripherem Blut bei Erwachsenen erzeugt. Das Verfahren wird von Christopher Wang, dem Doktoranden aus meinem Labor und Laborprofessor Nicholas Morrell, demonstriert.

So starten Sie dieses Verfahren. Geben Sie für jeden Spender drei Milliliter Natriumcitrat in jedes der beiden konischen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann 30 Milliliter des gesammelten Blutes in jedes Röhrchen.

Drehen Sie die Röhrchen zum Mischen zwei- bis dreimal vorsichtig um. Verdünnen Sie anschließend 60 Milliliter Blut mit DPBS im Verhältnis eins zu eins und kippen Sie das Röhrchen mit dem Dichtegradienten. Zentrifugationsmedium in einem Winkel von 20 Grad mit der Arbeitsfläche mit einer Pipettenhilfe und einer serologischen 25-Milliliter-Pipette zentrieren.

Schichten Sie langsam 21 Milliliter verdünntes Blut auf das Medium. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 400 mal G für 35 Minuten bei Raumtemperatur mit dem Beschleuniger und dem Abbruch Während der Zentrifugation reparieren Sie eine Kollagenlösung bei 50 Mikrogramm pro Milliliter durch Verdünnen von Brühe. Kollagen Typ eins in 10 Milliliter 0,02 molare Essigsäure steril.

Filtern Sie die Kollagensuspension vor der Verwendung. Geben Sie anschließend 7,5 Milliliter Kollagenlösung in einen T 75-Zellkulturkolben. Lassen Sie den Kolben eine Stunde lang bei Raumtemperatur überziehen.

Nach einer Stunde Beschichtung die Kollagenlösung aspirieren und 10 Milliliter DPBS in den Kolben pipettieren, um die restliche Essigsäure wegzuwaschen. Saugen Sie das DPBS ab und wiederholen Sie den Waschvorgang erneut. Geben Sie dann fünf Milliliter BOEC-Generationsmedium in den Kolben, um zu verhindern, dass die Kollagenbeschichtung austrocknet, bis die Zellsuspension für die Beschichtung bereit ist.

Nach der Dichtegradientenzentrifugation die Buffy-Coat-Schicht vorsichtig mit einer sterilen Kunststoff-Transferpipette auffangen und das Übertragen des Dichtegradientenmediums vermeiden. Die Entnahme von Buffy Coat sollte etwa 20 Milliliter Cel-Suspension und Plasma aus jedem Röhrchen ergeben. Danach verdünnen Sie die mononukleäre Zellsuspension in DPBS in einem Verhältnis von eins zu eins und invertieren Sie, um sie zu mischen, zentrifugieren Sie dann 20 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 mal G, wobei Bremse und Gaspedal nach der Zentrifugation auf Maximum eingestellt sind, saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie jedem Pellet einen Milliliter BOEC-Erzeugungsmedium hinzufügen und wiederholt auf und ab pipettieren, alle Zellsuspensionen zusammenziehen und die Zellen nachfüllen Gesamtvolumen auf 10 Milliliter mit dem restlichen Medium.

Um eine Schätzung der Gesamtzellzahl zu erhalten, verdünnen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension mit 490 Mikrolitern türkischer Lösung, um die roten Blutkörperchen zu reinigen. Zählen Sie dann eine 10-Mikroliter-Probe der verdünnten Zellsuspension mit einem Hämozytometer. Anschließend wird die Zellsuspension in einen mit Kollagen überzogenen T 75-Kolben plattiert.

Das mittlere Volumen auf bis zu 15 Milliliter pro Kolben und Kultur auffüllen. Die Zellen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5% CO2 enthält. Wechseln Sie nun das Medium alle zwei Tage, indem Sie 15 Milliliter frische BOEC-Erzeugung hinzufügen, Medium für Wochenenden in die Kultur, der Mediumwechsel kann auf alle drei Tage verschoben werden.

Überwachen Sie den BOEC-Kulturkolben an den Tagen sieben bis 14 auf das Auftreten von Bienenvölkern. Identifizieren Sie die Kolonien als kreisförmige Gruppen von Zellen, die die klassische endotheliale Kopfsteinpflastermorphologie aufweisen. Sobald eine Kolonie oder mehrere Kolonien im Kolben identifiziert sind, wird mit dem Mediumwechsel fortgefahren und die Kolonien auf etwa 1000 bis 2000 Zellen pro Kolonie anwachsen lassen.

Bestimmen Sie vor dem Verpacken die Zellzahl pro Kolonie durch eine grobe visuelle Schätzung. Dann passieren Sie die Zellen, indem Sie die Kolben zweimal mit 10 Millilitern DPBS spülen. Geben Sie fünf Milliliter von einem x Trips in EDTA und inkubieren Sie fünf Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Nach fünf Minuten neutralisieren Sie das Trypsin mit 10 Millilitern FBS-haltigem Medium und bringen Sie die Zellen durch wiederholtes Pipettieren in Suspension. Anschließend wird die Suspension fünf Minuten lang bei 300 mal G zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Zellen in 15 Millilitern frischem BOEC-Medium, und plattieren Sie die gesamte Zellsuspension in einen neuen T 75-Kolben ohne Kollagenbeschichtung. Fortsetzen.

Das Medium ändert sich, bis die Zellen zusammenfließen und passieren. Die Zellen werden wie zuvor beschrieben für die fortgesetzte Verpackungsplatte verwendet. Nicht weniger als 750.000 Zellen pro T 75-Kolben, da niedrige Zelldichten dazu führen können, dass die BO eecs nicht mehr proliferieren.

Bei diesem Verfahren beäugt Trypsin die Zellen und zentrifugiert sie fünf Minuten lang bei 300-fachem G. Danach aspirieren Sie die Snat und resuspendieren die Zellen in 10 Millilitern Medium. Entnehmen Sie eine 10-Mikroliter-Probe der Zellsuspension und führen Sie eine manuelle Zellzählung durch.

Anschließend zentrifugieren Sie die Probe erneut und resuspendieren sie in eiskaltem Kryokonservierungsmedium bei zweimal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter. Geben Sie 0,5 Milliliter Zellsuspension in jedes Fläschchen und stellen Sie die Fläschchen in ein eiskaltes Isopropanol-Kryokonservierungsgefäß. Stellen Sie das Gefäß dann für mindestens zwei Stunden in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius, bevor es auf flüssigen Stickstoff umgefüllt wird.

Um die Zellen aufzutauen, geben Sie 10 Milliliter vorgewärmtes Medium in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad unter leichtem Rühren auf, bis nur noch ein kleiner Eiskristall im Fläschchen übrig ist. Geben Sie dann den Inhalt des Fläschchens tropfenweise in das konische Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie es fünf Minuten lang mit dem 300-fachen G herunter.

Anschließend wird der Überstand abgesaugt und das Zellpellet wieder aufgehängt. Die Zellsuspension in den Kolben T 75 geben und das Medium auf 15 Milliliter auffüllen. In diesem Bild sind die Auswuchskolonien, die als Ansammlungen endothelähnlicher Zellen erscheinen, in einer Kopfsteinpflaster-Monoschicht angeordnet und proliferieren radial von einem zentralen Punkt um die Auswuchskolonien aus. Die adhärenten monozytären Zellen, die in frühen Kulturen die überwiegende Mehrheit der Zellen ausmachen. Nach dem Verpacken übernehmen die hochproliferativen Bo Oecs die Kultur, da die nicht-proliferativen monozytären Zellen entweder absterben oder sich nicht wieder anheften.

Hier ist ein repräsentatives Immunfluoreszenzbild von Bo Oecs Immunos, die mit einem Antikörper gegen den Endothelzelloberflächenmarker CD 1 44 gefärbt wurden. Und in diesem Bild waren B oecs immungefärbt mit einem Antikörper gegen das Blutglykoprotein von Willebrand-Faktor. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Blutproben so schnell wie möglich und vorzugsweise innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme zu verarbeiten. Nach diesem Verfahren können Zellen verwendet werden, um die Funktion von Endothelzellen in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen, oder in induzierte flury potente Stammzellen umprogrammiert werden, um sie in Differenzierungsstudien, Krankheitsmodellierung oder Zelltherapie nach ihrer Entwicklung zu verwenden. Diese Technik ebnete uns den Weg, um den Einfluss von Mutationen im Knochen-Morphogenetischen Proteinrezeptor vom Typ zwei auf die Pathogenese der pulmonalen arteriellen Hypertonie sowohl in den Endothelzellen des Patientenblutwachstums als auch in den von IPSC abgeleiteten Stimmungsmuskelzellen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man aus einem kleinen Volumen peripheren Blutes stabile Endothelzellen für das Blutwachstum erzeugt und charakterisiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit nicht untersuchtem menschlichem Blut äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe und ein Laborkittel getragen werden sollte.