Name: Isolierung und Analyse der Zusammensetzung von Pflanzen Cuticle Lipid Polyester Monomere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Analyse von Cutin-Lipidpolyestern aus Pflanzengeweben. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Monomerzusammensetzung mittels GC-MS für Pflanzenphysiologie und Stressantwortforschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA Zuschuss an S.J., und durch einen NSERC-Discovery Zuschuss an I.M. Wir danken Richard Bourgault, Meghan Rains und Amanda Fluke für ihre technische Unterstützung. Die Samen der att1-1- und att1-2-Mutanten wurden freundlicherweise von Dr. Jian-Min Zhou, Institut für Genetik und Entwicklungsbiologie, Peking, China, zur Verfügung gestellt.

Hinweis: Dieses Protokoll wurde von Bonaventure et al angepasst. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Schritte 1-5 sind in Abbildung 1 zusammengefasst. 1. Tissue Delipidierung Hinweis: Spülen Sie alle Glaswaren und Mützen mit Chloroform, ließ trockenen unter Abzug, vor der Verwendung. ACHTUNG: Führen Sie Gewebehomogenisierung und alle Lösungsmittel-Transferschritte unter Abzug; immer tragen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Spritzschutzbrille, um den direkten Kontakt mit Chemikalien zu vermeiden und um die Proben vor Verunreinigung zu schützen. <ol><li> Vorheizen Wasserbad und Heizblock auf 85 ° C. </li><li> Ein Gewicht von etwa 0,5 g jeder Blattprobe in vorgewogene 20 mm x 125 mm Glasröhrchen mit Polytetrafluorethylen (PTFE) -Flächen Schraubverschlüssen. Fügen Sie vier Wiederholungen pro Probe. </li><li> Platzieren 2-Propanol in einem Erlenmeyerkolben (etwa 125 ml; 25 ml pro g sample). Hinzufügen von 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (auch als butyliertes Hydroxytoluol, BHT bezeichnet) zu einer Endkonzentration von 0,01% (w / v). Anmerkung: BHT Hinzufügen von einem 5% (w / v) Stammlösung in Methanol (BHT trägt zur Minimierung Oxidation ungesättigter Fettsäuren). </li><li> Vorheizen 2-Propanol-Lösung auf 85 ° C im Wasserbad. </li><li> Hinzuzufügen 12 ml heißem 2-Propanol-Lösungsmittel zu jedem Probenröhrchen und Hitze für 15 Minuten bei 85 ° C im Heizblock. Dieser Schritt inaktiviert Lipasen, die aus zerstörten Zellen freigesetzt werden können. </li><li> Lassen Rohre abkühlen auf Raumtemperatur und schleifen Gewebe gründlich mit Homogenisator, bis eine homogene Suspension entstanden ist. </li><li> Legen Sie die Proben in einem Orbitalschüttler und schütteln Sie für 1-2 Stunden bei 100 UpM und Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Überstand verwerfen. </li><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen 2-Propanol und schütteln für 12 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Überstand verwerfen. </li><li> In 12 ml CHCl 3: CH 3 OH (2: 1, v / v) bis zu dem Rest (25 ml pro g Probe) und schüttelt über Nacht bei 100 rpm und Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Überstand verwerfen. </li><li> Hinzuzufügen 12 ml CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, v / v) bis Rest und schütteln über Nacht bei 100 rpm und Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Lösungsmittel zu entfernen. </li><li> Lassen Proben trocknen unter Abzug Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Der Luft trocknen den Rückstand und legen Sie dann in einem Vakuumexsikkator über wasserfreiem CaCl 2 oder CaSO 4 bis zur Gewichtskonstanz (3-5 Tage) erreicht ist. </li></ol> 2. Depolymerisation: Methanolyse mit Natriummethoxid (Abbildung 2) ACHTUNG: Führen Sie die Schritte 2,3 bis 2,4, 2,7 bis 2,8, 2,10 bis 2,11, 2,13 bis 2,15 und 2,17 bis 2,18 unter Abzug; immer tragen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Spritzschutzbrille. <ol><li> Vorheizwärmetauscher Block auf 60 ° C. </li><li> Wiegen Teströhrchen mit dem trockenen Rückstand (wichtig für die weiteren Berechnungen). </li><li> In internen Standards in jedes Röhrchen: 25 &amp; omega; L Methyl heptadecanoate (1 mg / ml Stamm) und 25 &amp; mgr; l ω-Pentadecalacton (1 mg / ml Stamm). </li><li> In 0,9 ml Essigsäuremethylester, 1,5 ml Natriummethylat und 3,6 ml Methanol zu jedem Röhrchen und diese abschließen. Alternativ bereiten eine Reaktionsmischung mit diesen drei Reagenzien und fügen 6-ml-Teilmengen zu jeder Probe. </li><li> Wärme Proben für 2 Stunden bei 60 ° C und Vortex periodisch in Intervallen von 15 min. </li><li> Lassen Proben abkühlen auf Raumtemperatur. </li><li> 10 ml Methylenchlorid (CH 2 Cl 2) und 1,5 ml Eisessig, um die Fettsäuremethylester zu extrahieren. </li><li> In Kochsalzlösung (0,5 M NaCl) in jedes Röhrchen und Kappe zu füllen. </li><li> Wirbel Proben für 1 min und zentrifugieren für 10 min bei 800 x g. </li><li> Übertragen Sie die organische Phase (unten) bis mittlere saubere Röhrchen (16 x 125 mm Glasröhrchen mit PolyTetrafluorethylen (PTFE) -Flächen Schraubkappe). </li><li> In Kochsalzlösung (0,5 M NaCl) in jedes Röhrchen und Kappe zu füllen. </li><li> Wirbel Proben für 1 min und zentrifugieren für 10 min bei 800 x g. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Phase und wiederholen Sie die Schritte von 2,11 bis 2,12. </li><li> Entfernen Sie das gesamte wässrige (obere) Phase. </li><li> Wasserfreies Natriumsulfat (Na 2 SO 4) zu dem Lösungsmittel, Verschließe die Röhrchen und Wirbel für 1 min; Proben können nun bis zum nächsten Tag gelassen werden. An dieser Stelle Proben können über Nacht im Abzug belassen werden. </li><li> Zentrifugieren für 2 Minuten bei 800 · g, um die Na &amp; sub2; SO &amp; sub4; -Salz im Boden zu verdichten. </li><li> Übertragen Sie die organische Phase zu einem kleinen Glaseinwegrohr (13 x 100 mm Glasröhrchen mit Polytetrafluorethylen (PTFE) -Flächen Schraubkappe). </li><li> Man dampft das Lösungsmittel zur Trockene unter Stickstoff und fahren mit dem Derivatisierungsschritt. Wenn nicht sofort verarbeitet, eingedampft Proben bei -20 ° C (Proben kann eine sein,lso vor dem Verdampfungsschritt gespeichert). </li></ol> 3. Herstellung von Derivaten für die Gaschromatographie ACHTUNG: Führen Sie die Schritte 3.1.2 und 3.1.5 - 3.1.8 unter einer Abzugshaube; immer tragen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Spritzschutzbrille. <ol><li> Trimethylsilylderivate <ol><li> Vorheizwärmetauscher Block auf 100 ° C. </li><li> 100 ul Pyridin und 100 ul BSTFA (N, O-Bis-trimethylsilyl trifluoracetamid) in jedes Röhrchen und diese abschließen. </li><li> Wärme Proben bei 100 ° C für 10 min. </li><li> Lassen Proben abkühlen auf Raumtemperatur. </li><li> Verdampfen Proben unter Stickstoff bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie die Anwendung von Wärme, um Proben, sind Monomere sehr volatil in diesem Stadium. </li><li> Gib 500 ul einer 1: 1 (V / V) Heptan: Toluol. </li><li> Wirbel Proben für 1 min und zentrifugieren für 2 min bei 800 x g. </li><li> Proben, die GC-Vials hinzufügen und fahren Sie mit GC / MS-Analyse. </li></ol></li><li> AcetylDerivate Hinweis: Zur Acetylierung ändern Schritte 3.1.1-3.1.3 oben wie folgt (nicht im Video gezeigt); Schritte 3.1.4-3.1.8 sind die gleichen: <ol><li> Vorheizwärmetauscher Block auf 60 ° C. </li><li> 100 ul Pyridin und 100 ul Essigsäureanhydrid (Ac 2 O) in die Röhrchen. </li><li> Wärme Proben 1 Stunde bei 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS-Analyse <ol><li> Verwenden Sie ein HP-5-Kapillarsäule (30 mx 0,25 mm x 0,25 um Filmdicke) oder gleichwertig (dh., 5% Diphenyl, 95% Dimethylpolysiloxan). Programmieren Sie die GC mit Helium-Trägergasstrom von 1,5 ml / min eingestellt und die Ofentemperatur von 150 bis 300 ° C bei 3 ° C / min programmiert. </li><li> Verwenden Teileinspritzung (Splitverhältnis 1:10), und legen Massenspektrometer-Modus über 40 bis 600 amu (Elektronenstoß-Ionisation) scannen. </li><li> Erstellen Sie eine Sequenztabelle einschließlich Lösungsmittel (blank), WT und Mutanten-Wiederholungen, jeder mit dem angegebenen Cutin Analyseverfahren. </li><li> Last Lösungsmittelund Probenfläschchen auf dem Karussell, fügen Hexan Spritzenspülung Fläschchen in den Autosampler wenn nötig, und starten Sie die Sequenz. Nachdem die Sequenz vollendet ist, sind insgesamt Ionenchromatogramm Spuren für alle Proben zur Verfügung. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Identifizieren Lipid-Polyester-Monomere durch den Vergleich der einzelnen Spitzenmassenspektrum zu veröffentlichten Massenspektren oder durch die Suche Kommerzielle Bibliothek, falls verfügbar. </li><li> Für jedes identifizierte Peak im Gesamtionenstrom-Chromatogramm, verwenden ihre jeweiligen Retentionszeiten, die Bereiche auf der Integrationsergebnisse Tabelle aus der GC / MS-Software (Supplemental Abbildung 1) zu finden. </li><li> Für jedes Monomer (Spalten AB), fügen Sie die Bereichswerte im Integrationstabelle (Supplemental Abbildung 1, Spalte D) festgestellt, dass die entsprechende Spalte für jeden replizieren Probe in der Excel-Tabelle von Monomeren (Supplemental Datei 2, Spalten CF), das ist eine Tabellenkalkulation, um Arabidopsis zu quantifizierenCutin TMSi Derivate. Verwenden STADT Datei-3, wenn acetylierten Derivaten anstelle vorbereitet. </li><li> Fügen die Bereiche der internen Standards (IS) an den IS-Säulen (HK). Für jene Monomere, die nicht derivatisiert sind, nämlich Fettsäuremethylester (FAME) und Dicarbonsäuredimethylester (DCA DME), verwenden 17: 0 FAME (IS1), wie es für die Quantifizierung (violett schattierten Zellen in der Monomer-Tabelle; Supplemental Files 3.2). Für hydroxylierten Monomeren, einschließlich primäre Alkohole, Ferulasäure und ω-Hydroxysäuren, verwenden 15: 0 15-Hydroxy FAME (IS2), wie der Wahl für die Verbindung, die Quantifizierung (grün-shadded Zellen in der Monomer-Tabelle; Zusatzdateien 2/3) . </li><li> In trockenen Flügelgewicht für jede Wiederholung, um Spalten AX-BA (Supplemental Datei 2) oder AQ-AT (Supplemental Datei-3); Alternativ scannen Blätter Flächen berechnen und fügen Bereich Werte in das Monomer Tabelle Monomers Lasten pro Einheit zum Ausdruck bringenOberfläche. </li></ol>

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Im Gegensatz zu anderen Biopolymeren wie DNA und Proteine ​​werden Pflanzenlipid Polyester nicht aus einer Vorlage hergestellt. Stattdessen ihre Kompositionen sind abhängig von der Spezifität der in den Geweben, die diese extrazellulären Polymeren machen vorhandenen Enzyme. Als solche chemischen Analysen der einzelnen Komponenten sind wichtig, um Lipidpolyestermasse zu verstehen. Chemische Verfahren, um Esterbindungen zu spalten, umfassen Verseifung, Hydrogenolyse, sauer katalysierte Transmethylierung und basenkatalysierte Trans 2. Jede von ihnen hat Vorteile und Nachteile. Verseifung produziert freie Fettsäure-Hydroxy-Säuren, die Nebenreaktionen eingehen können. Hydrogenolyse mit Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH 4) 16 für Cutin Analyse 7 verwendet. Hydrogenolyse reduziert funktionalisierten Kohlenstoffatomen zu Alkoholen und die ursprünglichen Strukturen müssen durch deuteriolysis mit Lithiumaluminiumdeuterid (LiAlD 4) zu entnehmen. DasNachteil dieser Vorgehensweise ist das Erfordernis hoher Auflösung GC / MS, den Grad der Deuterierung der Fett Polyolen Zuordnungen ihrer Strukturen bilden zu vergleichen. Säure-katalysierte Umesterung mit methanolischer Bortrifluorid (BF 3) ist mehrfach in Cutin und Suberin Depolymerisationen 8,17,18 verwendet, aber das Reagenz hat eine begrenzte Lagerfähigkeit und kann zu Artefakten aufgrund von Reaktionen 15 her einzuführen. Methanolischer Schwefelsäure ergibt auch Methylester von den Monomeren, aber mit größeren Anteilen von 2-Hydroxy-Fettsäuren, die vermutlich nicht wahr sind Lipidpolyesterkomponenten im Vergleich zu anderen Verfahren 10. Die in diesem Protokoll beschrieben NaOMe-katalysierten Umesterungsverfahren produziert Fettsäuremethylester, die durch Silylierung der Hydroxylgruppen derivatisiert sind, wodurch charakteristische Massenspektren zur Identifizierung oder durch Acetylierung, stabilere Derivate von Hydroxylgruppen fo liefernr Quantifizierung. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass die Hydrolyse in Konkurrenz Umesterung, wenn Wasser in der Reaktion vorhanden ist. Wasser reagiert mit NaOMe (den Katalysator) und erzeugt NaOH, was wiederum hydrolysiert Fettsäuremethylestern zu freien Säuren (2D) zu erhalten. Dies ist eine unerwünschte Nebenreaktion, weil zwei Peaks für jede Fettsäure vorhanden sein: einem Methylester und einem TMSi Esterderivat, so verkomplizieren die Analyse. Verwendung von wasserfreien Reagenzien und Zugabe von Methylacetat als ein Co-Lösungsmittel mit Verseifung konkurrieren somit entscheidenden Schritte zur Hydrolyse (2D) zu verhindern. Cutin und Suberin enthalten zwischen 1 und 26% Glycerin 4. Jedoch wird dieses Monomer nicht durch die in diesem Protokoll beschriebenen Versuchsbedingungen festgestellt werden. Glycerin ist stark hydrophil und im Gegensatz zu den Fettsäuremethylester-Monomeren, während das wässrige Lösungsmittel-Waschschritte eliminiert werden. Diese Einschränkung auch einpplies zu anderen Cutin Depolymerisationsverfahren, aber Glycerin in der wässrigen Phase nach der Umesterung unter Verwendung eines enzymatischen Verfahrens erhalten bestimmt werden. Alternativ kann sie unter Verwendung von milderen Bedingungen ohne weitere Wasserentnahme quantifiziert werden (z. B. 0,05 M NaOMe), um alle Monomere zu detektieren, einschließlich Glycerin 19,20 .Obwohl zwecks Quantifizierung Glycerin nützlich milden Bedingungen in der Regel geben unvollständige Depolymerisation von Cutin und Suberin. Wenn ein GC zu einem Flammenionisationsdetektor (FID) angeschlossen ist, verfügbar sind, können alle Wiederholungen in diesem Instrument zur quantitativen Zwecken ausgewertet werden, wonach Peaks einer repräsentativen Probe wurden durch GC / MS identifiziert. Alternativ können Monomere in den GC / FID Spuren identifiziert, wenn ihre Retentionsindizes bekannt sind. Der Flammenionisationsdetektor eine besonders hohe Empfindlichkeit und eine breite Palette der Verhältnismäßigkeit, der entscheidend für die Quantifizierung von größeren und kleineren Probenkomponenten istin einzelnen Läufen. Darüber hinaus ist es robust und einfach zu warten und zu bedienen 15. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die zuverlässige und reproduzierbare Isolierung, Identifizierung und Quantifizierung von pflanzlichen Lipid Polyestermonomere, wodurch die chemische Charakterisierung der Mutanten, die in der Zusammensetzung von einer oder mehreren Lipid Polyestermonomere abweichen. Das Verfahren ist skalierbar und kann leicht angepasst werden, um sowohl kleine als auch größere Mengen von verschiedenen Pflanzenmaterialien, einschließlich Wurzeln, Samen, Blätter, Stängel und Blüten zu verarbeiten. Massenspektraldaten von Lipid Polyestermonomere aus vielen Spezies wurden veröffentlicht z. B. 21-26 und stellen wertvolle Mittel zur unbekannten Monomere zu identifizieren, wenn eine Anpassung dieses Protokoll auf andere Gewebe und / oder Spezies. Dieses Verfahren ist anwendbar auf Untersuchungen der Biosynthese, Regelung und Verteilung von Lipid Polyestern in höheren Pflanzen.

Gefäßpflanzen verlassen sich auf extrazellulären Schichten, die als wasserdichte Barrieren zwischen Pflanzengewebe und der äußeren Umgebung zu funktionieren. Diese lipophilen Zellwand-assoziierten Strukturen beschränken pathogenen Infektionen und regulieren den passiven Transport von Gasen, Wasser und gelöste Stoffe in und aus Pflanzengeweben 1. Solche Barrieren sind die Kutikula, einem synapomorphic Struktur einzigartige Pflanzen 2 und verschiedenen Suberin haltigen Diffusionsbarrieren. Das Häutchen eine oleophile Schicht durch epidermale Zellen synthetisiert und an sie gebunden über eine pektinösen Schicht auf der extrazellulären Seite der Zellenwand 3-5. Er umhüllt die primären Luft Organe höherer Pflanzen, die als eine vitale Schnittstelle zwischen Pflanzengewebe und die Umwelt. Cutin, die Strukturmatrix der Kutikula und Suberin gibt zwei unlöslichen Glycerolipid Polyester mit Lösungsmittel extrahierbaren Wachse 2,4 verbunden. Diese polymeren lipids sind aus gesättigten und ungesättigten Fettsäurederivaten besteht und sowohl strukturell als auch funktionell ähnlich. Jedoch sind sie unterscheidbar durch charakteristische Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung und die Abscheidungsstellen. Suberin ein aliphatischer Polyester ist in den Zellwänden bestimmter äußeren und inneren Geweben Bildung einer Sekundärwand. Korkartige Gewebe schließen periderms von Wurzeln, Knollen und Baumrinde, Wurzeln Endodermis, Samenschale Schichten und geheilten Wunden 2. Im Gegensatz Cutin, Suberin enthält der Polyester in der Regel Alkohole, gesättigte und mono-ungesättigten Dicarbonsäuren, und einen großen Anteil der sehr langkettigen Monomeren (C≥20). Cutin ist das häufigste Lipid Polyester in Gefäßpflanzen 6 und wird von Glycerin und C16-C18 umgeesterten Fettsäurederivate wie Hydroxy und Hydroxy-Epoxy-substituierten Fettsäuren 4 besteht. Während die Zusammensetzung der Cutin Polymerenvariiert über tracheophyte Arten, die vorherrschende Primär Monomere sind 10, 16-Dihydroxy 16: 0, 18-Hydroxy-9,10-Epoxy-18: 0 und 9,10,18-Trihydroxy 18: 0-Fettsäuren. 2 Dicarbonsäure 7,8: Interessant ist, dass Arabidopsis Blatt und Stamm Cutin hauptsächlich aus 18 zusammengesetzt ist. Pflanzen cuticles präsentieren auch eine beträchtliche Variabilität in der Dicke im Bereich von wenigen Nanometern bis einigen Mikrometern. 9 Da Kutikula Isolation ist ein mühsamer und zeitraubender Schritt, insbesondere für sehr dünne Blatt cuticles wie die von Arabidopsis thaliana 8. Verfahren, die Kutikula Isolierung umgehen, wurden entwickelt und validiert 7,8. Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll, um die Monomerzusammensetzung von Cutin in Arabidopsis thaliana Blätter von Natriummethylat (NaOMe) -katalysierte Depolymerisation und anschließender Gaschromatographie / Massenspektrometrie (GC / MS) Analyse zu studieren. Dieses Protokoll bietet eine robuste Methode zur Untersuchung der ZusammenarbeitmPosition von Pflanzenlipid Polyester ganz delipidiertem Gewebe und hat sich von früher berichteten Protokolle 7,10,11 angepasst. Whole Gewebeproben werden zunächst homogenisiert und abschließend delipidierten, Entfernen von Lösungsmittel extrahierbaren Lipide einschließlich Kutikula und epikutikulären Wachse, Membranlipiden und Triacylglyceride. Zellwand-angereicherten Reste werden dann von Natriummethoxid-katalysierten Methanolyse in ihre konstituierenden Methylester-Monomeren depolymerisiert. Fettsäuremethylester werden nach Ansäuerung extrahiert, derivatisiert werden, um ihre entsprechenden Trimethylsilyl oder Acetyl-Derivaten erhalten. Derivatisierte Reste sind stark flüchtig und können aus einer Gaschromatographiesäule zu einem angemessenen Temperatur ohne Veränderung ihrer strukturellen Konformation während der GC / MS-Analyse eluiert werden.

<table><tbody><tr><td>Chemikalien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Lösungsmittel zur Entfettung</td></tr><tr><td>Wasserfreies Natriumsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>Derivatisierungsmittel</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoracetamid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Derivatisierungsmittel</td></tr><tr><td>Butyliertes Hydroxytoluol (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antioxidationsmittel</td></tr><tr><td>Calciumchlorid, wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Trockenmittel</td></tr><tr><td>Calciumsuflat, wasserfrei (DRIERITE- 8 MESH mit Indikator)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Trockenmittel</td></tr><tr><td>Chloroform (Trichlormethan)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Organisches Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Säuerungsmittel</td></tr><tr><td>Heliumträgergas, Druckluft</td><td>Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Trägergas, GC/MS</td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Organisches Lösungsmittel</td></tr><tr><td></td><td>Hexane Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Organisches Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Organisches Lösungsmittel, transmethylierungsreaktives</td></tr><tr><td>Methylacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Organisches Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Methylheptadecanoat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Interner Standard (1mg/ml-Lager)</td></tr><tr><td>Methylendichlorid (Dichlormethan)</td><td>Fisher</td><td>Scientific D374</td><td>Organisches Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Stickstoff, komprimiert</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Trägergas, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolacton</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Interner Standard (1 mg/ml Lager)</td></tr><tr><td>Pyridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Co-Lösungsmittel für die Derivatisierung</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>Salzlösung</td></tr><tr><td>Natriummethoxid (25 Gew.-%)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nukleophiles</td></tr><tr><td>Toluol</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Organisches Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Pflanzenwachstumszubehör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX wird für den Anbau von Arabidopsis-Pflanzen empfohlen (Eddy, R. und Hahn, D.T., 2012, http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest Feuchte-Kuppel&nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest Pflanzenschalen (22x11in)</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Quadratische Gewächshaustöpfe, 3,5 Zoll&nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>Allzweck-Pflanzendünger, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>/ A</td><td></td></tr><tr><td>Glaswaren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm Glasreagenzglas mit teflonbeschichtetem Schraubverschluss</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125 mm Glasreagenzglas mit teflonbeschichtetem Schraubverschluss</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>20 x 125 mm Reagenzgläser aus Glas mit teflonbeschichtetem Schraubverschluss</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC-Fläschchenkappen</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC-Fläschchen-Mikroeinsätze</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>GC-Fläschchen</td><td>National Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter Analytische</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bauchtänzerin</td><td></td><td></td><td>Zu diesem Zweck kann ein Shaker verwendet werden, wenn Bauchtänzerin nicht verfügbar</td></tr><tr><td>DB-5 Kapillare GC Säule</td><td>J& W Scientific, Kalifornien, USA; &nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0,25 mm x 0,25 &mu; m Schichtdicke</td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT Einzelquadrupol-Massenspektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stickstoffverdampfer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron Homogenisator</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 Gaschromatograph</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zweistufiger Regler</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und analyse der zusammensetzung von pflanzen cuticle lipid polyester monomere

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Landpflanzen produzieren extrazelluläre aliphatische Biopolyester, die die Zellwände bestimmter Gewebe modifizieren. Epidermale Zellen synthetisieren Cutin, einen Polyester aus Glycerin und modifizierten Fettsäuren, der das Gerüst der Kutikula bildet, die die Oberflächen der Luftpflanzen bedeckt. Suberin ist ein verwandter Lipidpolyester, der sich an den Zellwänden bestimmter Gewebe ablagert, einschließlich der Wurzelendodermis und des Periderms von Knollen, Baumrinde und Wurzeln. Diese Lipidpolymere sind in ihrer Zusammensetzung bei Pflanzenarten sehr unterschiedlich und unterscheiden sich oft zwischen Geweben innerhalb einer einzigen Spezies. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der Monomerzusammensetzung von Cutin in Arabidopsis thaliana-Blättern durch Natriummethoxid (NaOMe)-katalysierte Depolymerisation, Derivatisierung und anschließende Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC/MS)-Analyse. Diese Methode kann verwendet werden, um die Monomere von unlöslichen Polyestern zu untersuchen, die aus ganzen entlipidten Pflanzengeweben isoliert wurden, die entweder Cutin oder Suberin tragen. Die Methode kann nicht nur zur Charakterisierung der Zusammensetzung von Lipidpolymeren in Spezies eingesetzt werden, die bisher nicht analysiert wurden, sondern auch als analytisches Werkzeug in vorwärts- und rückwärtsgenetischen Ansätzen zur Beurteilung der Funktion von Kandidatengenen.

Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokoll wird bis zu Lipid Polyester-Monomere bestimmen, eingestellt und minimiert die Beiträge von Nicht Cutin Lipide 10 Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den Test, die insgesamt dauert zwischen 8 (dh Cutin oder Suberin.) -. 10 Tage (von der ersten Gewebeernte auf den Erhalt GC-Daten), je nachdem wie lange Proben trocknen gelassen. Der ausgewählte basenkatalysierte Methanolyse (Abbildung 2) Verfahren, um Polyester zu depolymerisieren, wurde zuvor für Arabidopsis Samen, die sowohl Cutin und Suberin enthalten validiert. Die Gewebe werden zuerst homogenisiert und abschließend delipidierten um Lösungsmittel extrahierbaren Lipide zu entfernen. Der Rückstand Ausbeute nach der Extraktion, als Prozentsatz der anfänglichen Frischgewicht, ist in der Regel 6% für A. thaliana Col-0 Blättern. Zellwand angereicherte Reste sind in einem Vakuumexsikkator getrocknet und dann durch in ihre konstituierenden Methylester-Monomeren depolymerisiertbasenkatalysierte Trans. Zweistündigen Inkubation wurde als die kritische Zeit für die ordnungsgemäße Depolymerisation und Rückgewinnung von Lipid-Polyester-Komponenten erforderlich gewählt. Längere Inkubationszeiten führten zu einer Zunahme der 2-Hydroxysäuren; diese möglicherweise stammen aus Membran Sphingolipide 10. Ein typisches Chromatogramm, wenn Arabidopsis-Wildtyp Blatt Cutin ist in Abbildung 3 gezeigt, für O -TMSi-Derivate (3A) und O-Acetyl-Derivate (3B). Jeder Peak wurde durch Vergleich mit Massenspektren aus der Literatur 7,8 und einer öffentlichen Datenbank 12 .Our Video-Protokoll zeigt, wie TMSi Derivate herzustellen identifiziert, aber Proben kann alternativ acetylierte Hydroxylgruppen derivatisieren. Silylierte Derivate sind gut für Identifikationszwecke, weil sie geben Diagnose-Massenspektren. Jedoch acetylierten Derivaten stabiler und eine gute Alternative zur Silylierungeinmal Monomere wurden identifiziert 10. , Zur Verwirklichung dieses Protokolls in den Labors, die nur GC Flammenionisationsdetektor (FID) gekoppelt ist, GC / FID Spuren entsprechend acetylierte Derivate von WT Blatt Cutin Monomeren und zu einem Homolog Reihe von Fettsäuremethylester-Standards werden auch gezeigt (Supplemental Abbildung 4). Diese Methode ist qualitative und quantitative erkennt Unterschiede zwischen Proben, daher der Wert für Mutanten-Analyse. Die Mengen der einzelnen Monomeren werden nach der Methode des internen Standards zur Quantifizierung, dass sie Vergleiche von Monomer Fluss zwischen den Proben bestimmt. Es sollte klargestellt werden, jedoch, dass die Spitzengröße (total ion counts) möglicherweise nicht die Molverhältnisse der Monomeren in der Polyester reflektieren. Wir sind inklusive editierbare Tabellen von Monomeren zu Monomermengen in Arabidopsis Blatt Cutin als Fettsäuremethylester und TMSi Derivate (Supplemental Datei 1), oder Ass berechnen<html> tyl-Derivate (Supplemental Datei 2) von Alkoholen. Diese Tabellen müssen möglicherweise angepasst werden, wenn Proben aus verschiedenen Organen oder Pflanzen extrahiert werden. Als Beispiel haben wir analysiert haben Arabidopsis Thalia na Columbia (Col-0) Wildtyp-Blätter und zwei bisher dadurch Null-Mutante Allele des CYP86A2 / ATT1 Gen att1-1 (m-1) und att1-2 (m-2 ) 13,14. Cytochrom-P450-Monooxygenasen der CYP86A Familie codieren vermeintliche ω-Oxydasen und beteiligen sich an Suberin und Cutin Monomer-Biosynthese. Die Ergebnisse (Figur 4) zeigen, signifikante Verringerungen in den Lasten der drei Hauptlipid Monomere in den mutierten Blätter im Vergleich zu WT-Blätter. In Übereinstimmung mit vorhergesagten Funktion des Enzyms, 16: 0, 18: 2 und 18: 1 Dicarboxylate sind speziell in att1 Mutanten beeinflusst. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53.386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Übersicht über die Lipid Polyester-Analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Figur 2. Mechanismus der NaOMe-katalysierte Transmethylierung Reaktion. Die nucleophilen Methoxidanion greifen die Carbonyl Kohlen von Lipid Polyester eine instabile tetraedrische Zwischenprodukt (A), die leicht dissoziiert in Fettsäuremethylester und Alkoholat-Anionen (B) zu bilden. Diese Alkoholate sind konjugierte Basen, und zur Reaktion mit Methanol, die Regenerierung der katalytisch aktiven Methoxidanion dadurch erhalt zusätzliche Depolymerisationsreaktionen (C). Wenn Wasser in die GegenwartSystem, wird es mit Natriummethoxid reagieren, um Natriumhydroxid, eine starke Basis, die irreversibel hydrolysiert Ester, um unerwünschte freie Fettsäuren produzieren zu bilden. Essigsäuremethylester wird als Co-Lösungsmittels 15 hinzugefügt, um kleine Mengen von Natriumhydroxid innerhalb des Systems (D) entfernen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Gesamt Ionenchromatogramm von Wildtyp-Arabidopsis thaliana Blatt Cutin Monomeren. (A) O -trimethylsilyl (TMSi) ether und (B) Acetat-Hydroxyl-Derivate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </a&gt; <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Abbildung 4. Cutin Monomerzusammensetzung von Arabidopsis thaliana WT und zwei Nullmutante Allele des CYP86A2-Gen. (Mutante-1 = att1-1; Mutant 2 = att1-2) Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert (n = 4) . Ab 13 angepasst ist, mit Erlaubnis von © Blackwell Publishing (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> STADT Abbildung 1. Peak-Integrationsergebnisse Tabelle aus der GC / MS-Software. Peaks entsprechend dem ermittelten Monomere und internen Standards werden durch ihre retenti identifiziert<html> pünktlich (Spalte C) und Flächenwerte sind in der Spalte tabellarisch D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> STADT Datei 2. Inhalts Arabidopsis Cutin Monomere (Trimethylsilylether-Derivate der Hydroxy-Fettsäuremethylester). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Zusätzliche Datei 3. Tabelle Arabidopsis Cutin Monomere (O-Acetyl-Derivate der Hydroxy-Fettsäuremethylester).com / files / ftp_upload / 53.386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> STADT Abbildung 4. GC / FID Spuren von (AB) Fettsäuremethylester (FAME) Retentionsindex-Standards (Peaks werden mit jedem gesättigten FAME Kettenlänge bezeichnet); und (C) acetyliert A. thaliana WT Blatt Cutin Monomeren. Zahlen Sie auf Spitzen entsprechen: 16: 0 FAME (1), Ferulat (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAME (4), 18: 0 FAME (5), Sinapinsäure (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH-18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-Dioh 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dicarbonsäuredimethylester; FAME: Fettsäuremethylester; IS1: interner Standard 1, 17: 0 FAME; IS2: Innen standard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Lipidpolyester stellen die strukturellen Komponenten von zwei Zellwandmodifikationen dar, der pflanzlichen Kutikula und der Suberin-haltigen Diffusionsbarriere. In diesem Video beschreiben wir eine Methode zur Depolymerisation von Cutin aus ganzen entfetteten Blättern. Die Methode kann zur Untersuchung von Mutanten angewendet werden, die entweder in der Cutin- oder Suberin-Biosynthese beeinträchtigt sind.

Isolierung und Analyse der Zusammensetzung von Pflanzen Cuticle Lipid Polyester Monomere

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Wasserpflanzen sind auf extrazelluläre Schichten angewiesen, die als wasserundurchlässige Barrieren zwischen Pflanzengeweben und der äußeren Umwelt fungieren. Diese lipophilen Zell- und assoziierten Strukturen beschränken pathogene Infektionen und regulieren den passiven Transport von Gasen, Wasser und gelösten Stoffen in und aus Pflanzengeweben. Eine wichtige Barriere ist die Pflanzenkutikula, eine komplexe, nur bei Pflanzen vorkommende Struktur.Cutin ist ein unlösliches Glycerin-Lipidpolyester, das die strukturelle Matrix der Cuticula bildet und mit löslichen Wachsen assoziiert ist. Hier stellen wir eine zuverlässige Methode zur Bestimmung der Zusammensetzung von Lipidpolyestern und zur Entfettung von Pflanzengeweben vor. In diesem Protokoll werden gesamte Gewebeproben geerntet, homogenisiert und durch eine Reihe von Lösungsmittel-Extraktionen vollständig abgebaut, um lösliche Lipide zu entfernen, einschließlich cuticularer und epikuticularer Wachse.Triglyceride in Membranlipiden. Die Proben werden anschließend durch natriummethoxidgekatalysierte Methylolyse in ihre Bestandteile aus Lipidmonomeren zerlegt. Es werden Simulationsreagenzien hinzugefügt, um Hydroxylgruppen in die entsprechenden trimethylsilylierten Derivate umzuwandeln, die für die gaschromatographische Analyse geeignet sind.Die derivatisierten Rückstände werden anschließend in GC-Gefäße überführt und zur Analyse in das A-G-C-M-S geladen, wodurch ein Chromatogramm erzeugt wird, das die monomere Zusammensetzung der Biopolyester charakterisiert, die in den extrahierten Proben vorhanden sind. Hier ernten wir Vollblattproben von Wildtyp und zwei Mutanten aus ausgewachsenen Arabidopsis ANA-Pflanzen.Für die Extraktion und Analyse 0,5 Gramm Gewebe in saubere Glasröhrchen geben, die zuvor mit Chloroform vorgewaschen wurden. 100 Milliliter Isopropanol in einen Kolben geben und Butylhydroxytoluol bis zu einer Konzentration von 0,01 % hinzufügen. BHT ist ein Antioxidans, das hinzugefügt wird, um Doppelbindungen und Fettsäuren während der Lösungsmittel-Extraktion vor Oxidation zu schützen. Das Lösungsmittel in einem Wasserbad auf etwa 85 Grad vorwärmen.Fügen Sie 25 Milliliter erhitztes Isopropanol pro Gramm Pflanzengewebe hinzu und inkubieren Sie die Proben im Heiz-LOC bei 85 Grad für 15 Minuten. Lassen Sie die Röhrchen unter Gehör- und Augenschutz auf Raumtemperatur abkühlen. Schließlich mahlen Sie die Proben mit einem Homogenisator, um eine homogene Dispersion zu erzielen, verschließen Sie die Röhrchen mit Schraubverschlüssen und schütteln Sie sie bei 100 U/min für eine bis zwei Minuten. Zentrifugieren Sie die Proben anschließend bei 800 ×g für 10 Minuten.Um die organische Phase von den dichteren Materialien zu trennen, die im Pellet kompaktiert sind, entfernen und verwerfen Sie den Überstand mithilfe einer Pasteur- oder Propent-Pipette. Achten Sie darauf, das Pellet nicht aufzuwirbeln. Geben Sie ein gleiches Volumen Isopropanol bei Raumtemperatur hinzu und schütteln Sie die Proben über Nacht. Die Proben bei 100 U/min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Ich gebe 25 Milliliter einer zwei zu eins-Lösung aus Chloroform und Methanol pro Gramm Gewebe hinzu und schüttele die Proben über Nacht, zentrifugiere und entferne die organische Phase. Anschließend diesen Vorgang mit einer ein zu zwei-Lösung aus Chloroform und Methanol wiederholen.Trocknen Sie das Pellet über Nacht und bringen Sie die Röhrchen aus dem Abzug in einen Vakuumexsikkator mit wasserfreiem Calciumsulfat, um die Proben über einen Zeitraum von mindestens drei Tagen zu dehydrieren oder bis eine konstante Masse erreicht ist. Sobald die Proben gründlich getrocknet sind, können sie durch eine Natriummethoxid-katalysierte Methylierung entsalzt werden. Geben Sie zwei Lösungen interner Standards mithilfe einer Glasspritze in die Röhrchen mit den trockenen Geweben, beginnend mit 25 µL Methyl-HETODECANOAT und 25 µL OMEGA-PENTECANLACTON.Um die tiefe Polymerisation einzuleiten, geben Sie 0,9 Milliliter Methylacetat zu den Proben hinzu, gefolgt von 1,5 Milliliter Natriummethoxid-Katalysator und 3,6 Milliliter Methanol. Inkubieren Sie die Proben zwei Stunden lang bei 60 Grad unter periodischem Wirbeln. Im Reaktionssystem reagieren die Lipidpolyester mit nukleophilen Methoxid-Anionen und bilden instabile tetraedrische Intermediate, die leicht in Fettsäuren, Methylester und Oxid-Anionen dissoziieren. Diese Oxide sind konjugierte Basen und reagieren mit Methanol, wodurch die katalytisch aktiven Methoxid-Anionen regeneriert werden, wodurch zusätzliche tiefe Polymerisationsreaktionen aufrechterhalten werden.Wenn Wasser im System vorhanden ist, reagiert es mit Natriummethoxid unter Bildung von Natriumhydroxid. Eine starke Base, die Polyester irreversibel in unerwünschte freie Fettsäuren umwandelt. Um die Hydrolyse zu verhindern, wird anstelle von Fas Methylacetat zugesetzt, um jegliches Natriumhydroxid im System zu entfernen.Lassen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur abkühlen. Nach der Inkubation extrahieren Sie die Monomere, indem Sie 10 Milliliter Methylenchlorid zu jedem Röhrchen hinzufügen. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter eisessige Säure zu, um die Proben anzusäuern.Füllen Sie die Röhrchen mit 0,5-molarer Natriumchloridlösung, wirbeln Sie gründlich und zentrifugieren Sie einige Minuten lang. Unter dem Abzug. Überführen Sie vorsichtig die untere organische Phase mittels Pipette in saubere, vorher gespülte, mittelgroße Röhrchen.Spülen Sie die Proben erneut mit Kochsalzlösung, wirbeln Sie sie und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang. Entfernen Sie die obere wässrige Phase, geben Sie dann wasserfreies Natriumsulfat als Trockenmittel zu den Proben hinzu, um Spuren von Wasser in der Lösung zu entfernen, wirbeln und zentrifugieren Sie die Proben erneut und überführen Sie das Lösungsmittel in saubere, vorher gespülte kleine Röhrchen. Füllen Sie die Röhrchen in einen Stickstoffverdampfer ein, um das Lösungsmittel zu verdampfen und trockene Rückstände der Monomere zu erhalten. Geben Sie mithilfe einer Glasspritze 100 Mikroliter Purin und 100 Mikroliter B-S-T-F-A hinzu, um Hydroxylgruppen in flüchtige trimethylsilylierte Derivate umzuwandeln.Die Proben 10 Minuten bei 100 Grad inkubieren. Die Röhrchen abkühlen lassen und unter Stickstoffgas verdampfen. 500 µL einer 1:1-HEPTAN-Toluol-Lösung hinzufügen, um die Rückstände rot aufzulösen, und dann kurz zentrifugieren.Überführen Sie die derivatisierten Proben in GC-Gefäße, die 400-Mikroliter-Einsätze enthalten. Verschließen Sie die Gefäße, laden Sie die Proben in ein Gaschromatographiegerät ein, das sie in eine Kapillarsäule zur Analyse injiziert; die Eluate werden anschließend durch ein Quadrupol-Massenspektrometer detektiert. Die Rohdaten, die durch die GC-MS-Analyse gewonnen werden, werden verarbeitet und als Chromatogramm für jede Probe dargestellt.Einzelne Monomere, die verschiedenen chromatographischen Peak entsprechen, werden anhand ihrer spezifischen Massenspektren identifiziert. Mithilfe der internen Standardmethode zur Quantifizierung werden anhand der GC-Retentionszeiten die Mengen der einzelnen Monomere bestimmt, wodurch Vergleiche der Monomer-Häufigkeit und -Zusammensetzung zwischen Proben ermöglicht werden. Hier dargestellt sind überlagerte Chromatogramme aus repräsentativen Analysen von Monomeren, die aus einem Abszessblattgewebe eines Kaninchens freigesetzt wurden, entsprechend dem Wildtyp und zwei Mutantenallelen eines Gens, das ein P450-Monooxygenase-Enzym kodiert, und die deutlich unterschiedliche monomere Profile zeigen.Unsere Ergebnisse zeigen signifikante Unterschiede in der Häufigkeit dreier Hauptbestandteile von Cutin sowie in Wildtyp- und Mutanten-Pflanzen von Arabidopsis. Dieses Protokoll ist eine robuste Methode zur Analyse der Zusammensetzung pflanzlicher Lipidpolyester durch Isolierung, Identifizierung und Quantifizierung ihrer konstituierenden Monomere. Das Verfahren ist skalierbar und kann leicht angepasst werden, um große Mengen verschiedener pflanzlicher Materialien zu verarbeiten, einschließlich Wurzeln, Samen, Blätter und anderer vollständiger Gewebe.Diese Technik eignet sich für Studien zur Untersuchung der Biosyntheseregulation und Verteilung von Cutin und Suberin in höheren Pflanzen.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Kutikula ist eine wachsartige Außenhaut auf Pflanzen, die eine primäre Rolle in Wasserschutzgebieten hat aber auch eine wichtige Barriere gegen das Eindringen von pathogenen Mikroorganismen. In diesem Video zeigen wir die Analyse der Kutikula-Mutanten durch Forward-und Reverse Genetik Ansätze identifiziert.

Verwendung von Arabidopsis-Mutanten zu eceriferum Kutikula Biosynthese entdecken

Pflanzlicher Biomasse ist ein wichtiger klimaneutrale erneuerbare Ressource, die für die Herstellung von Biokraftstoffen verwendet werden könnten. Pflanzliche Biomasse besteht im Wesentlichen aus Zellwände, eine strukturell komplexen Verbundwerkstoff bezeichnet Lignocellulose. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine umfassende Analyse des Inhalts und der Zusammensetzung der Polyphenol-Lignin.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil I: Lignin

Pflanzlicher Biomasse ist ein wichtiger klimaneutrale erneuerbare Ressource, die für die Herstellung von Biokraftstoffen verwendet werden könnten. Pflanzliche Biomasse besteht im Wesentlichen aus Zellwände, eine strukturell komplexen Verbundwerkstoff bezeichnet Lignocellulose. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine umfassende Analyse des Inhalts und der Zusammensetzung der Wand abgeleitet Kohlenhydrate.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

Zusammensetzung der polaren Lipid-Extrakte und der Fettsäure-Zusammensetzung der einzelnen Glycerolipide sind in einem einfachen und robusten Lipid-Profiling Experiment bestimmt. Zu diesem Zweck sind Glycerolipide durch Dünnschicht-Chromatographie isoliert und Transmethylierung ihrer Acylgruppen. Fatty Acyl Methylester durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie quantifiziert.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) Coupled

Oberirdischen Pflanzenteile werden durch die Kutikula, einem supramolekularen Biopolyester-Wachs Montage geschützt. Wir präsentieren Protokolle, um die selektive Entfernung von epi-und intracuticular Wachsen aus Tomatenfrucht Nagelhaut auf molekularer und Micro-Bereich durch Festkörper-NMR-und Rasterkraftmikroskopie, bzw. zu überwachen und die Vernetzung von technischen Kapazität kutikularen Biopolyester beurteilen.

Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

Isolierung und Charakterisierung der Lipid-A-Domäne von Lipopolysaccharid (LPS) von gramnegativen Bakterien gibt Einblick in Zelloberfläche basierend Mechanismen der Antibiotikaresistenz, bakterielle Überlebensrate und Fitness, und wie chemisch unterschiedlicher Lipid einer molekularen Spezies unterschiedlich modulieren Host angeborenen Immunantwort.

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch Peptide vernetzt sind. Ultra Performance Liquid Chromatography bietet eine hohe Auflösung und Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykan-Zusammensetzung. Wir präsentieren ein Verfahren zur Isolierung von Zellwänden (Sacculi) und deren anschließender Vorbereitung auf die Analyse über UPLC.

Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Ethanol-Gewinnung von Lignin aus verschiedenen Biomassequellen führen. Die Wirkung von der Extraktionsbedingungen auf Lignin-Ausbeute und β-O-4-Inhalte werden präsentiert. Selektive Depolymerisation erfolgt auf die erhaltenen Lignine, hoch aromatische Monomer-Produkte zu erhalten.

Gewinnung von Lignin mit hohen Gehalt an β-O-4 durch milde Ethanol Extraktion und seine Wirkung auf die Depolymerisation Ausbeute

Bei Reptilien sind Hautlipiden von Artgenossen zum sexuellen signalisieren, mit möglichen Einsatz in invasive Arten Management entscheidend. Hier beschreiben wir Protokolle für die Gewinnung von Hautlipiden aus Schuppen Haut oder ganze Tiere, Bestimmung und Analyse der gesamten Lipid-Mass und trennt die Lipide mit Fraktionierung über Säulenchromatographie.

Chemische Isolierung, Quantifizierung und Trennung von Hautlipiden Reptilien

Es wird ein schnelles und effizientes Protokoll für die Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen vorgestellt, die mit verschiedenen photosynthetischen Organismen assoziiert sind. Die erfolgreiche Herstellung isolierter Plastoglobuli ist ein entscheidender erster Schritt, der detaillierten molekularen Untersuchungen wie proteomischen und lipidomischen Analysen vorausgeht.

Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien

Lernen Sie die Isolierung und Analyse von Cutin-Lipidpolyestern aus Pflanzengeweben. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Monomerzusammensetzung mittels GC-MS für Pflanzenphysiologie und Stressantwortforschung.

Isolierung und Analyse der Zusammensetzung von Pflanzen Cuticle Lipid Polyester Monomere

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