Isolierung und Analyse der Zusammensetzung von Pflanzen Cuticle Lipid Polyester Monomere

Gefäßpflanzen sind auf extrazelluläre Schichten angewiesen, die als wasserdichte Barrieren zwischen Pflanzengewebe und der äußeren Umgebung fungieren. Diese lipophilen Zellen sind zwar assoziierte Strukturen, schränken aber pathogene Infektionen ein und regulieren den passiven Transport von Gasen, Wasser und gelösten Substanzen in und aus Pflanzengeweben. Eine wichtige Barriere ist die Nagelhaut der Pflanze, eine komplexe Struktur, die nur bei Pflanzen zu finden ist.

Cutin ist ein unlöslicher Glycerin-Lipid-Polyester, der die strukturelle Matrix der Nagelhaut bildet und mit lösungsmittelextrahierbaren Wachsen in Verbindung gebracht wird. Hier stellen wir eine zuverlässige Technik vor, um die Zusammensetzung von Lipidpolyestern zu bestimmen und das Lipid von Pflanzengeweben zu halten. Bei diesem Protokoll werden ganze Gewebeproben entnommen, homogenisiert und durch eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gründlich zerlegt, um lösungsmittellösliche Lipide, einschließlich kutikulärer und epispezifischer Wachse, zu entfernen.

Triglycerin in Membranlipiden. Die Proben werden dann durch Natriummethoxid-katalysierte Methyllyse in ihre Bestandteile Lipidmonomere depolymerisiert. Simulationsreagenzien werden transmethylierten Hydroxylgruppen in ihre entsprechenden Trimethylzellderivate gegeben, die für die gaschromatographische Analyse geeignet sind.

Derivative Rückstände werden dann in GC-Fläschchen überführt und zur Analyse in A-G-C-M-S geladen, wodurch ein Chromatogramm erstellt wird, das die monomere Zusammensetzung von Biopolyestern charakterisiert. Vorhanden in extrahierten Proben. Hier ernten wir ganze Blattproben von Wildtyp- und zwei Mutanten von reifen Arabidopsis ANA-Pflanzen.

Zur Extraktion und Analyse werden 0,5 g Gewebe in saubere Glasröhrchen gegeben, die mit Chloroform vorgespült wurden. Geben Sie 100 Milliliter Isopropanol in einen Kolben und fügen Sie butyliertes Hydroxytoluol in einer Konzentration von 0,01 % hinzu. BHT ist ein Antioxidans, das hinzugefügt wird, um Doppelbindungen und Fettsäuren vor Oxidation während Lösungsmittelextraktionen zu schützen. Erhitzen Sie das Lösungsmittel in einem Wasserbad auf ca. 85 Grad.

Fügen Sie 25 Milliliter erhitztes Isopropanol pro Gramm Pflanzengewebe hinzu und inkubieren Sie die Proben im Hitze-LOC bei 85 Grad für 15 Minuten. Lassen Sie die Tuben auf Raumtemperatur abkühlen und tragen Sie einen Ohren- und Augenschutz. Zum Schluss werden die Proben mit einem Homogenisator zerkleinert, um eine homogene Dispersion zu erhalten, die Röhrchen mit Schraubverschlüssen verschließen und bei 100 U/min für ein bis zwei Zentrifugenproben bei 800 g für 10 Minuten schütteln.

Um die organische Phase von den zu dem Pellet verdichteten Materialien höherer Dichte zu trennen, entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einem Pasteur oder Propent. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Geben Sie ein gleiches Volumen Isopropanol bei Raumtemperatur hinzu und schütteln Sie die Proben über Nacht.

Bei 100 U/min werden die Proben zentrifugiert und der Überstand verworfen. Ich füge 25 Milliliter einer Zwei-zu-Eins-Lösung aus Chloroform, Methanol und einem Pergramm Gewebe hinzu und schüttle die Proben über Nacht in der Zentrifuge und verwerfe die organische Phase. Wiederholen Sie dann diesen Vorgang mit einer ein bis zwei Chloroform-Methanollösung.

Trocknen Sie das Pellet über Nacht und übertragen Sie die Rohre aus dem Abzug in ein Vakuumtrockenmittel, das wasserfreies Calciumsulfat enthält, um die Proben über einen Zeitraum von mindestens drei Tagen oder bis eine konstante Masse erreicht ist, zu dehydrieren. Nach gründlicher Trocknung sind die Proben bereit für die Entjungferung durch Natriummethoxid-katalysierte Metalyse. Geben Sie mit einer Glasspritze zwei Lösungen von internen Standards in Röhrchen mit trockenem Gewebe, beginnend mit 25 Mikrolitern Methyl-HETO-Decanoat und 25 Mikrolitern Omega-Pentec und Lacton.

Um die Tiefenpolymerisation einzuleiten, fügen Sie den Proben 0,9 Milliliter Methylacetat hinzu, gefolgt von 1,5 Millilitern Natriummethoxid-Katalysator und 3,6 Millilitern Methanol. Proben werden zwei Stunden lang bei 60 Grad mit periodischem Vortexen innerhalb des Reaktionssystems inkubiert, wobei Lipidpolyester mit nukleophilen Methoxid-Anionen reagieren, um instabile tetraedrische Zwischenprodukte zu bilden, die leicht in Fettsäuren, Methylester und A-Oxid-Anionen dissoziieren. Diese a-Oxide sind konjugierte Basen und reagieren mit Methanol, wodurch die katalytisch aktiven Meth-IDE-Anionen regeneriert werden, wodurch zusätzliche tiefe Polymerisationsreaktionen aufrechterhalten werden.

Wenn Wasser im System vorhanden ist, reagiert es mit Natriummethoxid zu Natriumhydroxid. Eine starke Base, die Polyester irreversibel in unerwünschte freie Fettsäuren umwandelt. Anstelle von fas zur Verhinderung der Hydrolyse wird Methylacetat zugesetzt, um Natriumhydroxid im System zu entfernen.

Lassen Sie die Röhren auf Raumtemperatur abkühlen. Nach der Inkubation extrahieren Sie die Monomere, indem Sie 10 Milliliter Methylendichlorid in jedes Röhrchen geben. Fügen Sie dann 1,5 Milliliter Eissäure hinzu, um die Proben anzusäuern.

Füllen Sie die Röhrchen mit 0,5 molaren Natriumchloridlösung, wirbeln Sie sie gründlich durch und zentrifugieren Sie sie minutenlang. Unter dem Abzug. Übertragen Sie die untere organische Phase vorsichtig per Pipette in saubere, vorgespülte, mittelgroße Röhrchen.

Waschen Sie die Proben erneut mit Kochsalzlösung, wirbeln Sie sie und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang. Entfernen Sie die obere wässrige Phase, fügen Sie dann wasserfreies Natriumsulfat zu den Proben als Trocknungsmittel hinzu, um Spuren von Wasser zu entfernen, die in der Zentrifuge der Lösungsvortex-Proben verbleiben, und übertragen Sie das Lösungsmittel, um vorgespülte kleine Röhrchen zu reinigen, laden Sie Röhrchen in einen Stickstoffverdampfer, um das Lösungsmittel zu verdampfen und trockene Rückstände von Monomeren zu erhalten. Fügen Sie mit einer Glasspritze 100 Mikroliter Purin und 100 Mikroliter B-S-T-F-A hinzu, um Hydroxylgruppen in flüchtige Trimethylzellderivate umzuwandeln.

Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 100 Grad. Lassen Sie die Rohre abkühlen und unter Stickstoffgas verdampfen. Geben Sie 500 Mikroliter einer Eins-zu-Eins-HEPTAN-Toluol-Lösung zu rot auflösenden Rückständen, die dann kurz zentrifugiert werden.

Übertragen Sie derivatierte Proben in GC-Fläschchen mit 400 Mikroliter-Einsätzen. Schließen Sie die Fläschchen ein, laden Sie die Proben in einen Gaschromatographen, der sie zur Analyse in eine Kapillarsäule injiziert, das Eluat wird dann mit einem vierfachen Massenspektrometer detektiert. Die durch die GCMS-Analyse erfassten Rohdaten werden verarbeitet und für jede Probe als Chromatogramm dargestellt.

Einzelne Monomere, die unterschiedlichen chromatographischen Peaks entsprechen, werden durch ihre spezifischen Massenspektren identifiziert. In den GC-Retentionszeiten werden die Mengen der einzelnen Monomere mit der internen Standardmethode der Quantifizierung bestimmt, so dass Vergleiche der Monomerhäufigkeit und -zusammensetzung zwischen den Proben möglich sind. Hier sind Overlay-Chromatogramme aus repräsentativen Analysen von Monomeren gezeigt, die aus einem Kaninchenabszessblattgewebe freigesetzt wurden, das dem Wildtyp entspricht, und zwei mutierte Allele eines Gens, das für ein P vier 50-Monooxygenase-Enzym kodiert, das unterschiedliche monomere Profile zeigt.

Unsere Ergebnisse zeigen signifikante Unterschiede, nämlich die Häufigkeit von drei Haupt-Cutin-, Monomeren-, Wildtyp- und mutierten Arabidopsis-Pflanzen. Dieses Protokoll ist ein robustes Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung von pflanzlichen Lipidpolyestern durch Isolierung, Identifizierung und Quantifizierung ihrer Monomerebestandteile. Das Verfahren ist skalierbar und kann leicht an die Verarbeitung großer Mengen verschiedener Pflanzenmaterialien angepasst werden, darunter Wurzeln, Samen, Blätter und andere ganze Gewebe

Diese Technik ist anwendbar auf Studien, die die Biosynthese, Regulation und Verteilung von Cutin und Suberin in höheren Pflanzen untersuchen.