Isolierung und Analyse der Zusammensetzung von Pflanzen Cuticle Lipid Polyester Monomere

Wasserpflanzen sind auf extrazelluläre Schichten angewiesen, die als wasserundurchlässige Barrieren zwischen Pflanzengeweben und der äußeren Umwelt fungieren. Diese lipophilen Zell- und assoziierten Strukturen beschränken pathogene Infektionen und regulieren den passiven Transport von Gasen, Wasser und gelösten Stoffen in und aus Pflanzengeweben. Eine wichtige Barriere ist die Pflanzenkutikula, eine komplexe, nur bei Pflanzen vorkommende Struktur.

Cutin ist ein unlösliches Glycerin-Lipidpolyester, das die strukturelle Matrix der Cuticula bildet und mit löslichen Wachsen assoziiert ist. Hier stellen wir eine zuverlässige Methode zur Bestimmung der Zusammensetzung von Lipidpolyestern und zur Entfettung von Pflanzengeweben vor. In diesem Protokoll werden gesamte Gewebeproben geerntet, homogenisiert und durch eine Reihe von Lösungsmittel-Extraktionen vollständig abgebaut, um lösliche Lipide zu entfernen, einschließlich cuticularer und epikuticularer Wachse.

Triglyceride in Membranlipiden. Die Proben werden anschließend durch natriummethoxidgekatalysierte Methylolyse in ihre Bestandteile aus Lipidmonomeren zerlegt. Es werden Simulationsreagenzien hinzugefügt, um Hydroxylgruppen in die entsprechenden trimethylsilylierten Derivate umzuwandeln, die für die gaschromatographische Analyse geeignet sind.

Die derivatisierten Rückstände werden anschließend in GC-Gefäße überführt und zur Analyse in das A-G-C-M-S geladen, wodurch ein Chromatogramm erzeugt wird, das die monomere Zusammensetzung der Biopolyester charakterisiert, die in den extrahierten Proben vorhanden sind. Hier ernten wir Vollblattproben von Wildtyp und zwei Mutanten aus ausgewachsenen Arabidopsis ANA-Pflanzen.

Für die Extraktion und Analyse 0,5 Gramm Gewebe in saubere Glasröhrchen geben, die zuvor mit Chloroform vorgewaschen wurden. 100 Milliliter Isopropanol in einen Kolben geben und Butylhydroxytoluol bis zu einer Konzentration von 0,01 % hinzufügen. BHT ist ein Antioxidans, das hinzugefügt wird, um Doppelbindungen und Fettsäuren während der Lösungsmittel-Extraktion vor Oxidation zu schützen. Das Lösungsmittel in einem Wasserbad auf etwa 85 Grad vorwärmen.

Fügen Sie 25 Milliliter erhitztes Isopropanol pro Gramm Pflanzengewebe hinzu und inkubieren Sie die Proben im Heiz-LOC bei 85 Grad für 15 Minuten. Lassen Sie die Röhrchen unter Gehör- und Augenschutz auf Raumtemperatur abkühlen. Schließlich mahlen Sie die Proben mit einem Homogenisator, um eine homogene Dispersion zu erzielen, verschließen Sie die Röhrchen mit Schraubverschlüssen und schütteln Sie sie bei 100 U/min für eine bis zwei Minuten. Zentrifugieren Sie die Proben anschließend bei 800 ×g für 10 Minuten.

Um die organische Phase von den dichteren Materialien zu trennen, die im Pellet kompaktiert sind, entfernen und verwerfen Sie den Überstand mithilfe einer Pasteur- oder Propent-Pipette. Achten Sie darauf, das Pellet nicht aufzuwirbeln. Geben Sie ein gleiches Volumen Isopropanol bei Raumtemperatur hinzu und schütteln Sie die Proben über Nacht.

Die Proben bei 100 U/min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Ich gebe 25 Milliliter einer zwei zu eins-Lösung aus Chloroform und Methanol pro Gramm Gewebe hinzu und schüttele die Proben über Nacht, zentrifugiere und entferne die organische Phase. Anschließend diesen Vorgang mit einer ein zu zwei-Lösung aus Chloroform und Methanol wiederholen.

Trocknen Sie das Pellet über Nacht und bringen Sie die Röhrchen aus dem Abzug in einen Vakuumexsikkator mit wasserfreiem Calciumsulfat, um die Proben über einen Zeitraum von mindestens drei Tagen zu dehydrieren oder bis eine konstante Masse erreicht ist. Sobald die Proben gründlich getrocknet sind, können sie durch eine Natriummethoxid-katalysierte Methylierung entsalzt werden. Geben Sie zwei Lösungen interner Standards mithilfe einer Glasspritze in die Röhrchen mit den trockenen Geweben, beginnend mit 25 µL Methyl-HETODECANOAT und 25 µL OMEGA-PENTECANLACTON.

Um die tiefe Polymerisation einzuleiten, geben Sie 0,9 Milliliter Methylacetat zu den Proben hinzu, gefolgt von 1,5 Milliliter Natriummethoxid-Katalysator und 3,6 Milliliter Methanol. Inkubieren Sie die Proben zwei Stunden lang bei 60 Grad unter periodischem Wirbeln. Im Reaktionssystem reagieren die Lipidpolyester mit nukleophilen Methoxid-Anionen und bilden instabile tetraedrische Intermediate, die leicht in Fettsäuren, Methylester und Oxid-Anionen dissoziieren. Diese Oxide sind konjugierte Basen und reagieren mit Methanol, wodurch die katalytisch aktiven Methoxid-Anionen regeneriert werden, wodurch zusätzliche tiefe Polymerisationsreaktionen aufrechterhalten werden.

Wenn Wasser im System vorhanden ist, reagiert es mit Natriummethoxid unter Bildung von Natriumhydroxid. Eine starke Base, die Polyester irreversibel in unerwünschte freie Fettsäuren umwandelt. Um die Hydrolyse zu verhindern, wird anstelle von Fas Methylacetat zugesetzt, um jegliches Natriumhydroxid im System zu entfernen.

Lassen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur abkühlen. Nach der Inkubation extrahieren Sie die Monomere, indem Sie 10 Milliliter Methylenchlorid zu jedem Röhrchen hinzufügen. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter eisessige Säure zu, um die Proben anzusäuern.

Füllen Sie die Röhrchen mit 0,5-molarer Natriumchloridlösung, wirbeln Sie gründlich und zentrifugieren Sie einige Minuten lang. Unter dem Abzug. Überführen Sie vorsichtig die untere organische Phase mittels Pipette in saubere, vorher gespülte, mittelgroße Röhrchen.

Spülen Sie die Proben erneut mit Kochsalzlösung, wirbeln Sie sie und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang. Entfernen Sie die obere wässrige Phase, geben Sie dann wasserfreies Natriumsulfat als Trockenmittel zu den Proben hinzu, um Spuren von Wasser in der Lösung zu entfernen, wirbeln und zentrifugieren Sie die Proben erneut und überführen Sie das Lösungsmittel in saubere, vorher gespülte kleine Röhrchen. Füllen Sie die Röhrchen in einen Stickstoffverdampfer ein, um das Lösungsmittel zu verdampfen und trockene Rückstände der Monomere zu erhalten. Geben Sie mithilfe einer Glasspritze 100 Mikroliter Purin und 100 Mikroliter B-S-T-F-A hinzu, um Hydroxylgruppen in flüchtige trimethylsilylierte Derivate umzuwandeln.

Die Proben 10 Minuten bei 100 Grad inkubieren. Die Röhrchen abkühlen lassen und unter Stickstoffgas verdampfen. 500 µL einer 1:1-HEPTAN-Toluol-Lösung hinzufügen, um die Rückstände rot aufzulösen, und dann kurz zentrifugieren.

Überführen Sie die derivatisierten Proben in GC-Gefäße, die 400-Mikroliter-Einsätze enthalten. Verschließen Sie die Gefäße, laden Sie die Proben in ein Gaschromatographiegerät ein, das sie in eine Kapillarsäule zur Analyse injiziert; die Eluate werden anschließend durch ein Quadrupol-Massenspektrometer detektiert. Die Rohdaten, die durch die GC-MS-Analyse gewonnen werden, werden verarbeitet und als Chromatogramm für jede Probe dargestellt.

Einzelne Monomere, die verschiedenen chromatographischen Peak entsprechen, werden anhand ihrer spezifischen Massenspektren identifiziert. Mithilfe der internen Standardmethode zur Quantifizierung werden anhand der GC-Retentionszeiten die Mengen der einzelnen Monomere bestimmt, wodurch Vergleiche der Monomer-Häufigkeit und -Zusammensetzung zwischen Proben ermöglicht werden. Hier dargestellt sind überlagerte Chromatogramme aus repräsentativen Analysen von Monomeren, die aus einem Abszessblattgewebe eines Kaninchens freigesetzt wurden, entsprechend dem Wildtyp und zwei Mutantenallelen eines Gens, das ein P450-Monooxygenase-Enzym kodiert, und die deutlich unterschiedliche monomere Profile zeigen.

Unsere Ergebnisse zeigen signifikante Unterschiede in der Häufigkeit dreier Hauptbestandteile von Cutin sowie in Wildtyp- und Mutanten-Pflanzen von Arabidopsis. Dieses Protokoll ist eine robuste Methode zur Analyse der Zusammensetzung pflanzlicher Lipidpolyester durch Isolierung, Identifizierung und Quantifizierung ihrer konstituierenden Monomere. Das Verfahren ist skalierbar und kann leicht angepasst werden, um große Mengen verschiedener pflanzlicher Materialien zu verarbeiten, einschließlich Wurzeln, Samen, Blätter und anderer vollständiger Gewebe.

Diese Technik eignet sich für Studien zur Untersuchung der Biosyntheseregulation und Verteilung von Cutin und Suberin in höheren Pflanzen.