Name: Mess physiologischen Reaktionen von Drosophila Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Erfahren Sie Calcium-Imaging zur Messung physiologischer Reaktionen gustatorischer Neuronen bei Drosophila auf Lipid-Pheromone. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einzelner Neuronen in lebenden Tieren.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Singapore National Research Foundation (Grant NRF-RF2010-06 an J.Y.Y.).

1. Probenvorbereitung <ol><li> Überqueren Sie die Gal4 3,22 Fahrer zu UAS-GCaMP5G 19 Fliegen (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Lassen Sie das Kreuz bei 25 ° C wachsen. Hinweis: Generieren fliegt mit mehreren Kopien der Gal4 oder UAS-GCaMP Transgene helfen kann , die Fluoreszenzsignalintensität zu erhöhen. Eine frühere Version des UAS-GCaMP Transgen (UAS-GCaMP3) zeigten eine sehr schwache Fluoreszenzintensität , wenn sie unter der Kontrolle des Gr68a-Gal4 Treiber zum Ausdruck gebracht. <ol><li> Sammeln und getrennt nach Geschlecht neu erwachsenen Fliegen geschlüpften und erhöhen bei 25 ° C. Hinweis: Die Basisniveau von GCaMP5G florescence in Fliegen optimal ist im Alter zwischen 14 bis 28 Tagen. Isolieren von Fliegen nach Geschlecht schließt die Möglichkeit der sozialen Interaktionen, die die neuronalen Reaktionen beeinflussen können. </li></ol></li><li> Anästhesieren eine Fliege unter einem milden Strom von CO 2. </li><li> Bringen Sie die fly zu einem Deckglas, indem man zuerst einen kleinen Tropfen von Nagellack in der Mitte eines 0,17 mm Deckglas platzieren. Sanft legen Sie eine Fliege auf seiner Seite auf dem Tropfen klaren Nagellack und sicherzustellen, dass der gesamte Rückgang der Fliege bedeckt ist. </li><li> Führen Sie die Schritte 1.5 und 1.6 unter einem Sezieren Stereo, bei 8-facher Vergrößerung verwendet. </li><li> Verwenden Sie einen nassen Pinsel, die einen foreleg der Fliege zu verlängern. Sichern die foreleg in Position durch zwei dünne Streifen des Bandes über die erste und fünfte tarsal Segmente (2A) platzieren. Dies wird tarsal Segmente T2-T4 für die Bildgebung (2B) aus. </li><li> Um das Bild zu Neuronen auf den Rüssel, legen Sie einen dünnen Streifen Klebeband über die Tribüne des Rüssels die labellum (2C, D) zu belichten. </li><li> Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere um die Fliege mit einem PAP Stiftlösung fließt über die Deckfläche zu verhindern. Machen Sie Messungen innerhalb von 30 Minuten der Montage. </li></ol> 2. Herstellung von StimulusLösung <ol><li> Verdünnte lipophilen Liganden (wie CH503, in dieser Studie verwendet wurden ) in einer PBST - Lösung: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 0,1% Triton X-100 (v / v ); pH 7,4. <ol><li> Machen Sie eine 1 mg / ml Stammlösung des Liganden mit PBST. Bereiten Sie alle nachfolgenden Verdünnungen der Stammlösung mit PBST. Hinweis: Je nach der Löslichkeit des Liganden von Interesse können unterschiedliche Lösungsmittel erforderlich sein, um den Liganden aufzulösen. Die Löslichkeit von CH503 in verschiedenen Lösungsmitteln ist in Tabelle 1. Im Gegensatz zu anderen Lösungsmitteln beschrieben PBST keine Zunahme der Fluoreszenz erzeugen. </li></ol></li></ol> 3. Die Stimulation von Gustatory Neurons und Image Acquisition <ol><li> Mit einem 10 ul-Pipette legen 10 ul PBST auf die Fußwurzel Segmente. Hinweis: Dieser Schritt feuchtet das Bein und verhindert, dass die Fußwurzel Segmente driften. </li><li> Verwenden Sie ein optisches System, das eine Kamera von su hatffizient Geschwindigkeit und Empfindlichkeit auf eine gute Fluoreszenzsignal mit hoher Zeitauflösung zu erreichen. Hinweis: Für diese Studie haben wir eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop und eine sCMOS Kamera verwendet wird (siehe Materialliste). </li><li> Wählen Sie die spezifischen tarsal Segment und Neuronen abgebildet werden. Erwerben drei Vorstimulation konfokalen Z-Stacks. <ol><li> Idealerweise Einstellungen Verwendung Erwerb, die schnell genug maximale Zeitauflösung zu ermöglichen, während noch die gesamte Zellvolumen zu erfassen. Beispiel Erwerb Einstellungen sind: 200 ms Belichtung, Binning 2 x 2 und 6 x 0,5 um 2 optische Schnitte, erfasst alle 2 Sek. Anmerkung: Immobilisierte Beine abgebildet wurden erfolgreich für bis zu 10 min, bei 30 sec Intervallen ohne erkennbare Bleichen des GCaMP Signals. Für längere Aufnahmezeiten zu gewährleisten, dass die Beine sehr fest an ihrem Platz auf dem Deckglas gehalten werden. </li><li> Optimierung der Laserleistung für höchste Signal-zu-Rausch erreichbare mit minimaler Photobleaching während der gesamten imaGing Regime. Für die Experimente hier beschriebenen verwenden, um eine 491 nm Diodenlaser (100 mW) bei 30% Durchlässigkeit für die Bildgebung sowohl Gr68a und ppk23 gustatorischen Neuronen an den Beinen und Rüssels. Verwenden Sie 2 x 2-Binning für kürzere Belichtungszeiten zu ermöglichen, während noch eine ausreichende räumliche Auflösung zu erreichen. Hinweis: Die Laserleistungseinstellungen wurden optimiert Detektion von Fluoreszenzänderung von einem 1,2- bis 4,5-fache Steigerung bis hin zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Pipette 10 ul der Lösung auf die Stimulus tarsal Segmente. Für Kontrollexperimente, fügen Sie eine weitere 10 ul PBST. Unmittelbar 117 Poststimulations Bilder erwerben. Anmerkung: Die Anzahl der Poststimulations Bilder erfasst wird basierend auf der Menge an Zeit, in der die maximale Änderung der Fluoreszenz erreicht war (ca. 2 min). <ol><li> Kritischste Schritt: Während bei der Vorbereitung Pipettieren Lösung, nicht die Fliege mit der Pipettenspitze zu berühren, da dies der foreleg wird dazu führen, dass aus der Position zu bewegen. Hinweis: Alternativ verwendenenthält Reiz der Nähe des tarsal Segment ein Mikromanipulator, um genau eine Glaskapillare Position abgebildet werden. gesteuerte Mengen von Stimulus liefern eine intrazelluläre Mikroinjektion Spender nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li></ol></li></ol> 4. Bildverarbeitung und Analyse: Die Quantifizierung der Reaktion <ol><li> Öffnen Sie eine Reihe von konfokalen Z-Stapel mit Fidschi ( <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 oder ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) 24 Bildanalyse und Verarbeitungssoftware. </li><li> Machen Sie eine Summe-Intensitätsprojektion aller sechs Z-Scheiben für jede der 120 Zeitpunkten. <ol><li> Wählen Sie den &quot;Stack&quot; Option unter &quot;Bild&quot;. Außerdem wählen Sie die Option &quot;Z Projektion&quot; und &quot;1&quot; als Start Scheibe und &quot;4&quot; als Anschlagscheibe ein. Für Projektionstyp, wählen Sie R20; Summe Scheiben &quot;aus dem Pull-Down-Menü, und wählen Sie&quot; Alle Zeitrahmen &quot;. </li></ol></li><li> Definieren Sie die Region of Interest (ROI) durch die freihändige Auswahlwerkzeug mit einer Grenze um einen Zellkörper oder neuronalen Projektion zu zeichnen. Klicken Sie auf &quot;Analyze&quot; Label und wählen Sie die &quot;ROI-Manager&quot; Option unter &quot;Tools&quot;. </li><li> Quantifizieren der Fluoreszenz des ROI durch die &quot;Set-Messungen&quot; Option wählen, unter der &quot;Analyse&quot; Menü und die Kontrollkästchen für die integrierte Dichte, Fläche, mittleren und maximalen Grauwert und Label. Dann wählen Sie die &quot;Mehr&quot; Option unter dem ROI-Manager-Menü und weiter die &quot;Multi Maßnahme&quot; Option auswählen. Anmerkung: Dies wird ein Popup-Feld mit Werten für jeden der ausgewählten Parameter zu erzeugen. </li><li> Überprüfen Sie die maximale Grauwerte , um sicherzustellen , daß keines der Pixel Sättigung erreicht haben (beispielsweise 65.535 für einen 16-Bit - Kamera). HINWEIS: Für die Versuche in t gezeigtsein Papier, wurden Antworten entweder aus Zellkörpern oder neuronale Projektionen gemessen, je nachdem, wo der maximale Anstieg der &amp; Delta; F / F beobachtet wurde. </li><li> Berechnen Sie die maximale relative Fluoreszenzänderung (&amp; Dgr; F / F) zum Zeitpunkt t ist wie folgt: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Subtrahieren Hintergrundfluoreszenz von jedem F (Zelle) Wert. In den Hintergrundfluoreszenz, Messen der integrierten Dichte einer ROI gleicher Größe und Form von einem Bereich des Vorderbeins (oder Rüssel) frei von nachweisbaren Neuronen zu quantifizieren. </li><li> Die post-Stimulation Fluoreszenz, F (Zelle) t, messen Sie die integrierte Dichte des ROI des Zellkörpers oder Prozess zum Zeitpunkt &quot;t&quot; nach der Stimulation zu quantifizieren. </li><li> Die Vorstimulation Fluoreszenz, F (Zelle) , t = 0, zu analysieren pre-Stimulus Bilder des Zellkörpers oder Verfahren in der gleichen Weise zu quantifizieren , wiedie Post-Stimulationssignal. Verwenden Sie die mittlere integrierte Dichte von 3 Bildern F (Zelle) t = 0 zu bestimmen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Wir beschreiben hier eine Methode , um Live - Kalzium - Imaging von Drosophila peripheren Neuronen in 2 verschiedenen Sinnesorgane durchführen. Die Ca 2+ -evoked GCaMP fluoreszierende Reaktionen in Gr68a-Neuronen durch den Pheromon - Liganden induziert CH503 waren dosisabhängig und quantitativ. Es war auch möglich, verschiedene neuronale Antwortmuster wie phasic und Tonikum Antworten zu erkennen. Neurons zeigt phasischen Reaktionen wird angenommen, dass eine schnelle Anpa...

Tiere verlassen sich auf Geruchs- und Geschmacks Informationen Entscheidungen zu vermitteln, von wesentlicher Bedeutung für das Überleben und die Fortpflanzung. Zu verstehen , wie chemosensory cues werden erkannt und durch das Nervensystem verarbeitet erfordert die Identifizierung des sensorischen Rezeptor (en) und die entsprechenden chemischen Liganden. Drosophila eine erstaunliche Vielzahl von flüchtigen und nicht-flüchtigen Verbindungen erkennen und sind ein ausgezeichnetes Modell , bei dem die physiologische Studie Mechanismen der Chemosensorik. Während die Geruchsorgane flüchtige Moleküle wahrnehmen, werden die Geschmacks- Organe spezialisiert geringe Flüchtigkeit Verbindungen zu erkennen. Hier präsentieren wir eine Methode zur direkten neuronalen Antworten von den Geschmacksorgane von Drosophila melanogaster zu schwerflüchtige lipophile Liganden messen. Gustatory Organe der Fliege sind die Vorderbeine, Rüssel und Flügel. Verteilt auf der Oberfläche der Geschmacksorgane sind haarähnliche Strukturen als sensilla bekannt, die auf s antwortenugars, Bitters, Salze, Wasser und Pheromone 8. Die sensilla wurden morphologisch in Geschmack Borsten klassifiziert und Geschmack Heringe 9. Es gibt etwa 31 Geschmack Borsten auf dem Labellum, die in den langen (L-Typ) klassifiziert sind, kurz (s-Typ) und Zwischenprodukt (i-Typ) Morphologien. Die &#39;l&#39; und &#39;s&#39; sensilla Haus 4 sensorischen Neuronen , die physiologisch zu Zucker (der S - Zelle), wenig Salz (das L1 - Zelle), hohe Salz und Bitterstoffe (die L2 - Zelle) und Wasser (die W - Zelle) 10 antworten , 11. Die &quot;i&quot; sensilla Haus 2 sensorischen Neuronen, von denen 12 sowohl zu niedrigen Salz und Zucker, während die anderen reagiert auf hohe Salz reagiert. Es gibt etwa 41 Geschmack sensilla bei Männern und 26 bei Frauen sensilla auf jeder der Vorderbeine verteilt. Für Männer und Frauen gibt es 21 sensilla auf dem midleg, und etwa 22 sensilla auf dem Hinterbein 13. Die geschmackliche Neuronen durch den Geschmack sensilla auf den Beinen eingeschlossen sind auch classified in L1, L2, W und S-Typen. Ein Standardverfahren zur Messung der elektrischen Aktivität von einzelnen Neuronen verwendet extrazelluläre oder intrazelluläre Elektroden Ionenstrom zu erfassen. Elektrodenmessungen erlauben neuronale Funktion in nicht-Modellorganismen wie Drosophila - Arten, Motten und Bienen , die umfangreiche genetische Werkzeuge für neuronale Kennzeichnung fehlt untersucht werden. Routinemäßig verwendet haben , jedoch während elektrophysiologischen Methoden wurden Aktivität von Drosophila Geschmack sensilla 4,13,14 zu messen, dieser Ansatz zugrunde gelegt stellt einige technische Herausforderungen. Zuerst schmecken Borsten identifiziert werden müssen, basierend auf der Morphologie und der räumlichen Lage. Bei der Identifizierung kann elektrophysiologische Messungen durch die geringe Größe des sensilla behindert werden, begrenzt Zugänglichkeit durch Position und Schwierigkeiten bei der Anwendung von kontrollierten Mengen eines chemischen Stimulus zu einem Geschmack Borste. Auch die Stimulation von sensilla erzeugen kann Signale von mehr als einerneuronale Typ 15. Zweitens Detektion elektrischer Signale kann durch Hintergrundrauschen verwechselt werden, die aus mechanischen Schwingungen und Geräusche von der elektronischen Ausrüstung. Drittens kann die Verwendung eines geschärften Elektrode , die Fliege Vorbereitung beschädigen, wenn sie falsch 14 verwendet. Schließlich erfordert eine Elektro Rig Montage spezialisierten elektronischen Komponenten für Stimulus Lieferung, Signalaufzeichnung und Datenanalyse und kann teuer werden. In D. melanogaster, hat die Verfügbarkeit von genetisch-codierten Werkzeuge , um die Entwicklung von Bildgebungstechniken erleichtert , dass die Antworten von kleinen Populationen von Neuronen ermöglichen sucht werden. Ein solcher Ansatz ist die Verwendung des CaLexA Reporter 16. Bei diesem Verfahren Gensequenzen den Faktor LexA-VP16-Transkriptions Codierungs- und eine Calcium-empfindliche Protein NFAT miteinander verschmolzen. Calcium Aktivierung der Proteinphosphatase Calcineurin katalysiert die de-Phosphorylierung von NFAT und wiederum, facilitaTES seinen Import in den Zellkern. Im Kern bindet das LexA-Domäne in eine LexAop-DNA-Bindungsmotiv, das die Expression eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) reporter, wodurch nachhaltige Identifizierung von funktionell aktivierten Neuronen lenkt. Der Ansatz wurde erfolgreich zur Messung der Reaktion von spezifischen olfaktorischen Glomeruli im Antennallobus nach der Exposition von lebenden Fliegen Riechstoff 16 verwendet. Vor kurzem wurden die physiologischen Reaktionen von IR52c Geschmacks- Rezeptorneuronen von lebenden Fliegen gemessen mit CaLexA 7. Jedoch für diese Studie war es notwendig, zu altern Fliegen für bis zu 6 Wochen GFP Transkription zu erhöhen. Während Immunfärbung mit einem Anti-GFP-Antikörper verwendet werden kann, die CaLexA Signal zu verstärken, würde diese Methode Gewebefixierung erfordern, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird zum Abbilden lebenden Zellen. Genetisch kodierte Calciumindikatorprotein GCaMP auch neuronale Reaktionen in einer Anzahl von zu studieren extensiv verwendet wurde,Spezies 17. Das Protein GCaMP fluoresziert mit geringer Intensität vor neuronale Stimulation. Anwendung eines Stimulus löst ein Aktionspotential in dem Neuron, wodurch der Einstrom von Ca 2+. GCaMP, gebunden an Ca 2+, erfährt eine Konformationsänderung, so dass es mit heller Intensität (Abbildung 1) zu fluoreszieren. Ein vor kurzem Single-Neuron - Kalzium - Imaging - Ansatz entwickelt wurde verwendet für die foreleg Neuronen spezifischen Gr61a Geschmacks- 18 Glukose als Ligand zu identifizieren. In dieser Studie wurden seziert Vorderbeine aus transgenen Drosophila exprimiert GCaMP in Gr61a gustatorischen Neuronen wurden mit einer Schicht aus Agarose vor der Bilderzeugung behandelt. Jedoch kann die Verwendung von sezierten Gewebe verursachen eventuelle Verminderung von GCaMP Expression, wodurch die Messzeit und die Erfassungsempfindlichkeit begrenzen. Zusätzlich kann Agarose begrenzen Empfindlichkeit aufgrund der hohen Hintergrundniveaus der Fluoreszenz und ihre Lichtstreuungseigenschaften. To einige dieser Nachteile ansprechen, beschreiben wir die Verwendung von GCaMP-vermittelten Calcium Imaging physiologischen Reaktionen von foreleg und Rüssel Geschmacks- Neuronen intakter Tiere aufzunehmen. Wir zeigen die physiologischen Reaktionen von Gr68a und ppk23 Neuronen exprimieren genetisch kodierte GCaMP5G 19 einem Drosophila Lipid Pheromon, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronale Antworten werden durch Quantifizieren der Zunahme der Fluoreszenz des GCaMP5G Signals während Pheromon Stimulation gemessen. In diesem Protokoll Neuronen sind für eine Gesamtdauer von 120 sec abgebildet wird, wobei die Muster der neuronalen Aktivierung in einzelnen Zellen zu differenzieren ausreicht.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Geschenk von H. Amrein (Texas A& M Health Science Center, TX, USA) und J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Geschenk von K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&nbsp; Lager Center</td></tr><tr><td>0,17 mm Deckglas (Gold-Seal Deckglas)</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack, "Hard as Nails Clear"&nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP Kugelschreiber</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td></td><td></td>Z377821</tr><tr><td>Pinsel</td><td></td><td></td> mit <td>feiner Spitze</td></tr><tr><td>Tape&nbsp;</td><td>Schottische Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, Laborqualität</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexan, HPLC-Qualität</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td></td><td></td>472301</tr><tr><td>PBST-Rezept</td><td></td><td></td>, <td>beschrieben im Protokollabschnitt</td></tr><tr><td>CH503</td><td></td><td></td><td>Synthese, beschrieben in Mori et al., 2010</td></tr><tr><td>sCMOS Kamera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Scankopf</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji Software</td><td>Open Source</td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td></tr></tbody></table>

mess physiologischen reaktionen von<em&gt; drosophila</emneurone&gt; sensory zu lipid pheromone verwendung von live-calcium imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Im Gegensatz zu Säugetieren, Insekten wie Drosophila haben mehrere Geschmacksorgane. Die chemosensorische Neuronen an den Beinen, Rüssel, Flügel und ovipositor von Drosophila exprimieren Geschmacks- Rezeptoren 1,2, Ionenkanäle 3-6 und ionotropen Rezeptoren 7 , die bei der Erkennung von flüchtigen und nichtflüchtigen sensorischen Signale beteiligt sind. Diese Neuronen direkt tastants Kontakt wie Lebensmittel, Schadstoffe und Pheromone und daher beeinflussen viele komplexe Verhaltensweisen wie Fütterung, Eiablage und Paarung. Elektrodenaufzeichnungen und Kalzium-Imaging wurden in Insekten zu quantifizieren, die neuronalen Reaktionen hervorgerufen durch diese tastants weit verbreitet. Allerdings erfordert die Elektrospezialausrüstung und um Messungen von einem einzigen Geschmack Sensillum kann technisch schwierig sein, je nach Zelltyp, Größe und Position. Darüber hinaus können einzelne Neuron Auflösung in Drosophila schwierig sein , da Geschmack sensilla hou zu erreichense mehr als eine Art von chemosensorische Neuronen. Die Live-Kalzium-Imaging hier beschriebene Methode erlaubt Antworten einzelner Geschmacks- Neuronen im Live-Fliegen gemessen werden. Dieses Verfahren ist besonders geeignet zum Abbilden neuronaler Antworten auf Lipid Pheromone und andere Liganden-Typen, die eine geringe Löslichkeit in Wasser basierende Lösungsmittel haben.

Die GCaMP Calciumindikator wurde genetisch mit Gr68a-Gal4 oder ppk23-Gal4 Treiber zum Ausdruck gebracht. Distinct Populationen von foreleg Neuronen und nicht-neuronalen Stützzellen werden von jedem Fahrer (3A-C) bezeichnet. Ligand-spezifische Antworten auf die lipophilen Pheromon CH503 wurden in Gr68a-Gal4 und ppk23-Gal4 - exprimierenden Zellen GCaMP (3D) beobachtet. Die relative Veränderung der Fluoreszenzintensität des GCaMP5G Signal (&amp; Dgr;...

Die Vorderbeine und der Rüssel von Drosophila enthalten ein reiches Repertoire an geschmacklichen sensorischen Neuronen. Hier stellen wir eine Methode vor, die Calcium-Imaging verwendet, um physiologische Reaktionen von sensorischen Neuronen im Vorderbein und Rüssel lebender Fliegen nach exogener Applikation eines gustatorischen Pheromons zu messen.

Mess physiologischen Reaktionen von<em&gt; Drosophila</emNeurone&gt; Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die physiologischen Reaktionen von Drosophila-Geschmacksneuronen auf Lipidpheromone zu messen. Diese Technik kann verwendet werden, um zentrale Fragen der sensorischen Neurobiologie zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung der Liganden für verwaiste Geschmacksrezeptoren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Reaktionen einzelner Geschmacksneuronen an einem intakten, lebenden Tier untersucht werden können.Nachdem die Fliege anesthesiert wurde, befestigen Sie sie mit einem sehr kleinen Tropfen klarem Nagellack auf einer 0,17 Millimeter dicken Deckglasplatte. Befestigen Sie die Fliege seitlich am Objektträger unter Verwendung des gesamten Tropfens. Verlängern Sie anschließend unter einem Stereomikroskop mit einem angefeuchteten Pinsel ein Vorderbein der Fliege.Danach mit zwei sehr dünnen Klebestreifen das erste und fünfte Tarsalglied auf dem Deckglas befestigen. Falls Neuronen am Proboscis abgebildet werden sollen, einen weiteren dünnen Klebestreifen über den Rüssel des Proboscis legen, um das Labellum freizulegen. Anschließend mit einem PAP-Stift eine kurze Wand um die Fliege herum erstellen.Lassen Sie die Anästhesie vor der Messung für eine halbe Stunde nachlassen. Bereiten Sie für dieses Protokoll die erforderlichen Verdünnungen der Stammlösung des Liganden mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter unter Verwendung von PBST vor. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie 10 Mikroliter PBST auf die fixierten und freigelegten Tarsalsegmente auftragen.Dies befeuchtet das Bein und verhindert, dass es aus dem Fokus läuft. Fokussieren Sie anschließend die Segmente mit einem optischen System, das ein gutes fluoreszierendes Signal bei schneller zeitlicher Auflösung ermöglicht, wie beispielsweise ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop mit einer sCMOS-Kamera. Sammeln Sie drei Z-Stapel der Neuronen von Interesse im Tarsalsegment vor der Stimulation.In diesem Beispiel werden Bilder mit 200 Millisekunden Belichtungszeit und einer 2-mal-2-Binning über einen sechs Mikrometer mal einen halben Mikrometer großen Bereich alle zwei Sekunden aufgenommen. Achten Sie darauf, die Laserleistung zu optimieren, um eine Photobleiche zu minimieren und gleichzeitig ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten. Hier wird ein 491 Nanometer 100-Milliwatt-Laser bei 30 % Transmission betrieben.Das Signal muss vor der Stimulation nachweisbar sein, darf jedoch nicht in die Sättigung gehen. Geben Sie nun 10 Mikroliter Stimulationslösung auf das gewünschte Tarsalsegment. Achten Sie beim Pipettieren darauf, das Bein oder irgendeinen Körperteil der Fliege nicht zu berühren, da sonst die Tarsen ihre Position verlieren.Danach unverz&uuml;glich die ersten Aufnahmen nach der Stimulation aufnehmen und weiterhin gen&uuml;gend Bilder sammeln, um die maximale &Auml;nderung der Fluoreszenz zu dokumentieren. &Ouml;ffnen Sie f&uuml;r die Analyse eine Reihe von konfokalen Z-St&uuml;ckeln mit der Bildanalyse- und Verarbeitungssoftware Fiji oder ImageJ. Erstellen Sie eine Summenintensit&auml;tsprojektion aller Z-Schnitte f&uuml;r jeden Zeitpunkt.Hier gibt es sechs Schnittebenen und 120 Zeitpunkte. Wählen Sie zuerst die Option „Stack“ unter „Image“ und anschließend die Option „Z-Projektion“. Geben Sie eins als Start-Schnitt und vier als Stopp-Schnitt ein.Geben Sie für den Projektionstyp „Summierungs-Schnitte“ ein und wählen Sie alle Zeitpunkte aus. Definieren Sie nun einen interessierenden Bereich (ROI), wie beispielsweise einen Zellkörper oder eine neuronale Projektion. Verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug, um entlang der Grenzen der Struktur zu zeichnen.Klicken Sie anschließend auf das Etikett „analyze“ und wählen Sie die Option „ROI manager“ unter „tools“. Quantifizieren Sie die Fluoreszenz des ROI, indem Sie zunächst die Option „set measurements“ im Menü „analyze“ auswählen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für integrale Dichte, Fläche, mittlerer und maximaler Grauwert sowie Etikett.Wählen Sie anschließend die Option „mehr“ im Menü des ROI-Managers und aktivieren Sie die Option „Mehrfachmessung“. Berechnen Sie nun die maximale Änderung der Fluoreszenz für den Zeitpunkt t. Zur Quantifizierung der Fluoreszenz nach der Stimulation messen Sie die integrierte Dichte des interessierenden Bereichs (ROI).Für t gleich null messen Sie die Prästimulations-Fluoreszenz aus den Prästimulus-Bildern der ROI auf dieselbe Weise. Mitteln Sie die Werte aus drei Bildern für diesen t-gleich-null-Wert. Um die Hintergrundfluoreszenz zu quantifizieren, messen Sie die integrierte Dichte aus einem Gewebebereich ohne nachweisbare Neurone, der dieselbe Größe und Form wie die ROI aufweist.Sammeln Sie einen eindeutigen Hintergrundwert für jeden Zeitpunkt. Der GCaMP-Calciumindikator wurde unter Verwendung von zwei verschiedenen Gal4-Expressionsmustern exprimiert. Jedes Muster markiert eine unterschiedliche Population von Vorderbein-Neuronen und nicht-neuronalen Stützzellen.Bei beiden Expressionsmustern wurden ligandenspezifische Reaktionen auf das lipophile Pheromon CH503 beobachtet. Die relative Änderung der Fluoreszenzintensität des GCamP-Signals stieg mit höheren Konzentrationen von CH503 an. Merkwürdigerweise kann eine Dosis von fünf Nanogramm CH503 die neuronale Antwort unterdrücken.Die gemessenen Reaktionen der Gr68a- und ppk23-Neuronen unterschieden sich. Die neuronale Antwort von Neuronen, die mit dem Gr68a-Gal4-Treiber markiert waren, wies ein tonisches Muster auf, während ppk23-Neuronen im Bein eine phasische, oszillatorische Reaktion zeigten. Am Proboscis zeigten ppk23-Neuronen eine verzögert einsetzende tonische Antwort vom Zellkörper und eine oszillatorische Antwort von einem axonalen Fortsatz.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die physiologischen Reaktionen einzelner gustatorischer Neuronen auf Lipidpheromone und andere hydrophobe Liganden misst. Diese Technik eröffnet Forschern im Bereich der Chemosensorik die Möglichkeit, die Reaktionen einzelner gustatorischer Neuronen in Drosophila melanogaster zu messen. Mithilfe dieser Technik kann die neuronale Aktivität unter Verwendung eines temperaturgesteuerten Shibire oder eines TRiP a-one-Transgens unter Kopplung des Spinning-Disk-Mikroskops an einen temperaturgeregelten On-Stage-Inkubator unterdrückt oder aktiviert werden.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in fünf Minuten durchgeführt werden, ohne die Zeit einzubeziehen, die die Fliege benötigt, um sich von der Anästhesie zu erholen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Fliege fest auf dem Deckglas zu fixieren, ohne ihr Vorderbein zu beschädigen. Während der Bildgebung ist es wichtig, die Bilder unmittelbar nach der Stimulation des Vorderbeins mit der Pheromonlösung aufzunehmen.

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben eine etablierte Technik zur Messung und Analyse Gerüche hervorgerufene Kalzium-Reaktionen im Antennallobus...

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

Dieses Video beschreibt die In-vivo-Calcium-Bildgebung in Drosophila-Neuronen mit GCaMP. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz von Pilzkörperneuronen während eines olfaktorischen Konditionierungsexperiments aufgezeichnet werden können.

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung neuronaler Aktivität

Dieses Video demonstriert eine Methode zum Nachweis sensorischer Neuronenreaktionen in Drosophila mittels Ligandenbindung und Fluoreszenzbildgebung. Liganden binden an Neuronenrezeptoren und verursachen so den Kalziumeinstrom. Das Kalzium bindet an Indikatorkomplexe, was zu einer Fluoreszenzemission führt, die die neuronale Reaktion auf den Liganden bestätigt.

Detektion physiologischer Reaktionen von sensorischen Neuronen in Drosophila

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vivo Kalziumbildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren in Fliegen. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Fliegen für die Mikroskopie, zur Durchführung der olfaktorischen Konditionierung und zur Visualisierung des geruchsinduzierten Kalziumeinstroms.

im lebenden Organismus Calcium-Imaging mit synaptisch lokalisierten Calciumsensoren in Drosophila melanogaster

Quelle: Ishimoto, H. et. al., Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Visualisierung der Gehirnreaktionen auf endokrine Signalwege bei Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video zeigt die Kalziumbildgebung zur UntersuchungDrosophila Gehirnreaktionen auf Neuropeptide. Neuronen, die einen fluoreszierenden Kalziumindikator exprimieren, zeigen die intrazelluläre Kalziumdynamik und funktionelle Reaktionen auf Signalmoleküle.

Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Untersuchung der Reaktionen des Drosophila-Gehirns auf Neuropeptide

Dieser Artikel beschreibt ein anpassungs ex vivo - Protokoll zur Visualisierung von Ca 2+ während Eiaktivierung in Drosophila.

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die ex-Vivo Calcium Bildgebung des Gehirns Drosophila . Bei dieser Methode können der Puffer, testen Sie ihre Fähigkeit, bestimmte Nervenzellen im Gehirn zu aktivieren natürliche oder synthetische Verbindungen zugewiesen werden.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Ein Calcium-Imaging-Ansatz ermöglicht die Aufzeichnung von geschmacksinduzierten Reaktionen im Gehirn wacher Fliegen, während eine Lösung auf das Labellum aufgetragen wird. Primäre gustatorische Reaktionen in Drosophila melanogaster werden als Beispiel verwendet, aber dieses Protokoll kann angepasst werden, um nachgeschaltete Neuronen oder andere Spezies zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung von geschmacksinduzierten neuronalen Reaktionen bei adulten Drosophila

Wir stellen Calcium-Bildgebungsprotokolle  für ein Drosophila-Larven-Geruchsneuron vor, bei denen ein topischer Gewebekleber zur Immobilisierung verwendet wird. Diese Methode erhöht die Stabilität und ermöglicht zuverlässige in-vivo- und ex-vivo-Experimente. Benutzerdefinierte R-Skripte analysieren Kalziumsignale und bieten eine effiziente Plattform für detaillierte neurophysiologische Forschung.

In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium

Erfahren Sie Calcium-Imaging zur Messung physiologischer Reaktionen gustatorischer Neuronen bei Drosophila auf Lipid-Pheromone. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einzelner Neuronen in lebenden Tieren.

Mess physiologischen Reaktionen von

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