Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in Drosophila melanogaster Verwenden der Flywalk Paradigm

Das übergeordnete Ziel dieses Verhaltensbioassays ist es, das geruchsgesteuerte Verhalten bei Essigfliegen zu untersuchen. Fly Walk ist ein Hochdurchsatzsystem, das die Verhaltensreaktionen mehrerer einzelner Fliegen auf olfaktorische Reize automatisch verfolgt und analysiert. Diese neue Technik kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet des Geruchssinns von Insekten zu beantworten.

Was ist das hedonische Gleichgewicht eines Geruchs, oder was bedeutet die Zugabe von zusätzlichen Geruchsstoffen für dieses Gleichgewicht? Der Hauptvorteil dieses Experiments besteht darin, dass wir geruchsgesteuertes Verhalten in hoher temporärer Auflösung verwenden können und Geruchsreize verwenden, die denen ähneln, die Insekten in der Natur erleben oder die wir auch in elektrophysiologischen Aufzeichnungen verwenden. Im Allgemeinen könnten Personen, die versuchen, diese Methode anzuwenden, Schwierigkeiten haben, weil sie wirklich ein luftdichtes System benötigt, also müssen Sie wissen, wo die Luft hindurchströmt, und Sie müssen sicher sein, dass es überhaupt keine Lecks gibt, wo die Luft das System verlassen kann. Für diese Experimente ist es wichtig, die Fliegen unter einem 12 bis 12 hellen Dunkelzyklus in niedrigen bis mittleren Kulturen aufzuziehen, die eine normales Lebensmittelmedium.

Halten Sie die Raumtemperatur zwischen 23 und 25 Grad Celsius, und die relative Luftfeuchtigkeit sollte bei der Vorbereitung etwa 70 % betragen. Mit großen Kulturfläschchen wurden 20 bis 30 Erwachsene für eine Woche hergestellt und Gruppen von 30 bis 40 gemischtgeschlechtlichen Nachkommen gesammelt, um eine experimentelle Kohorte zu bilden. Wenn eine Kohorte zwei bis vier Tage alt ist, geben Sie sie in ein neues Fläschchen mit einem feuchten Schaumstoffstopfen oder einem feuchten Seidenpapier.

Lassen Sie die Fliegen vor dem Test 24 Stunden lang in diesem Fläschchen hungern. Es ist wichtig, dass die Fliegen während dieses Transfers nicht betäubt werden. Für dieses Setup dienen 250-Milliliter-Flaschen als ebenso viele Luftbefeuchter.

Füllen Sie jede Flasche mit 100 Millilitern destilliertem Wasser. Bereiten Sie als Nächstes einen halben Milliliter Arbeitsmaterial von jedem Odorant als eine 1000-prozentige Verdünnung der reinen Gerüche und des Mineralöls vor. Bereiten Sie auf ähnliche Weise ein PCR-Röhrchen nur mit Mineralöl vor, das als Negativkontrolle dient.

Bereiten Sie nun das Geruchsabgabesystem für jedes Odormittel vor. Im Experiment. Schließen Sie zwei Kugelrückschlagventile an jedes Geruchsfläschchen an.

Achten Sie darauf, die Geruchsfläschchen in der richtigen Durchflussrichtung anzuschließen. Eine falsche Verbindung beeinträchtigt nicht nur das geplante Experiment, sondern kann auch das Verabreichungssystem kontaminieren. Überprüfen Sie als Nächstes das System auf Undichtigkeiten.

Verschließen Sie zunächst den Auslass der Mischkammer. Überprüfen Sie dann, ob der gesamte Luftstrom vor dem Stimulusgerät auf Null abfällt. Wenn es Lecks im System gibt, achten Sie darauf.

Sie können in der Regel durch den Austausch von Gummidichtungen an wichtigen Anschlüssen oder den Austausch von Teflonschläuchen behoben werden. Für den ersten Schritt dieses Verfahrens ist das Zerbrechen von Glas ein Problem, also ziehen Sie Schutzausrüstung an. Übertragen Sie vorsichtig 15 einzelne Testfliegen auf die einzelnen Glasröhrchen Mit einem Aspirator verschließen Sie die Glasröhrchen beidseitig mit den entsprechenden Adaptern, sie müssen sehr fest sitzen.

Verbinden Sie als Nächstes die geladenen Glasröhren mit dem Fly Walk-Setup. Sobald alle Röhren angebracht sind, lassen Sie die Fliegen mindestens 15 Minuten lang an die neue Umgebung gewöhnen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Schalten Sie nun die Lichtquelle ein.

Stellen Sie sicher, dass genügend Licht für eine effiziente Nachführung vorhanden ist, ohne die Temperatur in den Glasröhren zu erhöhen. Die Geruchsfläschchen müssen an dieser Stelle alle miteinander verbunden werden, um ein geschlossenes System zu schaffen. Die Gewöhnungszeit beruht auf einem geschlossenen System ohne Lecks, so dass der Luftstrom durch die Rohre mit der gleichen Geschwindigkeit wie während der Testperioden erfolgt.

Überprüfen Sie den Luftstrom am Computer und schließen Sie ihn an die digitalen Durchflussmesser an. Der Gesamtluftstrom, der das System verlässt, sollte dem Luftstrom entsprechen, der in das System eintritt. Wenn nicht, liegt ein Leck vor.

Das Leck wirkt sich auf den Luftstrom in allen Rohren aus, aber das problematische Rohr ist in der Regel dasjenige, das den größten Abfall des Luftstroms aufweist. Wenn ein neues Leck festgestellt wird, wird es in der Regel durch ein Glasrohr verursacht, das im Inneren des Adapters zerbrochen ist, oder es wird durch Glasscherben in den Adaptern aus früheren Experimenten verursacht. Stellen Sie während dieses Prozesses sicher, dass die Luftfeuchtigkeit der aus dem System austretenden Luft zwischen 60 und 80 % liegtNachdem sich die Fliegen an ihre Röhren gewöhnt haben, kann das Experiment durchgeführt werden.

Prinzipiell kann bisher jede beliebige Abfolge von Gerüchen dargestellt werden. Die besten Ergebnisse erhält man, wenn man die Reize zufällig anordnet und sie mindestens 90 Sekunden voneinander trennt. Insgesamt.

Präsentieren Sie jeden Geruch 40 Mal in 500-Millisekunden-Impulsen. Richten Sie als Nächstes einen Interessenbereich ein, indem Sie einen Rahmen über den zu überwachenden Bereich ziehen. Nehmen Sie alle 15 Glasrohre in den Rahmen auf, aber schließen Sie die äußeren fünf Millimeter der Rohrenden aus.

Der nächste Schritt besteht darin, die Tracking-Software zu deaktivieren und Änderungen am Skript vorzunehmen. Dadurch ändert sich die Position der 14 parallelen Linien, die die einzelnen Rohre voneinander trennen, auf der Y-Achse. Wenn die Tracking-Software wieder eingeschaltet ist, sollte sich nur eine Fliege zwischen zwei beliebigen Leinen befinden.

Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die Kameraparameter so eingestellt sind, dass die Fliegen zuverlässig durch die Glasröhren verfolgt werden. Wenn die Fliegen an den Rändern des interessierenden Bereichs verloren gehen, erhöhen Sie die Helligkeit oder Verstärkung der Tracking-Software. Nachdem das System vollständig vorbereitet ist, starten Sie das Stimulusprotokoll

Zeichnen Sie die Positionen der Fliegen mit einer Rate von 20 Bildern pro Sekunde auf und protokollieren Sie diese Koordinatenpositionen in Kombination mit dem Status des Geruchsventils in Textdateien. Da das Experiment sehr geruchsempfindlich ist, ist eine regelmäßige Reinigung erforderlich, um die Glasröhren zu reinigen, sie in Reinigungsmittel einzuweichen und dann unter fließendem destilliertem Wasser abzuspülen. Trocknen Sie die Rohre nach der Spülung unter Druckluft und erhitzen Sie sie anschließend acht Stunden lang auf 200 Grad Celsius.

Um das Geruchsabgabesystem zuerst zu reinigen, entfernen Sie alle Geruchsfläschchen und Schläuche aus der zentralen Mischkammer. Entfernen Sie dann die Schlauchadapter aus der Mischkammer. Reinigen Sie die geleerte Mischkammer, indem Sie sie wie die Schläuche unter einer Haube mit einem Lösungsmittel spülen.

Trocknen Sie die Mischkammer mit Druckluft und erhitzen Sie sie acht Stunden lang bei 200 Grad Celsius. Um die Geruchsfläschchen und die Ventile zu reinigen, entfernen Sie die Stahlstopfen, entsorgen Sie die Gummidichtungen und entfernen Sie die Rückschlagventile, Seifenrückschlagventile und Ethanol sowie andere Bestandteile von Ethanol und Aceton. Anschließend beschallen Sie die eingeweichten Komponenten 30 Minuten lang auf der maximalen Stufe und spülen sie mit destilliertem Wasser ab.

Verwenden Sie wie bisher Druckluft zum Trocknen und erhitzen Sie die Bauteile acht Stunden lang auf 200 Grad Celsius. Spülen Sie sie mit Ethanol Wenn Aceton in Richtung des Luftstroms Aceton Gummiteile angreift, trocknen Sie jedes gespülte Rückschlagventil sofort mit Druckluft, um alle Restgerüche von den gespülten Rückschlagventilen zu entfernen. Pulsieren Sie mehrere Tage lang mit Luft, stellen Sie sie in einem 60 Grad Celsius heißen Inkubator auf, wobei der Luftstrom im Sekundentakt ein- und ausgeschaltet wird.

15 verhungerte weibliche Fliegen wurden Ethylbutyrat ausgesetzt. Der gelbe Balken stellt den Geruchsimpuls dar. Die blauen Quadrate zeigen die Aufwindbewegung innerhalb eines Zeitrahmens von 100 Millisekunden.

Entsprechend stellen rote Quadrate die Abwindbewegung dar. Dieselben Fliegen zeigten auch eine Aufwindbewegung als Reaktion auf die Stimulation mit Isop Pentylacetat, Ethylacetat oder zwei drei Butan d, gemittelt auf die Population. Die Reaktion der Fliege auf Ethylacetat hatte einen scharfen Beginn, eine hohe Amplitude und eine kurze Dauer.

Im Gegensatz dazu hatte die Reaktion auf zwei Drei-Butan-Dion einen späteren durchschnittlichen Beginn, eine geringere Amplitude und eine längere Dauer. Letztendlich wurden die Daten von jedem Odorant auf diese Weise aufgelöst und dann weiter analysiert, um zu zeigen, dass alle vier Gerüche innerhalb von vier Sekunden eine höhere Aufwindverschiebung hervorriefen als das Lösungsmittel. Darüber hinaus wurden durch das Öffnen von Odormittelfläschchen synchron Fliegen allen möglichen Mischungen ausgesetzt.

Nach der Stimulation der Fliegen mit den vier einzelnen Gerüchen waren die Stimulationen mit Mischungen der vier Gerüche alle mindestens genauso attraktiv wie die attraktivste einzelne Verbindung in der Mischung. Sobald Sie es beherrschen, können Sie dieses Experiment innerhalb einer Stunde durchführen, dann läuft es acht Stunden lang und bereits 30 Minuten später können Sie Ihre ersten Ergebnisse visualisieren. Diese Methode ermöglicht es also, Daten von vielen Fliegen in kurzer Zeit mit hoher temporärer Auflösung zu erhalten.

Aber seien Sie vorsichtig. Dieses Experiment erfordert eine umfangreiche Reinigung zwischen den Experimenten. Wenn Ihr System immer noch mit den Ameisen aus dem letzten Experiment kontaminiert ist, können Sie Ihre Ergebnisse beim Fliegengang vergessen.

Sie können natürlich auch genetisch veränderte Fliegen testen, mit denen Sie den Einfluss einzelner oder werksseitiger neuronaler Schaltkreise auf das OD-gesteuerte Verhalten untersuchen können. Nach der Entwicklung dieser neuen Technik ebnete sie den Weg für uns, die Forschung auf diesem Gebiet, der Insektenfraktion, zu betreiben, um die Kodierung dieser Gerüche im Gehirn des Insekts zu verstehen. Und wichtig ist, dass die Verwendung der gleichen Art von Stimulation für das Verhalten beim Fliegengang und für physiologische Experimente bedeutet, dass wir diese beiden unterschiedlichen experimentellen Paradigmen wirklich vergleichen können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie den Fliegengang etablieren können, und Sie sollten in der Lage sein, dieses Experiment auf Ihrem eigenen Schoß durchzuführen und bald Ihre eigenen Hochdurchsatzexperimente zur Insektenbefall zu starten. Aber vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Glaswaren und Chemikalien extrem gefährlich sein kann, tragen Sie daher immer einen Laborkittel. Tragen Sie eine Schutzbrille und Handschuhe.