Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, biomimetische Materialien herzustellen, die aus reinen rekombinanten Adhäsionen bestehen, die an Polystyrolkügelchen gekoppelt sind, mit denen dann die biochemischen und funktionellen Wechselwirkungen zwischen einzelnen bakteriellen Adhäsionen und Wirtszellrezeptoren untersucht werden können. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Wirt-Erreger-Interaktionen zu beantworten, wie z. B. die Messung der Auswirkungen auf die Signalübertragung von Wirtszellen und die Hemmung der durch Krankheitserreger vermittelten Zytotoxizität. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass gereinigte Adhäsionen, a AEAs, gerichtlich und kovalent an Polymerpartikel gekoppelt sind, die in ihrer Größe bakteriell ähnlich groß sind und somit die Darstellung der Bakterienoberfläche nachahmen.

Mit mir wird der TU A-C-E-D-A Doktorand aus unserem Labor das Verfahren demonstrieren. Hier wird die gerichtete Kopplung von Thal-Amin demonstriert. Dieses Protokoll eignet sich für die Kopplung von Cystin-haltigen Proteinen an aminfunktionalisierte Polymerkügelchen unter Verwendung von SUL-Succinyl für p Meliphenylbutyrat oder SMPB Als Vernetzungsmittel bereiten Sie alle notwendigen Reagenzien unmittelbar vor der Verwendung vor, wie im Protokolltext beschrieben, um das Verfahren zur Beads Aktivierung zu beginnen.

Mischen Sie eine Bead-Suspension durch vorsichtiges Invertieren und geben Sie dann die erforderliche Menge der Bead-Suspension in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen. Mit einem Milliliter sterilem PBS pH 7,0 pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Kügelchen und das Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge zu waschen. Huge vorsichtig die Schlinge mit einer Pipette und einer Narbe entfernen.

Suspendieren Sie das Bead-Pellet in einem Milliliter frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. Suspendieren Sie das Bead-Pellet wieder. In 0,8 Milliliter PBS fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitetes 10 Millimolar SFO SMPB hinzu.

Um eine Endkonzentration von zwei Millimolar zu erhalten, inkubieren Sie die Bead-Suspension eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius auf einem rotierenden Rad, während die Beads inkubieren. Bereiten Sie das Protein für den folgenden Kopplungsschritt vor, damit es sofort zu den aktivierten Kügelchen hinzugefügt werden kann. Überprüfen Sie die Proteinkonzentration und stellen Sie sie auf die für die Kupplungsreaktion erforderliche Endkonzentration ein. Sechs.

Mikromolare Proteine und PBS und ein Volumen von einem Milliliter werden in der Regel zur Proteinreduktion verwendet. Fügen Sie eine TEP-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von fünf Millimolaren zu erhalten. Inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang. Bei Raumtemperatur werden einige Mikroliter der Proteinlösung aufbewahrt, um die anfängliche Proteinkonzentration zu bestimmen und die Kopplungseffizienz zu berechnen.

Starten Sie den Proteinkopplungsvorgang, indem Sie die aktivierten Kügelchen pelletieren und das Pellet waschen. Sobald Sie einen Milliliter frisches, steriles PBS eingenommen haben, suspendieren Sie das Pellet in der vorbereiteten Proteinlösung, um die gewünschte Proteinkonzentration zu erhalten. Inkubieren Sie die Proteinbead-Suspension zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius auf einem rotierenden Rad. Nach zwei Stunden deaktivieren Sie die verbleibenden aktivierten Gruppen auf den Kügelchen, indem Sie eine Sixtin-Stammlösung mit einer Endkonzentration von 50 Millimolar hinzufügen und 30 Minuten lang bei 25 Grad Celsius auf einem rotierenden Rad zur Suspension inkubieren.

Die Kügelchen durch Zentrifugation gehalten. Behalten Sie die Snat zur Bestimmung der Proteinkonzentration und zur Berechnung der Kopplungseffizienz. Waschen Sie das Bead-Pellet zweimal mit einem Milliliter PBS und Resus-Biegung und einem Milliliter frischem PBS, um das Endprodukt einen Tag vor dem Wettkampf-Assay zu säen: Säen Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit einem Milliliter Hela-Zellen in einer Konzentration von 150.000 Zellen pro Milliliter aus.

Dies ermöglicht es den Zellen, vor Beginn des Experiments eine Co-Flüssigkeit von etwa 80 % zu erreichen. Beimpfen Sie eine fünf Milliliter schwere marine LB-Kultur mit einer frischen Kolonie von V para hämolytisch und züchten Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Bereiten Sie ausreichend beadgekoppeltes multivalentes Adhäsionsmolekül vor, wie zuvor gezeigt.

Erlauben Sie 100 Mikroliter 10 x Kügelchen pro Well oder eine Endkonzentration von 500 nanomolaren Proteinen am Tag des Wettbewerbsassays. Messen Sie den OD 600 der Bakterienkultur. Bereiten Sie Infektionsmedien vor, indem Sie Bakterienkulturen ohne Zusatzstoffe in farbloses DMM verdünnen.

Vorwärmen auf 37 Grad Celsius mit 10 % Volumen-zu-Volumen-Beat-Suspension. Um einen MOI von 10 zu erhalten, bereiten Sie einen Milliliter pro Vertiefung und 10 bis 20 % überschüssiges Volumen pro Probe vor. Entfernen Sie das alte Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie das Kultivierte.

Heilen Sie die Zellen, indem Sie in jede Vertiefung einen Milliliter steriles PBS geben, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie einen Milliliter Infektionsmedium pro Vertiefung hinzu. Fügen Sie Lösungen hinzu, die Kontrollkügelchen und Bakterien als Positivkügelchen und Adhäsionskügelchen und keine Bakterien als negativ enthalten. Steuerung.

Als Lysekontrolle wird DMM mit 0,1 %TRITTON X 100 zugegeben. Richten Sie jede experimentelle Bedingung ein, einschließlich der Steuerelemente, die dreifach ausgeführt werden. Inkubieren Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeit.

Die Zytotoxizität wird bewertet. Vier Stunden nach der Infektion. Entnehmen Sie 200 Mikroliter aus jeder Vertiefung, die in der 24-Well-Platte verwendet wird, und übertragen Sie sie auf eine neue 96-Well-Platte.

Schleudern Sie die 96-Well-Platte fünf Minuten lang bei 1.500 g und geben Sie 100 Mikroliter aus jeder Well in eine frische 96-Well-Platte. Geben Sie 100 Mikroliter des während der Infektionsexperimente verwendeten Mediums in drei frische Vertiefungen der 96-Well-Platte, um es als Blindproben zu verwenden. Führen Sie den Laktatdehydrogenase-Freisetzungsassay mit einem LDH-Zytotoxizitätsnachweiskit und gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.

Berechnen Sie zunächst die benötigte Reagenzmenge in Schritten von 25. Zum Beispiel für 100 Samples. Mischen Sie 11,25 Milliliter Reagenz A mit 250 Mikrolitern Reagenz B Invertieren, um Schaumbildung zu vermeiden, nicht wirbeln.

Geben Sie dann die Mischung in einen Behälter. Geben Sie dann 100 Mikroliter der Reagenzmischung zu jeder Probe und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur bei 10, 20 und 30 Minuten. Lesen Sie die Absorption bei 490 Nanometern auf einem Plattenlesegerät ab.

Berechnen Sie anschließend die prozentuale Zytotoxizität, wie im Manuskript beschrieben, die Messungen der bakteriellen Adhäsion erfolgen eine Stunde nach der Infektion. Entfernen Sie das Medium aus der Zellschicht und waschen Sie die Zellschicht gründlich mit sterilem, vorwarmem PBS, um nicht gebundene Zellen zu entfernen. Waschen Sie die Platte mindestens drei- bis viermal mit einem Milliliter PBS, jedes Mal mit Lyce in die Wirtszellen, indem Sie in jede Vertiefung einen Milliliter einer sterilen Triton X 100-Lösung von 1 Vol.-/Volumenprozent in PBS geben und die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Pipettieren Sie jede Probe mehrmals auf und ab, bevor Sie den Inhalt jeder Vertiefung in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Bereiten Sie zehnfache Serienverdünnungen der Proben in sterile PBS-Platten vor, 100 Mikroliter jeder Probe auf marinen LB-Agar und verteilen Sie sie mit einem Zellspreader, um die Verdünnung auf die Platte in Abhängigkeit von den Bakterienstämmen und dem Zeitpunkt für diesen Versuchsaufbau zu optimieren.

Eine Verdünnung von 10 bis zum Fünften oder 10- bis zum Sechsfachen ergibt eine geeignete Anzahl von KBE. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius über Nacht am nächsten Tag, zählen Sie die Bakterien durch Koloniezählung. In Wettkampfassays wurden Ferela-Zellen mit dem para-hämolytischen V-Stamm infiziert.

Schlecht als positiv angegeben oder nicht infiziert in Gegenwart verschiedener konkurrierender Entitäten. Eine In-vitro-Infektion mit einer schlechten Infektion führte zu einer sehr hohen Zelllyse, die durch sieben gekoppelte MAM-Kügelchen gehemmt wurde, nicht jedoch durch eine- oder GST-gekoppelte MA'AM-Kügelchen. Zählung von v paralytisch, die entweder an unbehandelte HELOC-Zellen oder mit MAM inkubierte Zellen gebunden sind.

Sieben MAM-Eins- oder GST-Kontrollperlen zeigten, dass MAM. Sieben Perlen, aber keine MAM-Perlen oder GST-Kontrollperlen. Outcompete v para hämolytisch für die Bindung an Oberflächenrezeptoren der Wirtszelle.

Adhäsionen, die an Fluor gekoppelt sind. Vier markierte Kügelchen können die Adhäsion von Bakterien an Wirtszellen nachahmen und sind leistungsstarke Werkzeuge für die zelluläre Bildgebung. Die Röhre auf der rechten Seite enthält eine Suspension aus fluoreszierenden blauen biomimetischen Kügelchen. Mam.

Sieben gekoppelte fluoreszierende blaue Kügelchen wurden verwendet, um den Prozess der MMM-vermittelten Bindung an Epithelzellen zu charakterisieren. Die Bindung von MAM seven an Wirtszellen führte zu Aktin-Umlagerungen und Bildung von Stressfasern, die mit Hilfe von Rumine Phin zur Färbung von f-Aktin kovisualisiert wurden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Affinitätsreinigung in Verbindung mit Proteomik oder Western Blot durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche zellulären Faktoren des Wirts an Signalprozessen nach der bakteriellen Anheftung beteiligt sind.