Name: Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung biomimetischer Materialien aus polymergebundenen rekombinanten Adhäsinen zur Analyse bakterieller Bindung an Wirtszellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Signalwegen und Zytotoxizität.

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Die Autoren danken den Mitgliedern der Krachler-Gruppe für die kritische Lektüre des Manuskripts. DHS, DV und AMK wurden vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1) finanziert, FA wurde durch ein Stipendium des irakischen Ministeriums für Hochschulbildung und wissenschaftliche Forschung finanziert und NPS wurde durch ein CONICYT-Stipendium finanziert.

1. Chemische Kopplung von Proteinen an Perlpolymerisates <ol><li> Thiol-Amin-Richtungskopplungs Hinweis: Dieses Protokoll ist für Kopplung von Cystein enthaltenden Proteinen zu Amin-funktionalisierten Polymerkügelchen mit Sulfosuccinimidyl-4- (p maleimidophenyl) butyrat (Sulfo-SMPB) als Vernetzungsmittel (1). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vernetzungsstrategie für gerichtete Thiol-Amin-Kupplung von Proteinen an Polymerkügelchen verwendet. Aminmodifizierten Polystyrol-Kügelchen sind mit Sulfo-SMPB aktiviert. Die Maleimid reagiert mit freien Cysteine ​​zu koppeln, Proteine, um Perlen gerichtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Herstellung der Reagenzien: <ol><li> Vorbereitung PBS (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) und Autoklaven. </li&gt; <li> Bereiten Sie eine 100x Lager (0,5 M oder 287 mg / ml in PBS) von TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin) unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 5x Lager (10 mM bzw. 4,58 mg / ml in dH 2 O) von Sulfo-SMPB unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (500 mM oder 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) von Cystein unmittelbar vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Bead-Aktivierung: <ol><li> Mischen die Perlensuspension durch sanftes Invertieren und Übertragen der erforderlichen Menge an Perlensuspension (beispielsweise 12 ml) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS, pH 7,0. </li><li> Gently Pipette auf und ab, um die Perlen und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (2 min bei 16.000 × g) waschen. </li><li> Den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie vorsichtig entfernen. Resuspendieren der Wulst Pellet in 1 ml frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. Resuspendieren Wulst Pellet in 0,8 ml PBS. </li><li> Fügen Sie 200 ml frisch hergestellte 10 mM Sulfo-SMPB, um eine endgültige concent gebenration von 2 mm. </li><li> Inkubieren der Perlen-Suspension für 1 h bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. </li></ol></li><li> Protein-Reduktion: <ol><li> Während der Inkubationszeit der Aktivierungsschritt vorzubereiten, die das Protein die folgenden Kupplungsschritt so kann sie sofort an die aktivierten Beads zugesetzt werden. Anmerkung: Obwohl diese Reduktionsschritt nicht immer für GST (Glutathion-S-Transferase) Fusionsproteine ​​erforderlich ist, wird empfohlen, eine hohe Kopplungseffizienz zu gewährleisten. <ol><li> Überprüfen der Proteinkonzentration und stellen sie auf die Endkonzentration für die Kupplungsreaktion erforderlich. Anmerkung: 6 mM Protein in PBS, und ein Volumen von 1 ml werden in der Regel verwendet. </li><li> In TCEP Lager, um eine Endkonzentration von 5 mM zu ergeben. Inkubieren der Lösung für 30 min bei RT. Anmerkung: Das Reaktionsgemisch kann direkt für die folgende Kupplungsreaktion verwendet werden. </li><li> Behalten eine kleine Menge (einige ml) der Proteinlösung für die Bestimmung der pro<html> Proteinkonzentration und Berechnung des Kopplungseffizienz (siehe Abschnitt 2). </li></ol></li></ol></li><li> Protein-Kupplungsschritt: <ol><li> Pellet die aktivierten Beads durch Zentrifugation (2 min, 16.000 xg in einer Mikrozentrifuge) und wasche das Pellet einmal in 1 ml frischer steriler PBS. </li><li> Das Pellet in die vorbereitete Proteinlösung (zum Beispiel 1 ml), um das gewünschte Proteinkonzentration zu ergeben. Achtung: Die Proteinkonzentration während der Kupplungsschritt wird auf die durchschnittliche Kupplungseffizienz (siehe Abschnitt 2 zur Bestimmung der Kopplungseffizienz) und der gewünschten Kupplungsdichte (wie in 1.1.4.3 berechnet) abhängen. Der Wirkungsgrad etwa 85%, und die gewünschte Endkonzentration 5 mM im 10x Perlensuspension, so Proteinkonzentration während der Kupplungsstufe sollte ungefähr 6 mm betragen. </li><li> Berechnung der Kupplungsdichte unter Verwendung der folgenden Formel: jpg &quot;/&gt; wobei ρ c Kupplungsdichte [Anzahl der Protein-Moleküle / nm 2], Protein konzentrierter Proteinkonzentration [mg / ml] Protein M w Proteinmolekulargewicht [da], Wulst konz Perlenkonzentration [Anzahl der Perlen / L], d Perlendurchmesser [nm 2] Avogadro-Zahl </li><li> Verwenden Sie die Kupplungsdichte, um die durchschnittliche Ligand Abstand berechnen: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Inkubieren der protein Bead-Suspension 2 h bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Hinweis: EinigeProteine ​​können nicht stabil sein bei RT. In diesen Fällen kann die Reaktion bei 4 ° CO / N ausgeführt werden. </li><li> Deaktivieren verbleibenden aktivierten Gruppen auf den Perlen durch Zugabe von Cystein-Lager bis zu einer Endkonzentration von 50 mM und Inkubation der Suspension für 30 min bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Pellet die Beads durch Zentrifugation (2 min, 16.000 xg in einer Mikrozentrifuge). </li><li> Halten Sie den Überstand zur Bestimmung der Proteinkonzentration und Berechnung des Kopplungseffizienz (siehe Abschnitt 2). </li><li> Zweimaliges Waschen der Bead-Pellet mit 1 ml PBS und resuspendieren in 1 ml frischem PBS, um das Endprodukt zu ergeben. Hinweis: Das obige Protokoll wird in der Regel geben, 1 ml gekoppelten Protein, in einer Endkonzentration von 5 mM Protein, das als 10x Lager für nachfolgende Experimente (siehe Abschnitt 3) verwendet werden kann. </li><li> Um in Abschnitt 3 des Protokolls gehen, arbeiten mit 100 ml / ml Bead Lager, oder in einer Endkonzentration von 500 nM Protein. Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt für diese procedure ist 2 × 10 12 Perlen / ml sein, was zu einer durchschnittlichen Kupplungsdichte von 3 × 10 -4 Proteine ​​/ nm 2 oder einem mittleren Abstand von 57 nm auf einem Kügelchen von 2 mm Durchmesser. </li></ol></li></ol></li><li> Thiol-Carboxy Richtungskopplungs Hinweis: Dieses Protokoll ist für die Kopplung Cystein enthaltenden Proteinen an carboxylfunktionalisierten Polystyrolperlen. Die Carboxylgruppe zunächst mit 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) / N-Hydroxysuccinimid (NHS), modifizierte Amin und anschließend vernetzt mit Sulfo-SMPB (Figur 2) aktiviert wird. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vernetzungsstrategie für gerichtete Thiol-carboxyl Kopplung von Proteinen an Polymerkügelchen verwendet. Carboxylierte Polystyrolkügelchen werden zunächst mit EDC aktiviert und mit NHS modifiziert, um eine semistabile NHS-Ester zu bilden. Nachfolgende Amin-Kopplung ethylenediAmin führt zu einer freien Amingruppe, die sich mit Sulfo-SMPB reagiert. Maleimid aktivierte Kügelchen können dann mit freien Cysteinen reagieren paar Proteine, um Perlen gerichtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Herstellung der Reagenzien: <ol><li> Vorbereitung PBS (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) und Autoklaven. </li><li> Bereiten Sie eine 100x Lager (0,5 M oder 287 mg / ml in PBS,) von TCEP unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (20 mM oder 4 mg / ml in PBS) EDC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (50 mM, oder 6 mg / ml in PBS) des NHS (N-Hydroxysuccinimid) unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 5x Lager (10 mM bzw. 4,58 mg / ml in dH 2 O) von Sulfo-SMPB unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 10-faches (500 mM oder 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) von Cystein sofort bevor Gebrauch. </li></ol></li><li> Bead-Aktivierung: <ol><li> Mischungsperlensuspension durch sanftes Invertieren und Übertragen der erforderlichen Menge an Perlensuspension (beispielsweise 12 ml) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS, pH 7,0. </li><li> Gently Pipette auf und ab, um die Perlen und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (2 min bei 16.000 × g) waschen. </li><li> Den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie vorsichtig entfernen. </li><li> Resuspendieren der Wulst Pellet in 1 ml frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Resuspendieren Wulst Pellet in 0,8 ml PBS. </li><li> 100 ml 10-fach EDC Lager (2 mM Endkonzentration) und sofort 100 ml 10x NHS-Stammlösung (5 mM Endkonzentration) auf die Partikelsuspension. </li><li> Inkubieren der Perlen-Suspension für 30 min bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. </li><li> Einmal zu waschen Kügelchen in 1 ml PBS und resuspendieren in 0,8 ml frischem sterilem PBS. </li><li> In 200 ml Ethylendiamin und incUbate die Perlensuspension 1 Stunde bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. </li><li> Einmal zu waschen Perlen mit 1 ml PBS und Resuspendieren der Kügelchen in 0,8 ml frischem PBS. </li><li> Gehen Sie aus dem Abschnitt 1.1.2.4 (Wulst Aktivierung mit Sulfo-SMPB) wie in Abschnitt 1.1.2 beschrieben und folgen Sie den Rest des in Abschnitt 1.1 (Thiol-Amin-Richtungskopplungs) beschriebenen Protokoll. Führen Proteinpräparat und Protein-Kopplungsschritte in einer Weise identisch zu denen in Abschnitt 1.1 beschrieben. Hinweis: Die typische Kopplungseffizienz unter Verwendung dieses Protokolls ist etwas niedriger im Vergleich zum Abschnitt 1.1, also die anfängliche Proteinkonzentration entsprechend anpassen, um die gleiche Kopplungsdichte zu erreichen (ca. 75%.). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Bestimmung der Kopplungseffizienz Hinweis: Um festzustellen, Proteinkonzentration, verwenden Sie Bradford-Reagenz 10 und kolorimetrische Assays wie folgt: <ol><li> Vorsichtig umdrehen Bradford-Reagenz bis e<html> Nsure Homogenität des Reagens. </li><li> Unter Verwendung einer 10 mg / ml BSA-Stammlösung, prepare protein Normen für Konzentrationen von 0,1 bis 1,5 mg / ml BSA in Puffer. </li><li> Man 250 ml Bradford Reagenz in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Vorbereitung genug Vertiefungen für alle Proben, Proteinstandards und negative Kontrollen (nur Puffer). </li><li> 5 ml der Proteinprobe (Proteinstandards oder Puffer für die Negativkontrolle), um das Reagenz in der 96-Well-Platte. </li><li> Inkubieren der Platte auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Messung der Extinktion bei 595 nm mit einem Plattenlesegerät. </li><li> Generieren Sie eine Standardkurve der BSA-Konzentration gegen die A595 nm und nutzen diese, um Proteinkonzentrationen in der Aus- und Überstandsproben zu bestimmen. </li><li> Wird die Konzentration des gekoppelten Proteins wie folgt: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Berechnung der Kopplungseffizienz als: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> 3. Verwendung von Bead-gekoppelter Adhäsine in Konkurrenztests <ol><li> Vorbereitung: <ol><li> Samen 1 ml pro Vertiefung von HeLa-Zellen bei einer Konzentration von 150.000 Zellen / ml in eine Platte mit 24 Vertiefungen einen Tag vor der Kompetitionsassay, sodass die Zellen etwa 80% Konfluenz vor dem Beginn des Experiments zu erreichen. </li><li> Richten Sie jeden experimentellen Zustand in dreifacher Ausfertigung. Fügen Brunnen für die negativen Kontrollen (keine Bakterien während der Konkurrenz-Assays hinzugefügt), positive Kontrollen (Kontrollkügelchen, um die Fusion-Tag nur während Kompetitionsassays hinzugefügt gekoppelt) und Lyse Kontrollen (Zytotoxizität Experimente). </li><li> Impfen eine 5 ml marine LB (MLB) Kultur mit einer frischen Kolonie V. parahaemolyticus und wachsen O / N bei 30 ° C, zu zittern. </li><li> Bereiten Sie ausreichend Kügelchen gekoppelt MAM, wie in Kapitel 1 (Kupplung) beschrieben. Lassen Sie für 100 ml 10x Korn Stock pro Vertiefung. </li></ol></li><li> Competition Assay: <ol><li> Am Tag der competitIonen-Experiment messen die OD 600 der Bakterienkultur. </li><li> Bereiten Infektion Medien durch Bakterienkulturen in farblose DMEM ohne Zusätze verdünnt, auf 37 ° C vorgewärmt, mit 10% v / v Perlensuspension (entweder Adhäsin-gekoppelten Kügelchen oder Kontrollkügelchen), zu einer MOI von 10. Bereiten Sie 1 ml geben / gut, und 10-20% Überschussvolumen pro Probe. Anmerkung: Bei den oben genannten Bedingungen (24-Well-Platte, V. parahaemolyticus, MOI 10), das notwendige Volumen des O / N-Kultur zu je Vertiefung (ml / ml) ist als 3 / OD 600 der Kultur Höhe berechnet. Zum Beispiel wird 1 ml Infektionsmedium enthält typischerweise 100 ml Partikelsuspension, ein paar ml Bakterienkultur und bis zu 1 ml mit farblosen, nicht ergänzten DMEM hergestellt werden. </li><li> Entfernen alte Medium aus den Vertiefungen und waschen kultivierten HeLa-Zellen durch Zugabe von 1 ml sterilem PBS vorgewärmt auf 37 ° C zu jeder Vertiefung. </li><li> Entfernen PBS und 1 ml Infektionsmedium pro Vertiefung. Auch die Kontrollen eingestellt, durch Zugabe von Lösungen containing Steuer Perlen und Bakterien (positive Kontrolle) oder Adhäsin Perlen und keine Bakterien (negative Kontrollen) oder DMEM, das 0,1% Triton X-100 (Lyse-Steuerung, nur für Zytotoxizität Messungen erforderlich). </li><li> Inkubieren der Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C für die gewünschte Zeitdauer (zB 4 Stunden auf Cytotoxizität Messungen oder 1 Stunde auf Haftung Messungen). Anmerkung: sind bakterielle Adhäsion und Zytotoxizität auf Wirtszellen können als Auslesungen für die Wirksamkeit der Hemmung verwendet werden. Wenn die Zeitpunkte der Zytotoxizität und Haftungsmessungen übereinstimmen, können beide Tests durchgeführt unter Verwendung von Proben aus der gleichen gut, da Zytotoxizität wird mit dem Kulturüberstand und Befestigungs Assays verwenden Proben aus der restlichen Zellschicht abgeleitet wird, bestimmt. </li></ol></li><li> Zytotoxizität Messungen: <ol><li> Zu angegebenen Zeitpunkten (zB 4 Stunden nach der Infektion), entfernen Sie dreimal 200 ml von jedem 24-Loch und Transfer zumeine 96-Well-Platte. </li><li> Spin 96-Well-Platten bei 1500 × g, 5 min und Transfer 100 ml aus jeder Vertiefung in ein frisches 96-Well-Platte. 100 ml der bei der Infektionsexperimente Frisch Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen in dreifacher Ausführung verwendeten Medien (diese werden als Rohlinge verwendet werden). </li><li> Durchführung der Laktat-Dehydrogenase (LDH) Freisetzungstest unter Verwendung eines LDH Zytotoxizität Nachweiskits und nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Kurz gesagt, die Berechnung der Menge an Reagenz in Schritten von 25 benötigt (zB wenn 62 Proben gemessen werden sollen, machen genug Reagenz-Mix für 75 etc.). </li><li> Zum Beispiel für 100 Proben, mischen 11,25 ml Reagenz A mit 250 ul Reagenz B. umkehren, nicht vortexen Schaumbildung zu vermeiden. </li><li> Setzen Sie die Mischung in einem Behälter in der Lage sein, mit einer Mehrkanal-Pipette pipettiert werden. 100 l Reagenzienmix zu jeder Probe. </li><li> Inkubieren Platte bei RT und die Extinktion bei 490 nm auf einem Plattenleser bei 10, 20, 30 min. </li&gt; <li> Analysieren des Datensatzes, für die die Absorption der Lyse Kontrollprobe hoch ist, aber immer noch innerhalb des linearen Bereichs des Plattenlesers (typischerweise 2-3 Extinktionseinheiten). </li><li> Express-Ergebnisse als% Zytotoxizität, nach der folgenden Formel für die Umrechnung: <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Die Messung der bakteriellen Adhäsion: <ol><li> Bei den angegebenen Zeitpunkten (beispielsweise 1 Stunde nach der Infektion), das Medium entfernt, der Zellschicht. </li><li> Die Zellschicht gründlich mit steriler, vorgewärmten PBS (mindestens 3-4 Wäschen von jeweils 1 ml PBS), um alle nicht-anhaftenden Zellen zu entfernen. </li><li> Lyse von Wirtszellen durch Zugabe von 1 ml einer sterilen 1% v / v Triton X-100-Lösung in PBS pro Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Pipettieren Sie jede Probe nach oben und unten mehrere Male, bevor die Übertragung der Inhalt der Vertiefungen bis 1,5-ml-Röhrchen zu trennen. Bereiten Sie das 10-fache serielle Verdünnungen von Probenin sterile PBS (zB verwenden 100 ml Probe und 900 ml PBS). </li><li> Platte 100 ml von jeder Probe auf MLB Agar und verteilt unter Verwendung einer Zelle Treuer. Optimieren Sie die je nach Bakterienstämme und Zeitpunkt bis zum Teller Verdünnung. Hinweis: Für die beschriebenen Versuchsaufbau, geben 10 5 oder 10 6 fachen Verdünnungen eine geeignete Anzahl von KBE. </li><li> Platten bei 37 ° CO / N und aufzuzählen Bakterien durch Koloniezählung. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschreiben wir zwei Protokolle, die zum Koppeln thiolhaltigen Proteine ​​verwendet werden können, um Amin- oder Carboxylat-modifizierten Polystyrolperlen sind. Wegen der Leichtigkeit der Verfahrensweise, Thiol-Amin-Kopplung bevorzugt, aber abhängig von dem gewünschten Wulst Spezifikation (Durchmesser, Fluoreszenzeigenschaften) kann die Verwendung von Amin-funktionalisierten Kügelchen nicht möglich sein, und wir haben deshalb enthalten ein Protokoll, das den Carbonsäureester umwandeln - in eine Amin-Einheit für den Forscher die größtmögliche Flexibilität bei der Wahl des Gerüsts zu geben. Obwohl beide Thiol-Amin und Thiol-carboxyl Kupplungs Arbeit für jeden Cystein Protein Richtkoppler enthält (dh die Immobilisierung des Proteins pro seinem N-Terminus, imitiert surface display) erfordert eine Protein ohne Cysteinreste, wird diese als eine GST-Fusion hergestellt Protein oder dass enthält ein Nebenstelle eingeführt einzigen terminalen Cysteinrest Mutagenese. Wenn mehrere reaktive Cysteine ​​enthalten sindinnerhalb des Proteins, wird dieser zufällige Immobilisierung der Proteinfunktion beeinträchtigen könnten führen. Viele bakterielle Adhäsine weiß Cysteine ​​enthalten, nicht natürlich. Für andere kann diese durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt werden, obwohl dies umfangreiche Untersuchungen erfordert, um sicherzustellen, nativen Struktur und Funktion in der Mutante erhalten. GST-Fusionsproteine ​​können gereinigte GST-Tag an Kügelchen gekoppelt sind, wie eine geeignete Negativkontrolle verwendet werden. Verwendung entkoppelt Kügelchen als Kontrolle sollte vermieden werden, da diese oft eine höhere Neigung zu verklumpen oder sich an Zellen nicht-spezifisch. Eine vereinfachte Version der Protokoll 1.2., Nur mit EDC kann zu koppeln Proteinen an Carboxylgruppen funktionalisierten Polymerkügelchen verwendet werden, jedoch ist in diesem Fall Kopplung erfolgt über primäre Amine in dem Protein und garantiert deshalb nicht Richtungskopplung. TCEP als Reduktionsmittel darf nicht mit anderen kommerziell erhältlichen und üblichen Reduktionsmitteln, wie zum Beispiel dithiothr ersetzt werdeneitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (BME), da die in ihnen enthaltenen Thiole mit Protein-Kopplung in der Thiol-Maleimid Kopplungsschritt konkurrieren. PBS kann mit anderen Puffer ersetzt werden, aber mit den folgenden Überlegungen: Puffer möglicherweise nicht primäre Amine enthalten (so Tris-Puffer enthält, sind nicht geeignet). Verwendung von Puffern, die sehr gering (&lt;10 mm) Salzkonzentrationen führt zu Verklumpung Auffädeln und sollten ebenfalls vermieden werden. Proteinreinheit ist auch ein wichtiger Faktor, der bei diesem Verfahren entstehen, sowie die Daten von hoher Qualität zu erreichen, sollte reine Proteine ​​verwendet werden. Wir routinemßig zu reinigen Proteine ​​in mehreren Schritten, darunter mindestens eine Affinitätsreinigung und Gelfiltrationsschritt, aber in einigen Fällen Ionenaustauschchromatographie in einem dritten Schritt erfolgt. Als Folge ist die Reinheit von Proteinen für die Kopplung verwendet wird, ist üblicherweise 90% oder höher, wie durch SDS-PAGE beurteilt. Es wird empfohlen, Protein-Konzentrationen sowohl in der anfänglichen Reaktionsmischung sowie th bestimmene Stand nach Beendigung der Reaktion. Dies wird helfen, die scheinbare Konzentration der Kügelchen gekoppelten Proteins und damit Kopplungsdichte zu bestimmen. Bestimmung der beiden Werte ermöglicht auch die Berechnung der Kopplungseffizienz. Dies kann berücksichtigt werden, wenn die Vorbereitung der Ausgangsproteinlösung in nachfolgenden Reaktionen, um die gewünschte Endkonzentration zu erzielen, und Kupplungsdichte berücksichtigt werden. Bradford-Reagenz ist insbesondere zur Bestimmung der Proteinkonzentration geeignet vor und nach der Kupplungsreaktion, da keine der Substanzen in der Reaktions stört die Farbstoffkomplexbildung bei den verwendeten Konzentrationen. Niedrigeren Proteinkonzentrationen, die verwendet werden sollen, kann dieses Verfahren müssen durch eine empfindlichere Nachweismethode ersetzt jedoch Aufmerksamkeit ist auf die Tatsache hat es mit den in der Kopplungsreaktion enthaltenen Substanzen kompatibel sind gezahlt. Es wird auch empfohlen, um frisch zubereiteten Reagenzien zu verwenden und zu handhaben pulverförmigen Reagenzien mit Sorgfalt (zB Shopin einem verschlossenen Behälter und mit Siliciumdioxidperlen, um die Reagenzien Feuchtigkeit zeichnen), da die Qualität der Reagenzien wird die Kopplungseffizienz beeinflussen zu vermeiden. Wenn die Kopplungseffizienz geringer als erwartet ist, umfassen mögliche Abhilfen Erhöhung der anfänglichen Wulst und Proteinkonzentrationen. Falls höhere Konzentrationen verwendet werden, muss die Konzentration von Kopplungsreagenzien proportional erhöht, um eine ausreichende molaren Überschuss sicherzustellen. Ändern von Korn / Protein-Konzentrationen in der Regel eine bessere Schritt hin zu Optimierung, anstatt die Reaktionszeiten. Da die Protokolle für die Wulst Kopplung sind langwierig, wir gemeinhin bereiten eine große Charge des Materials. Aliquots der Suspension in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -20 ° C mehrere Monate gelagert werden. Aufgetauten Aliquots sollten nicht eingefroren werden und bei 4 ° C gelagert und innerhalb von 1-2 Tagen verwendet werden. Dies wird jedoch mit der Art und Stabilität der so sollte auf eine kleine Charge zunächst getestet werden verwendeten Proteins variieren. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bead-gekoppelter Adhäsine kann für viele Anwendungen verwendet werden, wie unten diskutiert. Dieses Protokoll beschrieben einen Test, der üblicherweise verwendet wird, um die Hemmung der bakteriellen Bindung und Pathogen-vermittelten Zytotoxizität auf Wirtszellen zu messen. Der Test wird üblicherweise durchgeführt, um die Kapazität der Kügelchen gekoppelt MAMs kompetitiv inhibiert Infektion von HeLa-Epithelzellen mit dem Meeresfoodborne pathogen Vibrio parahaemolyticus zu messen, entweder mit einer Abnahme der bakteriellen Bindung an die Wirtszellen oder reduzierte Zytotoxizität als Auslese . In beiden Fällen, die Vorbereitung und kompetitive Assays nach dem gleichen Protokoll. Je nach dem Auslesen verschiedener Stämme von V. parahaemolyticus verwendet werden: die zytotoxische Stamm POR1 zur Zytotoxizität Messungen verwendet, während die nicht-zytotoxischen Stamm POR2 zum Messen der bakteriellen Adhäsion verwendet, da Zelltod und Zellablösung beeinträchtigt das Verfahren zur Quantifizierung hefteten Bakterien. Zunächst compebewerb Experimente wurden als schrittweise Protokoll, bei dem Wirtszellen wurden zunächst mit Perlen vor der Zugabe von Bakterien präinkubiert eingestellt. Für V. parahaemolyticus und dem Wulst bestimmungsgemäßer Verwendung (2 &amp; mgr; m-Perlen zu MAM7 gekoppelt) können beide Perlen und Bakterien zur gleichen Zeit, ohne die Änderungen in der resultierenden Zytotoxizität hinzugefügt werden. Das heißt, in diesem Versuchsaufbau, Perlen outcompete Bakterien Wirtszelle verbindlich. In Abhängigkeit von der Bakterienart und Wulstgeometrie verwendet wird, kann es gute Gründe für die Aufrechterhaltung der Wulst Adhäsion und bakterielle Infektion als zwei getrennte Stufen. Beispielsweise um Zellen mit nicht-beweglichen Bakterien zu infizieren, werden die Platten üblicherweise nach der Zugabe der Infektion Medium zentrifugiert. Jedoch sollte Zentrifugation von Platten enthaltenden Suspensionen Wulst vermieden werden, da dies zu einer sehr ungleichmäßigen Verteilung der Perlen auf die Zellschicht. Wenn kleinere Partikelgrößen verwendet werden, werden Kügelchen länger dauern, bis auf der Zelloberfläche zu regeln, in welchem ​​Fall suffizient Zeit sollte für Korn Anbringung vor der Infektion zugelassen. Wenn bakterielle Adhäsion wird als ein Auslesen verwendet wird, sollten die Proben zu den Zeitpunkten genommen werden, wo Wirtszellen nicht wesentlich von der infizierenden Stamm beschädigt, wie Zellablösung und Lyse kann die Quantifizierung der angehefteten Bakterien beeinträchtigen. Statt Aufzählen bakterielle Adhäsion durch Verdünnungsausstrichtest können Proben alternativ zur Abbildung (Abbildung 5) verarbeitet werden. In diesem Fall sollte der Gewebekultur von Zellen auf Glasdeckgläschen ausgesät werden, anstatt direkt in die Vertiefungen. Zusätzlich können fluoreszierende Kügelchen und Bakterien ein Fluoreszenzprotein exprimieren, verwendet werden, zusammen mit einer Infektion spezifischen Wirtszellmarker. Zum Beispiel werden Kompetitionsexperimente üblicherweise unter Verwendung von fluoreszierenden roten Rhodamin-Phalloidin, die Wirtszellen &quot;Aktin-Zytoskelett zu färben und zu bewerten morphologische Veränderungen, die sich aus der Infektion zusammen mit fluoreszierenden blauen Perlen und fluoreszierende abgebildetgrün (GFP-exprimierenden oder SYTO18 gefärbt) Bakterien. Eine Reihe von Kügelchen gekoppelt Adhäsine, einschließlich Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD und Vibrio parahaemolyticus MAM wurden als biomimetische Materialien verwendet worden, um die Haftung, Adhäsionsinhibierung und den Beitrag der Adhäsion zu untersuchen Pathogen-vermittelten Zytotoxizität 1, 7, 8. Einer der Vorteile der Verwendung dieses Ansatzes ist die einfache Visualisierung der Befestigungs Ereignisse, da die Polymerperlen als Gerüste verwendet werden, sind in einer breiten Palette von Farben (beispielsweise blau, fluoreszierend rot, blau, grün, orange). Somit direkte Markierung von Proteinen, die mit der Funktion beeinträchtigen können, vermieden werden. Weiterhin werden die Oberflächenkupplungs ahmt das mehrwertige Anzeige Adhäsine auf der bakteriellen Oberfläche reflektiert damit eine physiologisch relevante Konformation im Vergleich zu löslichen Proteinen. Im Vergleich zu Studien mit intakten Bakterien oder bacterial-Mutanten, umgeht der Wulst Ansatz Probleme mit Bakterienwachstum verbunden. B. Langzeit (zB O / N) Studien über die bakterielle Adhäsion an Zellen mit intakten Bakterien beherbergen werden oft durch bakterielle Begleitwachstumserscheinungen gefährdet - Ansäuern des Wachstumsmediums und Nährstoffraubbau negativ auf Wirtszellen und bakteriellen Replikations letztendlich Kompromisse Abbildungsqualität. In jüngerer Zeit ist die Verwendung von Kügelchen gekoppelt Adhäsine wurde erweitert, um ihre Verwendung als Mittel zur Affinitätsreinigungen von Wirtszellfaktoren in Signalprozesse nachgeschalteten bakteriellen Befestigung beteiligt sind. V. parahaemolyticus MAM7, über die Bindung an Phosphatidsäuren in der Membran der Wirtszelle, löst RhoA Aktivierung und Aktin Umlagerungen 1, 3. MAM-gekoppelten Kügelchen verwendet werden, um zu reinigen und zu identifizieren Proteine ​​in den Signalisierungs Plattformen als Folge MAM-Wirtszelle zusammengebaut beteiligten Bindung. Seit Perlendurch einen kurzen Zentrifugationsschritt vom Überstand abgetrennt werden und das Protein von Interesse kovalent gekoppelt ist, ist dies ein gutes Verfahren, um eine Trennung von verunreinigenden Proteinen zu erreichen und zu bereichern relevanten Protein-Komplexe, die für Downstream-Anwendungen wie Proteomik oder Western verwendet werden können, Blotting.

Die Entschlüsselung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Adhäsinen und Wirtsoberflächenrezeptoren an der Wirt-Pathogen-Grenzfläche ist ein wesentlicher Schritt zum Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen, die die bakterielle Adhäsion antreiben. Letztendlich wird uns dies helfen, Strategien zu identifizieren, um in diese Prozesse während einer Infektion einzugreifen. Bei der Durchführung solcher Studien stehen wir oft vor einem Dilemma: Die biochemische und biophysikalische Analyse der molekularen Mechanismen der Adhäsinbindung erfordert deren Trennung von anderen Zellwandbestandteilen, was die Adhäsionsereignisse beeinträchtigen kann. Auf der anderen Seite vereinfacht die Verwendung rekombinanter löslicher Proteine das Adhäsionsereignis übermäßig, indem die Proteinverankerung in der bakteriellen Zellwand und die Multivalenz der Bindung, die durch die Darstellung der bakteriellen Oberfläche erreicht wird, außer Acht gelassen werden. Ebenso hat das Aufeinandertreffen und Binden an einzelne Adhäsinmoleküle aus Sicht der Wirtszelle nicht immer die gleichen Auswirkungen in Bezug auf die Organisation der Plasmamembran, die Membranfluidität und die Rezeptorclusterbildung1, was es letztendlich schwierig macht, den Einfluss der Adhäsion auf die zelluläre Signalübertragung des Wirts und das Ergebnis von Bakterien-Wirt-Interaktionen zu bewerten. 
Kürzlich wurde eine Methode entwickelt, bei der rekombinante gereinigte Adhäsine oder Adhäsinfragmente gerichts- und kovalent an Polymerpartikel gekoppelt werden, die in ihrer Größe wie Bakterien ähnlich groß sind, wodurch die Oberflächendarstellung von Bakterien nachgeahmt wird. Dieser Ansatz wurde bei einer Reihe verschiedener Adhäsine angewendet, von gramnegativen multivalenten Adhäsionsmolekülen (MAMs)2, 3 bis hin zu grampositiven Adhäsinen wie Staphylococcus aureus, Fibronektin-bindendem Protein (FnBPA)4, 5 und Streptococcus pyogenes F1, 6, 7. Diese Methode ermöglichte die Dissektion von Adhäsinfragmenten, die für die Bindung an Wirtszellen wichtig sind, die Identifizierung von Rezeptoren auf der Wirtsoberfläche und die Bestimmung ihres Verhaltens auf der Oberfläche der Wirtszelle, wobei sowohl die Bindungsaffinität als auch die Avidität berücksichtigt wurden 1, 8. Darüber hinaus wurde dieser Ansatz verwendet, um die Wirksamkeit von immobilisierten Adhäsinen und Derivaten als Inhibitoren von Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen 8, 9. Es wurde gezeigt, dass oberflächengekoppelte Derivate des Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 verwendet werden können, um eine Reihe von bakteriellen Infektionen in vitro abzuschwächen, einschließlich solcher, die durch multiresistente Erreger wie Acinetobacter baumannii und Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) verursacht werden 7, 9. 
Hierin beschreiben wir verschiedene Chemikalien, die verwendet werden können, um Adhäsine an kommerziell erhältlichen funktionalisierten Polystyrolpartikeln zu immobilisieren. Aufgrund der breiten Palette an verfügbaren Oberflächenfunktionalitäten, Markierungen und Partikelgrößen sind diese ein nützliches Gerüst für die Herstellung bakteriomimetischer Materialien zur Untersuchung von Adhäsin-Wirt-Interaktionen. Des Weiteren beschreiben wir Methoden zur initialen Charakterisierung der Kupplungsreaktion und zur Berechnung wichtiger Eigenschaften der resultierenden Materialien. Schließlich wird die Verwendung von Bead-gekoppelten Adhäsinen als kompetitive Inhibitoren von in vitro bakteriellen Infektionen als Beispiel für ihre Anwendung sowie der zukünftige Umfang und die Grenzen dieses Ansatzes diskutiert.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td>Gefahr; ätzend können als Lösung oder frisch zubereitet gekauft werden</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrat (Sulfo-SMPB)</td><td>Fisher</td><td></td><td>PN22317 Gefahr; giftig</td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>30089</td><td>Gefahr; giftig</td></tr><tr><td>Latexkügelchen, aminmodifiziertes Polystyrol, fluoreszierend blau - wässrige Suspension, 2,0&nbsp; &mu; m mittlere Partikelgröße</td><td>Sigma</td><td>L0280</td><td>schädlich; ist eine Reihe alternativer Partikelgrößen und -farben erhältlich</td></tr>: <tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)Thermo</td> <td>scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimid (NHS)</td><td>Thermo scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylat-modifizierte Polystyrolkügelchen</td><td>Sigma</td><td>CLB9</td><td>schädlich; eine Reihe alternativer Partikelgrößen und -farben verfügbar</td></tr> ist <tr><td>Ethylendiamin</td><td>Sigma</td><td>E26266</td><td>Gefahr; entzündlich, ätzend, giftig, sensibilisierend</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Promega</td><td>W3841</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td>Gefahr; ätzend und giftig</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium - hoher Glukosegehalt - Mit 4.500 mg/L Glukose und Natriumbicarbonat, ohne&nbsp; L-Glutamin, Natriumpyruvat und Phenolrot, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>für Infektionsexperimente</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>für die Konservierung von kultivierten Wirtszellen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, hitzeinaktiviertes</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Supplement für Gewebekulturmedium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin - Lösung stabilisiert, mit 10.000 Einheiten Penicillin und 10&nbsp; mg Streptomycin/ml, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Ergänzung für Gewebekulturmedium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>LDH Zytotoxizitätsnachweiskit</td><td>Takara</td><td>MK401</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzreservoire aus</td><td></td><td></td> Kunststoffen (25ml)SLS F267660 <td></td></tr><tr><td></td> 24-Well-Platten <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner</td><td>66160</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Greiner</td><td>655182</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment Hämozytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>,<td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugen-Plattenleser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturanlagen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanal-Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biomimetische materialien zu den bakterien-wirt-interaktionen charakterisieren

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Die bakterielle Anheftung an Wirtszellen ist eines der frühesten Ereignisse während der bakteriellen Besiedlung von Wirtsgeweben und somit ein Schlüsselschritt während der Infektion. Die biochemische und funktionelle Charakterisierung von Adhäsinen, die diese anfänglichen Bakterien-Wirt-Interaktionen vermitteln, wird oft durch das Vorhandensein anderer bakterieller Faktoren wie Zellwandbestandteile oder sezernierter Moleküle beeinträchtigt, die die Analyse beeinträchtigen. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Verwendung von biomimetischen Materialien, bestehend aus reinen rekombinanten Adhäsinen, die chemisch an kommerziell erhältliche, funktionalisierte Polystyrolkügelchen gekoppelt sind und erfolgreich eingesetzt wurden, um die biochemischen und funktionellen Wechselwirkungen zwischen einzelnen bakteriellen Adhäsinen und Wirtszellrezeptoren zu entschlüsseln. Protokolle für verschiedene Kopplungschemien, die eine gerichtete Immobilisierung von rekombinanten Adhäsinen auf Polymergerüsten ermöglichen, und zur Bewertung der Kopplungseffizienz der resultierenden "bakteriomimetischen" Materialien werden ebenfalls diskutiert. Wir beschreiben weiterhin, wie diese Materialien als Werkzeug zur Hemmung der pathogenvermittelten Zytotoxizität eingesetzt werden können, und diskutieren den Umfang, die Grenzen und weitere Anwendungen dieses Ansatzes bei der Untersuchung von Bakterien-Wirt-Interaktionen.

Die V. parahaemolyticus Adhäsin MAM7 enthält sieben Tandemsäugetierzell Eintrag (MCE) Domänen in Anerkennung der Host-Oberflächenrezeptoren beteiligt. Wir verwendeten Polystyrolkügelchen, um rekombinantes gekoppelt, gereinigten Fragmente umfasst entweder alle sieben Tandem MCE-Domains (MAM7) oder nur die erste MCE Domain (MAM1), um die Fähigkeit dieser Materialien, mit V. Wettbewerb testen parahaemolyticus für Wirtszellenbindung und die resultierende Wirksamkeit dieser Materialien als Haftinhibitoren. HeLa-Zellen wurden mit V. infiziert parahaemolyticus Stamm POR1 und Zytotoxizität von in vitro-Infektion wurde nach 4 h (Figur 3) untersucht. Behandlung von HeLa-Zellen mit 0,1% Triton X-100 (positive Lyse Kontrolle) führte zu einer vollständigen Zellyse angezeigt infizierte Zellen sehr geringe Zytotoxizität. In vitro-Infektion von unbehandelten Zellen mit POR1 führte zu sehr hohen Niveaus der Zelllyse, und das wurde von MAM7-co gehemmtupled Perlen aber nicht MAM1 gekoppelte oder GST-gekoppelten Kontrollkügelchen (Abbildung 3). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Abbildung 3. Charakterisierung von Vibrio parahaemolyticus induzierte Zytotoxizität in Epithelzellen während der Konkurrenz-Assays. Die Zellen wurden mit V. behandelt parahaemolyticus (Vp), angedeutet mit (+) oder keine Bakterien (-) in Gegenwart von verschiedenen konkurrierenden Einheiten (Komp.), wie angegeben. Dazu gehörten entweder keine comp. (-), MAM7 Perlen (MAM7), MAM1 Perlen (MAM1) oder GST Kontrollkügelchen (GST). Als Kontrollen wurden Zellen, die entweder mit Triton X-100 (Triton-Lyse-Kontrolle) behandelt bzw. links nicht infizierten (uninf). LDH-Freisetzung nach 4 h wurde wie in Kapitel 3 beschrieben, gemessen und die Ergebnisse zu Triton Kontrollen (100%) und Rohlinge (0%), wie oben beschrieben normalisiert. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM von Dreifachversuche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Aufzählung V. parahaemolyticus entweder unbehandelten HeLa-Zellen oder Zellen mit MAM7-, MAM1- oder GST Steuer Perlen, inkubiert befestigt gezeigt, dass MAM7-Perlen, aber nicht MAM1- oder GST-Kontrollkügelchen outcompete V. parahaemolyticus zur Befestigung Zelloberflächenrezeptoren (Figur 4) zu hosten. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Abbildung 4. Charakterisierung von bakteriellen Befestigung während der Konkurrenzexperimente. HeLa-Zellen wurden mit V. infiziert parahaemolyticus POR2 (Vp +), in Abwesenheit (-) oder in Gegenwart von konkurrierenden Einheiten wie folgt: MAM7 Kügelchen (MAM7) MAM1 Kügelchen (MAM1) oder GST Kontrollkügelchen (GST) (vgl.). Bakterielle Adhäsion wurde nach 1 Stunde gemessen,<html> im Abschnitt 3. Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM von Dreifachversuche. Mittel (vlnr in CFU / ml) sind 2,3010 6, 1,5310 5, 6 2,0510, 2,1210 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Adhäsine Fluorophor markierten Kügelchen gekoppelt resultieren in der Erzeugung von Materialien, die bakterielle Adhäsion imitieren an Wirtszellen und sind leistungsstarke Werkzeuge für die zelluläre Bildgebung (Abbildung 5). Verwendung MAM7 gekoppelten fluoreszierenden blauen Perlen, dadurch wir den Prozess der MAM7-vermittelte Bindung an Epithelzellen. Befestigung MAM7 an Wirtszellen in Folge Aktin Umlagerungen und die Bildung von Stressfasern, die Co-visualisiert mit Rhodamin-Phalloidin auf F-Actin (5B) Fleck waren. _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Herstellung und die Verwendung von Fluorophor zur Bildgebung markiert biomimetische Perlen. (A) Die Aussetzung der fluoreszierenden blauen biomimetische Perlen (rechts Rohr, 10x Lager) und Puffersteuerung (links Rohr). (B) Befestigung MAM7-gekoppelten Kügelchen, um Hela Zellen führt zu Aktin Umlagerungen und Stressfaserbildung. Befestigung von fluoreszierenden blauen Perlen und daraus resultierende Aktin-Stressfasern (rot, mit Rhodamin-Phalloidin gefärbt) wurden durch Mikroskopie abgebildet. Bar, 10 &amp; mgr; m. Bilder im Feld B wurden von Lim et al. 1 angepasst und unter der Creative Commons Attribution Lizenz reproduziert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die bakterielle Anheftung an Wirtszellen ist ein wichtiger Schritt während der Besiedlung und Infektion des Wirts. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von polymergekoppelten rekombinanten Adhäsinen als biomimetische Materialien, die es ermöglichen, den Beitrag einzelner Adhäsine zu diesen Prozessen unabhängig von anderen bakteriellen Faktoren zu analysieren.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, biomimetische Materialien herzustellen, die aus reinen rekombinanten Adhäsinen bestehen und an Polystyrolkügelchen gekoppelt sind. Diese können anschließend verwendet werden, um die biochemischen und funktionellen Wechselwirkungen zwischen einzelnen bakteriellen Adhäsinen und Wirtszellrezeptoren zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu beantworten, beispielsweise durch die Messung der Auswirkungen auf die Signalübertragung in Wirtszellen sowie der Hemmung der pathogenvermittelten Zytotoxizität. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass gereinigte Adhäsine, sogenannte AEAs, gerichtet und kovalent an Polymerpartikel gekoppelt werden, die eine Größe ähnlich der von Bakterien aufweisen und somit die oberflächenständige Präsentation von Bakterien nachahmen.Begleiten Sie mich bei der Demonstration des Verfahrens wird der Doktorand TU A-C-E-D-A aus unserem Labor. Die Tholamin-Richtungskupplung wird hier gezeigt. Dieses Protokoll eignet sich für die Kopplung von Cystin enthaltenden Proteinen an aminfunktionalisierte Polymerkugeln unter Verwendung von SUL-Succinimidyl-p-Maleimidbenzoat oder SMPB als Vernetzungsreagenz. Bereiten Sie alle notwendigen Reagenzien unmittelbar vor der Anwendung gemäß dem Protokolltext vor, um mit der Aktivierung der Kugeln zu beginnen.Den Beadsuspension durch vorsichtiges Umstülpen vermischen und anschließend die erforderliche Menge der Beadsuspension in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Unter Zugabe von einem Milliliter steriler PBS, pH 7,0, die Beads vorsichtig mit einer Pipette mehrmals auf- und abpipettieren, um sie zu waschen, und anschließend durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge pelletieren. Vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und einer Schaumkappe entfernen.Resuspendieren Sie das Perlen-Pellet in einem Milliliter frischem, sterilen PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. Resuspendieren Sie das Perlen-Pellet. Geben Sie 200 Mikroliter frisch zubereitete 10-Millimolar-SFO-SMPB zu 0,8 Milliliter PBS hinzu.Um eine Endkonzentration von zwei Millimolar zu erreichen, inkubieren Sie die Bead-Suspension eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius auf einem rotierenden Rad, während die Beads inkubiert werden. Bereiten Sie das Protein für den folgenden Kopplungsschritt vor, damit es unmittelbar zu den aktivierten Beads hinzugefügt werden kann. Überprüfen Sie die Protein-Konzentration und stellen Sie sie auf die für die Kopplungsreaktion erforderliche Endkonzentration ein. Sechs.Für die Proteindreduktion werden üblicherweise Mikromolar Protein und PBS sowie ein Volumen von einem Milliliter verwendet. Geben Sie eine TEP-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von fünf Millimolar zu erreichen. Inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bewahren Sie einige Mikroliter der Proteinslösung auf, um die anfängliche Protein-konzentration zu bestimmen und die Kopplungseffizienz zu berechnen.Beginnen Sie den Proteinkopplungsprozess, indem Sie die aktivierten Kügelchen pelletieren und das Pellet waschen. Suspendieren Sie das Pellet anschließend in einem Milliliter frischem, sterilen PBS in der vorbereiteten Proteinslösung, um die gewünschte Protein-Konzentration zu erreichen. Inkubieren Sie die Protein-Kügelchen-Suspension zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius auf einem rotierenden Rad. Nach zwei Stunden deaktivieren Sie die verbleibenden aktiven Gruppen auf den Kügelchen, indem Sie eine Cystein-Stammlösung auf eine Endkonzentration von 50 Millimolar hinzufügen und die Suspension 30 Minuten bei 25 Grad Celsius auf einem rotierenden Rad inkubieren.Die Kügelchen durch Zentrifugation festgehalten. Den Überstand zur Bestimmung der Proteinkonzentration und zur Berechnung der Kopplungseffizienz aufbewahren. Den Kügelchenpellet zweimal mit einem Milliliter PBS und Resus-Bend sowie einem Milliliter frischem PBS waschen, um das Endprodukt zu erhalten. Einen Tag vor dem Kompetitionsassay jedes Loch einer 24-Loch-Platte mit einem Milliliter Hela-Zellen bei einer Konzentration von 150.000 Zellen pro Milliliter beimpfen.Dadurch können die Zellen vor Beginn des Experiments eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen. Inokulieren Sie eine fünf Milliliter große marine LB-Kultur mit einer frischen Kolonie von V. parahaemolyticus und ziehen Sie diese über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln heran. Bereiten Sie ausreichend bead-gekoppeltes multivalentes Adhäsionsmolekül wie zuvor gezeigt vor.Verwenden Sie 100 Mikroliter einer 10 x Bead-Stocklösung pro Vertiefung oder eine Endkonzentration von 500 Nanomolar Protein am Tag des Kompetitionsassays. Messen Sie den OD 600 der bakteriellen Kultur. Bereiten Sie das Infektionsmedium vor, indem Sie bakterielle Kulturen in farbloses DMM ohne Zusätze verdünnen.Im Voraus auf 37 Grad Celsius erwärmen, einschließlich 10 % (Volumen pro Volumen) inaktivierter Fötus-Rinderserum-Suspension. Um einen MOI von 10 zu erreichen, bereiten Sie ein Milliliter pro Vertiefung sowie ein zusätzliches Volumen von 10 bis 20 % pro Probe vor. Entfernen Sie das alte Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie die kultivierten Zellen.Heilen Sie die Zellen, indem Sie jeder Vertiefung ein Milliliter sterilem PBS zusetzen, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Entfernen Sie das PBS und geben Sie je Vertiefung ein Milliliter Infektionsmedium hinzu. Fügen Sie Lösungen mit Kontrollperlen und Bakterien als positive Kontrollen sowie Adhäsionsperlen und keine Bakterien als negative Kontrollen hinzu.Fügen Sie DMM mit 0,1 % TRITTON X-100 als Lysekontrollen hinzu. Richten Sie jede experimentelle Bedingung einschließlich der Kontrollen im Dreifachansatz ein. Inkubieren Sie die Platte im Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Dauer.Die Zytotoxizität wird beurteilt. Vier Stunden nach der Infektion werden 200 Mikroliter aus jedem verwendeten Wells der 24-Well-Platte entfernt und in eine neue 96-Well-Platte übertragen.Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 1.500 G für fünf Minuten und überführen Sie 100 Mikroliter aus jedem Well in eine neue 96-Well-Platte. Geben Sie 100 Mikroliter des Mediums, das während der Infektionsversuche verwendet wurde, in drei neue Wells der 96-Well-Platte, die als Blindwerte dienen sollen. Führen Sie den Lactatdehydrogenase-Freisetzungs-Assay mit einem LDH-Zytotoxizitäts-Detektionskit gemäß den Herstelleranweisungen durch.Berechnen Sie zunächst die benötigte Menge des Reagenzien in Schritten von 25. Zum Beispiel für 100 Proben. Mischen Sie 11,25 Milliliter Reagenz A mit 250 Mikrolitern Reagenz B, invertieren Sie die Mischung, um Schäumen zu vermeiden, und wirbeln Sie nicht.Als Nächstes die Mischung in ein Reservoir geben. Dann 100 Mikroliter der Reagenzienmischung zu jeder Probe hinzufügen und die Platte bei Raumtemperatur 10, 20 und 30 Minuten lang inkubieren. Die Absorption bei 490 Nanometern mit einem Plattenreader messen.Anschließend berechnen Sie die prozentuale Zytotoxizität, wie in der Publikation beschrieben. Die Messungen der bakteriellen Adhäsion erfolgen eine Stunde nach der Infektion. Entfernen Sie das Medium von der Zellschicht und waschen Sie die Zellschicht gründlich mit steriler, vorgewärmter PBS, um nicht angeheftete Zellen zu entfernen. Waschen Sie mindestens drei bis vier Mal mit jeweils einem Milliliter PBS. Lyse die Wirtszellen, indem Sie jeder Vertiefung ein Milliliter einer sterilen 1 %igen (Volumen/Volumen) Triton X-100-Lösung in PBS hinzufügen, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.Pipettieren Sie jede Probe mehrmals auf und ab, bevor Sie den Inhalt jedes Wells in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Bereiten Sie zehnfache serielle Verdünnungen der Proben in sterilem PBS vor, geben Sie jeweils 100 Mikroliter jeder Probe auf marine LB-Agar und verteilen Sie diese mit einem Zellverteiler. Optimieren Sie, welche Verdünnung verwendet werden soll, abhängig von den Bakterienstämmen und dem Zeitpunkt für diesen experimentellen Aufbau. Eine Verdünnung im Verhältnis 10 hoch fünf oder 10 hoch sechs liefert eine geeignete Anzahl an Koloniebildenden Einheiten (CFUs). Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius und zählen Sie am folgenden Tag die Bakterien durch Koloniezählung. Bei Wettbewerbsassays wurden HeLa-Zellen mit einem Vibrio parahaemolyticus-Stamm infiziert.Schwacher Einser wurde mit positiv gekennzeichnet oder blieb unbehandelt infiziert, und zwar in Gegenwart verschiedener konkurrierender Entitäten. Die In-vitro-Infektion mit dem schwachen Einser führte zu sehr hohen Spiegel an Zelllyse, die durch mit MAM sieben gekoppelte Kügelchen gehemmt wurde, nicht jedoch durch mit MA'AM eins oder mit GST gekoppelte Kügelchen. Zählung der an entweder unbehandelte HELOC-Zellen oder an mit MAM inkubierte Zellen gebundenen v-pareseartigen Partikel.Sieben MAM-eins- oder GST-Kontrollperlen zeigten, dass MAM. Sieben-Perlen, jedoch nicht MAM-eins- oder GST-Kontrollperlen, V. parahaemolyticum bei der Bindung an Wirtszelloberflächenrezeptoren überlegen sind.Adhäsionen gekoppelt an Fluoro. Vier markierte Kügelchen können die bakterielle Adhäsion an Wirtszellen nachahmen und sind leistungsstarke Werkzeuge für die zelluläre Bildgebung. Das Rohr rechts enthält eine Suspension fluoreszierender blauer biomimetischer Kügelchen. MAM.Sieben gekoppelte fluoreszierende blaue Kügelchen wurden verwendet, um den Prozess der MAM-sieben-vermittelten Anheftung an Epithelzellen zu charakterisieren. Die Anheftung von MAM sieben an Wirtszellen führte zu einer Neuordnung des Aktins und zur Bildung von Stressfasern, die mithilfe von Rumine Phin zur Färbung von F-Aktin gleichzeitig sichtbar gemacht wurden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Affinitätsreinigung gekoppelt mit Proteomik oder Western Blot durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche zellulären Faktoren des Wirts an Signalprozessen abwärts der bakteriellen Anheftung beteiligt sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Stones, D. H., et al. Biomimetische Materialien zur Charakterisierung von Bakterien-Wirt-Interaktionen. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt die Verwendung von bakteriomimetischen Kügelchen zur Quantifizierung der bakteriellen Adhäsion an Wirtsepithelzellen unter kompetitiven Bedingungen. Es beschreibt die Schritte bei der Behandlung der Zellen, ihrer Lyse und der Beschichtung von seriellen Verdünnungen zur Messung koloniebildender Einheiten.

Bewertung von Bakterien-Wirtszell-Interaktionen mit biomimetischen Kügelchen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Beurteilung der Fähigkeit von Porphyromonas gingivalis, einem anaeroben pathogenen Bakterium, an menschlichen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) zu haften und in diese einzudringen. Nach der Infektion der Wirtszellen mit den Bakterien werden die Wirtszellen lysiert, um sowohl anhaftende als auch internalisierte Bakterien freizusetzen. Wenn das Lysat in einem geeigneten Medium plattiert wird, deutet das Vorhandensein von Kolonien auf erfolgreiche...

Ein bakterieller Infektionsassay zur Untersuchung anaerober Bakterien-Wirtszell-Interaktionen

Dieser Artikel stellt zwei Protokolle vor: eines, um anaerobe Bakterien zu messen, die erfolgreich in den Wirt eindringen und darin überleben können, und das andere, um anaerobe Bakterien zu visualisieren, die mit Wirtszellen interagieren. Diese Studie kann auf jede kultivierbare anaerobe und jeden eukaryotischen Zelltyp angewendet werden.

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Die in diesem Protokoll vorgestellten Co-Kultur-Interaktions-Assays sind kostengünstig, hochdurchstöbet und einfach. Diese Assays können verwendet werden, um mikrobielle Wechselwirkungen in der Kokultur zu beobachten, Interaktionsmuster zu identifizieren und das hemmende Potenzial eines mikrobiellen Stammes von Interesse gegen menschliche und ökologische Krankheitserreger zu charakterisieren.

High Throughput Co-Culture Assays für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen

Dieses live-bakterielle Zellbildgebungsprotokoll ermöglicht die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen mehreren Bakterienarten auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit. Die Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Beobachtung jeder Bakterienart in Monokultur oder Kokultur, um Wechselwirkungen zwischen den Arten in bakteriengemeinschaften mit mehreren Arten, einschließlich individueller Zellbeweglichkeit und Lebensfähigkeit, zu untersuchen.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Dieses optimierte Protokoll beschreibt einen Workflow zur Erkennung und Abbildung von Bakterien in komplexen Gewebeproben, von der Fixierung des Gewebes bis zur Färbung von Mikroben mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung .

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Der Nachweis von Wirt-Bakterien-Pathogen-Interaktionen basierend auf phänotypischer Adhärenz mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzmarkierungsbildgebung zusammen mit automatisierten statistischen Analysemethoden ermöglicht eine schnelle Bewertung potenzieller bakterieller Interaktionen mit Wirtszellen.

Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

Eine neuartige Probenvorbereitungsmethode wird für die Analyse von agarbasierten, bakteriellen Makrokolonien mittels matrixunterstützter Laserdesorptions-/Ionisationsbildgebungs-Massenspektrometrie demonstriert.

Untersuchung der mikrobiellen Kooperation mittels bildgebender Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkolonien, die während der Infektion auf Agar und im Gewebe gezüchtet wurden

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Anwendung organotypischer Gewebemodelle zur Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen in vitro. Konkret verwendet das beschriebene Modellsystem ein mehrschichtiges orales Epithel, das Mikroorganismen ausgesetzt ist, die mit Biofilmen (Zahnbelag) im Zusammenhang mit Mundgesundheit versus -erkrankung assoziiert sind.

Organotypische Gewebemodellsysteme zur Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen in vitro

Die Charakterisierung von T-Zell-Epitopen von Krankheitserregern, die lokalisierte Infektionen wie das humane Papillomvirus verursachen, ist aufgrund der begrenzten Anzahl von T-Zellen im Umlauf eine Herausforderung. Es wird eine Methode beschrieben, bei der seltene T-Zellen isoliert und charakterisiert wurden, ausgehend von einer sehr geringen Anzahl von Zellen.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

Erfahren Sie die Herstellung biomimetischer Materialien aus polymergebundenen rekombinanten Adhäsinen zur Analyse bakterieller Bindung an Wirtszellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Signalwegen und Zytotoxizität.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

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