Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen kleinen Schlaganfall in der weißen Substanz der Maus genau zu lokalisieren, um diese häufige Form des subkortikalen Schlaganfalls der weißen Substanz zu modellieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Schlaganfallbereich zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen axonaler Verletzungen, die neuronale Reaktion auf einen subkortikalen Schlaganfall und wie die zellulären Elemente der weißen Substanz sowohl während der akuten als auch der Reparaturphase des Schlaganfalls reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur präzisen Lokalisierung eines Schlags in der weißen Substanz verwendet werden kann und mit einer Vielzahl von Mausmodellen verwendet werden kann.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die geringe Menge an weißer Substanz zur Fehllokalisierung des Schlaganfalls führt. Möglicherweise sind geringfügige Anpassungen des Injektionswinkels oder der stereotaktischen Koordinaten für jeden Mausstamm oder die stereotaktische Einrichtung erforderlich. Beginnen Sie damit, zuerst eine gezogene Glaspipette an einem Schlauch zu befestigen, der an einer Vakuumleitung befestigt ist.

Führen Sie das gezogene Ende in die L-Nio-Lösung oder L-Nio plus fluoreszierenden Tracer ein. Starten Sie das Vakuum und saugen Sie so lange, bis mindestens zwei Millimeter des Teils der Pipette mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern gefüllt sind. Legen Sie die gefüllte Pipette zur Seite.

Setzen Sie dann die Maus in ein stereotaktisches Gerät, das mit einem stereotaktischen Mikroskop ausgestattet ist. Überprüfen Sie nach der Betäubung und Vorbereitung der Maus für die Operation nach zugelassenen Verfahren die Narkosetiefe mit einem Zehenkneifen. Es sollte keine Antwort geben.

Stellen Sie anschließend den Injektionsarm auf 36 Grad ein. Befestigen Sie einen Pipettenhalter aus gezogenem Glas am distalen Ende eines Injektionssystems mit niedrigem Volumen und befestigen Sie ihn am Injektionsarm. Nachdem Sie einen 1,5 Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut gemacht haben, um den Schädel freizulegen, trocknen Sie den oberflächlichen Schädel mit einem Wattestäbchen.

Während Sie dann durch ein stereotaktisches Mikroskop mit ein- bis dreifacher Vergrößerung schauen, verwenden Sie ein Mikropunktwerkzeug, um das darüber liegende periostale Gewebe zu entfernen. Markieren Sie Bregma mit einem feinen Markierer. Verwenden Sie dann einen chirurgischen Bohrer, der mit einem chirurgischen Bohrer mit feiner Spitze ausgestattet ist, um eine zwei Millimeter lange elliptische Kraniotomie zu bohren, die posterior am Bregma beginnt und sich nach anterior knapp links von der Mittellinie erstreckt.

Entfernen Sie Knochenfragmente und darüber liegendes Weichgewebe, damit die Großhirnrinde sichtbar gemacht werden kann. Halten Sie die kortikale Oberfläche feucht, indem Sie intermittierend Tropfen sterile Kochsalzlösung auftragen. Befestigen Sie anschließend die gefüllte Pipette am Injektorarm.

Richten Sie das distale Ende der Pipette am Bregma aus und setzen Sie die stereotaktischen Koordinaten auf Null. Schieben Sie die Pipette unter Verwendung der in Tabelle eins aufgeführten anterioren, hinteren und medial-lateralen Koordinaten bis zum ersten Injektionspunkt vor. Schieben Sie dann die Pipette bis zur kortikalen Oberfläche vor und stellen Sie die dorsal-ventrale Messung auf Null.

Senken Sie die Pipette langsam auf die dorsal-ventralen Koordinaten ab. Stellen Sie sicher, dass die Vergrößerung des stereotaktischen Mikroskops auf drei X eingestellt ist und dass das kalibrierte Absehen deutlich zu sehen ist. Betrachten Sie die abgewinkelte Pipette von der Seite, so dass der Luftflüssigkeitsmeniskus eine sagittale Ansicht hat.

Der Meniskus sollte in der gleichen Brennebene wie die Innen- und Außenwand der Pipette erscheinen. Mit einem lokalen Druckinjektionssystem, das auf 20 PSI für 20-Millisekunden-Impulse eingestellt ist, injizieren Sie nun 100 Nanoliter L-Nio in das Gehirn. Warten Sie nach der Injektion des Gesamtvolumens fünf Minuten, um einen Rückfluss in der Pipettenspur zu verhindern.

Ziehen Sie dann die Pipette heraus und wiederholen Sie den Injektionsvorgang am zweiten und dritten Koordinatensatz in Tabelle eins. Entfernen Sie nach der letzten Injektion die Pipette und geben Sie so viel Knochenwachs, dass die Kraniotomiestelle gefüllt ist. Zum Schluss nähern Sie sich den Rändern der Kopfhautwunde an und binden Sie sie mit Hautkleber.

Nach der Verabreichung einer postoperativen Analgesie setzen Sie das Tier in einen sauberen Käfig. Verabreichen Sie postoperative Antibiotika fünf Tage lang mit dem Trinkwasser oder bis zur Opferung, wenn weniger als fünf Tage. Nachdem Sie die Maus nach zugelassenen Verfahren geopfert und geköpft haben, öffnen Sie den Schädel mit einer sterilen Schere nach hinten und entfernen Sie dann mit einem Spatel vorsichtig den darüber liegenden Schädel.

Führen Sie als Nächstes einen sterilen vier Millimeter großen Spatel an der Vorderseite des Gehirns ein, um den Riechkolben und die Sehnerven zu durchtrennen. Heben Sie dann das Gehirn vorsichtig aus dem Schädeldach und legen Sie es in einen eiskalten Dissektionspuffer. Schneiden Sie mit einem Hirnblock und sterilen Rasierklingen zwei bis drei Millimeter große Scheiben mit der betroffenen Region und legen Sie sie in einen Kaltdissektionspuffer.

Identifizieren Sie unter einem Präpariermikroskop die weiße Substanz unter dem motorischen Kortex in der injizierten Hemisphäre. In früheren Intervallen nach dem Schlaganfall kann die Injektion von L-Nio gemischt mit gängigen Laborfarbstoffen, wie z. B. Fast Green, eine visuelle Identifizierung des Schlaganfalls ermöglichen. In längeren Intervallen nach einem Schlaganfall kann die Region visuell durch fokale Nekrose und Myelinblässe identifiziert werden.

Sobald Sie identifiziert sind, verwenden Sie ein Skalpell, um den Bereich der weißen Substanz vorsichtig zu sezieren, der den Strich enthält. Entfernen Sie nach Bedarf den darüber liegenden Kortex und das darunterliegende Striatum. Wie hier gezeigt, zeigt die Immunfluoreszenzmarkierung für neuronale Filamente, rot dargestellt, den Grad des axonalen Verlusts sieben Tage nach dem Schlaganfall unter Verwendung des medialen Zugangs.

Beim posterioren Winkelzugang wird die Schlaganfallläsion der weißen Substanz direkt über dem lateralen Ventrikel anvisiert und zeigt eine intensive Mikroglia-Reaktivität, wie durch Immunmarkierung für IBA-1 nachgewiesen wurde. Zwei Astrozyten-Intermediärfilamentmarker, Vimentin, rot dargestellt, und saures Gliafibrilläres Protein, grün, zeigen Veränderungen in der Morphologie der Astrozyten der weißen Substanz nach einem Schlaganfall. Die Co-Injektion von fluoreszierendem Dextran-Amin zum Zeitpunkt der Schlaganfallinduktion ermöglicht die Identifizierung einzelner Neuronen mit Axonen, die durch einen Schlaganfall verletzt wurden.

Der größte Teil der Markierung findet in Axonen innerhalb der Neuronen der Schichten fünf und sechs im primären sensomotorischen Kortex statt, die den Schlaganfall überlagern. Dieses Bild zeigt sieben Tage nach dem Schlaganfall. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 45 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen fokalen Schlaganfall der weißen Substanz in einer Maus erzeugt und das Gehirn auf eine Vielzahl von Downstream-Prozessen vorbereitet, die nützlich sind, um wichtige Fragen bei Schlaganfällen und Neuroreparaturen zu beantworten.