Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen kleinen Schlaganfall im weißen Hirnsubstanz von Nagern genau zu lokalisieren, um diese häufige Form eines subkortikalen Schlaganfalls im weißen Hirnsubstanz zu modellieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Schlaganfallforschungsbereich zu beantworten, wie beispielsweise die Mechanismen der axonalen Schädigung, die neuronale Reaktion auf einen subkortikalen Schlaganfall sowie die Reaktion der zellulären Bestandteile des weißen Hirnsubstanz sowohl in der akuten Phase als auch während der Reparaturphase des Schlaganfalls. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur präzisen Lokalisierung eines Schlaganfalls im weißen Hirnsubstanz verwendet werden kann und mit einer Vielzahl unterschiedlicher Mausmodelle kombiniert werden kann.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die geringe Menge an weißer Substanz zu einer falschen Lokalisation des Schlags führen kann. Geringfügige Anpassungen des Injektionswinkels oder der stereotaktischen Koordinaten für jeden Mausstamm oder der stereotaktischen Aufbauten können erforderlich sein. Beginnen Sie damit, zunächst eine gezogene Glaspipette an ein Rohr anzuschließen, das mit einer Vakuumleitung verbunden ist.

Führen Sie das gezogene Ende in die L-Nio-Lösung oder in L-Nio mit fluoreszierendem Farbstoff ein. Starten Sie das Vakuum und saugen Sie so lange, bis mindestens zwei Millimeter des 0,5-Millimeter-Durchmesser-Abschnitts der Pipette gefüllt sind. Stellen Sie die gefüllte Pipette beiseite.

Bringen Sie die Maus anschließend in eine stereotaktische Vorrichtung, die mit einem stereotaktischen Mikroskop ausgestattet ist. Nachdem die Maus gemäß den genehmigten Verfahren anästhesiert und für die Operation vorbereitet wurde, überprüfen Sie die Anästhesietiefe durch einen Zehenquetschtest. Es sollte keine Reaktion erfolgen.

Als Nächstes stellen Sie den Injektionsarm auf 36 Grad ein. Befestigen Sie einen gezogenen Glaspipettenhalter am distalen Ende eines Niedrigvolumen-Druckinjektionssystems und befestigen Sie dieses am Injektionsarm. Nachdem Sie einen 1,5 cm langen medianen Hautschnitt angelegt haben, um den Schädel freizulegen, trocknen Sie die Schädelloberfläche mit einem Wattestäbchen.

Danach unter einem stereotaktischen Mikroskop bei einer Vergrößerung von einem- bis dreifach mit einem Mikropunktwerkzeug überstehendes Überknochenhautgewebe entfernen. Bregma mit einem feinen Markierstift kennzeichnen. Anschließend mit einem chirurgischen Bohrer, der mit einem feinen chirurgischen Bohrerbit ausgestattet ist, eine zwei Millimeter große elliptische Kraniotomie bohren, beginnend hinter Bregma und nach vorne leicht links der Mittellinie verlaufend.

Entfernen Sie Knochenfragmente und überliegendes Weichgewebe, sodass der Großhirnkortex sichtbar wird. Halten Sie die kortikale Oberfläche feucht, indem Sie in regelmäßigen Abständen Tropfen steriler Kochsalzlösung auftragen. Befestigen Sie anschließend die gefüllte Pipette am Injektorarm.

Richten Sie das distale Ende der Pipette an Bregma aus und setzen Sie die stereotaktischen Koordinaten auf Null. Bewegen Sie die Pipette zu dem ersten Injektionspunkt unter Verwendung der anterioren, posterioren und medial-lateralen Koordinaten aus Tabelle eins. Anschließend führen Sie die Pipette bis zur kortikalen Oberfläche vor und setzen die dorsoventrale Messung auf Null.

Senken Sie die Pipette langsam auf die dorsoventralen Koordinaten ab. Stellen Sie sicher, dass die Vergrößerung des stereotaktischen Mikroskops auf drei X eingestellt ist und das kalibrierte Fadenkreuz deutlich sichtbar ist. Betrachten Sie die schräg positionierte Pipette von der Seite, sodass der Luft-Flüssigkeits-Meniskus in sagittaler Ansicht sichtbar ist.

Der Meniskus sollte sich in derselben Fokalebene sowohl der inneren als auch der äußeren Wand der Pipette befinden. Injizieren Sie nun mit einem lokalen Druckinjektionssystem, das auf 20 PSI für 20 Millisekunden-Impulse eingestellt ist, 100 Nanoliter L-Nio in das Gehirn. Warten Sie nach der Injektion des Gesamtvolumens fünf Minuten, um einen Rückfluss entlang der Pipettenbahn zu verhindern.

Ziehen Sie dann die Pipette zurück und wiederholen Sie den Injektionsvorgang an den zweiten und dritten Koordinatensätzen gemäß Tabelle eins. Nach der letzten Injektion entfernen Sie die Pipette und geben ausreichend Knochenwachs ein, um die Kraniotomiestelle zu verschließen. Schließen Sie abschließend die Ränder der Kopfhautwunde aneinander an und fixieren Sie sie mit einem Hautkleber.

Nach der Verabreichung einer postoperativen Analgesie das Tier in einen sauberen Käfig stellen. Postoperative Antibiotika fünf Tage lang im Trinkwasser verabreichen oder bis zur Tötung, falls diese weniger als fünf Tage dauert. Nach der Tötung und Enthauptung der Maus gemäß den genehmigten Verfahren den Schädel mit sterilen Scheren von dorsal öffnen und anschließend den überliegenden Schädel vorsichtig mit einem Spatel entfernen.

Als Nächstes einführen Sie einen sterilen Vier-Millimeter-Spatel an der Vorderseite des Gehirns, um den Riechkolben und die Sehnerven zu durchtrennen. Anschließend heben Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Schädelknochen heraus und legen es in eiskaltes Dissektionspuffer. Mithilfe einer Gehirnschneidvorrichtung und sterilen Rasierklingen schneiden Sie zwei bis drei Millimeter dicke Schnitte, die den betroffenen Bereich enthalten, und legen diese in kaltes Dissektionspuffer.

Unter einem Stereomikroskop das weiße Mark unterhalb der motorischen Rinde in der injizierten Hemisphäre identifizieren. Bei früheren Zeitpunkten nach dem Schlaganfall kann die Injektion von L-Nio in Kombination mit gängigen Laborfarbstoffen wie Fast Green eine visuelle Identifizierung des Schlaganfalls ermöglichen. Zu späteren Zeitpunkten nach dem Schlaganfall lässt sich die Region visuell anhand fokaler Nekrose und Myelinpallor identifizieren.

Nach der Identifizierung verwenden Sie ein Skalpell, um den Bereich der weißen Substanz, der den Schlaganfall enthält, vorsichtig zu dissezieren. Entfernen Sie nach Bedarf die überliegende Großhirnrinde und den darunterliegenden Striatum. Wie hier gezeigt, verdeutlicht die immunfluoreszenzmarkierte Färbung für Neurofilamente, dargestellt in Rot, das Ausmaß des axonalen Verlusts sieben Tage nach dem Schlaganfall mittels des medialen Zugangswegs.

Bei Verwendung des posterioren schrägen Ansatzes wird die weiße Substanz umfassende Schlaganfallläsion direkt oberhalb des Seitenventrikels angepeilt und zeigt eine intensive Mikroglia-Reaktivität, wie durch Immunfärbung für IBA-1 nachgewiesen. Zwei Marker für astrozytäre Zwischenfilamente, Vimentin (rot dargestellt) und das gliale fibrilläre saure Protein (grün dargestellt), zeigen morphologische Veränderungen der Astrozyten in der weißen Substanz nach dem Schlaganfall. Die gleichzeitige Injektion von fluoreszierendem Dextranamin während der Schlaganfallinduktion ermöglicht die Identifizierung einzelner Neurone, deren Axone durch den Schlaganfall verletzt wurden.

Die meiste Markierung erfolgt in Axonen der Neuronen der Schichten fünf und sechs der primären sensorimotorischen Kortices, die über dem Infarktgebiet liegen. Diese Aufnahme zeigt den Zustand sieben Tage nach dem Schlaganfall. Sobald die Technik beherrscht wird, kann sie bei korrekter Durchführung in 45 Minuten durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen fokalen weißen-Materie-Infarkt bei einer Maus erzeugt und das Gehirn für eine Vielzahl nachgeschalteter Verarbeitungsschritte vorbereitet, die zur Beantwortung wichtiger Fragen im Bereich Schlaganfall und neuronale Reparatur nützlich sind.