Name: Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Erfahren Sie die stereotaktische L-Nio-Injektion zur Modellierung subkortikaler Weißsubstanz-Schlaganfälle bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise axonale Degenerationsstudien und Untersuchungen zellulärer Reaktionen.

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SN und MDD erhielt Unterstützung von NIH K08 NS083740 und der UCLA Klinik für Neurologie. AJG dankt für die Unterstützung durch die Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation und der Larry L. Hillblom Foundation. KLN dankt Unterstützung von der American Heart Association 14BFSC17760005 ASA-Bugher Stroke Center. ILL, EGS und STC wurden von NIH R01 NS071481 unterstützt. JDH dankt für die Unterstützung von NIH K08 NS083740.

Die Verwendung von Tieren in diesem Protokoll wurde in Übereinstimmung mit Verfahren, die von der University of California Los Angeles Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt wurde. Hinweis: Beginnen Sie mit der Ziel murine Bevölkerung zu identifizieren. In früheren Studien, nur männliche Wildtyp-C57 / BL6-Mäusen verwendet wurden, jedoch verschiedene transgenen oder Knockout-Mäuse auch verwendet werden können. Beachten Sie, dass sind stereotaktischen Koordinaten basierend auf C57 / Bl6 Anatomie. Es wird empfohlen, dass jeder Benutzer zunächst die Lokalisierung des Hubs zu der weißen Substanz zu überprüfen. 1. Weiß Matter Stroke Induktion - Medial mit schräger Ansatz <ol><li> Beginnen Sie mit einer gezogenen Glaspipette unter Verwendung von 0,5 mm Kapillarrohr vorbereitet , so dass der distale Durchmesser zwischen 15 bis 25 &amp; mgr; m 11 ist. </li><li> Bereiten einer sterilen 10-ul-Aliquot von L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-Ornithin HCl) bei 27,4 mg / ml (130 uM) in steriler 0,9% normale Kochsalzlösung. </li><li> Vorfüllen die gezogener Glaspipettemit einem kleinen Volumen von L-Nio (2-5 &amp; mgr; l) durch die Glaspipette Befestigung mit einer Vakuumleitung an die Rohrleitung. Legen Sie die Pipette flach auf der Tischplatte und setzen Sie das zog Ende in die L-Nio Lösung. <ol><li> Übernehmen des Vakuums, bis mindestens 2 mm von der 0,5 mm Abschnitt der Pipetten gefüllt ist. Schalten Sie das Vakuum aus, und die Pipette zurückziehen. Legen Sie sie beiseite, bis Schritt 1.12. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die Maus in einer Induktionskammer und induzieren Anästhesie der Maus unter Verwendung von Standard 32% Isofluran floss durch einen Verdampfer (5 l / min inhaliert mit 5 l / min Sauerstoff und 0,5 l / min N 2) für 1 min oder bis tief anästhesiert. Übertragen Sie die Maus an einen stereotaktischen Apparat mit einem stereotaktischen Mikroskop ausgestattet. Geben Sie Isofluran Aufrechterhaltung der Narkose mit 32% floss durch einen Verdampfer (2 l / min inhaliert mit 5 l / min Sauerstoff und 0,5 l / min N 2) und einem Nasenkegel. Prüfen Tiefe der Anästhesie mit einer Zehe Prise. </li><li> Stellen Sie den Injektionsarm bis 36 °. </li><li> Affixa gezogen Glaspipette Halter an das distale Ende eines geringen Volumendruck-Einspritzsystem und befestigen Sie es an der Injektions Arm des Stereotaxie-Setup. </li><li> Mantel des narkotisierten Tieres Whiskers mit Vaseline und Ort künstliche Tränen Salbe über beide Augen. Bereiten Sie eine sterile OP-Feld durch einen sterilen Tuch über den Kopf des Tieres mit einer 5-10 cm Öffnung über den Kopf stellen. Bereiten Sie eine aseptischen OP-Oberfläche, die durch das Fell rasiert den Schädel überlagert. Reinigen Sie die Kopfhaut mit abwechselnden betadine und 70% Alkoholtupfer. </li><li> Machen Sie eine 1,5 cm Mittellinie Kopfhauteinschnitt mit sterilen feinen Schere, um die Schädeloberfläche zu belichten. Trocknen Sie den Schädel mit einem sterilen Wattestäbchen und unter Verwendung eines stereotaktischen Mikroskop bei 1-3x Vergrößerung, entfernen Sie alle darüber liegenden periostaler Gewebe eine sterile Mikropunkt-Werkzeug. </li><li> Markieren Sie die Bregma als Referenzpunkt einen feinen Punkt Marker. </li><li> Bohren Sie ein 2 mm ellipitical Craniotomie einer sterilen feinen stip chirurgische Bohrer mit0; posterior am Bregma beginnen und nach vorne gerade links von der Mittellinie erstrecken. Entfernen von Knochenfragmenten und Weichgewebe überlagert, so dass der Großhirnrinde sichtbar gemacht werden kann. </li><li> Halten Sie das OP-Feld und kortikalen Oberfläche feucht durch intermittierend Tropfen steriler Kochsalzlösung anwenden. </li><li> Affix eine gezogen Glaspipette mit dem Injektor Arm des stereotaktischen Apparat. Richten Sie das distale Ende der Pipette mit dem Bregma und Null, um die stereotaktischen Koordinaten. </li><li> Vorzurücken die Pipette mit dem ersten anterioren / posterioren (A / P) und medial / lateral (M / L) -Koordinaten in Tabelle 1 bereitgestellt. </li><li> Schieben Sie die Pipette auf die kortikalen Oberfläche und Null die dorsale / ventralen (D / V) Messung. </li><li> Passieren langsam die Pipette in das Gehirn bis zum Erreichen der ersten D / V in Tabelle 1 zu koordinieren. </li><li> Mit einem geringen Volumendruck-Einspritzsystem bei 20 psi für 20 ms Impulse gesetzt, injizieren 100 nl von L-Nio in das Gehirn ein und warten 5 Minuten Reflux zu verhindernup der Pipette Spur. <ol><li> Verwenden eines kalibrierten Retikel in das Okular des Stereotaxie-Mikroskop und einer Vergrößerung von 3X. </li><li> Dementsprechend insgesamt 0,100 mm 3 (0,5 mm Länge in einer 0,5 mm Durchmesser Pipette bis 100 nl entspricht) verdrängen aus der ausgezogenen Glaspipette für jeden Satz von Koordinaten. Mit der Einrichtung eines reticule mit, zu messen und zu standardisieren, da jeder einrichten variiert in Abhängigkeit von der Vergrößerung und Skalen verwendet. </li><li> Für eine genaue Volumenmessung während jedes Einspritz nähern sich die abgewinkelten Pipette mit dem Mikroskop von der Seite, so dass der Flüssigkeitsmeniskus eine Sagittalansicht aufweist. Der Meniskus sollte in der gleichen Brennebene erscheinen sowohl der Innen- und Außenwand der Pipette. </li></ol></li><li> Langsam die Pipette zurückziehen und die Schritte wiederholen 1.13-1.16.3 bei der zweiten und dritten Satz von Koordinaten in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt. </li><li> Nach der letzten Injektion, entfernen Sie die Pipette und legen genug Knochenwachs die Kraniotomiestelle zu füllen. EINpproximate die Kanten der Kopfhaut Wunde und binden mit dermal Klebstoff. </li><li> Injizieren von 0,1 ml 0,5% Marcain in die Wundränder eine sterile 30 G-Nadel zu verhindern, lokale Schmerzen zu verhindern, mit der Kopfhaut Einschnitt verbunden. </li><li> Bringen Sie das Tier mit dem Gehäuse und Versorgung postoperativer Antibiotika (0,48 mg / ml Trimethoprim-Sulfamethoxazol oder 0,5 mg / ml Levofloxacin) im Trinkwasser für 5 Tage. </li></ol> 2. Weiß Matter Stroke Induktion - posterior gewinkelt Ansatz <ol><li> Führen Sie die Schritte 1,1-1,12 wie im medialen abgewinkelte Ansatz Protokoll, mit Ausnahme der Injektionsarm des stereotaktischen Setup anpassen, um 45 Grad ausgerichtet von vorne nach hinten. </li><li> Vorzurücken die Pipette mit dem ersten A / P und M / L - Koordinaten in Tabelle 2 bereitgestellt. </li><li> Vollständige verbleibenden Schritte 1,14-1,20 wie in der seitlichen abgewinkelten Ansatz Protokoll. </li></ol> 3. Rückläufige Neuronale Labeling <ol><li> Bereiten Sie eine sterile 10&amp; mgr; l Aliquot von L-Nio bei 54,8 mg / ml in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung. </li><li> Bereiten Sie eine sterile aliquote Menge von 20% Fluororuby (oder 20% biotinyliertes Dextran Amin oder 2% Fluorogold) in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung. </li><li> Verdünnte zusammen 1: 1 für Endkonzentrationen von 27,4 mg / ml L-NiO und 10% Fluororuby. </li><li> Führen Sie den Hub-Protokoll, wie oben in den Schritten 1,3-1,23. </li><li> Visualisieren Sie die nativ fluoreszierende Tracer in Gewebeschnitt durch Perfusionsfixierung, Kryoschneiden und Mikroskopie wie zuvor 8 beschrieben. </li></ol> 4. Gewebeverarbeitung für Immunofluoreszenz <ol><li> Zu einem geeigneten post-Takt-Intervall im Bereich von 3 Stunden bis 14 Tage nach Schlaganfall, einschläfern Mäuse über Isofluran Überdosierung oder lokalen IACUC Verfahren genehmigt. </li><li> Öffnen Sie die Brusthöhle mit abgewinkelten Schere und legen Sie eine 23 G Butterfly-Nadel in den linken Ventrikel. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof mit einer feinen Schere einen Abfluss Spur für die Perfusionsflüssigkeit zu ermöglichen. </li><li> Transkardial mit 30-40 ml kaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung perfundiert von 30-40 ml kaltem 4% Paraformaldehyd bei einer Rate von 10 ml / min bei RT verfolgt. </li><li> Enthaupten die Maus und entfernen Sie das Gehirn mit einer sterilen Schere den Schädel posterior zu öffnen und entfernen Sie dann vorsichtig den darüber liegenden Schädel mit einem Spatel, legen Sie das Gehirn in kalte 4% PFA für 24 h und dann übertragen auf 30% Saccharose in PBS für 48 Stunden . </li><li> Bereiten Sie vierzig Mikron schwebenden Abschnitte unter Verwendung eines Kryostats und Antikörper - Verarbeitung durchführen , wie zuvor 6-8 beschrieben. In dieser Studie wurden die folgenden Antikörper: Kaninchen-Anti-Neurofilament 200 (1: 500 Verdünnung); Kaninchen-anti-Vimentin (1: 500); Ziege-Anti-GFAP (1: 500); Kaninchen-anti-Iba-1 (1: 1000). </li></ol> 5. Gewebeverarbeitung für Protein oder RNA-Analyse <ol><li> Zu einem geeigneten post-Takt-Intervall im Bereich von 3 Stunden bis 14 Tagen nach dem Schlaganfall, einschläfern über Isofluran Überdosierung oder lokalen IACUC Verfahren genehmigt. </li><li> enthaupten dieMaus und das Gehirn mit einer sterilen Schere entfernen Sie den Schädel posterior zu öffnen und dann mit einem Spachtel die darüber liegende Schädel sanft entfernen. </li><li> Legen Sie eine sterile 4 mm Spachtel an der Vorderseite des Gehirns Riechkolben und Sehnerven zu trennen. Heben Sie vorsichtig das Gehirn aus dem Schädelkalotte aufnehmen und in eiskalten Dissektion Puffer (1x Hanks Balanced Salt Solution, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 35 mM Glucose, 4 mM Natriumbicarbonat und 0,01 mg / ml Cycloheximid). </li><li> Mit einem Gehirn blockieren und sterile neue Rasierklingen, vorbereiten 2-3 mm Platten den Hub und Ort in kalte Dissektion Puffer enthält. </li><li> Unter einem Binokular, identifizieren die weiße Substanz zugrunde liegenden motorischen Kortex in der injizierten Hemisphäre. Bei längeren post stroke Intervallen kann die Region visuell durch fokale Nekrosen und Myelin Blässe identifiziert werden. Hinweis: Bei früheren Post-Takt-Intervalle, die Injektion von L-Nio gemischt mit 1 ul 10% Fast Green kann eine visuelle Identifikation des Hubs ermöglichen ( <strong&gt; 4A). </li><li> Unter Anleitung eines Binokular und ein frisches Skalpell vorsichtig die Region der weißen Substanz sezieren den Hub enthält, identifiziert durch entweder Fast Green Kennzeichnung oder Gewebeverlust. Entfernen Sie darüber liegenden Kortex und der zugrunde liegenden Striatum nach Wunsch. </li></ol>

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<li>Jung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin+receptor+A+during+myelination+of+developing+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes.</a> J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).</li>
</ol>

Eine Anzahl von früheren Modellen von subkortikalen Schlaganfall einschließlich Brenn Injektionen von Endothelin-1 in die Capsula interna, subkortikalen weißen Substanz und Striatum in der Ratte und Maus - 12-14 6,15 beschrieben. Neuere Modelle von kleinen Brenn Hübe haben Cholesterin Mikroemboli Injektion in die Arterie carotis 16 verwendet und photothrombotic Okklusion eines einzelnen eindringenden arteriole 17. Jedes dieser Modelle hat sowohl Vorteile als auch Nachteile <su...

Schlaganfall, der die subkortikale weiße Substanz betrifft, ist eine häufige klinische Entität und macht jährlich bis zu 25% der klinischen Schlaganfälle in den USA aus 1. Auch ischämische Schädigungen der weißen Substanz treten im Stillen mit einer signifikant höheren Rate auf und tragen zur Entwicklung einer vaskulären Demenz bei 2,3. Derzeit haben Patienten mit dieser Form der zerebralen Ischämie, wenn überhaupt, nur wenige Behandlungsmöglichkeiten. Trotz der klinischen Bedeutung dieser Erkrankung gibt es nur wenige klinisch relevante Tiermodelle 4,5. 
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine fokale ischämische Läsion innerhalb der weißen Substanz der Maus zu erzeugen. Dieses Mausmodell menschlicher Krankheiten ermöglicht die spezifische Untersuchung der axonalen Verletzungsreaktion auf einen Schlaganfall und wie die zellulären Elemente der weißen Substanz, nämlich Oligodendrozyten und Astrozyten sowie Axone, auf einen Schlaganfall reagieren und sich nach einem Schlaganfall reparieren.
Frühere Berichte haben ein Modell des subkortikalen Schlaganfalls der weißen Substanz mit Endothelin-1 (ET-1) 6 beschrieben, das dem hier beschriebenen ähnlich ist. Es wurden mehrere wichtige Änderungen am Versuchsprotokoll vorgenommen, wodurch sich die Einsatzmöglichkeiten dieses Modells erweitert haben 7,8. Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige und modifizierbare Strategie, um einen fokalen Schlaganfall in der weißen Substanz des Mausgehirns zu erzeugen. 
Die Hauptvorteile dieses Modells sind die Verwendung eines chemischen endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS)-Inhibitors N(5)-(1)-Iminoethyl-L-ornithin HCl (L-Nio) 9 ohne bekannte parakrine Wirkungen auf zelluläre Elemente der weißen Substanz, was eine Komplikation bei Modellen mit Endothelin-1 10 war. Darüber hinaus ermöglicht das stereotaktische Targeting der weißen Substanz in der Maus die Verwendung einer beliebigen Vielzahl von transgenen oder Knockout-Stämmen, wodurch die verfügbaren Werkzeuge zur Bestimmung der Wirkung eines Schlaganfalls auf die weiße Substanz des Gehirns erheblich erweitert werden. Hier werden zwei Variationen dieser Technik beschrieben und zeigen einige der zusätzlichen Variationen, die genutzt werden können, um das Verständnis von Schäden und Reparaturen durch axonale und weiße Substanz nach einem Schlaganfall zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>L-N5-(1-Iminoethyl)ornithin, Dihydrochlorid</td><td>Calbiochem</td><td>400600-20MG</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc.</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarrohre</td><td>World Precision Instruments</td><td>50-821-807</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instrumentation</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Aufbau</td><td>Kent Scientific</td><td>KSC51725</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>KOPF</td><td>Modell 720</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop SZ51</td><td>Olympus</td><td>88-124</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Harvard Apparat</td><td>PY2 72-8547</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>Harvard Apparat</td><td>PY2 72-8598</td><td></td></tr><tr><td>Stumpfes Sezierwerkzeug</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Dremel</td><td>8220-1/28</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Fein Wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-1610-50</td><td></td></tr><tr><td>Trimethoprim-Sulfamethaxol</td><td>STI Apotheke</td><td>NDC 54879-007-16</td><td></td></tr><tr><td>Fluororuby</td><td>Fluorochrome Inc</td><td>30 mg</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>BP220-10</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica CM3050 S</td><td></td><td></td>14047033518</tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Grün&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>23 G Schmetterlingsnadel</td><td>Fisher</td><td>14-840-35</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank's Balanced Salt Solution Life</td><td>Technologies</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES-KOH, PH 7,4</td><td>Affymetrix</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cyclohexamid</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td></td></tr></tbody></table>

ein vielseitiges mausmodell von subcortical weiß matter stroke für das studium der axonalen degeneration and white matter neurobiologie

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

Schlaganfall beeinflussen weißen Substanz macht bis zu 25% der klinischen Schlaganfall Präsentationen, tritt leise auf Raten, die 5-10-fach größer, und trägt wesentlich zur Entwicklung von vaskulärer Demenz sein kann. Nur wenige Modelle von fokalen weißen Substanz Schlaganfall existieren und dieser Mangel an geeigneten Modellen hat Verständnis der neurobiologischen Mechanismen zu Verletzungen Antwort und Reparatur nach dieser Art von Schlaganfall beteiligt behindert. Die Hauptbeschränkung von anderen subkortikalen Schlaganfallmodellen ist, dass sie nicht fokal Infarkt zu der weißen Substanz zu beschränken oder haben in nicht-murine Arten validiert primär sind. Dies begrenzt die Fähigkeit, die Vielzahl von murinen Forschungswerkzeuge anzuwenden, um die Neurobiologie der weißen Substanz Schlaganfall zu studieren. Hier präsentieren wir eine Methode für die zuverlässige Herstellung eines fokalen Schlaganfalls in murine weißen Substanz eine lokale Injektion eines irreversiblen eNOS-Inhibitor verwendet wird. Wir präsentieren auch mehrere Varianten auf dem allgemeinen Protokoll einschließlich zwei einzigartige StereotaxieVariationen, retrograden neuronale Tracing sowie frisches Gewebe Kennzeichnung und Dissektion, die stark die möglichen Anwendungen dieser Technik erweitern. Diese Variationen erlauben für mehrere Ansätze, um die neurobiologischen Auswirkungen dieser gemeinsamen und erforschten Form von Schlaganfall zu analysieren.

Mit dem Modell dargestellt wird, kann die weiße Substanz zugrunde liegenden forelimb sensomotorischen Kortex zuverlässig ausgerichtet sein. Diese chemisch induzierte Hubmodell produziert Brenn axonalen und Myelinverlust, Astrozytose und Mikrogliose (Abbildung 1), wie sie typischerweise in menschlichen lacunar Infarkte zu sehen ist. Durch die Verwendung von drei Injektionen, ein klinisch nützliches Modell mit frühen Beeinträchtigung auf forelimb motorischen Aufgaben einge...

Hier stellen wir die Methodik zur Erzeugung eines fokalen Schlaganfalls in der weißen Substanz der Maus durch lokale Injektion eines irreversiblen endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS)-Inhibitors (L-Nio) vor. Vorgestellt werden zwei stereotaktische Varianten, die retrograde neuronale Verfolgung und die Markierung und Dissektion von frischem Gewebe, die die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik erweitern.

Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen kleinen Schlaganfall im weißen Hirnsubstanz von Nagern genau zu lokalisieren, um diese häufige Form eines subkortikalen Schlaganfalls im weißen Hirnsubstanz zu modellieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Schlaganfallforschungsbereich zu beantworten, wie beispielsweise die Mechanismen der axonalen Schädigung, die neuronale Reaktion auf einen subkortikalen Schlaganfall sowie die Reaktion der zellulären Bestandteile des weißen Hirnsubstanz sowohl in der akuten Phase als auch während der Reparaturphase des Schlaganfalls. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur präzisen Lokalisierung eines Schlaganfalls im weißen Hirnsubstanz verwendet werden kann und mit einer Vielzahl unterschiedlicher Mausmodelle kombiniert werden kann.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die geringe Menge an weißer Substanz zu einer falschen Lokalisation des Schlags führen kann. Geringfügige Anpassungen des Injektionswinkels oder der stereotaktischen Koordinaten für jeden Mausstamm oder der stereotaktischen Aufbauten können erforderlich sein. Beginnen Sie damit, zunächst eine gezogene Glaspipette an ein Rohr anzuschließen, das mit einer Vakuumleitung verbunden ist.Führen Sie das gezogene Ende in die L-Nio-Lösung oder in L-Nio mit fluoreszierendem Farbstoff ein. Starten Sie das Vakuum und saugen Sie so lange, bis mindestens zwei Millimeter des 0,5-Millimeter-Durchmesser-Abschnitts der Pipette gefüllt sind. Stellen Sie die gefüllte Pipette beiseite.Bringen Sie die Maus anschließend in eine stereotaktische Vorrichtung, die mit einem stereotaktischen Mikroskop ausgestattet ist. Nachdem die Maus gemäß den genehmigten Verfahren anästhesiert und für die Operation vorbereitet wurde, überprüfen Sie die Anästhesietiefe durch einen Zehenquetschtest. Es sollte keine Reaktion erfolgen.Als Nächstes stellen Sie den Injektionsarm auf 36 Grad ein. Befestigen Sie einen gezogenen Glaspipettenhalter am distalen Ende eines Niedrigvolumen-Druckinjektionssystems und befestigen Sie dieses am Injektionsarm. Nachdem Sie einen 1,5 cm langen medianen Hautschnitt angelegt haben, um den Schädel freizulegen, trocknen Sie die Schädelloberfläche mit einem Wattestäbchen. Danach unter einem stereotaktischen Mikroskop bei einer Vergr&ouml;&szlig;erung von einem- bis dreifach mit einem Mikropunktwerkzeug &uuml;berstehendes &Uuml;berknochenhautgewebe entfernen. Bregma mit einem feinen Markierstift kennzeichnen. Anschlie&szlig;end mit einem chirurgischen Bohrer, der mit einem feinen chirurgischen Bohrerbit ausgestattet ist, eine zwei Millimeter gro&szlig;e elliptische Kraniotomie bohren, beginnend hinter Bregma und nach vorne leicht links der Mittellinie verlaufend.Entfernen Sie Knochenfragmente und überliegendes Weichgewebe, sodass der Großhirnkortex sichtbar wird. Halten Sie die kortikale Oberfläche feucht, indem Sie in regelmäßigen Abständen Tropfen steriler Kochsalzlösung auftragen. Befestigen Sie anschließend die gefüllte Pipette am Injektorarm.Richten Sie das distale Ende der Pipette an Bregma aus und setzen Sie die stereotaktischen Koordinaten auf Null. Bewegen Sie die Pipette zu dem ersten Injektionspunkt unter Verwendung der anterioren, posterioren und medial-lateralen Koordinaten aus Tabelle eins. Anschließend führen Sie die Pipette bis zur kortikalen Oberfläche vor und setzen die dorsoventrale Messung auf Null.Senken Sie die Pipette langsam auf die dorsoventralen Koordinaten ab. Stellen Sie sicher, dass die Vergr&ouml;&szlig;erung des stereotaktischen Mikroskops auf drei X eingestellt ist und das kalibrierte Fadenkreuz deutlich sichtbar ist. Betrachten Sie die schr&auml;g positionierte Pipette von der Seite, sodass der Luft-Fl&uuml;ssigkeits-Meniskus in sagittaler Ansicht sichtbar ist.Der Meniskus sollte sich in derselben Fokalebene sowohl der inneren als auch der äußeren Wand der Pipette befinden. Injizieren Sie nun mit einem lokalen Druckinjektionssystem, das auf 20 PSI für 20 Millisekunden-Impulse eingestellt ist, 100 Nanoliter L-Nio in das Gehirn. Warten Sie nach der Injektion des Gesamtvolumens fünf Minuten, um einen Rückfluss entlang der Pipettenbahn zu verhindern.Ziehen Sie dann die Pipette zurück und wiederholen Sie den Injektionsvorgang an den zweiten und dritten Koordinatensätzen gemäß Tabelle eins. Nach der letzten Injektion entfernen Sie die Pipette und geben ausreichend Knochenwachs ein, um die Kraniotomiestelle zu verschließen. Schließen Sie abschließend die Ränder der Kopfhautwunde aneinander an und fixieren Sie sie mit einem Hautkleber.Nach der Verabreichung einer postoperativen Analgesie das Tier in einen sauberen Käfig stellen. Postoperative Antibiotika fünf Tage lang im Trinkwasser verabreichen oder bis zur Tötung, falls diese weniger als fünf Tage dauert. Nach der Tötung und Enthauptung der Maus gemäß den genehmigten Verfahren den Schädel mit sterilen Scheren von dorsal öffnen und anschließend den überliegenden Schädel vorsichtig mit einem Spatel entfernen.Als Nächstes einführen Sie einen sterilen Vier-Millimeter-Spatel an der Vorderseite des Gehirns, um den Riechkolben und die Sehnerven zu durchtrennen. Anschließend heben Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Schädelknochen heraus und legen es in eiskaltes Dissektionspuffer. Mithilfe einer Gehirnschneidvorrichtung und sterilen Rasierklingen schneiden Sie zwei bis drei Millimeter dicke Schnitte, die den betroffenen Bereich enthalten, und legen diese in kaltes Dissektionspuffer.Unter einem Stereomikroskop das weiße Mark unterhalb der motorischen Rinde in der injizierten Hemisphäre identifizieren. Bei früheren Zeitpunkten nach dem Schlaganfall kann die Injektion von L-Nio in Kombination mit gängigen Laborfarbstoffen wie Fast Green eine visuelle Identifizierung des Schlaganfalls ermöglichen. Zu späteren Zeitpunkten nach dem Schlaganfall lässt sich die Region visuell anhand fokaler Nekrose und Myelinpallor identifizieren.Nach der Identifizierung verwenden Sie ein Skalpell, um den Bereich der weißen Substanz, der den Schlaganfall enthält, vorsichtig zu dissezieren. Entfernen Sie nach Bedarf die überliegende Großhirnrinde und den darunterliegenden Striatum. Wie hier gezeigt, verdeutlicht die immunfluoreszenzmarkierte Färbung für Neurofilamente, dargestellt in Rot, das Ausmaß des axonalen Verlusts sieben Tage nach dem Schlaganfall mittels des medialen Zugangswegs.Bei Verwendung des posterioren schrägen Ansatzes wird die weiße Substanz umfassende Schlaganfallläsion direkt oberhalb des Seitenventrikels angepeilt und zeigt eine intensive Mikroglia-Reaktivität, wie durch Immunfärbung für IBA-1 nachgewiesen. Zwei Marker für astrozytäre Zwischenfilamente, Vimentin (rot dargestellt) und das gliale fibrilläre saure Protein (grün dargestellt), zeigen morphologische Veränderungen der Astrozyten in der weißen Substanz nach dem Schlaganfall. Die gleichzeitige Injektion von fluoreszierendem Dextranamin während der Schlaganfallinduktion ermöglicht die Identifizierung einzelner Neurone, deren Axone durch den Schlaganfall verletzt wurden.Die meiste Markierung erfolgt in Axonen der Neuronen der Schichten fünf und sechs der primären sensorimotorischen Kortices, die über dem Infarktgebiet liegen. Diese Aufnahme zeigt den Zustand sieben Tage nach dem Schlaganfall. Sobald die Technik beherrscht wird, kann sie bei korrekter Durchführung in 45 Minuten durchgeführt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen fokalen weißen-Materie-Infarkt bei einer Maus erzeugt und das Gehirn für eine Vielzahl nachgeschalteter Verarbeitungsschritte vorbereitet, die zur Beantwortung wichtiger Fragen im Bereich Schlaganfall und neuronale Reparatur nützlich sind.

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Forschung

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Medicine

Medizin

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Induktion eines Schlaganfalls der weißen Substanz in einem Mausmodell unter Verwendung eines Stickstoffmonoxid-Inhibitors

Verschiedene Mausmodellen der mittleren Hirnarterie (MCAO) sind weit verbreitet in der experimentellen Hirnforschung. Hier zeigen wir das Modell der transkraniellen Dauer distalen MCAO, die im Einklang kortikalen Infarkt von einer Größe, die von der Mehrheit der menschlichen ischämische Schlaganfälle auferlegt Schaden produziert.

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Dieses Manuskript beschreibt eine Modellierungstechnik der Kapsel Infarkt. Hier verwendeten wir eine modifizierte photothrombotic Technik mit geringer Intensität des Lichts nach Vorchirurgischer Ziel-Mapping. Mit dieser Technik haben wir einen umschriebenen Kapselinfarktmodell mit persistierendem motorischen Beeinträchtigungen.

Umschriebene Capsular Infarkt Modellierung einer Photothrombotic unter Verwendung der Technik

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Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie (Video) | JoVE Journal

Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie

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