Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls zur Laser-Mikrodissektion ist die Isolierung von Gesamt-RNA aus reinen Populationen prostatischer epithelialer Zelltypen aus heterogenen gefrorenen Prostatageweben für nachgeschaltete Genexpressionsanalysen. Diese Methode kann bei der Untersuchung von Patientenproben helfen und zentrale Fragen im Bereich der Prostatakrebsforschung beantworten, beispielsweise wie sich die RNA-Expression in benignen und erkrankten epithelialen Prostatagewebe-Proben oder in Proben aus klinischen Studien unterscheidet. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass die Laser-Mikrodissektion die RNA-Isolierung homogener Populationen epithelialer oder stromaler Zellen aus gefrorenem Prostatagewebe ermöglicht.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, hochwertige RNA zu gewinnen, da sie nicht wissen, welche Schritte entscheidend für die Erhaltung der RNA sind. Freie Bedingungen Beginnen Sie damit, alle für das Verfahren benötigten Reagenzien und Werkzeuge zusammenzustellen. Nachdem das gefrorene Prostatagewebe im Kryostaten 30 Minuten lang akklimatisiert wurde, geben Sie Einbettungsmedium in den Boden der Kassette und montieren Sie das Gewebe schnell mit gekühlten Pinzetten.

Stellen Sie die Kassette fünf Minuten lang in die Kühlvorrichtung des Kryostaten, um das Einbettmedium fest werden zu lassen. Sobald es fest ist, spritzen Sie gefrorenes Einbettmedium auf den Objekthalter und drücken Sie das eingebettete Gewebe vorsichtig hinein. Unterseite nach oben.

Lassen Sie die Vorbereitung fünf Minuten lang ruhen. Bevor Sie den Spannfutterhalter in die Halterung einsetzen, arretieren Sie den Griff in der Position und setzen Sie eine neue Klinge am Kryostaten ein. Nach dem Entriegeln des Griffs bewegen Sie die Probe vorsichtig vorwärts, bis die gewünschte Gewebeexposition erreicht ist.

Wenn bereit, stellen Sie den Kryostaten auf fünf Mikrometer ein und schneiden Sie eine oder zwei Schnitte. Legen Sie diese Schnitte auf einen geladenen Objektträger für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. Stellen Sie den Objektträger sofort für zwei Minuten in kalten, 100 %igen Ethanol.

Nach dieser Zeit die Objektträger entfernen und bei Raumtemperatur trocknen lassen. Der mit h und d gefärbte Objektträger ermöglicht eine bessere Visualisierung der Kernstrukturen und sollte vom Pathologen verwendet werden, um die Bereiche von Interesse zu markieren. Danach einen Stift-Rahmen bei Raumtemperatur aufbringen.

Gleiten Sie in einen Objektträgerhalter, stellen Sie den Kryostaten auf 10 Mikrometer ein und erstellen Sie Schnitte. Je nach Gewebegröße können ein bis vier Schnitte auf jeden Objektträger gebracht werden. Tauchen Sie den Objektträger sofort in kalten 100 %igen Ethanol ein.

Entfernen Sie die Probe nach zwei Minuten und lagern Sie sie zur späteren Analyse im Gefrierschrank. Am selben Tag der Laser-Mikrodissektion holen Sie die Objektträger mit dem Stift-Rahmen aus dem Gefrierschrank und arbeiten dabei in einem RNA-freien Bereich. Befeuchten Sie die Objektträger, indem Sie sie vorsichtig zwei Minuten lang in 90 % Ethanol und anschließend zwei Minuten lang in 75 % Ethanol eintauchen.

Nach dem Quellen die Prostatagewebe einfärben, indem die Objektträger vorsichtig für fünf bis 30 Sekunden in 0,5 % Toluidinblau getaucht werden. Das Gewebe fixieren, indem die Objektträger zweimal für jeweils 15 Sekunden in destilliertem Wasser und anschließend für 30 Sekunden bis drei Minuten in 75 % Ethanol gewaschen werden. Zuletzt die Pen-Frame-Objektträger in einen RNA-freien Behälter auf Eis überführen.

Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, legen Sie einen Objektträger zum Trocknen für 15 Minuten auf eine Objektträgerheizung. Trocknen Sie nur den Objektträger, der verarbeitet werden soll, und lagern Sie die übrigen auf Eis, bis sie benötigt werden. Schalten Sie die LCM-Komponenten in der folgenden Reihenfolge ein.

Mikroskop einschalten, der Laserschlüssel, der Laserschalter und anschließend der Computer. Starten Sie danach die Software für die Laser-Mikrodissektion mithilfe der Software. Weisen Sie das Mikroskop an, die Objektträger und Sammelröhrchen zu laden.

Klicken Sie auf „Probenhalter entladen“ und laden Sie den Objektträger mit der Gewebeseite nach unten auf den Objektträgerhalter. Setzen Sie den Objektträgerhalter in den entsprechenden Schlitz des Mikroskops ein und klicken Sie auf „Weiter“. Klicken Sie anschließend auf „Sammelröhrchen entladen“.

Etikettieren Sie die Röhrchen und laden Sie sie auf den Röhrchenhalter, dann setzen Sie sie in den entsprechenden Schlitz ein. Verschließen Sie die Deckel fest und geben Sie 35 Mikroliter Lysepuffer hinzu, wobei Sie darauf achten sollten, Luftblasen zu vermeiden.

Nachdem die Sammelkappen geladen wurden, klicken Sie auf „Okay“. Wählen Sie mit der Software die Position des Objektträgers im Halter aus und anschließend die Sammelkappe, um die Probe zu gewinnen. Visualisieren und fokussieren Sie den Objektträger über den Computer mit 10-facher Vergrößerung.

Verwenden Sie die Software, um den Laser zu kalibrieren, indem Sie Laser und anschließend Kalibrieren auswählen. Passen Sie dann die Leistungsblende und die Geschwindigkeit des Lasers an, indem Sie Laser und danach Steuerung auswählen. Nehmen Sie weitere Anpassungen vor, bis der Laser vollständig durch das Gewebe schneidet.

Es ist entscheidend, die Bereiche von Interesse abzugrenzen, was üblicherweise von einem fachärztlich zertifizierten Pathologen durchgeführt wird, um die gewünschten Gewebebereiche, die der LCM unterzogen werden sollen, genau zu dissezieren. Verwenden Sie die histologische H&E-Färbung im Format 8 × 11 als visuelle Vorlage. Umkreisen Sie mit dem Zeichenwerkzeug der Software die gewünschten epithelialen Bereiche in der Ansicht und vermeiden Sie es, irgendein Stromagewebe zu sammeln. Klicken Sie auf „Schneiden“, um den Laser zu starten.

Wenn ein Bereich nicht vollständig geschnitten ist, verwenden Sie das Bewegungs- und Schneidewerkzeug, um ihn manuell nachzubearbeiten. Setzen Sie die Bewegung des Objektivs zu neuen Ansichten fort und wiederholen Sie den Laserschnitt, bis die Probe vollständig disseziert ist oder die gewünschte Menge an Gewebe gesammelt wurde. Entfernen Sie nach Abschluss vorsichtig die Röhrchen aus dem Sammelhalter und schließen Sie die Deckel, wobei Sie auf die Lyse, den Puffer und das Gewebe in den Deckeln achten sollten.

Kurz zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang, um die Flüssigkeit und das Gewebe am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten bei 42 Grad Celsius und lagern Sie sie anschließend bei minus 80 Grad Celsius, bis die RNA-Isolierung durchgeführt wird. Diese Beispiele zeigen repräsentative mit Toluidinblau gefärbte Prostataschnitte auf einem Objektträger mit Rahmen vor und nach dem Laser-Mikrodissektionsverfahren zur Gewinnung benigner epithelialer Zelltyp-spezifischer Kontrollen.

Überprüfen Sie die Spezifität des mit dem Laser erfassten Gewebeareals. Gutartiges Epithel und Stroma. Drücken das prostatakarzinomspezifische Gen A-M-A-C-R nicht aus.

Das Stroma exprimierte das epitheliale Spezifitätsgen nicht und KX 3.1 Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, in einer RNA-freien Umgebung zu arbeiten, um RNA-Abbau zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA aus homogenen Populationen von epithelialen oder Stromazellen aus gefrorenem Gewebe für zahlreiche nachgeschaltete Analysetechniken isoliert.

Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit einem Kryostaten äußerst gefährlich sein kann; Vorsichtsmaßnahmen wie eine gute Schulung und äußerst aufmerksames Verhalten gegenüber der Klinge sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.