Name: Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Laser-Mikrodissektion zur Isolierung reiner Prostataepithelzellen aus gefrorenem Gewebe für RNA-Analysen. Diese Methode ermöglicht hochwertige Genexpressionsstudien in der Prostatakrebsforschung.

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Wir danken Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco und Avani Vaishnav für die Unterstützung bei der Optimierung dieser Methodik im Laufe der Jahre und Yang Zhang und Dr. Jian Ma von der University of Illinois in Urbana-Champaign für die RNA-Seq-Analyse. Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) und ein Stipendium der Prevent Cancer Foundation (Zhou).

Alle menschlichen Geweben für diese Experimente verwendet wurden, über ein Institutional Review Board genehmigten Protokoll und / oder Freistellung an der Universität von Illinois in Chicago erworben. 1. § frisch gefroren Prostate auf PEN-Rutsche und auf Geladene Glass Slide <ol><li> Am Tag vor oder ein paar Stunden vor dem Schneiden die Probe, saubere Werkzeuge (dh, Pinsel, Pinzette, coplins, Klingen, PEN-gerahmte Dias (falls nicht bereits RNase frei), eine ETOH sicheren Marker und ein Bleistift) und das Innere des einen RT Kryostat mit RNase-Dekontaminationslösung mit einer Sprühflasche und Lab-Wischtücher. <ol><li> Erlauben RNase-Dekontaminationslösung für 5 min vor wischte sitzen, Spülen mit depcH 2 0 auf über RNase-Dekontaminationslösung und eine abschließende Spülung mit 70% EtOH (mit depcH 2 0) hergestellten links entfernen. Hinweis: Es ist wichtig, eine RNase-freie Arbeitsfläche zu erhalten. Alle coplins, Werkzeuge, gefroren Eindeckmedium, Klingen und Folien verwendet werden, sollten nur für RNase freie Arbeiten verwendet werdenund nie in einem Standard-nicht-RNase freien Umgebung verwendet. Alle Instrumente müssen mit einer RNase Dekontaminationslösung vor jedem Experiment behandelt werden. </li></ol></li><li> Coole Kryostaten auf -24 ° C. </li><li> Setzen Sie die folgenden gereinigt RNase frei Instrumente innerhalb Kryostat mindestens 30 Minuten vor dem Schneiden abkühlen: slide Coplin gefüllte mit 100% Ethanol, Werkzeuge, kleine gefrorene Gewebekassetten und Montagezange. </li><li> Abrufen gefrorenen Prostatagewebe aus Kryospeicherung aufnehmen und in einem Trockeneis gefüllten Schaum Eimer für den Transport. Platzieren Gewebe in Kryostat Temperatur angeglichen wird für mindestens 30 min Kryostaten. Hinweis: Human Prostatagewebe für Laser-Capture-Mikrodissektion kann entweder frisch gefroren oder sein in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE). Die Zeitdruck und Objektträgervorbereitung sind etwas anders zwischen Gewebequellen. Hier beschreiben wir die Schritte für die Gefrierschnitten. </li><li> Arbeiten Sie mit einem Gewebe zu einem Zeitpunkt, und spritzen gefrorenen Einschlussmittel in die bottom der Kassette und schnell montieren Sie die gefrorenen Prostatagewebe in den gefrorenen Eindeckmedium mit den gekühlten Pinzette. </li><li> Legen Sie die Kassette mit dem Gewebe auf Kühler in Kryostaten für 5 min auf gefrorenen Eindeckmedium gesetzt. </li><li> Squirt eine kleine Menge gefrorenen Montagemedium auf dem Spannfutter und bis drücken montiert Gewebeunterseite vorsichtig auf dem gefrorenen Eindeckmedium. Lassen Sie in den Kryostaten Set für 5 Minuten, damit das gefrorene Eindeckmedium vollständig zu verfestigen. </li><li> Zeigen Futter in die Halterung ein und ziehen. </li><li> Verriegeln Sie den Griff in Sperrstellung und eine neue Klinge auf den Kryostaten. Für nachgeschaltete molekulare Endpunkte, die einen Verstärkungsschritt umfassen (dh qPCR) ist es ratsam, eine neue Klinge für jeden Patienten zu verwenden, um eine Kontamination zu verhindern (oder bewegen Sie die Klinge über den Bereich des Schaufel für die nächste Probe zu verwenden). </li><li> Entriegeln Sie den Griff und das Gewebe vorsichtig voran mit der Hand oder mit einem Fußpedal zu glätten und setzen das Gewebe mit 50 μm Abschnitte, bis die gewünschte Gewebe Belichtung erreicht ist. </li><li> Passen Kryostaten bis 5 um, schneiden ein oder zwei Abschnitte und legen Sie sie auf geladene Objektträger für die Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung (siehe Schritt 2). </li><li> Sofort platzieren Sie die Folie in die kalte 100% Ethanol für 2 min. </li><li> Entfernen Sie die geladene Objektträger aus Ethanol und trocknen lassen bei RT, bevor Sie mit H &amp; E Färbung (Schritt 2). </li><li> Zeigen RT PEN-Frame-Schieber auf einem Rahmen Fan. </li><li> Passen Kryostaten bis 10 um und Ort Abschnitten auf die RT PEN Rahmen gleitet. Ein bis vier Abschnitte Ort auf jeder Folie je nach Gewebegröße sein. </li><li> Die Folie sofort tauchen Sie ein in der Kälte 100% Ethanol für 2 min. </li><li> Entfernen Sie die PEN-Frame-Folien aus Ethanol und speichern Sie die Folie in einer Dia-Box in einem Exsikkator Feld in einem -80 ° C Gefrierschrank bis bereit LCM. Drei Tage ist die maximale Speicherdauer für eine optimale RNA-Gewinnung. </li><li> Fahren Sie mit Schritt 2 nur für die geladenen Glas geschobene. Fahren Sie mit Schritt 3 für PEN-Frame-Folie. </li></ol> 2. Hämatoxylin und Eosin-Y (H &amp; E) Stain zur histologischen Mark-up Hinweis: Diese, wenn für das Gewebe auf der geladenen Objektträger und den Stift nicht Rahmen Rutsche für LCM. <ol><li> Hydrat in den Abschnitten über die geladene Objektträger Eintauchen der Objektträger durch abgestufte Ethanol wie folgt: Tauchen Sie die Objektträger zweimal in 100% Ethanol für 3 Minuten, zweimal in 95% Ethanol für 3 min, einmal in 70% Ethanol für 3 min und zwei mal in destilliertem H 2 O 3 min. <ol><li> Vorbereitung Säurealkohollösung: 99 ml 70% igem Ethanol + 1 ml 1% HCl und 0,1% ige Natriumbicarbonatlösung: 0,1 g Natriumbicarbonat in 100 ml destilliertem H 2 O </li></ol></li><li> Tauchen Sie die Folie in Hematoxylin Gill II (0,4%) für 5 min. </li><li> Abwaschen überschüssige Beize in Steady fließendem Wasser H 2 O 3 min. </li><li> Tauchen Sie die Objektträger 10 Mal in saurem Alkohol </li><li> In fließendem H 2 O 3 min Waschen Sie die Folie. </li><li> Tauchen Sie den Schiebein 0,1% Natriumhydrogencarbonat-Lösung für 30-60 Sekunden, um die violette Farbe auf blau um. </li><li> In fließendem H 2 O 3 min Waschen Sie die Folie. </li><li> Spülen Sie die Folie in 95% Ethanol mit 10 Dips. </li><li> Tauchen Sie die Folie in Eosin-Y 2-3 mal für 15 sec insgesamt. </li><li> Entwässern die Folie durch abgestufte Ethanol wie folgt: Tauchen Sie die Objektträger zweimal in 95% Ethanol, zweimal in 100% Ethanol und zweimal in Xylol (stellen Sie sicher, das Gewebe wird klar, welche gründliche Entwässerung anzeigt). </li><li> Montieren Sie den Schieber mit nicht-wässrigen permanenten Fest Eindeckmedium und Deckglas. </li><li> Lassen Sie die Folie trocken für 30 Minuten. </li><li> Ein großes, hochauflösendes Bild Scan Rutsche mit jeder ganzen Dia-Scanner und drucken auf 8 &quot;x 11&quot; Papier. </li><li> Gliederung Interessengebiete (in der Regel durch einen Facharzt Pathologen durchgeführt) mit einem Marker. Dieses Markup ist der Leitfaden für die LCM Verfahren. </li></ol> 3. Toluidinblaufärbung des PEN-Frame-Slides Hinweis: Thwird am selben Tag wie der LCM durchgeführt. Verwenden depcH 2 O Wasser für alle Lösungen. Füllen Sie alle Schritte in RNase-free-Bereich. Alle coplins muss mit RNase-Dekontaminationslösung gereinigt werden. <ol><li> Der Tag des LCM entfernen Sie die PEN-Frame-Folien von -80 ° C Gefrierschrank und Hydrat durch flach geneigte Objektträger in 90% EtOH für 2 Minuten, dann 75% EtOH für 2 min. <ol><li> Bereiten Sie 0,5% Toluidinblau durch Auflösen in der molekularen Wasser biology grade dann auswählen, sterilisieren, durch ein 0,2 um-Filter und lagern bei RT. Diese Lösung kann für bis zu 6 Monate weiterverwendet werden. Hinweis: Es wird dringend empfohlen, die Lösung vor, wie die Filtration kann ein paar Stunden dauern vorzubereiten. </li></ol></li><li> Färben das Prostatagewebe durch flach geneigte Objektträger in 0,5% Toluidinblau für 5-30 sec. Entfärben das Gewebe durch Waschen gleitet 2 mal in depcH 2 O für 15 Sekunden, gefolgt von 75% EtOH für 30 Sekunden bis 3 Minuten. Hinweis: Fleck und destain Zeiten können eingestellt werden, um eine gute Färbung zu gewährleisten. Prostate neigt dazu, über Fleck. </li><li&gt; Über PEN-Frame-Folien RNAase freien Trockenbehälter auf Eis. </li></ol> 4. Laser-Capture-Micro-Dissektion (LCM) <ol><li> Unmittelbar vor LCM, trockenen Objektträger auf einer Trägerwärmer bei 42 ° C für 15 min. Chemische nur die Folie, die verarbeitet werden wird und der Rest auf Eis zu lagern, bis für sie bereit. </li><li> Schalten Sie LCM und Computer in dieser Reihenfolge, Mikroskop Macht, der Laserschlüssel, der Laserschalter und dann den Computer ein. Starten Sie die Laser Mikrodissektion Software. </li><li> Verwenden Sie die Software, um das Mikroskop, um die Folien und Sammelröhrchen Laststeuerung. Klicken Sie auf &quot;unload Probenhalter&quot;, legen Sie die Folie mit den Abschnitten auf den Objektträger-Halter mit dem Gewebe nach unten und legen Sie die Objektträgerhalter in den entsprechenden Steckplatz im Mikroskop, klicken Sie dann auf &quot;Weiter&quot;. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;unload Sammelröhrchen&quot;, Label und laden 0,5-ml-Röhrchen auf Rohrhalter und setzen Sie sie in den entsprechenden Steckplatz im Gerät. EinmalKappen gesichert sind, fügen Sie 35 ul Lysispuffer zu den Sammel Kappen und versuchen, Blasen zu vermeiden. Klicken Sie dann auf &quot;OK&quot;. Hinweis: Wenn Verdunstung ist ein Problem, verdünnte den Puffer, wie folgt: 25 &amp; mgr; l Lysepuffer mit 10 ul depcH2O. </li></ol></li><li> In der Software, wählen Sie die Position, in der der Schieber in der Objektträgerhalter gelegt. Wählen Sie die Auffangkappe, um die LCM Probe zu sammeln. </li><li> Visualisieren und konzentrieren sich die Folie durch den Computer zu 10X. Verwenden Sie die Software, um den Laser, indem Sie &quot;Laser&quot; und dann &quot;Kalibrierung&quot; zu kalibrieren. Stellen Sie die Macht, Blende und Geschwindigkeit des Lasers, die Auswahl von &quot;Laser&quot; und dann &quot;Control&quot;, damit der Laserstrahl die vollständig und effizient ausgewählten Bereich zu schneiden. Wiederholen Sie Einstellungen, bis die Laserschnitte vollständig durch das Gewebe. </li><li> Unter Verwendung des 8 &quot;x 11&quot; Pathologen Aufschlag als Leitfaden, benutzen Sie die &quot;Form zeichnen&quot; Werkzeug, um die gewünschten Bereiche der epithe umschreibenlium in der Ansicht und vermeiden Sammeln von Stroma. Hinweis: Mehrere Bereiche können auf einen Blick ausgewählt werden, aber nicht zu einer anderen Ansicht wechseln, ohne erste Schneid indem Sie auf das &quot;cut shape&quot; Werkzeug. <ol><li> Wenn ein Bereich nicht vollständig durch den Laser geschnitten bekommen benutzen Sie die &quot;bewegen und schneiden&quot; Werkzeug, um mehr als es manuell zu gehen. Bewegen Sie weiterhin das Ziel, neue Ansichten und wiederholen Laserschneiden bis Schieber vollständig seziert oder die gewünschte Menge an Gewebe gesammelt wurden (in der Regel 100 gutartigen Drüsen ergeben 150-500 ng RNA). (siehe Beispiel in Abbildung 1A). </li></ol></li><li> Rohre aus der Sammlung Halter vorsichtig heraus, und schließen Sie die Kappen, eingedenk des Lysepuffers und Gewebe in den Kappen. Kurz zentrifugieren für 30 Sekunden, um Flüssigkeit und Gewebe in dem Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 30 min und bei -80 ° C, bis sie zur RNA-Isolierung. </li></ol> 5. Gesamt RNA-Isolierung mit einem Filter-basierten Kit und Qualitätsanalyse <ol><li> Auftauen der Röhrchen auf Eis und bringe das Volumen der Lösung auf 100 ul. </li><li> Pre-nass das Mikrofilter eines RNA-Extraktions-Kit, indem 30 ul ofLysis Lösung auf die Mitte des Filters und lassen Sie es genießen whileperforming die nächsten beiden Schritte (mindestens 5 min). </li><li> In 3 ul LCM Additivlösung (im Kit enthalten) zum Lysat und mischen durch Vortexen für 5 Sekunden. Zentrifugieren für 30 Sekunden, um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die vorbenetzt Filter für ~ 30 Sekunden mit Höchstgeschwindigkeit, um Flüssigkeit zu entfernen. </li><li> Hinzufügen 1,25 Volumina (in diesem Fall 129 &amp; mgr; l) von 100% Ethanol zu dem Lysat Mischung sanft Wirbel oder einer Pipette auf und ab. ** Diese Methode wird für große und kleine RNA-Spezies zu erholen. </li><li> Laden der Probe auf die vorbenetzte Mikrofilter und Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min, um die RNA zu dem Filter zu binden. Dann waschen Mikrofilter mit 180 &amp; mgr; l von &quot;Waschlösung 1, R21; Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 min. Anmerkung: Von diesem Zeitpunkt an alle Zentrifugationen sollte bei 13.000 xg oder maximalen Geschwindigkeit durchgeführt werden. </li><li> Waschfilter zweimal mit 180 ul des &quot;Waschlösungen 2 und 3&quot; bezeichnet, wie durch die Kitprotokoll gerichtet. Zentrifuge für 30 Sekunden, dann entsorgen Sie die Strömung durch, und drehen Sie den Filter für 1 min, um Restflüssigkeit zu entfernen und den Filter trocknen. </li><li> Übertragen Sie Filter, um eine neue Sammelröhrchen. </li><li> Warm Elutionslösung bis -95 ° C (im Kit enthalten). </li><li> Übernehmen 10 ul vorgewärmtes Elutionslösung in die Mitte des Filters, schließen Sie die Kappe und zu speichern für 5 min bei RT. Dann Zentrifuge für 1 min, um die RNA zu eluieren, und wiederholen Sie diesen Schritt einmal nachgeben ~ 20 ul RNA. </li><li> Führen die DNase I-Behandlung für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Quantifizierung der RNA durch Spektralphotometer mit Absorption bei 260 nm. Das Verhältnis der optischen Dichte bei Wellenlängen von 260 nm und 280 nm verwendet, um die Reinheit zu beurteilenDie RNA (siehe Tabelle 1) 15. </li></ol> 6. Genexpressionsanalyse Hinweis: Gene Expression lange RNA-Spezies (wie mRNAs und lncRNAs) im Schritt 6.1 und kurze RNA-Spezies (wie miRNAs) gezeigt in Schritt 6.2. Verschiedene Kits sind für die RT-qPCR zur Verfügung und die Menge der RNA erforderlich variiert je nach Kit (so wenig wie 10 ng). RNA-Sequenzierung Analyse ist in 6.3 beschrieben. <ol><li> Revers transkribieren (RT) die RNA in cDNA, indem 5 ul 20 ng / ul RNA-Probe mit 5 &amp; mgr; l des RT Master Mix (RT-Puffer, dNTPs, Zufallsprimer, RT-Enzym, RNase-Inhibitor). Inkubieren der Reaktion für 25 min bei 25 ° C, dann 120 min bei 37 ° C und 5 min bei 85 ° C. </li><li> Verdünnen Sie die RT-Reaktion im Verhältnis 1:10 mit RNase-freiem Wasser und verwenden Sie 2,5 ul pro 10 &amp; mgr; l qPCR Reaktion mit Primer oder Primer / Sondensätze für die Gene von Interesse. Hinweis: Zur Analyse von teilweise abgebauten RNA erleichtern, ist es ratsam, Primer fo verwendenr kürzere Amplikons (weniger als 100 bp) 16. (Tabelle 2B) <ol><li> Für microRNA-Expressionsanalyse führen Sie die RT-Reaktion durch Mischen von 5 &amp; mgr; l von 2-10 ng / ul RNA-Probe mit 5 &amp; mgr; l des RT Master Mix. Hinweis: Jeder handelsüblichen PCR-basierte microRNA-Detection-Technologie erfordert den Einsatz von proprietären und spezifische RT-Primer. </li></ol></li><li> Alternativ oder zusätzlich zur RT-PCR, der nächsten Generation verwenden Sequenzierung (RNA-seq oder kleinen RNA-seq), um verschiedene Arten von RNAs zu quantifizieren. Typischerweise verwenden 500 ng RNA für dieses Verfahren (Tabelle 3) und die Durchführung des Verfahrens, wie vom Hersteller und Nachweisinstrument. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Genexpressionsprofile von Humanproben kann eine Herausforderung sein, nicht nur für die Qualität oder Quantität von Gewebe zur Verfügung, sondern auch für die verschiedenen histologischen in einem bestimmten Gewebeprobe vorhanden Entitäten. Dies ist eine besondere Herausforderung in der Prostata, in der gutartigen Gewebe sind weitgehend stromalen Geweben und Bereichen Krebs frei von Stroma. LCM ermöglicht physikalische Trennung Prostatastroma und Epithel-RNA für eine genauere Signatur der zwei verschiedenen Zelltypen <s...

Die Prostata ist eine heterogene Gewebe des sekretorischen Epithels in Drüsenacini durch fibromuskuläre Stroma in erster Linie aus der glatten Muskulatur 1 komponiert umgeben angeordnet sind. Basalzellen, sekretorischen Zellen, neuroendokrinen Zellen, Transit Verstärken und Stammzellen 2: Die Epithelzellen Fach besteht aus fünf verschiedenen, aber organisierter Zelltypen besteht. Bei Prostatakrebs (PCa), die sich von den luminalen Epithelzellen entsteht, das Wachstum des Adenokarzinoms bewirkt eine evident allmählichen Rückgang des Stroma 3. Aus diesen Gründen werden Gewebeproben deutliche Unterschiede im Verhältnis von stromalen und epithelialen Zelltyp auf der Basis des Ausmaß der PCa haben. Diese Unterschiede können zu Verzerrungen der Annahmen der Genexpressionsdaten von ganzen Geweben ungeachtet Mikrodissektion der gewünschten Zelltyp gewonnen führen. Daher ist es wichtig, diese Vorspannung zu entfernen, um Zelltypen vor der RNA-Extraktion und TrennungGenexpressionsanalyse. Macrodissection oder Mikrodissektion verwendet werden, um physisch zu trennen gut charakterisierten epithelialen Bereichen von der umgebenden Stroma 4 -6 werden. Macrodissection wird typischerweise mit einer Rasierklinge unter einem Präpariermikroskop gemacht und funktioniert gut zum Trennen großer PCa Knötchen vom Stroma, aber ist nicht fähig zur Entfernung von gutartigen Epithel von umgebenden Stroma (siehe Beispiel benigner Prostata Histologie in Abbildung 1). Mikrodissektion mit einem Laser (LCM) wesentlich arbeitsintensiver als macrodissection, aber sehr genau sezieren gutartige Epithel 4. Aktuelle Veröffentlichungen aus unserem Labor haben gezeigt, dass RNA erfolgreich durch LCM entweder aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Biopsien oder gefrorenen Gewebe 4,7-9 extrahiert werden. Die großen Herausforderungen in LCM-RNA-Extraktion sind 1), genau zu sezieren die gewünschten Bereiche des Gewebes, und 2) zur Erhaltung RNA Integrität während des LCM und Isolierungsverfahren 4,10. RNA aus reinen Zellpopulationen isoliert können zur Genexpressionsanalyse durch mehrere Verfahren einschließlich Reverse-Transkription quantitative PCR (RT-qPCR) 7,8 Microarray 11 und tiefe -sequencing 12-14 verwendet werden. Ziel dieses Protokolls ist es, Gesamt-RNA aus LCM Prostataepithel aus gefrorenem Gewebe zu isolieren, für nachgeschaltete Genexpressionsanalysen.

<table><tbody><tr><td>RNase-WEG&nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>PEN-Membran 4,0 mm Objektträger&nbsp;</td><td>Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger aus Glas, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Dekon-Labore.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (Diethylpyrocarbonat)</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Färbebehälter)</td><td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Färbegestell)</td><td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope</td><td>Aperio(Leica)</td><td>ScanScope&reg; </td><td></td>CS</tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Fluka</td><td>89640-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laser-Mikrodissektionssystem</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml dünnwandige Röhrchen für LCM</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous&reg;-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific Marke</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>cDNA-Reverse-Transkriptionskit mit hoher Kapazität</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA RT Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>Thermo Fisher Scientific Marke</td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Färbung</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Richard Allan Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>7111</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-mikrodissektion für menschen prostataepithel für die rna-analyse

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Die Prostata enthält ein heterogenes Milieu von stromalen, epithelialen, neuroendokrinen und Immunzelltypen. Eine gesunde Prostata besteht aus fibromuskulärem Stroma, das diskrete, epithelial ausgekleidete sekretorische Lumen umgibt, und einer sehr kleinen Population von Immun- und neuroendokrinen Zellen. Im Gegensatz dazu weisen Bereiche mit Prostatakrebs ein erhöhtes dysplastisches luminales Epithel mit stark reduzierter oder fehlender Stromapopulation auf. Angesichts des tiefgreifenden Unterschieds zwischen stromalen und epithelialen Zelltypen ist es zwingend erforderlich, die Zelltypen für jede Art von nachgelagerter molekularer Analyse zu trennen. Trotz dieses Wissens vergleicht der Großteil der Genexpressionsstudien gutartige Prostata mit Krebs ohne Mikrodissektion, was zu einer stromalen Verzerrung in den gutartigen Proben führt. Die Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ist eine effektive Methode, um verschiedene Zelltypen physisch aus einem Probenschnitt zu trennen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, dass RNA erfolgreich aus LCM-gesammeltem humanem Prostataepithel isoliert und für nachgelagerte Genexpressionsstudien wie RT-qPCR und RNAseq verwendet werden kann.

In einer früheren Studie haben wir gezeigt, die Verwendung von LCM zu epithelialen und stromalen Gewebe zu sammeln, um Expression Profiling durch RT-qPCR von mRNA und microRNA aus gefrorenen und FFPE Prostatagewebe des gleichen Patienten 4 zu vergleichen. LCM ist zeitaufwendig, vor allem, wenn große Menge an RNA ist für die nächste Generation Sequenzierungsanalyse gesammelt werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um den Arbeitsraum zu halten und Tools kostenlos RNase. Es wird empfohlen, um die Qual...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Laser-Capture-Mikrodissektion als effektive Methode zur Isolierung reiner Populationen von Zelltypen aus heterogenem Prostatagewebe für die nachgeschaltete RNA-Analyse zu verwenden.

Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls zur Laser-Mikrodissektion ist die Isolierung von Gesamt-RNA aus reinen Populationen prostatischer epithelialer Zelltypen aus heterogenen gefrorenen Prostatageweben für nachgeschaltete Genexpressionsanalysen. Diese Methode kann bei der Untersuchung von Patientenproben helfen und zentrale Fragen im Bereich der Prostatakrebsforschung beantworten, beispielsweise wie sich die RNA-Expression in benignen und erkrankten epithelialen Prostatagewebe-Proben oder in Proben aus klinischen Studien unterscheidet. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass die Laser-Mikrodissektion die RNA-Isolierung homogener Populationen epithelialer oder stromaler Zellen aus gefrorenem Prostatagewebe ermöglicht.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, hochwertige RNA zu gewinnen, da sie nicht wissen, welche Schritte entscheidend für die Erhaltung der RNA sind. Freie Bedingungen Beginnen Sie damit, alle für das Verfahren benötigten Reagenzien und Werkzeuge zusammenzustellen. Nachdem das gefrorene Prostatagewebe im Kryostaten 30 Minuten lang akklimatisiert wurde, geben Sie Einbettungsmedium in den Boden der Kassette und montieren Sie das Gewebe schnell mit gekühlten Pinzetten.Stellen Sie die Kassette fünf Minuten lang in die Kühlvorrichtung des Kryostaten, um das Einbettmedium fest werden zu lassen. Sobald es fest ist, spritzen Sie gefrorenes Einbettmedium auf den Objekthalter und drücken Sie das eingebettete Gewebe vorsichtig hinein. Unterseite nach oben.Lassen Sie die Vorbereitung fünf Minuten lang ruhen. Bevor Sie den Spannfutterhalter in die Halterung einsetzen, arretieren Sie den Griff in der Position und setzen Sie eine neue Klinge am Kryostaten ein. Nach dem Entriegeln des Griffs bewegen Sie die Probe vorsichtig vorwärts, bis die gewünschte Gewebeexposition erreicht ist.Wenn bereit, stellen Sie den Kryostaten auf fünf Mikrometer ein und schneiden Sie eine oder zwei Schnitte. Legen Sie diese Schnitte auf einen geladenen Objektträger für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. Stellen Sie den Objektträger sofort für zwei Minuten in kalten, 100 %igen Ethanol.Nach dieser Zeit die Objektträger entfernen und bei Raumtemperatur trocknen lassen. Der mit h und d gefärbte Objektträger ermöglicht eine bessere Visualisierung der Kernstrukturen und sollte vom Pathologen verwendet werden, um die Bereiche von Interesse zu markieren. Danach einen Stift-Rahmen bei Raumtemperatur aufbringen.Gleiten Sie in einen Objektträgerhalter, stellen Sie den Kryostaten auf 10 Mikrometer ein und erstellen Sie Schnitte. Je nach Gewebegröße können ein bis vier Schnitte auf jeden Objektträger gebracht werden. Tauchen Sie den Objektträger sofort in kalten 100 %igen Ethanol ein.Entfernen Sie die Probe nach zwei Minuten und lagern Sie sie zur späteren Analyse im Gefrierschrank. Am selben Tag der Laser-Mikrodissektion holen Sie die Objektträger mit dem Stift-Rahmen aus dem Gefrierschrank und arbeiten dabei in einem RNA-freien Bereich. Befeuchten Sie die Objektträger, indem Sie sie vorsichtig zwei Minuten lang in 90 % Ethanol und anschließend zwei Minuten lang in 75 % Ethanol eintauchen.Nach dem Quellen die Prostatagewebe einfärben, indem die Objektträger vorsichtig für fünf bis 30 Sekunden in 0,5 % Toluidinblau getaucht werden. Das Gewebe fixieren, indem die Objektträger zweimal für jeweils 15 Sekunden in destilliertem Wasser und anschließend für 30 Sekunden bis drei Minuten in 75 % Ethanol gewaschen werden. Zuletzt die Pen-Frame-Objektträger in einen RNA-freien Behälter auf Eis überführen.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, legen Sie einen Objektträger zum Trocknen für 15 Minuten auf eine Objektträgerheizung. Trocknen Sie nur den Objektträger, der verarbeitet werden soll, und lagern Sie die übrigen auf Eis, bis sie benötigt werden. Schalten Sie die LCM-Komponenten in der folgenden Reihenfolge ein.Mikroskop einschalten, der Laserschlüssel, der Laserschalter und anschließend der Computer. Starten Sie danach die Software für die Laser-Mikrodissektion mithilfe der Software. Weisen Sie das Mikroskop an, die Objektträger und Sammelröhrchen zu laden.Klicken Sie auf „Probenhalter entladen“ und laden Sie den Objektträger mit der Gewebeseite nach unten auf den Objektträgerhalter. Setzen Sie den Objektträgerhalter in den entsprechenden Schlitz des Mikroskops ein und klicken Sie auf „Weiter“. Klicken Sie anschließend auf „Sammelröhrchen entladen“.Etikettieren Sie die Röhrchen und laden Sie sie auf den Röhrchenhalter, dann setzen Sie sie in den entsprechenden Schlitz ein. Verschließen Sie die Deckel fest und geben Sie 35 Mikroliter Lysepuffer hinzu, wobei Sie darauf achten sollten, Luftblasen zu vermeiden.Nachdem die Sammelkappen geladen wurden, klicken Sie auf „Okay“. Wählen Sie mit der Software die Position des Objektträgers im Halter aus und anschließend die Sammelkappe, um die Probe zu gewinnen. Visualisieren und fokussieren Sie den Objektträger über den Computer mit 10-facher Vergrößerung.Verwenden Sie die Software, um den Laser zu kalibrieren, indem Sie Laser und anschließend Kalibrieren auswählen. Passen Sie dann die Leistungsblende und die Geschwindigkeit des Lasers an, indem Sie Laser und danach Steuerung auswählen. Nehmen Sie weitere Anpassungen vor, bis der Laser vollständig durch das Gewebe schneidet.Es ist entscheidend, die Bereiche von Interesse abzugrenzen, was üblicherweise von einem fachärztlich zertifizierten Pathologen durchgeführt wird, um die gewünschten Gewebebereiche, die der LCM unterzogen werden sollen, genau zu dissezieren. Verwenden Sie die histologische H&E-Färbung im Format 8 × 11 als visuelle Vorlage. Umkreisen Sie mit dem Zeichenwerkzeug der Software die gewünschten epithelialen Bereiche in der Ansicht und vermeiden Sie es, irgendein Stromagewebe zu sammeln. Klicken Sie auf „Schneiden“, um den Laser zu starten.Wenn ein Bereich nicht vollständig geschnitten ist, verwenden Sie das Bewegungs- und Schneidewerkzeug, um ihn manuell nachzubearbeiten. Setzen Sie die Bewegung des Objektivs zu neuen Ansichten fort und wiederholen Sie den Laserschnitt, bis die Probe vollständig disseziert ist oder die gewünschte Menge an Gewebe gesammelt wurde. Entfernen Sie nach Abschluss vorsichtig die Röhrchen aus dem Sammelhalter und schließen Sie die Deckel, wobei Sie auf die Lyse, den Puffer und das Gewebe in den Deckeln achten sollten.Kurz zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang, um die Flüssigkeit und das Gewebe am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten bei 42 Grad Celsius und lagern Sie sie anschließend bei minus 80 Grad Celsius, bis die RNA-Isolierung durchgeführt wird. Diese Beispiele zeigen repräsentative mit Toluidinblau gefärbte Prostataschnitte auf einem Objektträger mit Rahmen vor und nach dem Laser-Mikrodissektionsverfahren zur Gewinnung benigner epithelialer Zelltyp-spezifischer Kontrollen.Überprüfen Sie die Spezifität des mit dem Laser erfassten Gewebeareals. Gutartiges Epithel und Stroma. Drücken das prostatakarzinomspezifische Gen A-M-A-C-R nicht aus.Das Stroma exprimierte das epitheliale Spezifitätsgen nicht und KX 3.1 Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, in einer RNA-freien Umgebung zu arbeiten, um RNA-Abbau zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA aus homogenen Populationen von epithelialen oder Stromazellen aus gefrorenem Gewebe für zahlreiche nachgeschaltete Analysetechniken isoliert.Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit einem Kryostaten äußerst gefährlich sein kann; Vorsichtsmaßnahmen wie eine gute Schulung und äußerst aufmerksames Verhalten gegenüber der Klinge sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quantitative Real Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist eine schnelle und empfindliche Methode, um die Expression verschiedener microRNA (miRNA) Moleküle in Tumorproben zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahrens Expression von Hunderten von verschiedenen miRNA-Moleküle können verstärkt, quantifiziert werden, und analysiert die gleiche cDNA-Matrize.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

Humanen endogenen Retroviren (HERV), die 8% des menschlichen Genoms zu besetzen, halten knapp Codierung Kapazitäten aber hunderttausend long terminal repeats (LTR). Eine benutzerdefinierte Affymetrix-Microarray wurde entwickelt, um einzelne HERV Expression Ort identifizieren und wurde auf Prostata-Krebsgewebe als Proof of Concept für zukünftige klinische Studien verwendet.

Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs

Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren.

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Hier beschreiben wir ein vereinfachtes Protokoll für microRNA (miRNA)-Expressionsanalysen in archivierten klinischen Geweben mit Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem (FFPE) oder frisch gefrorenem Prostatakrebs (PCa) unter Verwendung von quantitativer Echtzeit-PCR (RT-PCR) und in situ Hybridisierung (ISH).

miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine reproduzierbare Laser Capture Microdissection (LCM) zur Isolierung von trabekuläre Geflecht (TM) für die nachgelagerten RNA-Analyse. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Genexpression im TM zu analysieren hilft beim Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der TM-okulären Erkrankungen.

Laser Capture Microdissection von hochreinen trabekuläre Geflecht aus Maus Augen für Gene Expression Analysis

Das Ziel dieses Protokolls ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien isoliert von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Dieses Protokoll beinhaltet Probenvorbereitung Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe, Kryoschneiden, ethanolische Färbung und Dehydrierung, LCM, und RNA-Extraktion.

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

Ein Lasercapture Microdissection (LCM) Protokoll wurde entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen zu erhalten. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf Mausfemurabschnitte. Das hier berichtete LCM-Protokoll kann jedoch verwendet werden, um die Genexpression in Zellen von hartgeweben zu untersuchen.

Ein Laser Capture Microdissection Protocol, das hochwertige RNA aus frisch gefrorenen Mausknochen liefert

Dieses Protokoll beschreibt lasercapture microdissection for the isolation of knorpel and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Knorpel und Knochen können durch Kresylviolettfärbung schnell visualisiert und präzise gesammelt werden, um hochwertige RNA für die transkriptomische Analyse zu liefern.

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Therapieresistenz entwickelt sich oft bei Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs, und in einigen Fällen entwickelt sich Krebs zu einem tödlichen Subtyp namens neuroendokrine minale Prostatakrebs. Die Bewertung der kleinen nicht-kodierenden RNA-vermittelten molekularen Veränderungen, die diesen Übergang erleichtern, würde eine bessere Krankheitsschichtung und Identifizierung von kausalen Mechanismen ermöglichen, die zur Entwicklung von neuroendokrinem Prostatakrebs führen.

Sequenzierung kleiner nicht-kodierender RNA aus formalinfixierten Geweben und Serum-abgeleiteten Exosomen von kastrationsresistenten Prostatakrebspatienten

Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.

Anwendung der Laser-Mikrodissektion zur Aufdeckung der regionalen Transkriptomik im menschlichen Nierengewebe

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.

Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse

Erfahren Sie die Laser-Mikrodissektion zur Isolierung reiner Prostataepithelzellen aus gefrorenem Gewebe für RNA-Analysen. Diese Methode ermöglicht hochwertige Genexpressionsstudien in der Prostatakrebsforschung.

Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

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