Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse
26. November 2015
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Laser-Capture-Mikrodissektion als effektive Methode zur Isolierung reiner Populationen von Zelltypen aus heterogenem Prostatagewebe für die nachgeschaltete RNA-Analyse zu verwenden.
Das übergeordnete Ziel dieses Laser-Capture-Mikrodissektionsprotokolls ist die Isolierung von Gesamt-RNA aus reinen Populationen von Prostata-Epithelzelltypen aus heterogenem gefrorenem Prostatagewebe für nachgelagerte Genexpressionsanalysen. Diese Methode kann helfen, Patientenproben zu analysieren und wichtige Fragen in der Prostatakrebsforschung zu beantworten, z. B. wie sich die RNA-Expression in gutartigen und krankheitsbedingten epithelialen Gewebeproben oder in klinischen Studien unterscheidet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Laser-Capture-Mikrodissektion die RNA-Isolierung homogener Populationen von Epithel- oder Str-Zellen aus gefrorenem Prostatagewebe ermöglicht.
Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, qualitativ hochwertige RNA zu erhalten, da sie nicht wissen, welche Schritte für die Erhaltung der RNA entscheidend sind. Freie Bedingungen Beginnen Sie damit, alle Reagenzien und Werkzeuge zu sammeln, die für den Eingriff benötigt werden. Nachdem Sie das gefrorene Prostatagewebe 30 Minuten lang im Kryostaten ausballibrieren ließen, spritzen Sie das Eindeckmedium in den Boden der Kassette und befestigen Sie das Gewebe schnell mit einer gekühlten Pinzette.
Legen Sie die Kassette für fünf Minuten in den Kühler des Kryostaten, um das Einbettmedium einzustellen. Nach dem Aushärten das gefrorene Eindeckmedium auf das Spannfutter spritzen und das montierte Gewebe vorsichtig hineindrücken. Unterseite nach oben.
Lassen Sie die Zubereitung fünf Minuten lang fest werden. Bevor Sie das Spannfutter in den Halter einsetzen, verriegeln Sie den Griff und setzen Sie eine neue Klinge auf den Kryostaten ein. Nachdem Sie den Griff entriegelt haben, schieben Sie die Probe vorsichtig voran, bis die gewünschte Gewebefreilegung erreicht ist.
Wenn Sie fertig sind, stellen Sie den Kryostaten auf fünf Mikrometer ein und schneiden Sie ein oder zwei Abschnitte. Legen Sie diese Abschnitte auf einen geladenen Objektträger, um Hämatin und Eoin zu färben. Legen Sie den Objektträger sofort für zwei Minuten in kaltes, 100%iges Ethanol.
Entfernen Sie nach dieser Zeit den Objektträger und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur trocknen. Der mit h und d gefärbte Objektträger bietet eine bessere Visualisierung der Kerntexturen und sollte vom Pathologen zur Markierung der interessierenden Bereiche verwendet werden. Platzieren Sie als Nächstes einen Stiftrahmen mit Raumtemperatur.
Schieben Sie in eine Rahmenhalterung, stellen Sie den Kryostaten auf 10 Mikrometer ein und erstellen Sie Abschnitte. Je nach Gewebegröße können ein bis vier Abschnitte auf jeden Objektträger gelegt werden. Tauchen Sie die Rutsche sofort in kaltes 100%iges Ethanol.
Entfernen Sie den Objektträger nach zwei Minuten und bewahren Sie ihn zur späteren Analyse im Gefrierschrank auf. Entnehmen Sie am selben Tag der Laser-Capture-Mikrodissektion die Objektträger aus dem Gefrierschrank und arbeiten Sie in einem RNA-freien Bereich. Hydratisieren Sie die Objektträger, indem Sie sie zwei Minuten lang vorsichtig in 90 % Ethanol und dann zwei Minuten lang in 75 % Ethanol tauchen.
Sobald Sie hydratisiert sind, färben Sie das Prostatagewebe, indem Sie die Objektträger zwischen fünf und 30 Sekunden lang vorsichtig in 0,5 % Toinblau tauchen. Halten Sie das Taschentuch fest, indem Sie die Objektträger zweimal 15 Sekunden lang in tiefem Wasser waschen, gefolgt von 75 % Ethanol für 30 Sekunden bis drei Minuten. Übertragen Sie zum Schluss die Objektträger des Stiftrahmens in einen RNA-freien, trockenen Behälter auf Eis.
Legen Sie vor Beginn des Eingriffs einen Objektträger zum Trocknen für 15 Minuten auf einen Objektträgerwärmer. Trocknen Sie nur den Objektträger, der verarbeitet werden soll, und lagern Sie den Rest bis zur Verwendung auf Eis. Aktivieren Sie die LCM-Komponenten in der folgenden Reihenfolge.
Die Stromversorgung des Mikroskops, die Lasertaste, der Laserschalter und dann der Computer. Starten Sie als Nächstes die Lasermikrodissektionssoftware mit der Software. Fordern Sie das Mikroskop auf, die Objektträger und Entnahmeröhrchen zu laden.
Klicken Sie auf Probenhalter entladen und legen Sie den Objektträger mit dem Gewebe nach unten auf den Objektträgerhalter. Setzen Sie den Objektträgerhalter in den entsprechenden Schlitz des Mikroskops ein und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie anschließend auf Sammelrohre entladen.
Beschriften und laden Sie die Schläuche in den Röhrchenhalter und stecken Sie sie in den entsprechenden Schlitz. Verschließen Sie die Kappen und fügen Sie 35 Mikroliter Lysepuffer hinzu. Achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden.
Nachdem die Sammlungsobergrenzen geladen sind, klicken Sie auf OK. Verwenden Sie die Software, um die Position des Objektträgers im Halter auszuwählen, und wählen Sie dann die Entnahmekappe aus, um die Probe zu entnehmen. Visualisieren und fokussieren Sie die Folie durch den Computer bei 10-facher Vergrößerung.
Verwenden Sie die Software, um den Laser zu kalibrieren, indem Sie Laser auswählen. Kalibrieren Sie dann, passen Sie die Leistungsblende und die Geschwindigkeit des Lasers an, indem Sie Laser auswählen, und steuern Sie dann. Nehmen Sie weitere Anpassungen vor, bis der Laser das Gewebe vollständig durchschneidet.
Es ist wichtig, die interessierenden Bereiche zu skizzieren, die typischerweise von einem staatlich geprüften Pathologen durchgeführt werden, um die Wunschbereiche des Gewebes, das der LCM unterzogen wird, genau zu analysieren, wobei das Pathologen-Markup von acht x 11 Stunden und e als visuelle Anleitung verwendet wird. Verwenden Sie das Werkzeug zum Zeichnen von Formen in der Software, um die gewünschten Bereiche des Epithels in der Ansicht zu umschreiben und das Sammeln von Stroma zu vermeiden. Klicken Sie auf Ausschneiden, um den Laser zu starten.
Wenn ein Bereich nicht vollständig geschnitten ist, verwenden Sie das Verschieben- und Schnittwerkzeug, um ihn manuell zu überarbeiten. Bewegen Sie das Objektiv weiter in neue Ansichten und wiederholen Sie den Laserschnitt, bis der Objektträger vollständig präpariert ist oder die gewünschte Menge an Gewebe entnommen wurde. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus dem Sammelhalter und schließen Sie die Kappen, wobei Sie auf die Lyse, den Puffer und das Gewebe in den Kappen achten.
Kurz zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang, um die Flüssigkeit und das Gewebe am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die RNA-Isolierung bereit sind. Diese Beispiele zeigen repräsentative toluidinblau gefärbte Prostataschnitte auf einem Stiftrahmen-Objektträger vor und nach der Laseraufnahme von gutartigen Epithelzelltyp-spezifischen Kontrollen.
Bestätigen Sie die Spezifität des mit dem Laser erfassten Bereichs des Gewebes. Gutartiges Epithel und Stroma. Exprimieren Sie nicht das Prostatakrebs-spezifische Gen A-M-A-C-R.
Das Stroma exprimierte nicht das epithelspezifische Gen und KX 3.1 Bei diesem Versuch dieses Verfahrens. Es ist wichtig, daran zu denken, in einer RNA-freien Umgebung zu arbeiten, um den RNA-Abbau zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie RNA aus homogenen Populationen von Epithel- oder Sturmzellen aus gefrorenem Gewebe für zahlreiche nachgelagerte Analysetechniken isoliert werden kann.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Kryostaten äußerst gefährlich sein kann, da Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. eine gute Schulung und eine extrem gute Aufmerksamkeit für die Klinge, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer angewendet werden sollten.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Überblick
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Laser-Capture-Mikrodissektion zur Isolierung reiner Populationen von epithelialen Prostatazellen aus heterogenen gefrorenen Prostatageweben. Diese Methode erleichtert die anschließende RNA-Analyse und unterstützt die Prostatakrebsforschung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Onkologie
Hintergrund
- Prostatakrebsforschung erfordert präzise RNA-Analysen aus spezifischen Zelltypen.
- Heterogene Gewebe erschweren die Isolierung reiner Zellpopulationen.
- Laser-Capture-Mikrodissektion bietet eine Lösung für die Extraktion hochwertiger RNA.
- Das Verständnis von RNA-Expressionsunterschieden kann klinische Praktiken beeinflussen.
Ziel der Studie
- Isolierung von Gesamt-RNA aus reinen Populationen von epithelialen Prostatazellen.
- Analyse der RNA-Expression in benignen versus erkrankten Geweben.
- Verbesserung des Verständnisses von Prostatakrebs durch Genexpressionsanalysen.
Verwendete Methoden
- Laser-Capture-Mikrodissektionstechnik.
- Isolierung von RNA aus gefrorenen Prostatagewebeproben.
- Kritische Schritte zur Aufrechterhaltung der RNA-Qualität während des Verfahrens.
- Verwendung gekühlter Pinzetten und Montagemedium für die Gewebehandhabung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung hochwertiger RNA aus spezifischen Zellpopulationen.
- Fähigkeit, RNA-Expressionsprofile in verschiedenen Gewebeproben zu differenzieren.
- Demonstration der Effektivität der Laser-Capture-Mikrodissektion in der Forschung.
- Potenzial für verbesserte Analyse von Patientenproben in klinischen Studien.
Schlussfolgerungen
- Laser-Capture-Mikrodissektion ist ein wertvolles Werkzeug für die Prostatakrebsforschung.
- Isolierte RNA kann Einblicke in Krankheitsmechanismen liefern.
- Diese Methode verbessert die Fähigkeit, heterogene Gewebe effektiv zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Laser-capture microdissection (LCM) enables precise isolation of pure prostatic epithelial cell populations from heterogeneous tissue, directly addressing stromal bias in gene expression studies. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports robust biomarker discovery for prostate cancer research. Integrating LCM-derived RNA analysis at early discovery and translational stages improves portfolio decision-making by reducing biological ambiguity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-type specific gene expression in benign versus diseased prostate tissue.
- Supports functional target validation by isolating homogeneous epithelial or stromal populations.
- Reduces confounding stromal signals, increasing predictive confidence in molecular findings.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying cell-type contributions to disease phenotypes.
Screening & Assay Development
- Provides validated RNA samples for downstream RT-qPCR and RNAseq workflows.
- Improves assay reproducibility by ensuring sample homogeneity and reducing variability.
- Enables standardization of gene expression assays across clinical and preclinical specimens.
- Supports reliable compound evaluation by linking molecular readouts to defined cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression profiles with disease-relevant epithelial compartments for biomarker development.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell-type specificity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, cell-specific molecular data.
- Supports translational research by providing high-quality RNA for clinical trial specimen analysis.
Pipeline & Workflow Integration
LCM-based RNA isolation fits at the interface of early discovery, target validation, and translational research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing by isolating pure epithelial or stromal populations for differential gene expression analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA samples for assay development and validation.
- Analytics: Provides high-quality molecular readouts for comparing benign and diseased tissue conditions.
- Translational Research: Maintains disease relevance by aligning molecular outputs with specific tissue compartments.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for cell-type specific RNA analysis across multiple studies and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of RNA-based assays.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cryostat operation, and RNA preservation techniques.
- Demands access to LCM instrumentation and RNA analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different tissue types or disease models.
- RNA integrity is highly sensitive to handling and environmental conditions.
