Name: Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Lernen Sie einen zellfreien Assay zur Rekonstitution der Chromatindekondensation am Ende der Mitose mit HeLa-Zellen und Xenopus laevis-Eiextrakt. Diese Methode ermöglicht die biochemische Manipulation und isolierte Untersuchung.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem ERC (AN377 / 3-2 und 309.528 CHROMDECON zu WA) und ein PhD Fellowship of des Boehringer Ingelheim Fonds unterstützt werden, um AKS Abbildung 1 und 2 werden von Developmental Cell 31 (3), Magalska nachgedruckt et al., RuvB artigen ATPasen Funktion in Chromatindekondensation am Ende der Mitose, 305-318, 2014, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier.

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+mitotic+chromosomes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract.</a> Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Galy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+gp210+in+mitotic+nuclear-envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown.</a> J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+DNA+replication+and+chromatin+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins.</a> Methods. 57, 203-213 (2012).</li>
<li>Gant, T. M., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).</li>
<li>Magalska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvB-like+ATPases+function+in+chromatin+decondensation+at+the+end+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis.</a> Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).</li>
<li>Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+structure+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome structure and condensation.</a> Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).</li>
<li>Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+condensation+requires+Brn1p%2C+the+yeast+homologue+of+Barren%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren.</a> Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+remodels+sperm+chromatin+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 69, 759-767 (1992).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+decondensation+in+Xenopus+egg+cytoplasm+is+mediated+by+nucleoplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin.</a> Cell. 65, 569-578 (1991).</li>
<li>Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+nucleoplasmin+from+Xenopus+laevis+oocytes+and+analysis+of+its+developmental+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression.</a> Genes Dev. 1, 97-107 (1987).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
<li>Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+in+vitro+assays+to+analyze+the+function+of+transmembrane+nucleoporins+and+targeting+of+inner+nuclear+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins.</a> Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).</li>
<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Xenopus laevis Eiextrakten sind ein sehr nützliches Werkzeug, um originalgetreu zu reproduzieren zellulären Prozessen in vitro, und dieses System wurde erfolgreich für die Charakterisierung einer Zellzyklus und Zellteilung Ereignisse 2, 3,5,6,17 verwendet. Aufgrund großer speichert der Kernkomponenten in dem Ei während der Oogenese sequestriert sind Eiextrakten eine ausgezeichnete Quelle für zelluläre Bestandteile. Im Vergleich zu anderen Ansätzen wie RNAi auf Säugergewebezelllini...

Xenopus laevis Eiextrakt ist ein leistungsfähiges und breit angelegten Werkzeug komplizierte zelluläre Ereignisse in der Einfachheit eines zellfreien Assay zu studieren. Seit ihrer ersten Beschreibung durch Lohka &amp; Masui 1 wurden sie ausgiebig genutzt, um mitotische Prozesse wie Chromatinkondensation 2, Spindelanordnung 3, Kernhülle Aufteilung 4, aber auch nukleozytoplasmatischen Transport 5 oder DNA-Replikation 6 studieren. Die Veranstaltungen finden am Ende der Mitose für die Reformation der interphasic Kern erforderlich, wie beispielsweise Kernhülle Reformation und Kernporenkomplex Remontage sind viel weniger verstanden, den frühen mitotischen Ereignissen verglichen, sondern kann auf ähnliche Weise unter Verwendung von Xenopus Eiextrakt 7 untersucht werden. Wir haben vor kurzem einen Test basierend auf Xenopus-Ei-Extrakt zu Chromatindekondensation am Ende der Mitose 8 studieren gegründet, ein untersuchten Prozess, den ich erwartetts detaillierte Charakterisierung. In Metazoen, Chromatin ist stark an mitotischen Eintrag, um treu Trennung des genetischen Materials durchzuführen kondensiert. Um sicherzustellen, dass das Chromatin während der Interphase ist für die Genexpression und die DNA-Replikation zugänglich ist, muss es bei Ende der Mitose De-verdichtet werden. Bei Wirbeltieren ist Chromatin bis zu fünffach während der Mitose kompakteren gegenüber Interphase 9, in Gegensatz zu Hefen, wo der mitotischen Verdichtung ist in der Regel viel geringer, beispielsweise nur zwei-fach in S. cerevisiae 10. Vertebraten Chromatindekondensation wurde hauptsächlich im Zusammenhang mit der Spermien DNA Reorganisation nach Eibefruchtung sucht. Ein molekularer Mechanismus, bei dem Nucleoplasmin, eine reichliche Oozyte Protein tauscht spermienspezifische Protamine Histone H2A und H2B im Ei gespeichert. Dieses Verfahren wurde auch unter Verwendung von Xenopus-Ei-Extrakt 11, 12 erläutert. Jedoch bedeutet der Ausdruckvon Nucleoplasmin an Oozyten 13 und mitotischen Chromatin beschränkt nicht diese Spermien spezifische Protamine enthalten. Daher Chromatindekondensation am Ende der Mitose unabhängige Nucleoplasmin 8. Für die in vitro Dekondensation Reaktions beschäftigen wir Auszug aus aktiviert X. laevis Eiern und Chromatin-Cluster aus synchronisierten HeLa-Zellen isoliert generiert. Die Behandlung der Eier mit einem Calcium-Ionophor ahmt die Calcium-Freisetzung in die durch Spermien Eintrag bei der Befruchtung erzeugten Eizelle. Das Calciumwelle triggert den Zellzyklus wieder aufgenommen und das Ei, in der zweiten Metaphase der Meiose fest schreitet zu dem ersten Zwischenphase 14. Daher Ei Extrakte hergestellt Form aktiviert Eier stellen die mitotische exit / Interphasezustand und sind befugt, die spezifisch für mitotische Ausfahrt wie Chromatindekondensation, Kernhülle Ereignisse induzieren und Porenkomplex Reformation. Zur Isolierung von mitotischen chromatin Cluster verwendeten wir eine leicht modifizierte Version des von Gasser &amp; Laemmli 15, in dem Chromosom Cluster werden durch Lyse aus HeLa-Zellen in der Mitose synchronisiert und in Polyamin enthaltenden Puffern getrennt durch eine Gradienten-Zentrifugationen erfolgten Veröffentlichung Protokoll.

<table><tbody><tr><td>Spermin Tetrahydrochlorid</td><td>Fluka analytisch</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spermidintrihydrochlorid</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>hochreines Digitonin</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td>toxisches</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Applichem</td><td>A0999,0100</td><td>toxisches</td></tr><tr><td>Thymidin</td><td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td>giftige</td></tr><tr><td>37%ige Formaldehydlösung</td><td>Roth</td><td>7398-1</td><td>giftige</td></tr><tr><td>Trypanblaulösung (0,4% )</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>toxisches</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF-Hydrochlorid</td><td>Applichem</td><td>A1421.0001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roth</td><td>2936.1/2/3</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin,</td><td>Roth</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (kolloidale Kieselsäurepartikel GE</td> <td>Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2; Gewebekulturkolben</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator (40 ml Gewebewolf)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer</td><td>chamber Assistent</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Oak Ridge Zentrifugenröhrchen, Polycarbonat (50 ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m-Zell-Sieb, Nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Applichem</td><td>A7657,0010</td><td>toxisches</td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Roth</td><td>8682.3</td><td>toxisches</td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Merck</td><td>1.028.381.000</td><td></td></tr><tr><td>hCG erhältlich als Ovogest</td><td>MSD</td><td>1431593</td><td></td></tr><tr><td>PMSG erhältlich als Intergonan</td><td>MSD</td><td>1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (gemischtes Calcium-Magnesium-Salz)</td><td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td>giftige</td></tr><tr><td>Spritzenkanülen (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")</td><td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>Kreatinphosphat Dinatriumsalz</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>Kreatinphosphokinase</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugationsröhrchen für Toxizität für TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 Zoll)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (Spitzen mit breiter Öffnung, 1.000 & micro; l)</td><td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>50%ige Glutaraldehyd-Lösung, Grad I</td><td>Sigma alderich</td><td>G7651-10 ml</td><td>giftig</td></tr><tr><td>0,1% (w/v) Poly-L-Lysin-Lösung</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Flachboden-Röhrchen (6 ml, 16,0/55 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Rohre für TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 Zoll)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (Spitzen mit breiter Öffnung, 200 & micro; l)</td><td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Deckgläser</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

ein zellfreien assay zu chromatindekondensation studieren am ende der mitose

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Während des Zellzyklus von Wirbeltieren erfährt Chromatin umfangreiche strukturelle und funktionelle Veränderungen. Beim Eintritt in die Mitose kondensiert es massiv zu stäbchenförmigen Chromosomen, die einzeln durch den mitotischen Spindelapparat bewegt werden. Die mitotische Chromatinkondensation führt zu verdichteten Chromosomen, die fünfzigfach dichter sind als in der Interphase. Beim Austritt aus der Mitose müssen die Chromosomen ihren funktionellen Interphase-Zustand wiederherstellen, der von einer Kernhülle umschlossen ist und für die Replikation und Transkription zuständig ist. Der Dekondensationsprozess ist morphologisch gut beschrieben, aber molekular wenig verstanden: Uns fehlt das Wissen über die zugrundeliegenden molekularen Vorgänge und zu einem großen Teil über die beteiligten Faktoren sowie deren Regulation. Wir beschreiben hier ein zellfreies System, das die Chromatin-Dekondensation in vitro originalgetreu rekapituliert, basierend auf mitotischen Chromatinclustern, die aus synchronisierten HeLa-Zellen und X. laevis Ei-Extrakt gereinigt wurden. Unser zellfreies System stellt ein wichtiges Werkzeug für die weitere molekulare Charakterisierung der Chromatin-Dekondensation und ihre Koordination mit Prozessen dar, die gleichzeitig während des Mitoseaustritts ablaufen, wie z. B. die Wiederassemblierung der Kernhülle und des Porenkomplexes.

Zeitabhängigkeit der Dekondensation Reaktions Figur 1 zeigt einen typischen zeitlichen Verlauf der Dekondensation Assay. Die Gruppe von Chromosomen zu Beginn der Reaktion sichtbar decondenses und geht in einem einzigen, runden und glatten Kern. Wenn das Ei-Extrakt wird durch Saccharose ersetzt puffern das Chromosom Cluster bleibt Kondenswasser, die vorschlagen, dass Dekondensation Aktivität im Ei-Extrakt vorhanden ist. Chromatindekondensation ist...

Die molekularen Mechanismen der Dekondensation von hochverdichtetem mitotischem Chromatin sind unklar. Wir präsentieren einen zellfreien Assay, der auf mitotischen Chromatinclustern basiert, die aus HeLa-Zellen und Xenopus laevis-Eiextrakt isoliert wurden und den Dekondensationsprozess in vitro originalgetreu rekonstituieren.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Chromatin-Dekondensation in der Einfachheit eines zellfreien Tests so genau wie möglich nachzubilden, wie sie am Ende der Mitose auftritt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen der Mitoseforschung zu beantworten, da sie die Charakterisierung des molekularen Mechanismus der Chromatin-Dekondensation sowie die Identifizierung der an der Regulation beteiligten Faktoren ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie leicht biochemisch manipuliert werden kann und dass das Chromatin zugänglich ist.Die Dekolonisierung kann isoliert von anderen Zellzyklusereignissen untersucht werden. Beginnen Sie damit, mitotische Chromatin-Cluster aus HELA-Zellen zu isolieren, und bereiten Sie die Puffer für die Herstellung des IIC Xenopus laevis Ei-Extrakts vor, wie in der beigefügten Textanleitung beschrieben. Bereiten Sie danach eine 5-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, zur Injektion von 500 internationalen Einheiten humanen Choriongonadotropins in ovulationsinduzierte Frösche vor.Spritzen Sie die Frösche am Abend vor dem Experiment unter die Haut des dorsalen Lymphsacks, um die Eiabgabe auszulösen. Nach der Induktion halten Sie die Frösche 13 bis 17 Stunden lang bei 18 Grad Celsius in einzelnen Behältern mit jeweils 1,2 Liter Mark’s modifiziertem Ringer-Puffer. Nachdem die Frösche ihre Eier abgelegt haben, entfernen Sie bereits aktivierte Eier sowie beschädigte oder unansehnliche Eier. Sammeln Sie die Eier, indem Sie den Inhalt der Behälter vorsichtig in Glasbecher mit einem Fassungsvermögen von 600 bis 1000 Milliliter gießen.Die Sortierung der Eier ist entscheidend, da die Gesamtqualität der weiteren Schritte von diesem Schritt abhängt. Entfernen Sie aktivierte, fadenziehende oder anderweitig beschädigte Eier. Auch in späteren Schritten sollten beschädigte Eier weiterhin entfernt werden.Decantieren Sie das überstehende S-Supernatant, sobald sich die Eier abgesetzt haben, und füllen Sie das Becherglas anschließend mit frischem Puffer erneut auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal, um die Eier nach dem letzten Waschschritt zu waschen. Entfernen Sie das Supernatant ein letztes Mal und füllen Sie das Becherglas dann mit einer 2 %igen L-Cystein-Lösung, um die Eier darzustellen.Nach zwei bis vier Minuten auf frische Pufferlösung mit L-Cystein umstellen. Die Entgelierung gilt als abgeschlossen, wenn das Volumen der Eier drastisch abnimmt und sich die Eier nach etwa fünf bis sieben Minuten dichter zusammenlagern. Anschließend spülen Sie die Eier vorsichtig in Marks modifizierter Ringer-Pufferlösung, indem Sie die Pufferlösung abgießen und die Pufferlösung an der Wand des Bechers statt direkt auf die Eier nachfüllen.Dann aktivieren Sie die Eier in 100 Milliliter Marx-modifiziertem Ringer-Puffer, der acht Mikroliter zwei Milligramm pro Milliliter Calciumion enthält. Vier, stoppen Sie die Aktivierung, sobald die Kontraktion der Animalcap sichtbar wird.Oder nach 10 Minuten ab dem Zeitpunkt der Aktivierung die Eier vorsichtig in Marks modifiziertem Ringer-Puffer waschen, indem der Puffer nach dem letzten Waschschritt abgegossen und erneut aufgefüllt wird. Die Eier anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur in Marks modifiziertem Ringer-Puffer inkubieren. Danach Zentrifugenröhrchen mit fünf Milliliter Inhalt vorbereiten, bestehend aus 50 Mikrolitern Saccharose-Puffer und 50 Mikrolitern eines 100-fach verdünnten Proteaseinhibitors.Mischen Sie fünf µL einer einmolaren DTT-Lösung, 12,5 µL Cycloheide und 2,5 µL Cyto. Waschen Sie die Eier zweimal mit kaltem Saccharosepuffer und überführen Sie sie anschließend in die Zentrifugenröhrchen. Packen Sie die Eier mit einer Plastik-Pasteurpipette mit weitem Öffnungsdurchmesser, indem Sie die Röhrchen eine Minute lang bei 130 ×g zentrifugieren. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den überschüssigen Puffer mit einer Plastik-Pasteurpipette und füllen Sie den verbleibenden Platz mit weiteren Eiern auf.Anschließend die eiergefüllten Röhrchen 20 Minuten bei vier Grad Celsius und 21.000 × g in einem 6 × 5-Milliliter-Schwingrotor zentrifugieren. Nachdem sich die Lösung nun in drei Schichten getrennt hat, eine 5-Milliliter-Spritze mit einer 16-Gauge-Nadel durch die Seitenwand des Röhrchens in die mittlere Schicht zwischen dem gelben Eigelb oben und direkt über dem dunklen, zerbrochenen Ei-Debris unten einführen. Den Phasenextrakt niedriger Geschwindigkeit in ein frisches, auf Eis stehendes Röhrchen überführen und dann 10 Mikroliter eines 100-fach verdünnten Proteaseinhibitors hinzufügen.Mischen Sie ein Mikroliter einer einmolaren DTT-Lösung, 2,5 Mikroliter Cycloheid bei 20 Milligramm pro Milliliter und 0,5 Mikroliter Cyto B. Geben Sie 10 Milligramm pro Milliliter zu jedem Milliliter des Extrakts nach der langsamen Zentrifugation hinzu. Zentrifugieren Sie den Extrakt nach der langsamen Zentrifugation 12 Minuten bei 355.000 × g in einem 10-mal-2-Milliliter-Rotor. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die oberste Lipidschicht und überführen Sie das entstehende Überstand enthaltende Hochgeschwindigkeitspräparat in ein frisches Reaktionsgefäß.Dieser Schritt ist entscheidend, um eine Probe von hoher Qualität zu erhalten. Achten Sie darauf, dass die entfernte Flüssigkeit keine Verunreinigungen aus der oberen Lipidschicht oder der störenden unteren Schicht enthält. Pipettieren Sie 18 Mikroliter des Hochgeschwindigkeits-Extrakts in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen und geben Sie anschließend 0,5 Mikroliter Glykogen und 0,5 Mikroliter der Energiemischung hinzu.Punkt drei, Mikroliter sechs Dimethyl Purin und 0,7 Mikroliter der mitotischen Cluster. Verwenden Sie Pipettenspitzen mit einer weiten Öffnung, um die Reaktion unmittelbar nach dem Hinzufügen des Chromatins zu mischen, um eine Scherung des sich entfaltenden Chromatins zu verhindern. Nach dem Mischen inkubieren Sie die Reaktionsmischung bis zu zwei Stunden bei 20 Grad Celsius.Fixieren Sie die Probe anschließend durch Zugabe von 0,5 Milliliter eiskaltem Fixans, der 4 % Paraldehyd, 0,5 % Glutaraldehyd und 0,1 Milligramm pro Milliliter DAPI enthält. Unter Verwendung von Pipettenspitzen mit großer Öffnung wird die Probe 20 bis 30 Minuten auf Eis inkubiert. Danach beschriften Sie 12 Millimeter durchmessende runde Deckgläser mit einer 0,1 %igen (Gewicht pro Volumen) Poly-L-Lysin-Lösung und inkubieren die Deckgläser fünf Minuten lang, um die Affinität der Deckgläser zu erhöhen.Trocknen Sie die Deckgläser zur Chromatinpräparation auf Filterpapier. Sobald sie trocken sind, geben Sie die beschichteten Deckgläser in sechs Milliliter fassende, flache Zentrifugierrohre, sodass die beschichtete Seite nach oben zeigt. Geben Sie dann 800 Mikroliter des 30 %igen Saccharosepolsters hinzu und schichten die gesamte fixierte Probe vorsichtig darauf auf.Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 2.500 × g. Danach entfernen Sie den Überstand S und nehmen die Deckgläser aus den Röhrchen, indem Sie vorsichtig mit einer Nadel der Stärke 16 am Boden des Zentrifugenröhrchens anstechen. Wenn das Deckglas durch die Nadel an einer Seite angehoben wird, verwenden Sie eine Pinzette, um das Deckglas herauszunehmen, spülen es kurz durch Eintauchen in entionisiertes Wasser und trocknen es vorsichtig ab, indem Sie die Seite an Filterpapier anlegen. Anschließend geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einen Objektträger und senken die Probenseite des Deckglases darauf ab.Legen Sie den Deckel auf das Eindeckmedium. Trocknen Sie den Deckel vorsichtig ab, verschließen Sie die Kante des Deckels mit Nagellack und bewahren Sie die Probe im Dunkeln auf, bis sie abgebildet wird. Hier ist der typische Zeitverlauf des Dekompensationsassays.Der Haufen von Chromosomen, der zu Beginn der Reaktion sichtbar ist, kondensiert und verschmilzt zu einem einzigen, runden und glatten Kern. Wenn der Ei-Extrakt durch einen Saccharose-Puffer ersetzt wird, bleibt der Chromosomenhaufen kondensiert, was darauf hindeutet, dass Aktivität zur Dekompensation im Ei-Extrakt vorhanden ist. In dem hier gezeigten Experiment wurden nicht hydrolysierte ATP- oder GTP-Analoga der Reaktion hinzugefügt.Beide Zusatzstoffe hemmen die Dekondensation, was zeigt, dass dieser aktive Prozess sowohl von der Hydrolyse von ATP als auch von GTP abhängig ist. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in etwa zwei Stunden für die Zugerichtung von Ei-Extrakten aus Singapore-Levels und in drei Stunden für den Assay zur Förderung der Dekolonisation durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass der Erfolg entscheidend von der Qualität des Extrakts abhängt.Insbesondere für Immundepletionen wird empfohlen, frisch hergestellten Extrakt gemäß diesem Verfahren zu verwenden. Andere Methoden wie Immundepletionen und die Zugabe rekombinanter Proteine können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welche Faktoren beteiligt sind. Diese Technik wird Forschern auf den Gebieten Mitose oder nukleare Struktur und Funktion den Weg ebnen, um die Chromatin-Dehumanisierung zu untersuchen, wie sie am Ende der Mitose in tierischen Zellen stattfindet.Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man exogene Xenopus-Leber-Eizell-Extrakte herstellt und wie man die Methode zur Rekonstitution der Chromatin-Depolymerisation anwendet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd, Hydrazin und DAPI gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, beispielsweise das Tragen von Handschuhen.

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