Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine ​​mit hydrophober Pigments

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, den Einbau von wasserunlöslichen Chlorophyllen in die Bindungsstellen wasserlöslicher Proteine zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht die Assemblierung von Chlorophyllen mit rekombinanten Proteinen, was eine gründliche Untersuchung der Chlorophyll-Protein-Wechselwirkungen ermöglicht und neue Möglichkeiten für die Konstruktion neuartiger Chlorophyll-Protein-Komplexe eröffnet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Proteine nicht markiert oder immobilisiert werden müssen.

Daher eignet es sich gut für Screening-Assays. Das Verfahren wird von Dominica Bednarczyk, einer Postdoktorandin in meiner Forschungsgruppe, demonstriert. Führen Sie bei der Herstellung der folgenden Stammlösungen alle Schritte der Chlorophyllvorbereitung unter einer chemischen Haube, bei grünem Licht oder im Dunkeln durch, um Lichtschäden zu minimieren.

Fügen Sie immer Stickstoff oder Argon hinzu, bevor Sie die Pigmente für die Lagerung einfrieren, und stellen Sie sicher, dass alle Lösungsmittel von analytischer Qualität sind. Wiegen Sie zu Beginn etwa fünf Gramm lyophilisierte Spirulina platensis-Zellen oder andere Cyanobakterienzellen, die nur Chlorophyll a oder Chlorophyll-a in Thylakoidmembranen enthalten, und verwenden Sie einen Mörser und einen Stößel, um sie zu zerkleinern. Der kritische Schritt während der Chlorophyllextraktion besteht darin, sicherzustellen, dass die Cyanobakterienzellen gründlich lyophilisiert werden und die vollständige Entfernung des Wassers aus der DEAE-Sepharose durch mehrere Wäschen mit Aceton sicherzustellen.

Laden Sie die zerkleinerten Zellen auf eine Glassäule und waschen Sie das Gewebe mit etwa 50-100 Millilitern 100%igem Aceton, um die Carotinoide zu entfernen. Entsorgen Sie nach dem Waschen die eluierte orange-grüne Fraktion. Die tatsächliche Farbe kann je nach Cyanobakterienkultur und Wachstumsbedingungen von orangegrün bis grün variieren.

Tauschen Sie das Aceton gegen 100%Methanol aus und sammeln Sie die chlorophyllhaltige Grünfraktion a. Wenn sich die Farbe der eluierten Fraktion von dunkelgrün zu blassgrün verfärbt, stoppen Sie die Elution. Als nächstes verdampfen Sie mit einem Rotationsverdampfer mit einem Wasserbad, das 30 Grad Celsius nicht überschreitet, das Methanol, bis der Extrakt vollständig trocken ist, und verwenden Sie dann ein kleines Volumen Diethylether, um die Pigmente aus den getrockneten Extrakten vollständig aufzulösen, und filtrieren Sie die Lösung durch Watte, wobei Sie zusätzliches kleines Volumen Ether verwenden, um Pigmente von der Watte zu waschen.

Verdampfen Sie den Diethylether, bis die Pigmente vollständig getrocknet sind. Wenn Sie an dieser Stelle aufhören, halten Sie die trockenen Pigmente unter Stickstoff oder Argon bei 20 Grad Celsius im Dunkeln bis zur Weiterverarbeitung. Um mit Chlorophyll fortzufahren, löst ein Präparat die trockenen Pigmente teilweise in dem kleinstmöglichen Volumen von 100%igem Aceton auf, dann fügen Sie der Suspension 4 Milliliter Aceton hinzu und schwenken Sie den Kolben, um die Pigmente vollständig aufzulösen.

Laden Sie die Probe mit einer Pasteurpipette vorsichtig auf eine DEAE-Sepharose-Säule, die in 100 % Aceton ausgeglichen ist, und eluieren Sie mit 100 % Aceton die Carotinoide. Verwenden Sie dann ein 3:1-Volumen-zu-Volumen-Aceton-Methanol-Gemisch, um das Chlorophyll a zu eluieren. Sie können eine Taschenlampe verwenden, um die Säule während der Elution kurz zu beleuchten, um die tatsächlichen Pigmentfarben zu beobachten.

Mit der Dünnschichtchromatographie wird die Reinheit des Chlorophylls anhand eines Volumen-zu-Volumen-Verhältnisses von Dichlormethan und Hexan von 68:25:5:2 überprüft, um die Probe zu eluieren. Anschließend wird das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer verdampft, bis das Chlorophyll a vollständig trocken ist. Zur Herstellung eines Chlorophylls löst man mit einer Stammlösung das trockene Chlorophyll a in 2-4 Millilitern 100%igem Methanol wieder auf.

Zur Herstellung der organischen Phase der Emulsion werden in einem 50-Milliliter-Röhrchen 0,2 Gramm Tween 80, 1,8 Gramm Span 80 und 38 Gramm Mineralöl gewogen. Die Komponenten gut vermischen und die Lösung zum Abkühlen auf Eis legen. Zur Herstellung einer wässrigen Phase, die gereinigtes wasserlösliches Chlorophyll-bindendes Protein (WSCP) enthält, züchten Sie E.coli BL21-Bakterien, die das WSCP-Gen enthalten, in 1 Liter LB-Medium bei 37 Grad Celsius auf eine OD600 von 0,3 bis 0,6.

Fügen Sie 1 Millimolar IPTG hinzu, um die Proteinexpression zu induzieren, und züchten Sie die Bakterien 12-16 Stunden lang bei 30 Grad Celsius, dann ernten Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 5000 G und 4 Grad Celsius für 10 Minuten. Mit einem für die Affinitätschromatographie geeigneten Puffer das Pellet auflösen, die Bakteriensuspension in kleinere Röhrchen überführen und auf Eis beschallen. Nach dem Abdrehen des Lysats reinigen Sie die rekombinanten markierten WSCP-Proteine mit dem entsprechenden kommerziell erhältlichen Affinitätschromatographiesystem für die Proteinreinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Bereiten Sie die wässrige Phase der Emulsion vor, indem Sie den Puffer gegen 50 Millimolare Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,8 austauschen und die gereinigte WSCP-Konzentration auf 0,5 bis 1 Milligramm pro Milliliter einstellen. Um eine wässrige Phase herzustellen, die rohes bakterielles Lysat mit WSCP enthält, züchten Sie E.coli BL21-Zellen, die ein Plasmid enthalten, das WSCP in 250 Millilitern LB bei 37 Grad Celsius exprimiert, um die logarithmische Phase zu erhalten. Fügen Sie 1 Millimolar IPTG hinzu, um die Proteinexpression zu induzieren, und züchten Sie die Bakterien über Nacht bei 30 Grad Celsius.

Am nächsten Tag, nach der Ernte, verwenden die Bakterienzellen 1-2 Milliliter 50 Millimolar Natriumphosphatpuffer pH 7,8, um das Pellet aufzulösen. Nach der Beschallung zentrifugieren Sie das Lysat dann 30 Minuten lang bei 12.000 g und 4 Grad Celsius. Die wässrige Phase der Emulsion wird durch Mischen von 0,125 Millilitern Überstand mit 0,875 Millilitern 50 Millimolar Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,8 hergestellt.

Um WSCP mit Chlorophyll a in Emulsion zusammenzusetzen, geben Sie 5 Milliliter eines gründlich gemischten Öl-Tensid-Gemisches in ein Glasfläschchen und kühlen Sie es auf Eis ab. Fügen Sie 1 Milliliter der gerade vorbereiteten eiskalten wässrigen Phase hinzu und verwenden Sie einen Gewebehomogenisator bei 9.500 U/min auf Eis für zwei Minuten, um beide Phasen zu mischen. Von diesem Zeitpunkt an führen Sie alle Schritte unter grünem Licht durch, um Lichtschäden zu minimieren, und fügen Sie der Emulsion 20 Mikroliter 25 millimolares Chlorophyll, eine Stammlösung, hinzu.

Dispergieren Sie durch Schnippen und Umdrehen des Glasfläschchens, wobei Sie sicherstellen, dass das Chlorophyll a gleichmäßig in der Emulsion verteilt ist, und inkubieren Sie dann 1-2 Stunden lang im Dunkeln auf Eis. Der entscheidende Schritt bei der Emulsionsvorbereitung besteht darin, sowohl die Wasserphase als auch die organische Phase vor dem Mischen abzukühlen. Um die Emulsion aufzubrechen und die Wassertröpfchen von der organischen Phase zu trennen, wird die Emulsion in 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 14.000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Entsorgen Sie die obere Ölphase und geben Sie 1 Milliliter Mineralöl in die untere Phase, dann durch Vortexen oder Umdrehen der Tube gut mischen. Nach dem Schleudern der Probe wird die obere Ölphase entfernt und die Zugabe von Mineralöl und Zentrifugation wiederholt, bis ein klarer Meniskus erreicht ist, der die wässrige und die Mineralölphase ohne Zwischenemulsion trennt. Geben Sie nun in die wässrige Phase 1 Milliliter wassergesättigten Diethylether.

Nachdem Sie die Probe vortext haben, schleudern Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 14.000 g herunter. Nach der dritten Zentrifugation in der Haube den Diethylether entfernen und die Röhrchen 5-20 Minuten offen lassen. Zum Schluss wird die wässrige Phase, die den WSCP-Chlorophyll-A-Komplex enthält, auf eine Entsalzungssäule geladen und mit einem für zukünftige Experimente geeigneten Puffer eluiert.

Lagern Sie die Probe bis zu einem Monat lang bei 4 Grad Celsius lichtgeschützt. Unter Verwendung des in diesem Video beschriebenen Protokolls wurden rekombinante WSCP-Apoproteine mit Chlorophyll a in Wasser- und Ölemulsionen assembliert. Hier sind die Absorptionen und CD-Spektren von Chlorophyll-a-Komplexen mit vier rekombinanten WSCP-Varianten dargestellt.

Die Ergebnisse ähneln in der bandförmigen Endlage den zuvor berichteten Spektren der jeweiligen nativen Komplexe. Diese Abbildung zeigt die positive Assemblierung von WSCP mit Chlorophyll a in Lysaten von WSCP-exprimierenden Zellen, wie sie an der grünen Farbe der wässrigen Phase zu sehen ist. Dieses Ergebnis zeigt das Potenzial von Wasser- und Ölemulsionen als schnelles Screening-System für die positive Assemblierung von WSCPs mit Chlorophyllen.

Wie hier gezeigt, weisen Tröpfchen von WSCP-haltigen Lysaten in konfokalen Mikroskopbildern eine ausgeprägte Chlorophyll-A-Fluoreszenz auf. Dies bedeutet, dass die erfolgreiche Assemblierung von WSCP-Chlorophyll-Komplexen direkt in den Wassertröpfchen nachgewiesen werden kann und eine Grundlage für wasser- und ölemulsionsbasierte Screening-Systeme bilden kann. Einmal gemeistert, kann diese Technik fünf Stunden lang durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass die Arbeit mit Chlorophyllen schnell erfolgen sollte, ohne Chlorophyll Licht und Sauerstoff auszusetzen. Nach ihrer Entwicklung ermöglichte uns diese Technik, eine breite Palette von wasserlöslichen Chlorophyll-bindenden Proteinen herzustellen, die verwendet werden, um den Einfluss der Proteinumgebung auf die elektrolytischen und spektralen Eigenschaften von Chlorophyllen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Chlorophylle aus Cyanobakterien extrahiert und reinigt und sie mithilfe von Wasser- und Ölemulsionen in wasserlöslichen Proteinen zusammenfügt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln wie Ether, Methanol oder Aceton schädlich sein kann und dass bei diesem Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Arbeiten in einer chemischen Haube.