Name: Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine mit hydrophober Pigments (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Montage wasserlöslicher Chlorophyll-bindender Proteine mit hydrophoben Pigmenten in Wasser-in-Öl-Emulsionen. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screenings ohne Protein-Tagging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DN dankt für die Unterstützung von EU - FP7 - Projekten PEPDIODE (GA 256672) und REGPOT-2012-2013-1 (GA 316157) und einer persönlichen Forschungsstipendium (Nr 268/10) von der Israel Science Foundation. Wir danken Prof. Shmuel Rubinstein, School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, Cambridge MA, USA für die konfokale Mikroskopie die Aufnahme von Bildern.

1. Vorbereiten Chl ein Stammlösungen <ol><li> Kritischste Schritt: Führen Sie alle Schritte des Chlorophylls Zubereitung in einer chemischen Haube, unter grünem Licht (520 nm) oder in der Dunkelheit, um Lichtschäden zu minimieren. Immer Stickstoff oder Argon hinzufügen, bevor die Pigmente für die Lagerung einfrieren. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungsmittel Analysequalität sind. </li><li> Man wiegt etwa 5 mg lyophilisiertes Spirulina platensis Zellen oder andere Cyanobakterium Zellen , die nur Chl a in Thylakoidmembran und zerquetschen sie mit einem Mörser zerstoßen. </li><li> Legen zerstoßenen Zellen auf eine Glassäule und wäscht mit etwa 50 bis 100 ml 100% Aceton, um Carotinoide zu entfernen. Entsorgen Sie die eluierte orange / grün Fraktion. Hinweis: Wenn das orangefarbene Fraktion nicht mit 100 ml Aceton weiter Waschen der Zellen mit Aceton, bis die grüne Fraktion eluiert wird, beginnt zu eluieren. </li><li> Austausch Aceton mit 100% Methanol und sammeln die grüne Fraktion , die Chl ein. Das Volumen des eluierten fractIon kann zwischen 50 bis 100 ml variieren. Am Anfang hat die eluierte Fraktion eine dunkelgrüne Farbe, die am Ende der Elution in hellgrün verändert. Wenn die Farbe der eluierten Fraktion in blass grün wird die Elution stoppen. </li><li> Man dampft das Methanol am Rotationsverdampfer, bis der Extrakt vollständig trocken ist. Wenden Sie keine Wärme an die Lösung; sicherzustellen, dass die Wasserbadtemperatur des Verdampfers nicht mehr als 30 ° C nicht übersteigt. Hinweis: Die Zeit der Verdampfung auf das Volumen des Methanolfraktion hängt verdampft und kann variieren zwischen 10-60 min. Es ist wichtig, den Extrakt vollständig trocknen. </li><li> Man löst die Pigmente aus dem getrockneten Extrakt in einem kleinen Volumen Diethylether (ca. 5-10 ml) und filtriere durch Watte. Stellen Sie sicher, dass Pigmente vollständig in Ether vor der Filterung gelöst sind. </li><li> Man dampft das Diethylether, bis die Pigmente vollständig trocken sind (10-30 min). Anmerkung: Die trockenen Pigmente mit gespült werden kann und gehalten unter Stickstoff oder Argon bei -2im Dunkeln 0 ° C bis zur Weiterverarbeitung. </li><li> Man löst die trockenen Pigmente in dem kleinsten Volumen möglich von 100% Methanol (ca. 1 ml), auch wenn nicht alles vollständig suspendiert. 4 ml Aceton zu der Lösung, und schlagen Sie das Glas vorsichtig, um vollständig die Pigmente auflösen. </li><li> Mit Hilfe einer Pasteur-Pipette, laden Sie die Probe vorsichtig auf eine Säule von DEAE-Sepharose in 100% Aceton ins Gleichgewicht gebracht. </li><li> Eluieren Carotinoide (ein orange-gelbes Band) mit 100% Aceton. Dann eluieren Chl a (grünes Band) mit 3: 1 v / v Aceton / Methanol - Gemisch. Hinweis: Das Volumen an Aceton und Aceton / Methanol-Gemisch auf das Volumen der DEAE entspricht etwa Sepharose auf die Säule geladen. </li><li> Überprüfen Chl eine Reinheit durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer 68: 25: 5: 2 Dichlormethan / n-Hexan / Isopropanol / Methanol (v / v) -Mischung als Eluierungsmittel 17. </li><li> Dampfe das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer , bis der Chl a vollständig trocken ist (10-60 min). Hinweis: Das trockene Chl a kann mit Stickstoff oder Argon gelagert und unter Argonatmosphäre bei -20 ° C im Dunkeln gespült werden. </li><li> Bereiten Sie Chl eine Stammlösung von 2-4 ml 100% Ethanol , um das trockene Chl a wieder aufzulösen. Hinweis: Der Extinktionskoeffizient von Chl a bei 663 nm beträgt 74.400 cm -1 M -1 (83,3 cm -1 (mg / ml) -1) in Ethanol. Eine typische Vorratslösung sollte eine OD von 1,860 haben, auf eine Konzentration von 25 mM (23 mg / ml) entspricht. Zugabe von 20 ul dieser Lager zu einer Emulsion , enthaltend 5 ml der organischen Phase, und 1 mg WSCP in 1 ml der wässrigen Phase führt zu einem Gemisch mit 10 - facher molarer Überschuß von Chl a vs. WSCP. </li></ol> 2. Herstellung von organischen Phase der Emulsion Anmerkung: Die organische Phase der Emulsion aus Mineralöl zusammengesetzt ist, das 4,5% (v / v) Span 80 und 0,4% (v / v) Tween 80. <ol><li> Wiegen in einem 50-ml-Röhrchen mit 0,2 g Tween 80, 1,8 g Span 80 und 38 g Mineralöl. Gut mischen alle Komponenten und abkühlen auf Eis. Anmerkung: Die organische Phase kann bis zu einer Woche in 4 ° C gelagert werden. </li></ol> 3. Herstellung der wässrigen Phase der Emulsion Anmerkung: Die wässrige Phase der Emulsion von entweder gereinigtem WSCP zusammengesetzt sein kann, oder Rohextrakt von Bakterien überexprimieren WSCP. <ol><li> Herstellung einer wässrigen Phase gereinigten WSCP enthält. <ol><li> Wachsen E.coli BL21 - Bakterien WSCP Plasmid 12 in 1 l LB - Medium bei 37 ° C bis zur OD von 0,3-0,6 enthält. </li><li> Induzieren die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG. Nach der Induktion wachsen Bakterien bei 30 ° C für 12 bis 16 Stunden. </li><li> Ernte Bakterien durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Man löst das Pellet in Bindungspuffer und beschallen auf Eis (30 sec auf 15 sec ab, fünf Mal). Verwenden 10 ml Puffer für das erhaltene Pellet aus der Zentrifugation von 250 mlLB-Medium mit Zellen, die das Protein überexprimieren. Hinweis: Je nach Reinigungsverfahren kann die Bindungspuffer aus 100 mM Phosphatpuffer bestehen, pH 7,2 oder 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA. </li><li> Drehen, um die Zell-Lysats bei 12.000 xg für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Reinige WSCP durch Affinitätschromatographie. Je nach dem Tag zu WSCP fusioniert, reinigen rekombinante Proteine ​​die geeignete im Handel erhältliche Affinitätschromatographie System zur Proteinreinigung folgende Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li><li> Zur Emulsionsherstellung Verwenden gereinigter WSCP in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,8. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Proteinmenge zur Rekonstitution verwendet wird, ist 0,5 bis 1,0 mg pro 1 ml Puffer. </li></ol></li><li> Herstellung einer wässrigen Phase rohen Bakterienlysats mit WSCP enthält. <ol><li> Wachsen E.coli BL21 Zellen enthaltende Plasmid-exprimierenden WSCP in 250 ml LB - Medium bei 37 ° C bis zur OD 0,3-0,6. </li><li> Induce Proteinexpression mit1 mM IPTG und Bakterien wachsen über Nacht bei 30 ° C. </li><li> Erntebakterienzellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Auflösen des Pellets in 1-2 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,8, Sonikat (30 sec auf 15 sec ausgeschaltet, dreimal) und Zentrifuge bei 12.000 xg für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Vorbereitung der wässrigen Phase der Emulsion von 0,125 ml Überstand Mischen mit 0,875 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,8. </li></ol></li></ol> 4. Montage von WSCP mit Chl a in Emulsion <ol><li> Transfer 5 ml Öl-Tensid-Mischung in einen Glaskolben und zu kühlen es auf Eis. Vor dem Pipettieren, sicherzustellen, dass alle Komponenten der organischen Phase werden gründlich gemischt, und es gibt keine Phasentrennung zwischen Tenside und Mineralöl. </li><li> 1 ml eiskaltem wässrige Phase hergestellt, wie in Abschnitt 3 bis 5 ml der organischen Phase. </li><li> Das Vermischen der beiden Phasen ein Gewebe-Homogenisator für 2 min bei 9.500 Umdrehungen pro Minute auf Eis verwenden.</li><li> Kritischste Schritt: Von diesem Zeitpunkt an, führen alle weiteren Schritte unter grünem Licht (520 nm), um Lichtschäden zu minimieren. In 20 ul 25 mM Chl eine Stammlösung zu der Emulsion (Abschnitt 1.13 sehen). Disperse durch Ausklopfen und Umkehren der Glasfläschchen. Stellen Sie sicher, dass die Chl gleichmäßig in der Emulsion verteilt wird. </li><li> Inkubieren Sie die Emulsion für 1-2 h auf Eis im Dunkeln. </li><li> Um die Emulsion und einem separaten Wassertröpfchen aus der organischen Phase übertragen, die Emulsion zu 1,5 ml Kunststoffröhrchen und Zentrifuge für 5 Minuten bei Raumtemperatur bei 14.000 xg abzubauen. Hinweis: Falls die Montage erfolgreich ist, sollte die untere wässrige Phase, die eine grüne Farbe haben. </li><li> Entsorgen Sie die obere Ölphase und 1 ml Mineralöl. Gut mischen das Mineralöl mit der pelle Emulsion durch Wirbel oder durch das Rohr gründlich Spiegeln. Spin down die Probe bei 14.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis eine klare Meniskus Abtrennen der wässrigen und Bergmannal Ölphasen, ohne Zwischen Emulsion erhalten. </li><li> Führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Haube. Nachdem die wässrige und Mineralöl Phasen deutlich voneinander getrennt sind, Mineralöl zu entfernen, und 1 ml Wasser-gesättigtem Diethylether hinzu. Vortex und Spin der Probe bei 14.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur nach unten. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> die Diethylether Nach der zweiten Zentrifugation, zu entfernen und die Röhrchen für 5-20 min in der Haube offen lassen. </li><li> Schließlich laden die wässrige Phase , die die WSCP / Chl einen Komplex auf eine Entsalzungssäule und Eluieren mit Puffer geeignet für weitere Experimente enthält. Hinweis: Das Protein in Phosphat- und Tris-Puffer in einem breiten Bereich von pH-stabil ist, (6,0-7,5). Die Probe kann bis zu einem Monat vor Licht geschützt bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol>

<ol><li>Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+photosynthesis+and+phototrophy+illuminated%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated.</a> Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).</li>
<li>Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+the+difference+in+absorbance+spectra+for+the+FMO+antenna+protein+from+various+green+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth.+Res%22%5BJournal%5D)">The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria.</a> Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).</li>
<li>Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+native+and+refolded+peridinin-chlorophyll-proteins+from+dinoflagellates%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).</li>
<li>Renger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+soluble+chlorophyll+binding+protein+of+higher+plants%3A+a+most+suitable+model+system+for+basic+analyses+of+pigment-pigment+and+pigment-protein+interactions+in+chlorophyll+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes.</a> J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).</li>
<li>Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+in+Brassicaceae+plants+is+a+stress-induced+chlorophyll-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein.</a> Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).</li>
<li>Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+%28WSCP%29+of+Arabidopsis+is+expressed+in+the+gynoecium+and+developing+silique%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique.</a> Planta. 236, 251-259 (2012).</li>
<li>Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+water+soluble+chlorophyll-binding+protein+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants.</a> J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).</li>
<li>Horigome, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+and+photoprotective+function+of+water-soluble+chlorophyll-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).</li>
<li>Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Role+of+Water-Soluble+Chlorophyll+Proteins+in+the+Transitory+Storage+of+Chorophyllide%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide.</a> Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).</li>
<li>Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll+protein%2C+a+putative+carrier+of+chlorophyll+molecules+in+cauliflower%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower.</a> J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).</li>
<li>Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+water-soluble+chlorophyll+protein+from+Brassica+oleracea+var.+Botrys+binds+various+chlorophyll+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives.</a> Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).</li>
<li>Takahashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+characterization+and+analysis+of+the+intracellular+localization+of+a+water-soluble+Chl-binding+protein+from+Brussels+sprouts+%28Brassica+oleracea+var.+gemmifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera).</a> Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).</li>
<li>Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll-binding+protein+from+Japanese+wild+radish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish.</a> J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).</li>
<li>Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+is+involved+in+herbivore+resistance+activation+during+greening+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).</li>
<li>Hughes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magneto-optic+spectroscopy+of+a+protein+tetramer+binding+two+exciton-coupled+chlorophylls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).</li>
<li>Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+water-soluble+chlorophyll-binding+proteins+with+native+hydrophobic+chlorophylls+in+water-in-oil+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions.</a> BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).</li>
<li>Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stereospecific+interaction+between+chlorophylls+and+chlorophyllase.+Possible+implication+for+chlorophyll+biosynthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation.</a> J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).</li>
<li>Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+properties+and+a+possible+function+of+a+water-soluble+chlorophyll+a%2Fb-protein+from+brussels+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts.</a> Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).</li>
<li>Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+water-soluble+chlorophyll-proteins+from+Lepidium+virginicum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum.</a> Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Unser Ziel war es, ein neues allgemeines System für die Montage von wasserlöslichen Chlorophylls-bindende Proteine ​​mit hydrophoben Pigmente zu entwickeln. Hier wird gezeigt , dass das neue Rekonstitution System auf Basis von W / O - Emulsion ein allgemeiner Ansatz ist erwiesen , für die Montage von WSCP Apoproteine ​​von Rosenkohl, Blumenkohl, japanischer Meerrettich und Virginia pepperweed rekombinant in E. ausgedrückt arbeiten coli. Hier werden Ergebnisse aus der Rekonstitution von 1 mg WSCP mit 10...

Hydrophobe Pigmente wie Chlorophylle (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) und Carotinoide sind die primären Cofaktoren in photosynthetischen Reaktionszentren und Lichtsammelproteine, die den Elektronentransport durchzuführen, und Lichtenergie Erfassung und Übertragung. Die Reaktionszentren und die meisten der Chl-bindenden Lichtsammelkomplexe sind Transmembranproteine. Die Fenna-Matthews-Olson (FMO) Protein von nicht-oxygenic photo grün-Schwefelbakterien 1,2 und die Peridinin-Chl Protein (PCP) von Dinoflagellaten 3 sind außergewöhnliche Beispiele von wasserlöslichen Lichtsammelproteine. Die wasserlöslichen Chlorophyll - bindenden Proteinen (WSCPs) von Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae und Amaranthaceae Pflanzen 4, 5 sind ein weiteres einzigartiges Beispiel, aber im Gegensatz zu FMO und PCP, sind diese weder in einem Licht Ernte noch in einem der primären photosynthetischen Reaktions und ihre genaue PHYphysiologischen Funktionen sind noch unklar 5-8. Ihre hohe Chl-Bindungsaffinität haben zu einem empfohlenen Funktion führte als vorübergehende Träger von Chls und Chl Derivate 9,10. Alternativ wurde die Hypothese aufgestellt , dass WSCP spielt eine Rolle bei Spülung Chls in geschädigten Zellen und schützt vor Chl-induzierten Photooxidationsschäden 7,11-13. In jüngerer Zeit wurde gezeigt , dass WSCP Funktionen als Protease - Inhibitor vorgeschlagen und spielt während der Blütenentwicklung 14 eine Rolle bei der Pflanzenfresser Widerstand als auch reguliert Zelltod. WSCPs werden in zwei Hauptklassen aufgeteilt, den photophysikalischen Eigenschaften auf. Die erste Klasse (Klasse I, z. B. von Chenopodium album) kann Photokonversion bei Beleuchtung unterziehen. Klasse II WSCPs von Brassica - Pflanzen , die durchlaufen nicht fotovoltaischen 5,10, sind weiter in der Klasse IIa unterteilt (z. B. von Brassica oleracea, Raphanus sativus) und IIb (z. B. von Lepidium virginicum </em&gt;). Die Struktur der Klasse IIb WSCP von Lepidium virginicum 8 wurde durch Röntgenkristallographie bei 2,0 Å Auflösung gelöst. Es zeigt eine symmetrische Homotetramers, in dem die Protein-Untereinheiten einen hydrophoben Kern bilden. Jede Untereinheit bindet ein einzelnes Chl, die in einer engen Anordnung Ergebnisse von vier dicht gepackten Chls innerhalb der core.This einfach alle Chl Anordnung WSCPs ein potentiell nützliches Modellsystem zur Untersuchung der Bindung und Montage von Chl-Protein-Komplexe bildet, und die Auswirkungen der benachbarten Chls und Protein-Umgebungen auf die spektralen und elektronischen Eigenschaften einzelner Chls. Darüber hinaus kann es Vorlagen bieten für die Konstruktion künstlicher Chl-bindende Proteine, die für die lichtsammelnden Module in künstlichen Photosynthese-Geräten verwendet werden kann. Rigorose Studien von nativen WSCPs sind nicht durchführbar , da die Komplexe aus Pflanzen gereinigt immer ein heterogenes Gemisch von Tetrameren mit verschiedenen Kombinationen von Chl a enthaltenund Chl b 9. Somit wird ein Verfahren zur rekombinant exprimierten WSCPs mit Chls in vitro Zusammenbauen erforderlich. Dies wird durch die vernachlässigbare Wasserlöslichkeit Chls herausgefordert , die es unmöglich macht , den Komplex in vitro zusammenzubauen , indem einfach die wasserlöslichen Apoproteine ​​mit Pigmenten in wässrigen Lösungen vermischt wird . In vitro Montage durch die Apoproteine ​​mit Thylakoidmembranen Vermischen von 15 gezeigt wurde, aber dieses Verfahren ist mit dem nativen Chls in den thylakoids begrenzt. Schmidt et al. berichtete über mehrere Chl und BChl - Derivate mit WSCP von Blumenkohl (CaWSCP) Montage von rekombinant ein Histidin-markierten Protein in E. exprimieren coli Immobilisierung es auf eine Ni-Affinitätssäule und in Detergenzien 11 Chl Derivate solubilisiert einzuführen. Erfolgreich Rekonstitution von rekombinantem WSCPs von A. thaliana 6 und Rosenkohl (BoWSCP), Japanisch Hederich (RshWSCP) eind Virginia pepperweed (LvWSCP) durch ein ähnliches Verfahren wurden ebenfalls berichtet. Hier stellen wir eine neue, allgemeine, einfache Methode zur Chls mit WSCP Montage, die nicht Tagging erfordert oder die Immobilisierung von Proteinen. Es stützt sich auf Emulsionen aus ihren wäßrigen Lösungen der wasserlöslichen Apoproteine ​​in Mineralöl vor. Die Proteine ​​werden daher in Wasser-in-Öl (W / O) Mikrotröpfchen mit sehr hohen Oberflächen - Volumen - Verhältnis 16 eingekapselt. Die hydrophoben Cofaktoren werden dann in dem Öl gelöst und leicht in den Tröpfchen aus Ölphase eingeführt. Wir berichten über die Verwendung der Methode für Apoproteine ​​von mehreren Varianten von WSCP Montage rekombinant in E. ausgedrückt coli mit Chl a. Wir veranschaulichen die Anordnung aus rohem Lysat von WSCP-überexprimierenden Bakterien, die für die Entwicklung neuer Bindeproteine ​​Chl als Screeningsystem verwendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Span80</td><td>Sigma</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Scale Mini Profinity eXact Kartuschen</td><td>Bio Rad</td><td>10011164</td><td>Affinitätschromatographie für die WSCP-Aufreinigung mit nativer Sequenz.</td></tr><tr><td>His Trap HF-Säule</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5248-02</td><td>Affinitätschromatographie für die WSCP-Aufreinigung mit His-Tag</td></tr><tr><td>DEAE Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-0709-01</td><td>Chromatographiemedium für die Chlorophyllaufreinigung</td></tr></tbody></table>

wasser in Öl-emulsionen: ein neues system für die montage wasserlösliche chlorophyll-bindenden proteine ​​mit hydrophober pigments

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylle (Chls) und bacteriochlorophylls (BChls) sind die primären Cofaktoren, die photosynthetischen Lichtnutzung und Elektronentransport durchzuführen. Ihre Funktionalität hängt entscheidend von ihrer spezifischen Organisation in großen und aufwendigen Multiuntertransmembranprotein-Komplexe. Um auf molekularer Ebene zu verstehen, wie diese Komplexe Umwandlung von Solarenergie zu erleichtern, ist es wesentlich, Protein-Pigment, und das Pigment-Pigment-Wechselwirkungen und ihre Wirkung auf die angeregten Dynamik zu verstehen. Eine Möglichkeit, ein solches Verständnis zu gewinnen, ist durch die Konstruktion und Komplexe von Chls mit einfachen wasserlöslichen rekombinanten Proteinen zu studieren. Jedoch ist die lipophile Chls und BChls in wasserlösliche Proteine ​​enthält schwierig. Darüber hinaus gibt es kein allgemeines Verfahren, das für die Montage von wasserlöslichen Proteinen mit hydrophoben Pigmente verwendet werden könnten. Hier zeigen wir ein einfaches und hohen Systemdurchsatz auf Basis von Wasser-in-Öl-Emulsionen, die Esel ermöglichtembly von wasserlöslichen Proteinen mit hydrophoben Chls. Das neue Verfahren wurde durch Zusammenfügen von rekombinanten Versionen des wasserlöslichen Chlorophylls Bindungsprotein von Brassicaceae Pflanzen (WSCP) mit Chl validierten einem. Wir zeigen die erfolgreiche Montage von Chl a mit rohen Lysaten von WSCP E. exprimieren coli - Zelle, die für die Entwicklung eines genetischen Siebsystem für neue wasserlösliche Chl-Bindungsproteine ​​verwendet werden können, und für Studien der Chl-Protein - Wechselwirkungen und Montageprozessen.

Rekombinante WSCP Apoproteine ​​wurden in W / O - Emulsionen gemäß dem Protokoll mit Chl a montiert in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben. Das Protokoll wurde unter Verwendung von wässrigen Phasen umgesetzt entweder reine WSCPs enthält, oder Lysaten von E. coli - Zellen überexprimieren WSCP (Abbildung 1). Das Protokoll ist einfach, schnell und erfordert keine spezielle Ausrüstung, außer einem Gewebe-Homogenisator. <p class="jove_content" fo:ke...

Diese Handschrift beschreibt eine einfache und Hochdurchsatzverfahren für wasserlösliche Proteine ​​mit hydrophoben Pigmente Zusammenbauen, die auf Wasser-in-Öl-Emulsionen basiert. Wir zeigen die Wirksamkeit des Verfahrens bei der Montage von nativen Chlorophylle mit vier Varianten von rekombinantem wasserlösliches Chlorophyll-Bindungsproteine ​​(WSCPs) von Brassica - Pflanzen in E. ausgedrückt coli.

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine ​​mit hydrophober Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, die Einbindung wasserunlöslicher Chlorophylle in die Bindungsstellen wasserlöslicher Proteine zu ermöglichen. Diese Methode erlaubt die Assemblierung von Chlorophyllen mit rekombinanten Proteinen, was umfassende Untersuchungen der Chlorophyll-Protein-Wechselwirkungen ermöglicht und neue Möglichkeiten für die Konstruktion neuartiger Chlorophyll-Protein-Komplexe eröffnet. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass keine Markierung oder Immobilisierung der Proteine erforderlich ist.Daher eignet es sich gut für Screening-Assays. Die Durchführung des Verfahrens wird Dominica Bednarczyk, eine Postdoktorandin in meiner Forschungsgruppe, demonstrieren. Während der Vorbereitung der folgenden Stammlösungen müssen alle Schritte zur Chlorophyllpräparation unter einer chemischen Abzugshaube unter grünem Licht oder im Dunkeln durchgeführt werden, um photochemische Schäden zu minimieren.Geben Sie vor dem Einfrieren der Pigmente zur Lagerung stets Stickstoff oder Argon hinzu und stellen Sie sicher, dass alle Lösungsmittel analytischer Reinheit sind. Beginnen Sie damit, etwa fünf Gramm lyophilisierte Spirulina platensis-Zellen oder andere

water-oil-emulsions-new-system-for-assembling-water-soluble

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Lichtsammelkomplexen in vitro. Diese integralen Membranproteine koordinieren Chlorophylle und Carotinoide und sind für die Lichternte in höheren Pflanzen und Grünalgen verantwortlich.

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

Organische Farbstoffmoleküle und ölsäurebeschichtete Upconverting-Nanopartikel sind nicht wasserlöslich. Dieses Protokoll beschreibt eine "Plug-and-Play"-Methode, die den Transfer von organischen Farbstoffmolekülen und die Umwandlung von Partikeln von ihrem ursprünglichen hydrophoben Lösungsmittel in Wasser ermöglicht.

A &#39;Plug and Play&#39; Methode, um Wasser dispergierbare Nanoanordnungen mit einem Gehalt eines amphiphilen Polymers, organische Farbstoffe und Hochskalierungs-Nanopartikel erstellen

Dieser Artikel berichtet über praktische Methoden zur Herstellung von Hydrogelen in freistehenden Filmen und imprägnierten Membranen und zur Charakterisierung ihrer physikalischen Eigenschaften, einschließlich der Wassertransporteigenschaften.

Synthese von Hydrogelen mit Antifouling-Eigenschaften als Membranen für die Wasserreinigung

Dieses Protokoll beschreibt ein klinisch einsetzbaren Mittel zur Auflösung von hydrophober Verbindungen in einer wässrigen Umgebung unter Verwendung von Kombinationen der Peptide und Aminosäuren-Lösungen selbst zusammenstellen. Unsere Methode löst eine große Einschränkung hydrophobe Therapeutika, die sichere und effiziente Mittel zur Löslichkeit und Lieferung Methoden in klinischen Einrichtungen fehlen.

Löslichkeit von hydrophoben Verbindungen in wässriger Lösung unter Verwendung von Kombinationen der Montage selbst Peptide und Aminosäuren

Hier präsentieren wir zwei ultraschnelle Protokolle zur Rekonstitution von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes und Verschmelzung von solchen Proteoliposomes mit Ziel Lipid Bilayer für Waschmittel-freie Lieferung dieser Membran Proteine in der postfusion Bilayer. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht schnelle und leichtführig Montage von komplexen Mehrkomponenten Membransystemen.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Fucoxanthin Chlorophyll a/c-bindende Proteine (FCP) von Kieselalgen zu isolieren und integrieren sie in Liposomen mit natürlichen Lipid Kompositionen Erregung Energieübertragung auf Ionen-Zusammensetzung Änderungen zu studieren.

Isolieren und die Einbeziehung von Licht-ernten Antennen von Diatomee Cyclotella Meneghiniana in Liposomen mit Thylakoidmembran Lipide

An der Schnittstelle von organischen und wässrigen Lösungsmitteln fügen sich maßgeschneiderte amphiphile Elastin-ähnliche Proteine zu komplexen supramolekularen Strukturen wie Vesikeln, Fasern und Koacervaten zusammen, die durch Umweltparameter ausgelöst werden. Die beschriebenen Montageprotokolle ergeben Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) mit abstimmbaren Eigenschaften, die die Verkapselung verschiedener Ladungen ermöglichen.

Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Wir berichten über ein Protokoll zur Herstellung einer Hybrid-Lipidmembran an der Wasser-Luft-Schnittstelle, indem wir die Lipid-Doppelschicht mit Kupfer (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-Phthalocyanin (CuPc) Molekülen dopen. Die resultierende Hybrid-Lipidmembran hat eine Lipid/CuPc/Lipid-Sandwichstruktur. Dieses Protokoll kann auch auf die Bildung anderer funktioneller Nanomaterialien angewendet werden.

Selbstmontage von Hybrid-Lipidmembranen, dotiert mit hydrophoben organischen Molekülen an der Wasser-Luft-Schnittstelle

Öle, die für die Verabreichung von Medikamenten verwendet werden, können das Lipidprofil von Patienten stören, was bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen unerwünscht ist. Omega-3-Fettsäuren-reiche Öle sind eine gesunde Alternative zu herkömmlichen Ölen und haben ein enormes Potenzial für selbstemulgierte Drug-Delivery-Systeme.

Selbst-Nanoemulgierung von gesunden Ölen zur Verbesserung der Löslichkeit lipophiler Arzneimittel

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), eine mikrofluidische Technik zur Erzeugung biokompatibler Liposomen. OLA produziert monodisperse, mikrometergroße Liposomen mit effizienter Verkapselung, die sofortige On-Chip-Experimente ermöglichen. Dieses Protokoll soll sich besonders für die synthetische Biologie und die synthetische Zellforschung eignen.

On-Chip-Oktanol-gestützte Liposomen-Assemblierung für die Biotechnologie

Dieses Protokoll beschreibt das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das beim Aufbau synthetischer Zellen verwendet wird. Es skizziert Schlüsselphasen mit repräsentativen Ergebnissen in verschiedenen Mikrokompartimenten. Das Protokoll zielt darauf ab, Best Practices für verschiedene Labore in der synthetischen Zellgemeinschaft zu etablieren und den Fortschritt in der Entwicklung synthetischer Zellen voranzutreiben.

Zellfreies Proteinsynthesesystem für den Aufbau synthetischer Zellen

Erfahren Sie die Montage wasserlöslicher Chlorophyll-bindender Proteine mit hydrophoben Pigmenten in Wasser-in-Öl-Emulsionen. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screenings ohne Protein-Tagging.

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine ​​mit hydrophober Pigments (Video) | JoVE Journal

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine ​​mit hydrophober Pigments

Weitere Videos entdecken

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine mit hydrophober Pigments