Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, Veränderungen in der Migrationskapazität von mesenchymalen Stromazellen der Lunge nach Schädigung mit löslichem Zigarettenrauchextrakt zu erkennen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen auf dem Gebiet der regenerativen Lungenbiologie zu beantworten, einschließlich der Frage, wie die Migrationskapazität von Lungenvorläuferzellen verbessert werden kann, um die Lungenreparatur zu unterstützen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie optimiert wurde, um bessere quantitative Messungen für die Zellmigration zu liefern und gleichzeitig wirtschaftlich durchzuführen und einfach anzupassen.

In dieser Demonstration wird der Scratch-Assay verwendet, um die Migrationskapazität von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) der Lunge von Mäusen zu quantifizieren. Nach Exposition gegenüber löslichem Zigarettenrauchextrakt werden die MSCs in vollständigen Medien auf 60-Millimeter-Platten gezüchtet und beschädigt, wie im Protokolltext beschrieben. Eine geeignete Konfluenz ist für den Scratch-Assay wichtig, da sie sicherstellt, dass die Bildgebungssoftware die Grenzen des Scratchs korrekt identifizieren kann.

Dieses Beispiel zeigt MSCs mit einer Konfluenz von 95 %, die für das Scratchen in einer sterilen Umgebung geeignet sind. Entfernen Sie den Deckel von einer Platte mit beschädigten MSCs und legen Sie eine gerade Kante, z. B. ein sterilisiertes Kunststofflineal, über den oberen Rand der Platte. Eine gerade Kante minimiert die Anzahl der Rotationseinstellungen, die für die Platte erforderlich sind, wenn sie später zur Bildgebung auf den Mikroskoptisch gestellt wird.

Ohne das Medium zu entfernen, verwenden Sie eine sterile 200-Mikroliter-Pipettenspitze, die von der sterilen geraden Kante geführt wird, um vier parallele Kratzer über die Platte zu machen, die etwa fünf Millimeter voneinander entfernt und 50 Millimeter lang sind. Die Erzeugung mehrerer Kratzer auf einer 60-Millimeter-Platte verändert die Mikroumgebung nicht in einer Weise, die die Zellmigration für MSCs beeinflusst, kann aber für andere Zelltypen eine Überlegung sein. Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Platte vorsichtig mit zwei Millilitern vorgewärmtem Komplettmedium.

Dadurch wird verhindert, dass Zellen an der Mitte des Kratzers haften bleiben und Zellen entfernt, die sich durch das Kratzen gelöst haben. Ersetzen Sie es durch vier Milliliter frisches vollständiges Medium mit einem sterilen Permanentmarker-Etikett und kratzen Sie jeden Kratzer von eins bis vier auf der Unterseite der Platte an Stellen, die die Bildgebung nicht beeinträchtigen. Die Scratches-Erstabbilder jedes Scratches müssen aufgenommen werden, da es wichtig ist, dass Bilder vom selben Scratch vor und nach der Migration verglichen werden, da es zu Abweichungen in der Scratch-Breite kommen kann.

Wenn der Scratch-Assay auf mehreren Platten durchgeführt wird, wird empfohlen, erste Bilder aller Kratzer auf einer einzigen Platte zu machen, bevor Kratzer auf der nächsten Platte gemacht werden. Verwenden Sie ein inverses Phasenkontrastmikroskop mit einer Kamera, um die für die Analyse benötigten Bilder aufzunehmen. Positionieren Sie die Kulturplatte auf dem Mikroskop und verwenden Sie das Objektiv mit geringem Stromverbrauch, um Kratzer zu lokalisieren.

Nummer eins. Es ist zwingend erforderlich, dass der Kratzer auf dem Bildschirm vollständig horizontal erscheint, während der Kratzer vollständig horizontal und in der Mitte des Sichtfelds gehalten wird, um so viele Bilder wie nötig zu erhalten, um 90 % der Länge des Kratzers einzudecken. Rufen Sie Bilder aus unterschiedlichen Teilen des Scratchs ab, ohne dass sich die Bilder überlappen.

Nehmen Sie keine Bilder von den ersten und letzten 5 % der Länge des Kratzers auf, da die Lichtbrechung an den Rändern der Kulturschale die Bilder überbelichtet und so eine Analyse unmöglich macht. Speichern Sie Bilder von Grund auf, Nummer eins in einem Ordner. Rufen Sie Bilder für die Scratcher zwei, drei und vier auf die gleiche Weise ab und speichern Sie Bilder von jedem Scratch in einem separaten Ordner.

Bringen Sie die Platten sofort nach dieser ersten Bildgebung wieder in den Inkubator zurück. Lassen Sie die Zellen vier bis sieben Stunden lang wandern, bevor Sie mit diesem Assay beginnen. Laden Sie die Image J-Software herunter und installieren Sie das Plugin für das Wundheilungstool.

Öffnen Sie die Bilddatei in Bild J und klicken Sie dann auf "Verarbeiten und Kanten suchen", um die Zellen um den Kratzer herum für das Wundheilungswerkzeug hervorzuheben. Um den Scratch-Bereich zu berechnen, klicken Sie auf Bildanpassung und Farbschwellenwert und ändern Sie im Dropdown-Menü mit der Bezeichnung Schwellenwertfarbe den Wert in BNW innerhalb des Menüs Farbschwellenwert. Verschieben Sie den unteren Schieberegler ganz nach rechts, um das Bild vollständig schwarz zu machen, und passen Sie dann den oberen Schieberegler an, um den maximalen Kontrast zwischen dem Kratzer und der Zellvorderseite zu erzeugen.

Stellen Sie den oberen Helligkeitsregler langsam von links nach rechts ein, bis das Bild die Kontur des Kratzers sauber anzeigt. Nachdem Sie die Kanten des Kratzers identifiziert haben, klicken Sie auf Weitere Werkzeuge. Wählen Sie in der Symbolleiste von Bild J aus dem Dropdown-Menü das MRT-Wundheilungswerkzeug aus und drücken Sie die M-Taste, um den Kratzbereich zu markieren und den berechneten Bereich auszugeben.

Kopieren Sie in einem Ergebnis-Popup-Fenster alle Zahlen aus dem Ergebnisfenster und fügen Sie sie in eine Excel-Tabelle ein. Achten Sie darauf, die Daten von den einzelnen Kratzern zu trennen. Nachdem die Zellen vier bis sieben Stunden lang migriert sind, wiederholen Sie den Bildaufnahmevorgang für die Kratzer, die die Platten in der gleichen Reihenfolge abbilden, in der sie zerkratzt wurden, so dass die Zellen auf jeder Platte die gleiche Zeit zum Wandern hatten.

Die Zellen können zu mehreren Zeitpunkten abgebildet werden, abhängig von ihrer Empfindlichkeit gegenüber Temperatur- und pH-Änderungen. Die endgültigen Scratch-Bilder werden dann mit Image J auf die gleiche Weise analysiert, wie es für die ersten Scratch-Bilder gezeigt wird. Scratch-Bereiche können auch berechnet werden, um die Migration zu quantifizieren, richtig.

Die Konfluenz ist entscheidend für den Erfolg des Scratch-Assays. Ein erfolgreiches Scratchen von murinen Lungen-MSCs bei 95%-Konfluenz ist hier dargestellt. Im Gegensatz dazu ist eine Konfluenz von 70 % zu niedrig für einen erfolgreichen Scratch und kann falsche Grenzen erzeugen.

Dabei handelt es sich um repräsentative Originalbilder vor und nach der Migration mit entsprechenden Scratch-Area-Grenzen, wie sie von der Imaging-Software definiert werden. Diese Diagramme zeigen die durchschnittliche berechnete Kratzfläche in Pixeln für jeden der vier Kratzer, die auf einer Platte mit murinen Lungen-MSCs bei einer Konfluenz von 95 % entweder vor oder nach der Migration mit einer Exposition gegenüber 0 % oder 4 % Zigarettenrauchextrakt gemacht wurden. Ein Vergleich der berechneten durchschnittlichen Veränderung der Kratzfläche ergab eine geringere Migration von muriner Lungen-MSC nach Exposition gegenüber 4%igem Zigarettenrauchextrakt.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellkonfluenz für den jeweiligen Zelltyp, mit dem wir arbeiten, zu optimieren und sorgfältig zu überwachen, und die Generierung der Kratzer zu üben, um sicherzustellen, dass sie so gleichmäßig wie möglich sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu Veränderungen und Proteinexpression zu beantworten, die die Zellmigration beeinflussen können.