Name: Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie den Scratch-Assay optimieren, um Veränderungen der Zellmigration muriner mesenchymaler Stromazellen nach Schädigung durch löslichen Zigarettenrauchextrakt quantitativ zu erfassen.

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Wir danken den anderen Mitgliedern des Labors für ihre technische Unterstützung bei der Entwicklung des CSE-Schadensassays und ihre Unterstützung und Beratung während der Entwicklung dieses Assays. Darüber hinaus danken wir dem Holy Cross Fenwick Scholar Committee für die Unterstützung von Nicholas Cormier und dem Holy Cross College Honors Program für die Unterstützung von Alexander Yeo.

Hinweis: Für diese Studie Lungen mesenchymale Stromazellen (LR-MSCs) vom distalen Lungengewebe isoliert wurden entweder auf der Grundlage ihrer Expression von Zelloberflächenmarker (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 hoch, EpCAM neg) 14,15, mit Explantation out-Wachstum 16, oder unter Verwendung von enzymatischen Abbau 17. Haft LR-MSCs wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt und kein Glutamin, 15% FBS, 1x Antibiotikum / Antimykotikum, und 2 mM Glutamin (nachstehend vollständige Medien) und bei 37 ° C, 5% CO 2 inkubiert. LR-MSCs wurden 3-4 mal passagiert, um eine Population von Zellen mit relativ homogenen Wachstumseigenschaften für den Migrationstest sicherzustellen. 1. Vorbereiten einer konfluenten Monolayer <ol><li> Um MSCs von Standard-100 mm Kulturschalen zu lösen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml 37 ° C vorgewärmten PBS, saugen Sie den PBS und fügen Sie 4 ml Trypsin (0,25%). Inkubieren 3-5 min in einem 37 ° C Inkubator. Saugen Sie das cells in eine konische Röhre fügen gleichen Volumen von komplettem Medium und Zentrifugation bei 300 g für 5 Minuten, um die Zellen zu pelletieren gelassen. Hinweis: Längere Inkubation in Trypsin kann die Zelloberflächenrezeptoren verändern und möglicherweise beeinflussen Migration. </li><li> Saugen Sie Medien und resuspendieren Zellen in frischem Vollmedium. Zählen von Zellen, ohne toten Zellen mit Trypanblau-Ausschluss und Platte 500.000 mesenchymalen Stromazellen in 4 ml komplettem Medium auf einer 60 mm Zellkulturschale. Anmerkung: Abhängig von der Quelle der Zellen, können die Tests erforderlich sein, um die optimale Anzahl der benötigten Zellen zu bestimmen. </li><li> Inkubieren Zellen bis Platten sind 90% konfluent für eine optimale Zellhaftung und Proliferation, in der Regel 48 bis 72 Stunden für MSCs. Hinweis: 100% Zusammenfluss ist nicht zu empfehlen, da viele verankerungsabhängigen Zellen Erfahrung Kontakthemmung, die ihre Migrationsfähigkeit verändern können. Platten mit weniger als 80% Konfluenz in unbrauchbare Fotos führen, da der Bildanalyse-Software wird Spalt interpretierens zwischen den Zellen als Teil des Umfangs des Kratzers (siehe Figur 1D). </li><li> Nachdem die Zellen 90% Konfluenz erreicht, schädigen die Zellen gegebenenfalls für die Anwendung. Um Zellschäden nach Einwirkung von löslichen Zigarettenrauch Extrakt (CSE) zu bewerten, zu erzeugen, 100% CSE durch Ziehen der Rauch von 1 University of Kentucky Forschungs Zigarette (3R4F) über 25 ml Komplettmedium in einer Saugflasche mehr als 2 min 18. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 24 h in 4 ml 1-4% CSE in komplettem Medium verdünnt. Nach der Inkubation, waschen Sie die Zellen zweimal mit 4 ml warmem sterilem PBS, bevor Sie mit 4 ml frisches Vollmedium. Hinweis: schädlichen Zellen mit hohen Konzentrationen von Zigarettenrauch-Extrakt (&gt; 5%) kann Fluss wesentlich zu verringern. </li></ol> 2. Erstellen der Scratch <ol><li> In einer sterilen Umgebung, nehmen Sie den Deckel von der 60-mm-Platte von beschädigten MSCs und legte eine gerade Kante (zum Beispiel eine sterilisierte Kunststofflineal) across der obere Rand der Platte. , Ohne dass die Medien, eine sterile 200 ul Pipettenspitze von der sterilen Lineal geführt, um 03.59 Uhr parallel Kratzer über die Platte ca. 5 mm voneinander entfernten und 50 mm Länge zu machen. Hinweis: Eine gerade Kante der Betrag der Dreh Anpassungen an der Platte benötigt wird, wenn es auf dem Mikroskoptisch minimiert. Es ist zwingend notwendig, dass die Kratzer vollständig vertikal (oder horizontal) auf dem Bildschirm angezeigt. Erzeugen mehrerer Kratzer auf einer 60 mm Platte nicht die Mikroumgebung in einer Weise, die die Zellmigration (Daten nicht dargestellt) beeinflusst zu verändern, kann jedoch eine Überlegung für andere Zelltypen sein. Die Verwendung kleinerer Vertiefungen wird nicht empfohlen, da die Variabilität der wachsenden Zellen dicht an der Kante des Bohrlochs wird ausgeprägter und kann einheitlich Erzeugung von Kratzern zu beeinflussen. </li><li> Saugen Sie die Medien und vorsichtig waschen die Platten mit 2 ml vorgewärmten komplette Medien um Zellen aus dem Zentrum von dem Kratzer anhaftet und zu Zelle zu entfernens, die durch das Kratzen gelockert wurden. Ersetzen durch 4 ml frisches Vollmedium. </li><li> Mit einem sterilen Permanentmarker kennzeichnen jeden Kratzer 1-4 auf der Unterseite der Platte an der Stelle, die nicht mit der Abbildung der Kratzer stören. Anmerkung: Es ist wichtig, dass die Bilder von dem gleichen Grund auf, verglichen vor und nach der Migration, da kann eine Variation in der Kratzbreite sein. </li></ol> 3. Unter Erste Bilder des Scratch Anmerkung: Falls die Scratch Test beruht auf mehreren Platten durchgeführt, ist es empfehlenswert, dass die ersten Bilder aller Kratzer auf einer einzigen Platte ergriffen werden, bevor Kratzer auf der nächsten Platte hergestellt. <ol><li> Verwenden eines invertierten Phasenkontrastmikroskops mit einer Kamera, die Bilder für die Analyse benötigt generieren. </li><li> Positionieren Sie die Kulturplatte auf dem Mikroskop, und verwenden Sie die Low-Power-Objektiv (10x) zu lokalisieren kratz # 1. Wenn sich Kondensation auf dem Deckel des Kulturplatte behindert eine klare image der Zellen, mit einem beheizten Bühnen auf 37 ° C. </li><li> Keeping the scratch vollständig horizontalen und in der Mitte des Sichtfeldes, erhalten so viele Bilder wie nötig, um 90% der Länge der Kratzer zu umfassen. Erhalten von Bildern von verschiedenen Abschnitten der Kratzer mit keiner Überlappung zwischen den Bildern. Anmerkung: Die Lichtbrechung an den Rändern des Kulturschale überbelichtet die Bilder, so dass sie nicht analysiert werden. Daher keine Bilder nehmen Sie aus dem ersten und letzten 5% der Länge der Kratzer ist. </li><li> Bilder von jedem Kratzer Speichern in einem separaten Ordner. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4 für Kratzer 2, 3, und 4. </li><li> Return-Platten in den Inkubator unmittelbar nach der anfänglichen Bildgebung. Lassen Zellen wandern für 4-7 Std. Hinweis: 7 h ist optimal, wenn die Beurteilung MSCs mit CSE beschädigt. Inkubation von Zellen, die für mehr als 7 Stunden wird nicht empfohlen, weil die Zellproliferation als verwirrende Variable für die Zellmigration handeln (siehe Optional Anmerkung 8.2 unten). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Analysieren Initial Scratch Bilder <ol><li> Laden Sie ImageJ und die Wundheilung Werkzeug-Plugin installieren (siehe die Tabelle der Materialien / Ausrüstung). </li><li> Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ, klicken Sie dann auf &quot;Process&quot; und &quot;Konturen finden&quot;, um die Zellen rund um den Grund auf für die Wundheilung Tool, um die Kratzfläche (2B) berechnen zu markieren. Klicken Sie dann auf &quot;Bild&quot;, &quot;Anpassen&quot;, &quot;Color Threshold&quot; und im Dropdown-Menü mit &quot;Threshold Color&quot; den Wert ändern &quot;B &amp; W&quot;. </li><li> Im Menü &quot;Farbschwelle&quot;, stellen die beiden Helligkeitsschwelle bewegen, bis die optimale Kontrast zwischen dem Kratzer und Zellfront erreicht wird. Um sich für die größte Reichweite bei dem Versuch, Kontrast im Bild zu erstellen, bewegen Sie den unteren Schieberegler ganz nach rechts (komplett schwarzes Bild), und stellen Sie dann den oberen Schieberegler, um maximalen Kontrast erzeugen kann. </li><li> Langsam stellen Sie den oberen brightness Schieberegler von links nach rechts, bis das Bild sauber zeigt die Kontur des Kratz (2C). Sobald die Kanten der Kratz identifiziert worden sind, klicken Sie auf &quot;Weitere Optionen&quot; in der ImageJ-Toolbar, wählen &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; im Dropdown-Menü, und drücken Sie die Taste &quot;M&quot; (das wird in der ImageJ Symbolleiste angezeigt werden), um den Entwurfsbereich markieren und gibt die berechnete Fläche in einem Ergebnisse Pop-Out-Fenster (2D). </li><li> Kopieren Sie alle Nummern aus dem Ergebnisfenster (2E) in einer Excel-Tabelle. Achten Sie darauf, Daten einzelner Kratzer zu trennen. </li></ol> 5. Unter Schlussbilder des Scratch <ol><li> Nachdem die Zellen migriert (4-7 h), wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4. Bild die Platten in der gleichen Reihenfolge, wie sie zerkratzt wurden, so dass die Zellen auf jeder Platte haben gleich viel Zeit für die Migration hatte. Anmerkung: Die Zellen können zu mehreren Zeitpunkten abgebildet werden, abhängig von ihrer Sensivität sowohl Temperatur und pH-Änderungen. Alternativ können Live Cell Imaging verwendet, um die Zellen zu folgen in Echtzeit, wie sie zu migrieren. </li></ol> 6. Analysieren von Final Scratch Bilder <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,5 für Final Scratch Bilder. </li></ol> 7. Berechnung des Scratch Bereich zur Migrations Quantifizieren <ol><li> Berechnen Sie den Mittelwert vor der Migration Bereich durch Mittelung der Anfangsbereich Werte der jeweiligen Kratzer. </li><li> Berechnen die Gesamtmenge der Migration durch Subtrahieren der endgültigen Migrationsbereich für jedes Bild, die in Schritt 6 berechnet aus dem Durchschnitt vor der Migration Bereich (Schritt 7.1). Erstellen Sie eine Liste von Werten für jeden Kratzer, die die Veränderung der Migration. </li><li> Bündeln die Daten aus mehreren Kratzer innerhalb des gleichen Testgruppe (dh alle Platten und alle Kratzer auf Zellen auf 0% CSE ausgesetzt ist). Verwenden Sie eine Varianzanalyse-Test, um die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen zu analysieren. </li><li> Wenn die Zellen langsam migrierenund eine längere Inkubationszeit nach dem Kratzen (größer als 10-12 Stunden), führen eine BrDU oder EdU Inkorporationstest 19 zu bestimmen, ob Zellen zuvor irgendeine Proliferation während des Zeitraums, in dem der Migrationstest auftritt. Wählen Sie einen Migrationstest Zeit zu erheblichen Zellproliferation zu vermeiden. </li></ol> 8. Optional <ol><li> Zu beurteilen, ob eine signifikante Zellalterung infolge des Kratzverfahren auftritt, führen Sie einen Seneszenz-assoziierte &amp; beta; -Galactosidase-Assay auf einer Testplatte zu vorbestimmten Zeiten nach dem Kratzen 19. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine quantitativ stabile, standardisierte Verfahren durchzuführen und zu analysieren Kratztests. Einfache kratz Tests werden routinemäßig in vielen verschiedenen Bereichen der Studie verwendet werden, um Zellmigration zu untersuchen. Jedoch traditionell die Scratch-Test hat ein standardisiertes Set-up und Quantifizierung Protokoll, das auf Fragen im Zusammenhang mit der Reproduzierbarkeit 7,10 geführt hat gefehlt. Viele der Änderungen und Optimierungen zur Verbesserung d...

Zellmigration ist hoch koordinierter und entscheidend für viele physiologische Prozesse, wie beispielsweise der Gewebeentwicklung, Reparatur und Regeneration sowie pathologischen Prozessen wie Krebsmetastasen und Arteriosklerose 1. Ein Verständnis der Zellmigration ist besonders relevant für Emerging Therapien eingesetzt, um beschädigte Gewebe zu reparieren und zu behandeln pathologischen Zuständen, einschließlich Zelltransplantation Technologien und künstliche Gewebe Pfropfen 2. Angesichts der gegenwärtigen Interesse an der Rolle von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) bei der Vermittlung der Reparatur von Gewebe 3, Quantifizierung der Migrationsfähigkeit dieser Zellen unter Verwendung eines Assays, die streng quantifizierbare, anpassungsfähig und kosteneffektiv ist von Interesse ist. Wichtig ist, dass ein solcher Test, relativ geringfügige Änderungen in der zellulären Migrationsfähigkeit nach Beschädigung ausreichend empfindlich sein. Aktuelle Methoden zur Quantifizierung der Zellmigration, einschließlich Grund auf Assays, trans-und Migrationsassays (Boyden chBernsteine), micropillar Arrays und Zellsperrzone Assays besitzen eine Reihe von Einschränkungen in der Reproduzierbarkeit, Anpassbarkeit, Quantifizierung und Kosten-Nutzen-1,4,5. Die hier beschriebene optimierte Kratz Test zeigt robuste Ergebnisse, quantifizierbar und bildbasierten Analysemöglichkeiten, Wirtschaftlichkeit und Anpassungsfähigkeit an andere Anwendungen. Scratch-Assays sind in mehreren Kapazitäten verwendet worden, um die Zellmigration und Proliferation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen 5 zu beurteilen. Der Test beinhaltet Aussäen der bezeichneten Zellen, wächst sie in oder in der Nähe Zusammenfluss abgeschlossen ist, und ein Verkratzen der resultierenden Monoschicht mit einer sterilen Nadel oder Pipettenspitze 6. Analyse wird am häufigsten durch Vergleichen der Breite des Kratzers über mehrere Zeitpunkte an zufällig ausgewählten Stellen 7-9 durchgeführt. Trotz seiner prominenten Gebrauch wird der Kratztest durch Probleme mit der Reproduzierbarkeit und Quantifizierung verwechselt. VariabilitätGeneration des Scratch nicht verändert nur die Mikroumgebung der Zellen, sondern kann auch die Zellmigration zu verhindern, indem die Plattenoberfläche und die zugrunde liegenden extrazellulären Matrix 5 zu beschädigen. Assays werden häufig mehr als 7 bis 12 h durchgeführt, jedoch für die Zelllinien Anzeige langsamer Migration und längere Testzeiten wird die Proliferation eine verwirrende Variable 7,10. Schließlich kann seneszenten Zellen durch den Ritzvorgang erzeugten Faktoren, die mit der extrazellulären Signalisierung benötigt, um die Lücke in der Monoschicht 1 schließen stören zugeben. Optimierung des Kratztest erfordert die Schaffung eines konsistenten Lücke, die nicht mit Oberflächeneigenschaften nicht beeinträchtigt, die Minimierung Assay Zeitlänge und verhindert unerwünschten Zelltod während der Manipulation. Der Anschlag basierenden Assay ist eine Optimierung der Zellausschlusszone Assay. Dieses Assay wendet einen Anschlag in der Mitte der Vertiefung, die das Zellwachstum schließt platziert, aber erlaubt den Zellen, um den zentralen Sperrzone plattiert werden.Um die Migration zu bewerten, wird der Anschlag entfernt und der sich ergebende Sperrzone stellt eine Oberfläche zur Migration auftritt. Allerdings ist dieser Test schwierig gestalten oder anzupassen 10 und für einige Anwendungen kann diese Technik auch zu kostspielig. Im Gegensatz zu Kratzassays und deren Derivaten, trans-well Migrationsassays (oder Boyden-Kammer-Assays) beurteilt Migration durch Quantifizieren der Anzahl von Zellen, die von einer Kammer zu bewegen, durch eine mikroporöse Filtermembran, in eine Kammer, die chemotaktische Mittel 8,11, 12. Diese Technik hat einen Nutzen für adhärente Zellen, wie MSCs begrenzt, da nach der Migration durch die poröse Membran, Zellen haften an der Membranseite auf die chemotaktische Mittel ausgesetzt wird, und kann schwer genau zu quantifizieren. Während der Test ist in der Lage, einige dreidimensionale Migrationsmuster zu untersuchen, die eingeschränkten Zelltypen, für die sie in der Lage, genau zu quantifizieren Zellmigrationsgrenzwert seine Nützlichkeit ist 10. Eine weitere Alternative zur Kratzassays verwendet einen Mikrosäulenarray, das zelluläre Motilität durch einen dreidimensionalen Raum misst unter Verwendung der Fähigkeit der Zellen, sich zu verformen und die Migration in das Array als Surrogat. Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomeren über einen präzisen Form gehärtet und mit Ozon behandelt und Fibronektin erzeugt ein homogenes und nicht-abbaubare Mikroumgebung. Mikrosäulenabstand kann bei Bedarf auch um die Fähigkeit der Zellen, um das Array 4 geben abzuschätzen variiert werden. Die Form wird durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung von Siliziumwafern geschaffen, um eine negative Version des hohen Aspektverhältnisses Array 13 zu schaffen. Während der Assay wird durch seine Anpassbarkeit verstärkt, um die Fähigkeit dreidimensionalen Migration, und die Analyse durch die direkte Visualisierung von wandernden Zellen zu modellieren, die Schwierigkeit bei der Schaffung von Mikrosäulenanordnungen wirtschaftlich behindert ihre weitverbreitete Verwendung. Die in diesem Protokoll beschriebenen optimierte Kratz Assay stellt ein effizientes, cost günstiges Verfahren zum Erzeugen konsistenter Kratzer, die durch frei verfügbaren Software analysiert werden können. Statt einfacher Breite Messungen über die Kratz vor und nach der Zellmigration hergestellt, ermöglicht die Software dem Anwender insgesamt kratz Bereiche vor und nach der Migration zu ermitteln. Dieser Fortschritt schränkt das Problem zu versuchen, festzustellen, wo die Kratz die Breitenmessungen sollten getroffen werden, und ob die Breite des Kratz einheitlich entlang ihrer Gesamtlänge. Außerdem ist eine sorgfältige Optimierung der Zellzahlen, die Zellkonfluenz und der Art und dem Grad der Beschädigung an den Zellen zugefügt, um eine weitere Optimierung der Assay erörtert.

<table><tbody><tr><td>DMEM (hoher Glukosegehalt, ohne Zusatz von Glutamin)</td><td>Life Technologies</td><td>31053-036</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher</td><td>Scientific SH3091002</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum/Antimykotikum, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV3007901</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin, 200 mM, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>TypLE Zelldissoziationsreagenz</td><td>Life Technologies</td><td>12563-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standard 60 mm Gewebekulturschalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Steril 200 &mu; l Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-502</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Lichtmikroskop mit Kameraaufsatz</td><td>Variable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software&nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MRI_Wound_Healing plugin</td><td><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statistische Analysesoftware</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimierung der wund scratch assay auf Änderungen in murine mesenchymale stromazellen zellmigration detect nach der beschädigung durch lösliche cigarette smoke extract

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Die Zellmigration ist für viele physiologische und pathologische Prozesse wie Gewebeentwicklung, -reparatur und -regeneration, Krebsmetastasierung und Entzündungsreaktionen von entscheidender Bedeutung. Angesichts des aktuellen Interesses an der Rolle mesenchymaler Stromazellen bei der Vermittlung der Gewebereparatur sind wir daran interessiert, die Migrationskapazität dieser Zellen zu quantifizieren und zu verstehen, wie sich die Migrationskapazität nach einer Schädigung verändern kann. Die Optimierung eines streng quantitativen Migrationsassays, der sowohl einfach anzupassen als auch kostengünstig durchzuführen ist, ist der Schlüssel zur Beantwortung von Fragen zu Veränderungen der Zellmigration als Reaktion auf verschiedene Stimuli. Aktuelle Methoden zur Quantifizierung der Zellmigration, einschließlich Scratch-Assays, Trans-Well-Migrationsassays (Boyden-Kammern), Mikrosäulen-Arrays und Zellausschlusszonen-Assays, weisen eine Reihe von Einschränkungen in Bezug auf Reproduzierbarkeit, Anpassbarkeit, Quantifizierung und Kosteneffizienz auf. Trotz seiner prominenten Verwendung wird der Scratch-Assay durch Probleme mit der Reproduzierbarkeit im Zusammenhang mit der Schädigung der Zellmikroumgebung, Hindernissen für die Zellmigration, dem Einfluss benachbarter seneszierender Zellen und der Zellproliferation sowie durch das Fehlen einer rigorosen Quantifizierung verwirrt. Der hier beschriebene optimierte Scratch-Assay zeigt robuste Ergebnisse, quantifizierbare und bildbasierte Analysemöglichkeiten, Kosteneffizienz und Anpassungsfähigkeit an andere Anwendungen.

Die Scratch-Assays hier präsentierten Objekte wurden durchgeführt unter Verwendung von Mäuselunge Wohnsitz mesenchymale Stromazellen (LR-MSCs) und isoliert, wie in den Protokollnotizen verwiesen. Die LR-MSCs wurden in einer Dichte von 500.000 Zellen in einer 60 mm-Gewebekulturschale ausgesät und bis 90% Konfluenz in 48 h gezüchtet. Um Schäden zu generieren, wurde 4% CSE (oben beschrieben) mit den Zellen 24 h nach der ersten Aussaat Periode, aber vor dem Kratzer Assay inkubiert. Für jeden Test wurde die Kratz mit einer 2...

Die Fähigkeit zu migrieren ist eine Schlüsselfunktion vieler verschiedener Zelltypen, einschließlich mesenchymaler Stromazellen (MSCs). Die Quantifizierung von Veränderungen der Migrationskapazität nach Schäden ist jedoch eine Herausforderung. Dieses Protokoll beschreibt einen leicht anpassbaren Migrationsassay, der strenge Statistiken verwendet, um Veränderungen der MSC-Migrationskapazität nach einer Schädigung zu quantifizieren.

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, Veränderungen in der Migrationskapazität von mesenchymalen Stromazellen der Lunge nach Schädigung mit löslichem Zigarettenrauchextrakt nachzuweisen. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Lungenbiologie zu beantworten, beispielsweise wie die Migrationsfähigkeit von Lungen-Progenitorzellen verbessert werden kann, um die Lungenreparatur zu unterstützen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie so optimiert wurde, dass sie genauere quantitative Messungen der Zellmigration ermöglicht, gleichzeitig aber kostengünstig durchführbar und leicht anpassbar bleibt.In dieser Demonstration wird der Kratzer-Test verwendet, um die Wanderungsfähigkeit muriner mesenchymaler Stromazellen der Lunge, oder MSCs, zu quantifizieren. Nach der Exposition gegenüber löslichem Zigarettenrauchextrakt werden die MSCs in komplettem Medium auf 60-Millimeter-Platten kultiviert und wie im Protokolltext beschrieben verletzt. Eine geeignete Konfluenz ist für den Kratzer-Test wichtig, da sie sicherstellt, dass die Bildanalyse-Software die Grenzen des Kratzers korrekt identifizieren kann.Dieses Beispiel zeigt MSCs bei 95 % Konfluenz, die für das Verkratzen in einem sterilen Umfeld geeignet sind. Entfernen Sie den Deckel von einer Platte mit beschädigten MSCs und legen Sie eine gerade Kante, beispielsweise ein sterilisiertes Plastiklineal, über den oberen Rand der Platte. Eine gerade Kante minimiert die Menge an Drehjustierungen, die erforderlich sind, wenn die Platte später auf dem Mikroskopständer zur Bildaufnahme platziert wird.Ohne das Medium zu entfernen, vier parallele Kratzer auf der Platte mit einer sterilen 200-Mikroliter-Pipettenspitze unter Verwendung der sterilen geraden Kante erzeugen, die etwa fünf Millimeter auseinanderliegen und 50 Millimeter lang sind. Die Erzeugung mehrerer Kratzer auf einer 60-Millimeter-Platte verändert das Mikromilieu nicht in einer Weise, die die Zellmigration von MSCs beeinflusst, könnte jedoch bei anderen Zelltypen eine Rolle spielen. Das Medium abpipettieren und die Platte vorsichtig mit zwei Milliliter vorgewärmtem komplettem Medium waschen.Dadurch wird verhindert, dass Zellen an der Mitte der Kratzerstelle haften, und es werden Zellen entfernt, die durch das Kratzen gelockert wurden. Ersetzen Sie das Medium durch vier Milliliter frisches, komplettes Medium und beschriften Sie mit einem sterilen, permanenten Marker jeden Kratzer von eins bis vier auf der Unterseite der Platte an Stellen, die die Bildaufnahme nicht beeinträchtigen. Es müssen Anfangsbilder jedes Kratzers aufgenommen werden, da es wichtig ist, vor und nach der Migration Bilder desselben Kratzers zu vergleichen, da die Breite der Kratzer variieren kann.Wenn der Kratzer-Assay an mehreren Platten durchgeführt wird, empfiehlt es sich, zunächst Bilder aller Kratzer auf einer einzelnen Platte aufzunehmen, bevor Kratzer auf der nächsten Platte angebracht werden. Verwenden Sie ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop mit einer Kamera, um die für die Analyse benötigten Bilder aufzunehmen. Platzieren Sie die Kulturplatte auf dem Mikroskop und verwenden Sie das Objektiv mit niedriger Vergrößerung, um den Kratzer zu lokalisieren.Nummer eins. Es ist unerlässlich, dass die Kratzerstelle auf dem Bildschirm vollständig horizontal erscheint, während sie gleichzeitig vollständig horizontal und mittig im Sichtfeld bleibt. Erstellen Sie so viele Bilder wie nötig, um 90 % der Länge der Kratzerstelle abzudecken. Gewinnen Sie Aufnahmen aus verschiedenen Abschnitten der Kratzerstelle, wobei keine Überlappung zwischen den einzelnen Bildern bestehen darf.Nehmen Sie keine Bilder aus den ersten und letzten 5 % der Kratzlänge auf, da die Lichtbrechung an den Rändern der Kulturschale die Bilder überbelichtet und sie somit nicht mehr analysierbar macht. Speichern Sie die Bilder des ersten Kratzes in einem Ordner. Erhalten Sie auf die gleiche Weise Bilder für die Kratzer zwei, drei und vier und speichern Sie die Bilder jedes Kratzers in einem separaten Ordner.Bringen Sie die Platten unmittelbar nach der ersten Bildaufnahme wieder in den Inkubator. Lassen Sie die Zellen vier bis sieben Stunden wandern, bevor Sie diesen Assay beginnen. Laden Sie die Image-J-Software herunter und installieren Sie das Plugin für die Wundheilungsanalyse.Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ, klicken Sie dann auf „Prozess“ und wählen Sie „Kanten finden“, um die Zellen hervorzuheben, die die Kratzerstelle für das Wundheilungswerkzeug umgeben. Um die Kratzerfläche zu berechnen, klicken Sie auf „Bild“ → „Anpassen“ → „Farbschwelle“. Ändern Sie im Dropdown-Menü mit der Bezeichnung „Schwellenfarbe“ den Wert im Farbschwellen-Menü auf BNW. Bewegen Sie den unteren Schieberegler vollständig nach rechts, um das Bild vollständig schwarz zu machen, und stellen Sie dann den oberen Schieberegler so ein, dass der maximale Kontrast zwischen dem Kratzer und der Zellfront erzeugt wird.Passen Sie den oberen Helligkeitsregler langsam von links nach rechts an, bis die Kontur des Kratzers im Bild deutlich sichtbar ist. Sobald die Kanten des Kratzers identifiziert wurden, klicken Sie auf „weitere Werkzeuge“. Wählen Sie in der Symbolleiste von Bild J das Werkzeug „MRI wound healing tool“ aus dem Dropdown-Menü aus und drücken Sie die Taste M, um den Bereich des Kratzers hervorzuheben und die berechnete Fläche auszugeben.Kopieren Sie in einem Ergebnis-Popup-Fenster alle Zahlen aus dem Ergebnisfenster in eine Excel-Tabelle. Stellen Sie sicher, dass die Daten einzelner Kratzer getrennt werden. Nachdem die Zellen vier bis sieben Stunden lang migriert sind, wiederholen Sie den Bildaufnahmeprozess für die Kratzer, und fotografieren Sie die Platten in der gleichen Reihenfolge, in der sie gekratzt wurden, damit die Zellen auf jeder Platte die gleiche Zeit zur Migration hatten.Die Zellen können zu mehreren Zeitpunkten abgebildet werden, abhängig von ihrer Empfindlichkeit gegenüber Temperatur- und pH-Änderungen. Die endgültigen Kratzerbilder werden anschließend auf die gleiche Weise mit Image J analysiert wie die anfänglichen Kratzerbilder. Kratzerflächen können ebenfalls berechnet werden, um die Migration zu quantifizieren, korrekt.Die Konfluenz ist entscheidend für den Erfolg des Kratzer-Assays. Hier wird ein erfolgreicher Kratzer an murinen Lungen-MSCs bei 95 % Konfluenz gezeigt. Im Gegensatz dazu ist eine Konfluenz von 70 % zu niedrig für einen erfolgreichen Kratzer und kann falsche Grenzen erzeugen.Dies sind repräsentative Originalbilder vor und nach der Migration mit den entsprechenden Ritzflächengrenzen, wie sie von der Bildgebungssoftware definiert wurden. Diese Diagramme zeigen die durchschnittlich berechnete Ritzfläche in Pixeln für jeden der vier Ritzungen, die über eine Platte muriner Lungens-MSCs bei 95 % Konfluenz entweder vor oder nach der Migration und nach Exposition gegenüber entweder 0 % oder 4 % Zigarettenrauchextrakt gezogen wurden. Ein Vergleich der berechneten durchschnittlichen Veränderung der Ritzfläche zeigte eine geringere Migration muriner Lungens-MSCs nach Exposition gegenüber 4 % Zigarettenrauchextrakt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Konfluenz der Zellen für den jeweiligen Zelltyp, mit dem gearbeitet wird, zu optimieren und sorgfältig zu überwachen, sowie das Erzeugen der Kratzer zu üben, um sicherzustellen, dass sie so einheitlich wie möglich sind. Nach diesem Verfahren können weitere Techniken wie die Immunhistochemie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu Veränderungen und der Proteinausprägung zu beantworten, die die Zellmigration beeinflussen könnten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video beschreibt einen berührungslosen Co-Kultur-Wundheilungsassay, um die Migrationskapazität von murinen Myoblasten zu bewerten. Dies hilft, die signalsendenden und signalempfangenden Komponenten der parakrinen nicht-kanonischen Wnt-Signalwechselwirkungen in vitro zu verstehen.

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Diese Studie berichtet zwei verschiedene Methoden für die Analyse der Zelle Invasion und Migration: Boyden Kammer Assay und der in-vitro- video Mikroskop-basierte Wundheilung Assay. Die Protokolle für diese zwei Experimente werden beschrieben und ihre Vorteile und Nachteile gegenüber.

Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

Dieses Manuskript wird beschrieben, wie Schnitt-ähnliche Läsionen am kultivierten Epithelzelle Monolagen günstig Modell Heilung in-vitro-, so dass für die Bildgebung durch konfokale gewickelt oder laser-scanning-Mikroskopie, und die bieten qualitativ hochwertige quantitative und qualitative Daten für das Studium Zelle Verhalten und die Mechanismen, die bei der Migration.

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bewertung der Wirkung der Peptide auf die Migration von bronchialen Epithelzellen. Diese Methode ermöglicht die schnelle und hoch reproduzierbare Einholung der quantitativen Daten über die Geschwindigkeit der Zelle Migration und Wunde Schließung.

Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

Hier beschreiben wir eine Prozedur, um die Zelle Migration in Vitro mit einer automatisierten optischen Kamera Mikroskop zu testen. Der Scratch-Test hat verbreitet wo die Schließung von Grund auf für einen bestimmten Zeitraum gefolgt ist. Das optische Mikroskop ermöglicht eine zuverlässige und preiswerte Erfassung von Zellmigration.

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Diese Studie konzentriert sich auf eine in-vitro- Modell der Wunde heilende (Scratch Assay) als Mechanismus zur Bestimmung wie Umweltschadstoffe wie Arsen Einfluss zelluläre Migration. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser in Vitro Assay schnelle und frühzeitige Hinweise auf Änderungen an zelluläre Migration vor dem in-Vivo -Experimente bietet.

In-vitro- Kratzen Sie Assay veranschaulichen Auswirkungen von Arsen auf Haut Zellwanderung

Hier stellen wir ein Protokoll für einen In-vitro-Scratch-Assay mit primären Fibroblasten und für einen in vivo Hautwundheilungstest bei Mäusen vor. Beide Assays sind einfache Methoden zur Beurteilung der In-vitro- und In-vivo-Wundheilung.

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Wir präsentieren eine kostengünstige Methode zum Scratch-Migrationstest, die einen neuen Ansatz zur Bestimmung der Zellmigration ohne den Einsatz geräteintensiver Methoden bietet. Während Fibroblasten in diesem Protokoll verwendet wurden, kann es angepasst und verwendet werden, um zusätzliche Zelltypen und Einflüsse auf die Zellmigration zu untersuchen.

Ein kostengünstiger und anpassungsfähiger Scratch-Migrationstest

Durch die Einbeziehung des Interaktionserlebnisdesigns und der Analyse der Benutzeranforderungen führen wir einen innovativen Zellschaber ein, der zelluläre Wundheilungsassays in Bezug auf Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit, Praktikabilität, zelluläre Integrität und Benutzererfahrung verbessert.

Ein Tool zur automatischen Erstellung stabiler und reproduzierbarer zellfreier Lücken zur Verbesserung der Zuverlässigkeit von Zellwundheilungsassays

In dieser Arbeit werden der zweidimensionale (2D) Scratch Wound Migration Assay und der dreidimensionale (3D) Sphäroid-Sphäroide-Assay zusammen mit ihren jeweiligen nachgeschalteten Analysemethoden, einschließlich RNA-Extraktion und Immunzytochemie, als geeignete Assays zur Untersuchung der Angiogenese in vitro vorgestellt.

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In dieser Arbeit beschreiben wir ein in vitro Modell zur Isolierung und Differenzierung von murinen Atemwegsepithelzellen, wobei der Schwerpunkt auf ihrer Akklimatisierung an chronischen Zigarettenrauchextrakt (CSE) liegt. Das Modell könnte verwendet werden, um die Multi-Omics-Auswirkungen von CSE umfassend zu charakterisieren, was möglicherweise Einblicke in die zellulären Reaktionen unter chronischer Rauchbelastung liefert.

In vitro Modell zur Untersuchung der Differenzierung und Veränderung von Multi-Omics an murinen Atemwegsepithelzellen, die mit Zigarettenrauchextrakt stimuliert wurden

Erfahren Sie, wie Sie den Scratch-Assay optimieren, um Veränderungen der Zellmigration muriner mesenchymaler Stromazellen nach Schädigung durch löslichen Zigarettenrauchextrakt quantitativ zu erfassen.

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract (Video) | JoVE Journal

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

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