Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, lösliches und unlösliches Alpha-Synuclein aus postmortalen Parkinson-Gehirnen zu extrahieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Erforschung der Parkinson-Krankheit zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine relativ einfache Technik handelt, bei der gängige Laborreagenzien und -instrumente verwendet werden.

Nachdem Sie die notwendigen Lösungen und Puffer vorbereitet haben, geben Sie zunächst eine 0,5-Gramm-Probe gefrorenen Basalgangliengewebes auf eine kleine Petrischale. Verwenden Sie eine sterile Skalpellklinge, um sie schnell in einen Millimeter quadratische Fragmente zu zerkleinern. Sammeln Sie das gehackte Gewebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie 10 Volumen eiskaltes, 1X ELS in das Röhrchen.

Homogenisieren Sie die Proben mit einem mechanischen Homogenisator bei 20.000 U/min für 10 Sekunden. Dann zwei Minuten auf Eis abkühlen lassen. Wiederholen Sie die Homogenisierung dreimal und kühlen Sie jedes Mal auf Eis ab.

Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 10.000 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Der Rohhomogenatüberstand wird in Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat überführt und eine Stunde lang bei 100.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Übertragen Sie den Überstand in gekühlte Röhrchen auf Eis und behalten Sie ihn als lösliche TBS-Fraktion bei.

In fünf Volumina 1X ELS Puffer waschen und bei 100.000 g 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Wiederholen Sie dann den Waschgang.

Das gründliche Waschen der Pellets zwischen den Ultrazentrifugationsschritten ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens. Nachdem die Proben eine Temperatur von 10 Grad Celsius erreicht haben, um SDS-Ausfällungen zu vermeiden, fügen Sie fünf Volumina 1X TBS-SDS hinzu und suspendieren Sie das endgültige Pellet erneut, indem Sie es 10 Sekunden lang bei 20 Kilohertz bei Raumtemperatur beschallen. Ultrazentrifugieren Sie bei 100.000 g für 30 Minuten bei 25 Grad Celsius.

Nach der Ultrazentrifugation wird der Überstand in gekühlte Röhrchen auf Eis überführt und als lösliche SDS-Fraktion beibehalten. Geben Sie fünf Volumina 1X TBS-SDS-Puffer bei Raumtemperatur in das Pellet und zentrifugieren Sie es 15 Minuten lang bei 25 Grad Celsius bei 100.000 gs. Entsorgen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie den Waschvorgang.

Nach dem Verwerfen des Überstands 50 Mikroliter 1X TBS-SDS-Harnstoff zugeben und mit einem auf 20 Kilohertz eingestellten Ultraschallgerät 10 Sekunden lang auflösen. Kennzeichnen Sie diese Probe als harnstofflösliche Fraktion. Es ist wichtig, dass alle unlöslichen Proteine während des Verfahrens gründlich extrahiert werden.

Verdünnen Sie TBS-SDS-Harnstoffproben eins zu eins mit 1X TBS-Puffer, um die Kompatibilität mit Proteinassay-Reagenzien zu gewährleisten, und testen Sie jede Fraktion auf den Gesamtproteingehalt mit einem handelsüblichen Proteinassay-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Aliquot der Proben in 20-Mikroliter-Aliquots mit 10 % Glycerin, um zukünftige Gefrier-Auftau-Zyklen zu reduzieren, und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Laden Sie 10 Mikroliter der TBS-, TBS-SDS- und TBS-SDS-Harnstoff-Extrakte in einem Molekulargewichtsmarker auf 10 Wells, vier bis 12 Prozent Bis-Tris-Polyacrylamid-Gel mit MOPS als Laufpuffer unter Verwendung von Standardtechniken.

Lassen Sie das Gel eine Stunde lang bei 200 Volt laufen oder bis der blaue Farbstoff aus dem Ladepuffer den Boden des Gels erreicht hat. Befeuchten Sie eine Nylonmembran mit 100 % Methanol und weichen Sie sie dann in Transferpuffer mit 20 % Methanol ein. Nehmen Sie eine Identifizierungsmarkierung auf dem Blot vor, um die Proteinseite und die Ausrichtung der Molekulargewichtsgrößenmarker zu bestimmen.

Sandwichen Sie das Gel mit der Membran zusammen mit nassem Filterpapier. Führen Sie die Übertragung zwei Stunden lang bei 40 Volt durch. Blockieren Sie die in 5%ige BSA-Lösung in 1X PBS-T für 30 Minuten unter Schütteln bei 70 U/min, um eine unspezifische Bindung des Primärantikörpers an die Membran zu verhindern.

Untersuchen Sie den Protein-Blot, indem Sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit sechs Millilitern des Alpha-Synuclein-Primärantikörpers Syn-1 inkubieren, der in PBS-T auf 750 verdünnt wurde. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal für jeweils fünf Minuten mit 1X PBS-T. Inkubieren Sie dann den Blot mit dem entsprechenden HRP-konjugierten Sekundärantikörper, verdünnt um eins bis 2.000 in PBS-T für 30 Minuten.

Waschen Sie die Membran wie zuvor mit 1X PBS-T. Tauchen Sie die Blots in eine verbesserte Chemilumineszenzlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers in einem dunklen Raum. Decken Sie die Blots mit Frischhaltefolie ab und erfassen Sie das Signal mit Hilfe der Autoradiographie.

Nach der Bildgebung inkubieren Sie den Western Blot 10 Minuten lang mit sechs Millilitern Western Blot Stripping Buffer unter ständigem Schütteln, um den Blot von Alpha-Synuclein-Antikörpersignal zu befreien. Wiederholen Sie das Western-Blot-Verfahren, um die Membran mit Beta-Aktin-Primärantikörpern in einer Verdünnung von 1 bis 8.000 zu untersuchen. Scannen und konvertieren Sie das endgültige Bild in ein Tiff-Bild und messen Sie die Dichte mit NIH ImageJ zu Quantifizierungszwecken.

Die folgenden Bilder sind repräsentative Immunoblots von Alpha-Synuclein-Spiegeln von Parkinson und kontrollieren menschliches Basalgangliengewebe. Die TBS-, SDS- und harnstofflöslichen Fraktionen wurden mit Hilfe eines westlichen Immunoblots auf das Vorhandensein von Alpha-Synuclein analysiert. 10 Milligramm Protein wurden in jede Spur geladen.

In der TBS-Fraktion sind in allen Fällen Alpha-Synuclein-Monomere vorhanden. Das Sternchen stellt möglicherweise eine C-terminale verkürzte Form von Alpha-Synuclein dar. In der SDS-Fraktion sind einige Oligomere von alpha-Synuclein zusammen mit Monomeren zu sehen, die durch die feste Pfeilspitze im PD-Gewebe angezeigt werden.

In der Harnstofffraktion werden Monomere, Oligomere und aggregiertes Alpha-Synuclein in den PD-Fällen variabel exprimiert, was ihre jeweilige Lewy-Körperbelastung widerspiegelt. Die neurologisch gesunden Kontrollproben zeigen das Vorhandensein von nur geringen Mengen an monomerem Alpha-Synuclein. Einmal gemeistert, kann diese Proteinextraktionstechnik innerhalb eines Arbeitstages durchgeführt werden, gefolgt von einem westlichen Immunoblot am nächsten Tag, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Lewy-Körperbiologie, um unlösliche und aggregierte Alpha-Synuclein-Spezies in pathologischem menschlichem Gewebe und in In-vivo-Tiermodellen zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit nicht fixiertem menschlichem Gewebe Vorsichtsmaßnahmen erfordert und dass bei allen Handhabungsvorgängen durchgehend Handschuhe und Laborkittel getragen werden sollten.