Name: Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T14:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Lernen Sie die sequentielle Extraktion von löslichem und unlöslichem Alpha-Synuclein aus post-mortem Parkinson-Gehirngewebe. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Proteinaggregationen mittels Ultrazentrifugation und Western Blot.

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Ich danke Dr. Adamantios Mamais für die Extraktion von α-Synuclein aus menschlichem Gewebe und das Ausführen von Blots. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen MRC Grant (MR/L010933/1) und zum Teil durch den Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration Award (WT089698) an das UK Parkinson's Disease Consortium (UKPDC) unterstützt, dessen Mitglieder vom UCL Institute of Neurology, der University of Sheffield und der MRC Protein Phosphorylation Unit an der University of Dundee stammen. RB erhielt für diese Arbeit Mittel von der MJFox Foundation und wird auch vom Reta Lila Weston Trust finanziert.

Post-mortem-Gehirngewebe wurde für neurologische Erkrankungen zu Queen Square Hirnbank gespendet, University College London, Institut für Neurologie mit ethisch anerkannten Protokolle und für die Forschung unter einer Lizenz von der menschlichen Gewebe Behörde gespeichert (HTA) UK (Nr. 12198). Siehe Liste der Fälle, für dieses Protokoll (Tabelle 1) verwendet. 1. Herstellung der Puffer <ol><li> Bereiten 1X TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) Puffer: <ol><li> Vorbereitung 10X TBS als Stammlösung mit 500 mM Tris-HCl pH 7,4 und 1500 mM NaCl. <ol><li> Man wiegt 60,5 g Tris-Cl pH 7,6 und 87,6 g NaCl in 800 ml hochreinem Wasser. Der pH-Wert mit 1 M HCl und die endgültige Aktienvolumen um 1 L. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Endkonzentration von 1X TBS durch Verdünnen der Stamm 10-mal in destilliertem Wasser. </li><li> Add-Protease-Inhibitoren (PI), (1 Tablette pro 50 ml Puffer) und Phos-stop Phosphataseinhibitor Tabletten (1 Tablette pro 10 ml Puffer), umhebt die Auswirkungen der nicht-spezifischen enzymatischen Wirkungen von Proteasen und Phosphatasen. Anmerkung: Hier haben wir den Enzyminhibitor Tabletten aus Roche aber ebenso andere kommerziell verfügbare Inhibitoren können gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden, eingesetzt. </li></ol></li><li> Vorbereitung TBS-SDS-Puffer durch Zugabe von 5% w / v Natriumdodecylsulfat (SDS) auf 1X TBS (pH 7,4) Puffer. Die Lösung auf 60 ° C unter ständigem Rühren mit einem Magnetrührer wurden einer SDS löslich. </li><li> Vorbereitung TBS-SDS-Harnstoff-Puffer durch Zugabe von Harnstoff bis zu einer Endkonzentration von 8 M w / v bis 1X TBS-SDS-Puffer (pH 7,4). Die Lösung auf 60 ° C unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer zu Harnstoff aufzulösen. </li></ol> 2. Proben Homogenisierung und Differential Ultrazentrifugation Hinweis: Der folgende Teil der Arbeit beinhaltet Umgang mit menschlichem Gehirngewebe nach den Regeln des HTA UK. Lokale Standardarbeitsanweisungen sind an allen ti gefolgtmes. Gehirnproben werden aus gefrorenen Gehirn blockiert und Gewebematerial in einem microcabinet bei Unterdruck gehalten homogenisiert seziert. Einwegkittel Handschuhe, Gesichtsmasken, Überschuh-Protektoren und Schutzbrille sind während des gesamten Verfahrens tragen. Menschliches Gewebe Abfall wird nach dem Autoklavieren bei 121 ° C für 20 min für eine sichere Entsorgung verworfen. Sharps (Skalpellklingen) werden in einem geeigneten Behälter für scharfe Gegenstände für Rückhaltung und sichere Entsorgung angeordnet ist. <ol><li> Nehmen Sie ein Stück gefrorenes menschliches Gewebe (ca. 0,5 g Gewicht aus der Basalganglien-Region) und schnell in kleine Fragmente (ca. 1 mm 2) auf Eis mit einem kleinen Petrischale und ein steriles Skalpell Blatt vor den Mund. Verwenden Sie eine separate Petrischale und Skalpellklinge für jede Probe. Sammeln Sie das zerkleinerte Gewebe in einem 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 10 Volumen eiskaltem 1xTBS Puffer in das Röhrchen. </li><li> Homogenisierung der Proben unter Verwendung eines mechanischen Homogenisators bei 20.000 Upm für 10 sec. Abkühlen auf Eis für 2 min. Wiederholen Sie diesen Schritt drei Zeits. Anmerkung: Dies ist so, dass die Proben nicht unter Homogenisieren erhitzt. </li><li> Klärung durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Entsorgen Pellets von nicht-homogenisierte Material. </li><li> Nehmen Stand (Rohhomogenat), in den Zentrifugenröhrchen (Größe des Rohres hängt von Rotorgröße) Polycarbonat und Waage vorsichtig. Zentrifuge bei 100.000 × g für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Behalten Stand als dies der TBS-löslichen Fraktion. </li><li> Waschen Sie das Pellet zweimal in fünf Volumen 1X TBS Puffer und Zentrifuge jedesmal bei 100.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Die Überstände verwerfen. <ol><li> Resuspendieren endgültige Pellet durch Beschallung des Pellets für 10 Sekunden bei 20 kHz in etwa 5 Volumen 1X TBS-SDS bei RT. Anmerkung: Vor der Zugabe des SDS enthaltenden Puffer Proben bei 10 ° C gebracht werden, um eine Ausfällung zu vermeiden SDS. </li><li> Ultrazentrifuge bei 100,000 × g für 30 min bei 25 ° C. </li></ol></li><li> Bewahren Überstand, wie das ist the SDB-löslichen Fraktion. <ol><li> Waschen Sie das Pellet zweimal in 5 Volumina 1X TBS-SDS-Puffer bei RT. Zentrifuge jedesmal bei 100.000 xg für 15 min bei 25 ° C. </li><li> Solubilisierung des letzte Pellet in 50 ul 1X TBS-SDS-Harnstoff-Puffer unter Verwendung eines Ultraschallgeräts in 20 KHz für 10 Sekunden eingestellt, um eine vollständige Auflösung zu erreichen; dies wird den Harnstoff lösliche Fraktion bezeichnet. </li></ol></li><li> Assay jede Fraktion auf den Gesamtproteingehalt unter Verwendung eines kommerziellen Protein-Assay-Kit nach Herstellerprotokoll. Verdünnter TBS-SDS-Harnstoff-Proben 1: 1 mit 1X TBS-Puffer, um die Kompatibilität mit der Protein-Assay-Reagenzien zu ermöglichen. Freeze-Proben in kleinen Aliquots (20 ul) bei -80 ° C, um Einfrieren und Auftauen zu reduzieren. Anmerkung: Zusatz von 10% Glycerin, um Proben für die langfristige Lagerung empfohlen bei -80 ° C. </li></ol> 3. Immunoblotting von Proben und analysieren Ergebnisse <ol><li> Führen Sie Proben von TBS, TBS-SDS und TBS-SDS-Urea-Extrakte auf 10-Well-4-12% Bis-Tris-Polyacrylamidgelmit MOPS als Laufpuffer Verwendung von Standardtechniken. Siehe Gallagher und Chakravarti (2008) 29 für eine detaillierte Western-Blot-Protokoll. </li><li> Last 10 ug Protein aus jeder Probe auf jeder Spur zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker für TBS und SDS und Harnstoff-Fraktionen. </li><li> Laufen Gel bei 200 V für 1 Stunde oder bis die blaue Farbe von Ladepuffer den Boden des Gels erreicht hat. </li><li> Transferproteine ​​aus Gelen elektrophoretisch auf Nylonmembranen 28, zuerst in 100% Methanol und dann vorbenetzt in Transferpuffer, der 20% Methanol. Geben Sie ein Kennzeichen auf dem Blot, um das Protein Seite und die Orientierung der Molekulare Größenmarker zu bestimmen. <ol><li> Sandwich des Gels mit der Membran neben feuchtem Filterpapier. Korrekte Platzierung der Membran entscheidend ist mit der Membran zwischen dem Gel und der Anode. Führen Sie den Transfer für 2 h bei 40 V. </li><li> Make up 1X PBS-Tween (1X PBS-T) Puffer: Man löst 1 Tablette PBS in 200 mlWasser unter Bildung von 0,01 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid und 0,137 M Natriumchlorid, pH 7,4. </li><li> Blockieren die Membran in 5% BSA-Lösung in 1X PBS-T für 30 min mit 70 UpM schüttelnd. Dies verhindert, dass nicht-spezifische Bindung des primären Antikörpers an die Membran. </li></ol></li><li> Sonde, die das Protein-Blot mit 6 ml α-syn Primärantikörper Syn-1 (BD Biosciences, monoklonaler Maus-Antikörper) bei 1: 750 Verdünnung (O / N bei 4 ° C), gefolgt durch eine Reihe von Waschungen mit 1X PBS-T ( 3 x je 5 min) 28. </li><li> Inkubieren des Blots mit dem geeigneten HRP konjugierten sekundären Antikörper bei einer 1: 2.000-Verdünnung für 30 min. Durchführen einer Reihe von Waschvorgängen (3 x je 5 min) mit 1 × PBS-T. <ol><li> Tauchen Blots in verstärkten Chemilumineszenz-Lösung für 15 Sekunden in einem dunklen Raum. Abdeckung Blots mit einer Klarsichtfolie und Ort Autoradiographie-Filme gegen den Blot mit Proteinseite nach oben in einer lichtdichten Kassette die entsprechenden Signale (angemessene Größe Bänder) zu erfassen. </li><li> Entwickeln Autoradiographie Filme in einem automatischen Entwickler. Hinweis: Flecken kann auch manuell unter Verwendung der Entwickler und Fixierer aus einer kommerziellen Quelle, falls ein automatisiertes Entwicklersystem nicht verfügbar ist entwickelt werden. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Western-Blot mit 6 ml Western-Blot-Stripping-Puffer für 10 Minuten unter konstantem Schütteln, um die Blot von α-syn-Antikörper Signalstreifen. Führen Sie die Schritte durch, um 3.43 3.6.2 Verwendung von beta-Actin primären Antikörpers (monoklonaler Maus) bei 1: 8.000-Verdünnung. </li><li> Scannen und konvertieren Sie das endgültige Bild in ein TIFF-Bild und messen Dichten mit NIH ImageJ zur Quantifizierung Zwecke (eine kostenlose Software zum Download). Hinweis: Die Software ermöglicht das Lesen der Dichten der relativen Fläche von Interesse (die entsprechende Größe Bänder) und die Daten können ausgedrückt werden entweder als ein Verhältnis der α-syn Dichte / β-Actin (a house-keeping Gen) als willkürliche Einheiten oder eine eigene, wenn ein Housekeeping-Gen nicht gültig ist (wie im Falle von Harnstoff-lösliche Proben). </li&gt; </ol>

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<li>Newman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314(2013).</li>
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Der Autor hat nichts zu offenbaren.

Dieser Artikel beschreibt eine biochemische Protokoll für die Extraktion und Untersuchung der unterschiedlichen Löslichkeit Eigenschaften der monomeren, oligomeren und aggregiert α-syn von erkrankten Gehirnen mit Denaturierungsgel Laufbedingungen. Dies ist eine gut etablierte Technik zum Studium aggregierten α-syn 17, 18, ​​20, 21 ein Protein, das normalerweise in seiner nativen Form löslich ist, jedoch gewinnen amyloidogenen oder erhöhte Aggregationseigenschaften mit Fortschreiten der Erkrankung oder mit genetischen Mutationen. Dennoch haben einige Gruppen leichte Variationen in SDS-Konzentrationen in ihrem Puffer verwendet (8% oder 10% statt 5%) 21,22, 30. Der SDS ist ein anionisches Detergens und solubilisiert α-syn-Oligomere, die Membran-gebundene Formen umfassen kann α-syn, während Harnstoff denaturiert ein chaotropes Reagenz der unlöslichen aggregiert und fibrillären oder amyloidogenen Formen von α-syn 20. In diesem Zusammenhang eine systematische Untersuchung von Paleologou et al 31 untersucht die Stabilitätvon α-syn-Oligomeren und Fibrillen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Harnstoff (6,5-8 M) oder SDS (0,25-2%) und berichtet, daß Oligomere in SDS-Konzentrationen stabil, aber nicht mit hohen Konzentrationen an Harnstoff. Ihre Fila-1-Antikörper, der spezifisch für α-syn-Oligomeren und Fibrillen detektiert höheren Konzentrationen von Fibrillen mit 6,5 M Harnstoffkonzentrationen unter nicht-denaturierenden Bedingungen. Die Pufferkonzentrationen in diesem Protokoll verwendet genau widerspiegelt, was in Culvenor et al. (1999) 32. Die anatomischen Hirnregionen für biochemische Extraktion der unlöslichen α-syn sollten sorgfältig ausgewählt werden und dies sollte α-syn LB und LN Belastung widerspiegeln, je nach Fortschreiten der Krankheit 33,34. Die hier verwendeten Fälle sind Basalganglien Proben aus den Neokortex und limbischen Subtypen von PD spät und Zwischenstufen der PD Progression nach McKeith reflektierenden ctriteria 34. Am Queen Square Hirnbank, die eine Hälfte des Gehirnsroutinemßig in Formalin für die histochemische Analyse fixiert und die andere Hälfte wird vorsichtig in verschiedenen anatomischen Bereichen seziert und schockgefroren und bei -80 o C Gefrierschränke für weitere biochemische und DNA / RNA-Analyse Untersuchungen gelagert. Nach Formalinfixierung der Gehirne und Dissektion von Neuropathologen, wird Immunhistochemie unter Verwendung α-syn-Antikörper und Ergebnisse archiviert. Auch als Routineverfahren wird der pH-Wert der Hirngewebe bei der Ankunft als Maß agonal Stand der Hirngewebe gemessen. Dies bildet eine solide Grundlage für die Qualität der Gewebekonservierung für die biochemische Analyse. Unsere Daten zeigen, dass hier gibt es mehr SDS lösliche α-syn-Monomer in PD Fällen im Vergleich zu Kontrollen; insbesondere die neokortikalen PD Fällen hat im Vergleich zum limbischen PD Vielzahl höheren α-syn Last. Die neokortikalen Fälle stellen größere Progression von PD α-syn Pathologie in den Neokortex Regionen wie den frontalen und parietalen corTices 33,34. Das limbische PD Fällen haben höhere LB Ticker im basalen Vorderhirn / limbischen Regionen Bereichen wie der Amygdala, transentorhinal und cinguli Regionen. Für aussagekräftige Daten und statistische Analysen, muss man mindestens 4 Fällen von jeder Kohorte laufen. Ebenso haben wir eine statistische Analyse der Blot hier vorgestellten Daten nicht versucht. Es muss auch darauf hingewiesen, dass verschiedene Antikörper können verschiedene Formen / Zusammensetzung der höheren Ordnung α-syn Oligomere erkennen und jedes kann seine eigene relative Sensitivität und Präferenz haben werden. Dies ist aus den Ergebnissen von 29 Tong et al., Wo sie zeigen, dass die 4 verschiedenen α-syn-Antikörpern (Syn-1, SS, Onco und LB509) erhalten veränd Ergebnisse zumindest für α-syn-Oligomere / Aggregate. Die α-syn-Monomere wurden in ähnlichem Ausmaß von allen 4 Antikörpern erkannt obwohl diese Abweichung abhängig davon, ob die α-syn Antikörperepitop befindet sich entweder in der N-terminalen oder C haben-terminalen 29. Ähnlich spezifische Antikörper für phospho-alpha-Synuclein bestimmen verschiedene hochmolekulare α-Synuclein Spezies 20,21. In dem hier beschriebenen Protokoll, das hoch gekennzeichnet Antikörper Syn-1 verwendet wurde, 19-21. Jedoch ist es wichtig zu berücksichtigen, die Validierung jedes neue Antikörper auf Western-Blots durch Antikörper Präabsorption Versuchen sowie Überexpression und Zuschlags des Proteins in den Zellen. Es ist wichtig, andere Variationen, die von den Forschern angewendet wurden betrachten, um kleinere Fragmente α-syn und tetrameren oder instabilen α-syn Formen zu bestimmen. Dies könnte mild-Fixierung von Membranen mit 0,4% PFA in PBS auf verkürzte Formen von α-syn 35 oder Behandlung von Proben Homogenate mit Vernetzer behalten zu stabilisieren Tetramere 36 gehören. Genaue biochemischen Auswertung von Proteinen unter Verwendung von Post-mortem-tiUSGABE erfordert die Minimierung der enzymatischen Proteinabbau und Veränderung. Es ist daher ratsam, um Gewebe mit den kürzesten post-mortem Verzögerungen innerhalb der Fallkohorten zu verwenden und / oder wählen Sie abgestimmte Proben. Immunhistochemie unter Verwendung von Standardantikörper für α-syn Immunhistochemie sollte vor Beginn der Isolierungsprotokoll durchgeführt werden. Das Ausmaß der α-syn-Pathologie ist sehr variabel und können entsprechend ausgewählten Regionen variieren. Es ist ratsam, Regionen mit reichlich Pathologie als eine positive Kontrolle für eine optimale Ausbeute bei jedem Durchlauf auszuwählen. Die Verwendung von Protease-Inhibitoren und ggf. Phosphataseinhibitoren unerwünschten enzymatischen Abbau zu verhindern, nach der Freigabe von intrazellulären Proteasen oder Phosphatasen während Zelllyse vorkommende und Aufrechterhalten der Proben bei 4 &amp; deg; C ist entscheidend. Wichtig ist, daß alle Proben innerhalb der Charge von Experimenten sind gleichmäßig und einheitlich behandelt werden, um intra-Benutzer Variationen zu vermeiden; Mehrfach freEZE-Auftau-Zyklen zu vermeiden, da diese potenziell posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung zurückzuziehen. Ein kritischer Punkt zu bedenken, bei der Prüfung einer großen Anzahl von Proben ist, dass die Daten von Immunoblots sollten normalisiert werden, um eine Probe, die parallel zu allen anderen Proben auf den Gelen, und alle zu dieser Probe referenzierten Daten ausgeführt werden soll. Dies geschieht, um eine Normalisierung der Immunoblot Daten zwischen mehreren Blots gewährleisten. Dies ist die in unserer aktuellen Studie 22 angewandte Methode. Es sei darauf hingewiesen, dass, um die Hintergrund ECL gering zu halten, werden die Blots nicht zu jeder Zeit während der Western-Blot-Protokoll austrocknen werden. Darüber hinaus sollte sehr lange Belichtungszeiten (&gt; 10 min) auf Autoradiographie Filmen vermieden werden, da dies zu einer Sättigung des ECL-Signals führen und zu ungenauen Quantifizierung führen. Das obige Protokoll ist eine relativ einfache Technik mit gemeinsamen Laborreagenzien und inInstrumente und können ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der Pathophysiologie der α-syn-Protein in PD Forschung sein. Diese Methode kann nicht nur mit entsprechenden Änderungen in der Untersuchung der α-syn Biologie in α-syn transgenen Tieren, sondern auch für andere neurodegenerative Erkrankungen mit abnormalen Ablagerungen von aggregierten Proteinen, wie AD, MSA, DLB, HD und frontotemporaldementias verlängert. Jedoch sind die hier beschriebenen Western-Blot-Daten könnten auch unter Verwendung von Enzym-Immuntests unter Verwendung von Antikörpern für spezifische Formen von α-syn-31 geprüft.

Eine der wichtigsten pathologischen gemeinsam unter mehreren neurodegenerativen Erkrankungen Merkmale ist die Bildung von abnormen Proteinaggregaten, die in einem Protein / krankheitsspezifische Weise 1 auftritt. Somit gibt es die charakteristischen extran Amyloid-beta-Plaques und aggregierte hyperphosphoryliertem tau Ablagerungen in Neuronen bei Alzheimer-Krankheit (AD); die aggregierten α-syn Ablagerungen in Lewy-Körperchen (innen), die intraneuronalen Einschlüsse sind, und auch innerhalb dystrophischen neuronale Prozesse namens Lewy Neuriten (LK) in PD, PD Demenz und Demenz mit Lewy-Körperchen (DLBS) 2-4. Abnormal α-syn Kautionen werden auch im Markenzeichen Läsionen der Glia-zytoplasmatische Einschlüsse in MSA 5 zu sehen. Huntington-Krankheit, gibt es die charakteristischen Poly-Q Ablagerungen und abnorme Tar DNA-Bindungsprotein-43 und in Sarkom Proteine ​​(FUS) fusioniert sind in frontotemporalen Demenzen abgeschieden. Wichtig für PD haben α-syn-Gen-Mutationen zu cau gefundense autosomal dominant PD 6-11. Zusätzlich α-syn-Gen Verdreifachung 12 und Vervielfältigung 13 verursacht auch familiären PD was eine Verknüpfung erhöhte α-syn-Expression auf die Pathomechanismen der PD. Bemerkenswert ist, bergen sowohl sporadischen und familiären PD Fällen anomale Vorkommen von α-syn Pathologie 14. Aktuell verfügbare Behandlungen für PD sind nur palliative und haben keine Auswirkungen auf die Eindämmung oder Verzögerung des unaufhaltsamen Fortschreiten der Krankheit. α-syn ist reichlich im Gehirn exprimiert und macht etwa 1% des Gesamthirnprotein. Es ist gegenwärtig insbesondere in den Neuronen, kann aber, wenn auch in geringeren Mengen in Gliazellen existieren. Ein strittiger Punkt ist die native Struktur des α-syn, die als Zufalls Monomers 15 oder als gefaltete Tetramer 16 existieren kann. Bei Erkrankung, Änderung α-syn seine Konformation, die es fehlgefaltetem erhalten können, und dieses Verfahren wird angenommen, dass die Ursache der Krankheit sein pathogeNesis. Trotz mehrjähriger Untersuchungen der pathophysiologische Aspekte der α-syn und Krankheit sind die genauen Ursachen der Krankheitsmechanismen schwer fassbaren 14 geblieben. Studien unter Verwendung von Post-mortem-Analyse der Parkinson-Gehirn bisher vorgesehen wichtige Hinweise in Bezug auf normale und abnormale Biologie der α-syn sowohl bei sporadischen PD und PD Mutationen im LRRK2-Gen 17-22 verbunden. Hier wird eine biochemische Extraktionsprotokoll (siehe Schema in Abbildung 1 dargestellt) für die immer unlösliche α-syn Ablagerungen aus menschlichem post-mortem Gehirngewebe PD, die α-syn-Aggregate in unterschiedlichem Ausmaß beherbergen beschrieben worden. Diese Technik kann auch mit Modifikationen in Pufferzusammensetzungen zu aggregierten Proteine ​​von anderen neurodegenerativen Erkrankungen 23,24 untersuchen und auch von transgenen Tierhirngewebe 25-27 angepasst werden. Das wichtigste Kriterium für den Anpassungen sind die Unterschiede in solubikeit und die Gesamtmengen der jeweiligen Proteine, von denen einige vor allem Kernenergie und kann Hochsalzpuffer muss für eine optimale Extraktion wie für FUS 28 dargestellt.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Tabletten</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase-Hemmer Tabletten</td><td>Roche&nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalztabletten&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Laufpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transferpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-P Membran</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM Filterpapier</td><td>Sigma</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris Gele 4-12%&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>NP0322BOX</tr><tr><td>Supersignal West Pico Chemilumineszenzsubstrat</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Bio-RAD DC Protein-Assay-Kit&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>Dickwandige Beckman Polycarbonat-Röhrchen</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>Western-Blot-Stripping-Puffer</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Syn-1 Primärantikörper (monoklonal der Maus)</td><td>BD</td><td>Biosciences 610786</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Aktin-Primärantikörper (monoklonal der Maus)</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP kojugierter Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Instrument</td><td>Company</td><td>Rotor/ Modell-Nr&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Ultrazentrifuge Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Heat Systems</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>Jenke und Kunkel</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

sequentielle extraktion von löslichen und unlöslichen alpha-synuclein von parkinson-brains

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-Synuclein (α-syn) Protein ist reichlich hauptsächlich in Neuronen exprimiert wird, und kommt in einer Reihe von verschiedenen Formen - Monomere, Tetramere, Oligomeren und Fibrillen. Während der Krankheit, α-syn erfährt Konformationsänderungen zu Oligomeren und Aggregaten mit hohem Molekulargewicht, die das Protein mehr unlöslich zu machen sind in der Regel zu bilden. Ungewöhnlich aggregierten α-syn ist ein neuropathologischen Merkmal der Parkinson-Krankheit (PD), Demenz mit Lewy-Körperchen (DLB) und Multisystematrophie (MSA). Biochemischen Charakterisierung und Analyse von unlöslichen α-syn unter Verwendung von Puffern mit zunehmender Waschmittelfestigkeit und Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Entwicklung von α-syn Pathologie, die mit Fortschreiten der Krankheit assoziiert zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von immer unlösliche / aggregierten α-syn aus post-mortem menschlichem Gehirngewebe. Diese Methode kann mit Modifikationen Untersuchungen normaler und abnormaler α angepasst werden-syn Biologie in transgenen Tiermodellen Beherbergen verschiedener α-syn-Mutationen sowie in anderen neurodegenerativen Krankheiten, die aberrant fibrillären Ablagerungen von Proteinen, um ihre jeweiligen Pathologien ähnliche Funktion.

TBS, SDS und Harnstoff lösliche Proteine ​​aus Basalganglien nach dem in Figur 1 dargestellten Protokolls extrahiert wurden auf Gelen laufen gelassen und mit dem Syn-1 monoklonalen Maus-α-syn primären Antikörper immungeblottet. Die TBS löslichen Fraktionen zeigten die Anwesenheit von monomeren α-syn (~ 14 kDa-Spezies) im PD und Kontrollfällen untersucht (Abbildung 2A). Die SDS löslichen Fraktionen zeigten auch reichlich monomeren α-syn in allen drei Subtypen von Fällen untersucht, wie in der geringen Exposition Blot (2C) angezeigt. Die PD Fällen zeigte auch höheres Molekulargewicht (MW) α-syn-Spezies auf der hohen Belichtungs Blot gesehen, die wahrscheinlich Oligomere (2C) sind. Der Harnstoff lösliche Fraktionen von PD Fälle zeigten erhöhte Mengen an α-syn-Monomere, Oligomere und im Vergleich zu Fällen zu steuern aggregierten Spezies. Die neokortikalen idiopathischer PD Fälle zeigen höhere Mengen an AGGREG<html> ATED α-syn-Spezies, während die limbischen Fälle zeigen Zwischenstufen von unlöslichen α-syn. Sowohl die SDS und Harnstoff-Fraktionen aus idiopathischer PD Fälle zeigen variable Ebenen der abgeschnittenen α-syn-Produkte bei 12 kDa und 6 kDa wie beschrieben 20. Im Gegensatz dazu die Steuer Fällen keine unlöslichen oder aggregierten α-syn (2E) zu zeigen. Semi-quantitative Dichte Maßnahmen spiegeln die Menge der LB Last categoriesd mit α-syn Immunhistochemie was die unlösliche Natur der aggregierten α-syn (2B, 2D, 2F) im Neokortex und limbischen PD Fällen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der unlöslichen α-syn-Extraktionsverfahren.rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Immunoblots von α-syn Stufen von PD und menschlichem Gewebe zu steuern. TBS, SDS und Harnstoff löslichen Fraktionen von Basalganglien (einer Region, die α-syn Pathologie birgt in PD Fälle) der idiopathischen PD Fälle und neurologisch normalen (Kontroll-) Gehirne wurden auf die Anwesenheit von α-syn mit Western Immunoblot analysiert. 10 ug Protein wurde auf jede Spur geladen. In TBS, die Anteile (A), hauptsächlich α-syn-Monomere sind in allen Fällen vorhanden. In SDS-Fraktionen (C), werden einige Oligomere von α-syn zusammen mit Monomeren, die hauptsächlich in der PD Gewebe gesehen. In Harnstoff-Fraktionen (C), Monomere, Oligomere und aggregierte α-syn variabel in der PD Fällen reflectin exprimiertg jeweiligen LB Last. Die neurologisch normalen Kontrollproben zeigen die Gegenwart von nur geringen Mengen an monomeren α-syn. Bitte beachten Sie mögliche Abbauprodukte von α-syn sind in einem Teil der Fälle mit hoher LB Last gesehen. Der feste Pfeilspitze stellt den monomeren Form des α-syn. Der * möglicherweise eine C-terminal verkürzte Form von α-syn, wie zuvor beschrieben 20,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Fall </td><td> Sex </td><td> alter Jahre </td><td> Post-mortem-Verzögerung (Stunden) </td><td> pH-Wert des Gewebes </td></tr><tr><td> Neokortikalen 1 </td><td> M </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> Neokortikalen 2 </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35,3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> Limbic 1 </td><td> M </td><td> 81 </td><td> 28,5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Limbic 2 </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36,5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Control 1 </td><td> M </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> Control 2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32,5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Begrenzte Demographie der Fälle verwendet

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von zunehmend unlöslichem/aggregiertem alpha-Synuclein (α-syn) aus postmortalem menschlichem Hirngewebe. Durch die Verwendung von Puffern mit zunehmender Detergensfestigkeit und Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugationstechniken können die variablen Eigenschaften der α-syn-Aggregation in erkranktem und nicht erkranktem Gewebe untersucht werden.

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, lösliches und unlösliches Alpha-Synuclein aus postmortalen Parkinson-Hirnen zu extrahieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen in der Forschung zur Parkinson-Krankheit zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine vergleichsweise einfache Methode ist, die gängige Laborreagenzien und -geräte verwendet. Nachdem die erforderlichen Lösungen und Puffer hergestellt wurden, beginnen Sie damit, eine 0,5 Gramm Probe gefrorenen Gewebes der Basalganglien auf eine kleine Petrischale zu geben. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sterilen Skalpellklinge rasch in eingeschnittene Fragmente von einem Millimeter Kantenlänge. Sammeln Sie das zerkleinerte Gewebe in einem 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie 10 Volumina eiskaltes 1X TBS hinzu.Homogenisieren Sie die Proben mithilfe eines mechanischen Homogenisators bei 20.000 U/min für 10 Sekunden. Danach zwei Minuten lang auf Eis abkühlen. Wiederholen Sie den Homogenisierungsschritt dreimal, wobei jedes Mal auf Eis abgekühlt wird.Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 10.000 × g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Überführen Sie den groben Homogenat-Überstand in Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie eine Stunde lang bei 100.000 × g bei vier Grad Celsius. Überführen Sie den Überstand in vorgekühlte Röhrchen auf Eis, und bewahren Sie diese als TBS-lösliche Fraktion auf.Waschen Sie mit dem Fünffachen Volumen 1X TBS-Puffer und zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 100.000 × g und vier Grad Celsius. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie dann den Waschschritt.Das gründliche Waschen der Pellets zwischen den Ultrazentrifugationsschritten ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens. Nachdem die Proben auf eine Temperatur von 10 Grad Celsius gebracht wurden, um eine Fällung von SDS zu vermeiden, geben Sie das Fünffache des Volumens an 1X TBS-SDS hinzu und resuspendieren das endgültige Pellet durch Beschallung für 10 Sekunden bei 20 Kilohertz bei Raumtemperatur. Führen Sie die Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für 30 Minuten bei 25 Grad Celsius durch.Nach der Ultrazentrifugation das Überstand in abgekühlte Röhrchen auf Eis überführen und als SDS-löslichen Anteil aufbewahren. Fünf Volumina 1X TBS-SDS-Puffer mit Raumtemperatur zum Pellet geben und bei 100.000 ×g für 15 Minuten bei 25 Grad Celsius zentrifugieren. Den Waschpuffer verwerfen und die Wäsche wiederholen.Nach dem Verwerfen des Überstandes 50 Mikroliter 1X TBS-SDS-Harnstoff hinzufügen und durch Ultraschallbehandlung bei 20 Kilohertz für 10 Sekunden solubilisieren. Dieses Probensubstrat als harnstofflösliche Fraktion kennzeichnen. Es ist entscheidend, gründlich sicherzustellen, dass alle unlöslichen Proteine im Verfahren extrahiert werden.Verdünnen Sie die TBS-SDS-Harnstoff-Proben im Verhältnis 1:1 mit 1× TBS-Puffer, um die Verträglichkeit mit Protein-Assay-Reagenzien zu gewährleisten, und bestimmen Sie den Gesamtgehalt an Protein in jeder Fraktion mithilfe eines kommerziellen Protein-Assay-Kits gemäß der Anleitung des Herstellers. Portionieren Sie die Proben in Aliquots zu je 20 Mikroliter mit 10 % Glycerin, um zukünftige Einfrier- und Auftauzyklen zu reduzieren, und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Laden Sie jeweils 10 Mikroliter der TBS-, TBS-SDS- und TBS-SDS-Harnstoff-Extrakte zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker auf ein 10-vertiefte Bis-Tris-Polyacrylamidgel mit 4–12 %, wobei MOPS als Laufpuffer dient, unter Verwendung standardisierter Techniken.Laufen Sie das Gel eine Stunde lang bei 200 Volt, oder bis sich der blaue Farbstoff aus dem Lade-Puffer am unteren Rand des Gels befindet. Benetzen Sie eine Nylonmembran mit 100 % Methanol und tauchen Sie sie anschließend in Transferpuffer, der 20 % Methanol enthält. Machen Sie eine Markierung auf der Blot, um die Proteinseite sowie die Orientierung der Molekulargewichts-Marker zu bestimmen.Platzieren Sie das Gel zusammen mit der Membran zwischen feuchtem Filterpapier. Führen Sie die Übertragung zwei Stunden lang bei 40 Volt durch. Blockieren Sie die Membran 30 Minuten lang in einer 5 %igen BSA-Lösung in 1X PBS-T unter Schütteln bei 70 U/min, um eine unspezifische Bindung des primären Antikörpers an die Membran zu verhindern.Die Proteinblot-Probe durch Inkubation mit sechs Milliliter des Primärantikörpers gegen Alpha-Synuclein, Syn-1, verdünnt im Verhältnis 1:750 in PBS-T, über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag die Membran dreimal für jeweils fünf Minuten mit 1X PBS-T waschen. Anschließend den Blot mit dem geeigneten HRP-konjugierten sekundären Antikörper, verdünnt im Verhältnis 1:2.000 in PBS-T, für 30 Minuten inkubieren.Spülen Sie die Membran wie zuvor mit 1X PBS-T. Tauchen Sie die Blots gemäß den Herstelleranweisungen in einer Dunkelkammer in die verbesserte Chemilumineszenzlösung. Bedecken Sie die Blots mit Abdeckfolie und erfassen Sie das Signal mittels Autoradiographie.Nach der Bildgebung die Westernblot-Membran mit sechs Milliliter Westernblot-Abbaupuffer unter ständigem Schütteln 10 Minuten lang inkubieren, um das Signal des Alpha-Synuclein-Antikörpers zu entfernen. Den Westernblot-Vorgang wiederholen, um die Membran mit dem primären Beta-Aktin-Antikörper in einer Verdünnung von 1:8.000 zu prozessieren. Das endgültige Bild scannen und als Tiff-Bild speichern, anschließend die Bandendichten mit NIH ImageJ zur Quantifizierung auswerten.Die folgenden Bilder zeigen repräsentative Immunblots der Alpha-Synuclein-Konzentrationen aus dem Basalganglien-Gewebe von Patienten mit Morbus Parkinson und Kontrollpersonen. Die in TBS-, SDS- und Harnstoff-löslichen Fraktionen wurde mittels Western-Immunblot auf das Vorhandensein von Alpha-Synuclein analysiert. Pro Band wurden 10 Milligramm Protein aufgetragen.In der TBS-Fraktion sind Alpha-Synuclein-Monomere in allen Fällen vorhanden. Das Sternchen stellt möglicherweise eine C-terminal abgeschnittene Form von Alpha-Synuclein dar. In der SDS-Fraktion sind einige Oligomere von Alpha-Synuclein zusammen mit Monomeren zu beobachten, wie durch den durchgezogenen Pfeil im PD-Gewebe angezeigt.In der Harnstoff-Fraktion werden Monomere, Oligomere und aggregiertes Alpha-Synuclein in den PD-Fällen variabel exprimiert, was deren jeweiliger Lewy-Körper-Last entspricht. Die neurologisch normalen Kontrollproben weisen nur geringe Mengen monomeren Alpha-Synucleins auf. Sobald die Methode beherrscht ist, kann diese Proteinextraktionstechnik innerhalb eines Arbeitstages durchgeführt werden, gefolgt von einer westlichen Immunoblot-Analyse am nächsten Tag, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Lewy-Körper-Biologie den Weg, um lösliche und aggregierte Alpha-Synuclein-Spezies in pathologischem menschlichem Gewebe sowie in tierischen In-vivo-Modellen zu untersuchen. Beachten Sie, dass beim Arbeiten mit ungefestigtem menschlichem Gewebe Vorsichtsmaßnahmen erforderlich sind und während aller Handhabungsschritte Handschuhe und Laborkittel getragen werden sollten.

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt einen Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis von neurodegenerativen krankheitsspezifischen Alpha-Synuclein-Aggregaten in Hautbiopsieschnitten. Die frei schwebende Immunfärbung wird eingesetzt, um die Carboxyl-terminale Hydrolase und die alpha-Synuclein-Aggregate in den dermalen Neuronen fluoreszierend zu markieren. Unter einem konfokalen Mikroskop zeigen Zellen mit Fluoreszenz beider Antikörper das Vorhandensein von Alpha-Synuclein-Aggregaten in den dermalen Neuronen an.

Ein Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis von Alpha-Synuclein-Aggregaten in einem Hautbiopsieschnitt

Dieses Video zeigt den Prozess der Quantifizierung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus, die mit alpha-Synuclein-vorgeformten Fibrillen vorbehandelt wurden. Es werden die Schritte zur Fixierung, Färbung und Quantifizierung der Dopamin-Neuronen, die Alpha-Synuclein-Aggregate enthalten, mittels Immunfluoreszenz beschrieben.

Untersuchung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus

Quelle: Bétemps, D., et al.,  Nachweis von krankheitsassoziiertem α-Synuclein durch verstärkten ELISA im Gehirn transgener Mäuse, die humanes A53T-mutiertes α-Synuclein überexprimieren. J. Vis. Exp. (2015). Dieses Video zeigt das Verfahren zum Nachweis des neurodegenerativen krankheitsassoziierten Proteins α-Synuclein im Hirngewebe von transgenen Mäusen mittels ELISA. Die Schritte umfassen die Homogenisierung des Gewebes, die Zentrifugation und den ELISA-Nachweis des α-Synuclein-Proteins zur...

Nachweis von neurodegenerativem Protein α-Synuclein mittels ELISA

Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie in Kombination mit der Biopanning-Technologie haben wir ein negatives und positives Biopanning-System entwickelt, um Antikörper gegen krankheitsspezifische Proteinvarianten zu gewinnen, die in jedem biologischen Material vorhanden sind, selbst bei niedrigen Konzentrationen.  Es ist uns gelungen, Antikörper gegen TDP-43-Proteinvarianten zu erhalten, die an der Amyotrophen Lateralsklerose beteiligt sind.

Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Es wird ein ELISA beschrieben, der einen neuartigen quantitativen Ansatz bietet. Er erkennt spezifisch krankheitsassoziiertes α-Synuclein (αSD) in einem transgenen Mausmodell (M83) der Synucleinopathie unter Verwendung mehrerer Antikörper entweder gegen die Serin129-phosphorylierte αS-Form oder den C-terminalen Teil des Proteins.

Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein durch verbesserte ELISA im Gehirn von transgenen Mäusen Expression Menschen A53T Mutierte α-Synuclein

Das Ziel dieses Protokolls ist, ein Zell-basierte System, das die Bildung von Alpha-Synuclein repliziert in Vivoaggregiert zu bieten. Intrazelluläre Alpha-Synuclein Einschlüsse sind in primären Neuronen durch die Internalisierung ausgesät und Vermehrung von exogenen verabreicht native microsomen-assoziierten Alpha-Synuclein-Aggregaten von erkrankten Alpha-Synuclein transgenen Mäusen isoliert.

Exogene Verabreichung von Alpha-Synuclein Microsomen verbundenen Aggregate zur primären Neuronen als eine mächtige Zellmodell der Fibrillen Bildung

Hier stellen wir ein Protokoll für einen frei schwebenden indirekten Immunfluoreszenz-Assay auf Hautbiopsieabschnitten vor, das die Identifizierung von krankheitsspezifischen Konformationsvarianten von Alpha-Synuclein ermöglicht, die an der Parkinson-Krankheit und mehreren Proteinen der peripheren Nervensystems.

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Kutane periphere Nervenfasern durch frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay

Das Ziel dieses Artikels ist es, die Schritte zu skizzieren, die für die Herstellung von Fibrillen aus monomem Alpha-Synuclein, anschließende Qualitätskontrolle und die Verwendung der vorgeformten Fibrillen in vivo erforderlich sind.

Generation von Alpha-Synuclein vorgeformten Fibrillen aus Monomers und Einsatz In Vivo

Hier, Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der neuronalen Synuclein-Akkumulation in primären Maus-Dopamin-Neuronen. Phosphorylierte-Synuclein-Aggregate in Neuronen werden mit vorgebildeten ,-Synuclein-Fibrillen induziert. Die automatisierte Bildgebung von immunfluorest markierten Zellen und die unvoreingenommene Bildanalyse machen dieses robuste Protokoll für das Screening von Medikamenten mit mittlerem bis hohem Durchsatz geeignet, die die Akkumulation von Synuclein...

Studium der vorgeformten Fibril-induzierten Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Maus-Midbrain-Neuronen

Diese Arbeit analysiert die Vektordosis und die Expositionszeit, die erforderlich sind, um Neuroinflammation, Neurodegeneration und motorische Beeinträchtigung in diesem präklinischen Modell der Parkinson-Krankheit zu induzieren. Diese Vektoren, die das menschliche α-Synuclein kodieren, werden in die Substantia nigra geliefert, um die mit der Parkinson-Krankheit verbundene Synuclein-Pathologie zu rekapitulieren.

Analyse des Parkinson-Mausmodells, das durch Adeno-assoziierte virale Vektoren induziert wird, die menschliches α-Synuclein kodieren

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur intranasalen Verabreichung von α-Synuclein-Aggregaten. Diese Methode gibt Aufschluss über die α-Synuclein-Ausbreitung von der Riechschleimhaut zum Riechkolben bei der Parkinson-Krankheit.

Technik zur intranasalen Verabreichung von α-Synuclein-Aggregaten

Lernen Sie die sequentielle Extraktion von löslichem und unlöslichem Alpha-Synuclein aus post-mortem Parkinson-Gehirngewebe. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Proteinaggregationen mittels Ultrazentrifugation und Western Blot.

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

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