Name: Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Lernen Sie die Ex-vivo-Elektroporation von Hühner-Kleinhirnschnitten zur Untersuchung von Körnerzellentwicklung. Diese Methode ermöglicht gezielte genetische Modifikationen zur Analyse neuronaler Vorläuferzellen.

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Die in diesem Artikel vorgestellte Methode entstand aus der Arbeit durch die BBSRC BB / finanziert I021507 / 1 (TB, RJTW) und eine MRC Doktor studentship (MH).

Hinweis: Alle Experimente wurden mit entsprechend den Kings College London, Großbritannien und die britische Innenministerium Tierpflege-Richtlinien durchgeführt. 1. Präparation der e14 Cerebellum <ol><li> Braun befruchteten Hühnereiern Inkubation bei 38 ° C zu embryonalen Tag 14. </li><li> Mit Ei Schere enthaupten Hühnerembryo in ovo, und entfernen Sie den Kopf auf eine Petrischale mit eiskaltem PBS (Abbildung 1A). </li><li> Verwendung von Standard-Pinzette, machen Einschnitte hinter jedem Auge den ganzen Weg durch das Gewebe, das Entfernen der Augen und Oberkiefer. Einen zweiten Schnitt ganz durch den Rachen Entfernen des Unterkiefers (Abbildung 1B). </li><li> Verwendung von Standard-Pinzette, entfernen Sie die Haut von der Oberfläche des Schädels durch Abziehen es weg (Abbildung 1c), und entfernen Sie frontalen und parietalen Knochen und enthüllt Gehirn. </li><li> Aus einer ventralen Seite, entfernen Rachen Knorpel und Hilfs Mesenchym. </li><li> Aus einer dorsalen, vorsichtigly entfernen Mesenchym dorsal der Hinterhirn dabei nicht pia und separate gesamte Gehirn (1D) beschädigen. </li><li> Machen Einschnitt den ganzen Weg durch das Gewebe zwischen Mittelhirn und Hinterhirn und Hinterhirn separaten einschließlich Kleinhirn (1E). </li><li> Durch Einschnitte den ganzen Weg durch das Gewebe an beiden seitlichen Übergängen von Kleinhirn und Flügelplatte des Hinterhirn, entfernen gesamte Kleinhirn, kümmert sich um die Integrität der Pia gesamten Dissektion (1F) zu halten. Entfernen Sie die bildenden Plexus (1G). </li><li> Bewegen Sie den seziert Kleinhirn in eiskaltes HBSS. </li></ol> 2. Scheibe Kultur von e14 Cerebellum <ol><li> Übertragen die gesamte Kleinhirn in den sterilen Plattform einer Tissue Chopper mit einem Spatel oder ein 3 ml Pasteurpipette mit der Spitze weggeschnitten ist, um die Öffnung zu erweitern. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette. </li><li> Schneiden gesamte Ganze Kleinhirn in ter benötigt Orientierung bei 300 &amp; mgr; m Dicke mit dem Gewebe Chopper mit einer Schnittgeschwindigkeit eingestellt auf 50% des Maximums. Gewebeintegrität wird am einfachsten im Sagittalschnitt bewahrt; jedoch ist die Orientierung auch ein wichtiger Gesichtspunkt für die Zellanalyse (Purkinjezelle Dendriten sagittal ausgerichtet sind, während die Körnerzell Axone verlaufen quer, senkrecht zur Ebene der Purkinje Zelle Dendriten). </li><li> Mit einem 3 ml Pasteurpipette, decken Sie die in Scheiben geschnittenen Kleinhirn in eiskaltem HBSS. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben in HBSS auf eine 60 mm Petrischale mit Eis kalte Frisch HBSS mit einem 3 ml Pasteurpipette mit geschnittenen Spitze. </li><li> Unter einem Binokular mit einem faseroptischen Lichtquelle beleuchtet wird, sicherzustellen, Trennung der einzelnen Scheiben mit Uhrmacher Pinzette. Identifizieren Scheiben elektroporiert werden, auf der Grundlage ihrer Gewebeintegrität und medio-laterale Position. Hinweis: Jeder Dissektion vom Embryo bis zur Inkubation in Kulturmedium in Scheiben schneiden dauert etwa 10-20 min je upon-Erlebnis. Zuführen Dissektionen eine zu einem Zeitpunkt, um sicherzustellen, dass cerebella verbringen minimalen Zeitspanne zwischen Dekapitation und ex vivo-Kultur. </li></ol> 3. Elektroporation von Slices <ol><li> Konstruktion eines Elektroporationskammer durch Fixieren der Anode einer Elektroporator auf der Basis einer 60 mm Petrischale mit Isolierband. In etwa 1 ml HBSS, um die Elektrode zu bedecken. </li><li> Legen Sie eine 0,4 um Kultureinsatz an der Spitze der Elektrode in HBSS bedeckt. Lassen Sie das Kultureinsatzes auf die Elektrode dafür sorgen, gibt es immer zwischen dem Einsatz und der Elektrode kontaktieren ausruhen. Hinweis: In dieser Konfiguration wird der Kultureinsatz mit den Scheiben auf die Oberfläche der Lösung liegen, die Aufrechterhaltung der Schaltung, sondern ermöglicht räumliche Ausrichtung der Kathode. </li><li> Transfer identifizierten Scheiben (bis zu fünf pro Kultureinsatz) auf Kultureinsatz mit 3 ml Pasteurpipette mit dem Schnitt Spitze. Separate und lassen Sie sie in einem sagitt auf Kultureinsatzes absetzenal Ausrichtung. </li><li> Mit einer Pipette entfernen überschüssiges HBSS, so dass Scheiben sind in der Lösung nicht mehr gebadet. </li><li> Verwendung einer P10-Pipettenspitze, einer Pipette DNA (bei einer Konzentration von 1 ug / ul) mit 20% Fast Green über die Oberfläche der Zielregion einer Scheibe verdünnt. 20% schnell grün sorgt für viskose DNA-Lösung und verhindert, dass übermäßig breite Streuung der DNA. In etwa 5 &amp; mgr; l DNA / schnell grün Lösung für jede Scheibe (2B). </li><li> Legen Sie die Kathode über gewünschte Zielgewebe und elektroporieren mit 3 x 10 V, 10 ms Dauer Impulse. Vermeiden Sie direkten Kontakt der Kathode mit dem Gewebe. Stattdessen profitieren Sie von der Oberflächenspannung der Flüssigkeit, um Leitfähigkeit zu halten (platzieren Sie die Kathode so nah an das Gewebe wie möglich, ohne zu berühren das Gewebe). </li><li> Wiederholen DNA Lieferung und Elektroporation, um mehrere Regionen der EGL auf jedem einzelnen Kleinhirn Scheibe nach Wunsch. </li><li> Nach Abschluss der Elektroporation, Transfer Kultur insert bis 30 mm Petrischale. </li><li> Zu jeder Kultur, 1 ml der vorgewärmten Kulturmedium (Basal Medium Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - Glucose, 1% B27 ergänzen, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin) unter dem Kultureinsatz, so dass die Kultureinsatzes in Kontakt mit dem Medium, aber Scheiben sind nicht in sie getaucht. </li><li> Kulturen, die bei 37 ° C / 6% CO 2 inkubieren bis 3 Tage. Ersetzen Sie den gesamten Kulturmedium alle 24 Stunden mit frischem vorgewärmten Medium. </li><li> Nach der Kultur, zu beheben Scheiben auf Kultureinsätze für 1 Stunde in 4% Paraformaldehyd (oder O / N bei 4 ° C) in einem frischen 30-mm-Schale ohne Kulturmedien. </li></ol> 4. Imaging von Kleinhirn-Slices <ol><li> Nach der Fixierung, Waschen Scheiben 3 mal 5 min in PBS. </li><li> Mit einer Rasierklinge, sezieren jede Elektroporation und kultivierten zerebellären Scheibe aus dem Kultureinsatzes durch Schneiden um die Scheibe und das Entfernen der Scheibe und den Bereich der Einsatz es eingehalten wird. MachenVersuchen Sie nicht, Scheibe aus der Kultur Einsatzoberfläche zu entfernen. </li><li> Berg Scheiben in etwa 1 ml Eindeckmedium enthält DAPI (falls gewünscht) unter einem Deckglas dabei nicht zu Blasen einzuführen und Bild mit Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie. Anmerkung: Bildparameter können gemß den Konstrukten elektroporiert variiert werden und liegt im Ermessen des jeweiligen Benutzers. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Protokoll hier berichteten beschreibt ein Verfahren zum Präparieren, Elektroporation und Kultivieren Scheiben embryonalen Tag 14 Kleinhirn von der Küken. Dieses Protokoll ermöglicht Targeting der Elektroporation zur kleinen Brenn Regionen der EGL, einschließlich isolierten Ausrichtung der einzelnen Kleinhirnlappen. Es ermöglicht die genetische Analyse und Bildgebung mit einer hohen Auflösung und Bequemlichkeit, und zu geringen Kosten im Vergleich zu etablierten Techniken in Nagetieren 43-47. Eine solche A...

Das Kleinhirn sitzt am vorderen Ende der Hinterhirn und ist für die Integration von sensorischen und motorischen Verarbeitung im reifen Gehirn verantwortlich sowie die Regelung höhere kognitive Prozesse 1. In Säugetieren und Vögeln, eine aufwendige Morphologie besitzt sie und ist stark blättrigen, ein Produkt der umfangreichen Transit Amplifikation von Vorläuferzellen während der Entwicklung, die mehr als die Hälfte der Nervenzellen im erwachsenen Gehirn produziert. Das Kleinhirn ist für Neurobiologen seit Jahrhunderten und in der molekularen Ära ein Thema der Studie hat ebenfalls erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. Dies bezieht sich nicht nur auf ihre inhärent interessante Biologie, sondern auch auf die Tatsache, dass es stark in menschlichen Erkrankungen einschließlich Entwicklungs genetische Störungen wie Autismus 2 und am deutlichsten Kleinhirnkrebs, Medulloblastom 3, die die häufigste pädiatrische Gehirn beteiligt ist Tumor. Wichtig ist, dass es ein ausgezeichnetes Modellsystem im which dem Schicksal Allokation und Neurogenese während der Gehirnentwicklung 4 studieren. In den letzten Jahren hat es sich auch als Modellsystem für die vergleichende Untersuchung der Entwicklung des Gehirns festgestellt wurde, auf Grund der großen Vielfalt von Formen für die Kleinhirnwirbel phylogeny 5-10 ersichtlich. Das Kleinhirn entwickelt sich von der dorsalen Hälfte Rhombomer 1 im Hinterhirn 11 und entwicklungs besteht aus zwei primären Vorläuferpopulationen, die Rautenlippe und der ventrikulären Zone zusammen. Die rhombische Lippe erstreckt sich um den dorsalen Bereich des Neuroepithels des Rautenhirns an der Grenze mit dem Dachblech. Es ist der Geburtsort der glutamatergen erregenden Neuronen des Kleinhirns 12-14. Die ventrikuläre Zone führt zu den inhibitorischen GABAergen Neuronen des Kleinhirns, allen voran die großen Purkinje Neuronen 14,15. Später in der Entwicklung (von etwa embryonalen Tag 13,5 in Maus; e6 in chick 16), glutamatergen PROGENitors tangential wandern von der Rautenlippe und bilden eine Schicht der Pia-Vorläuferzellen: eine sekundäre Vorläuferzone genannt externen Körnerschicht (EGL). Es ist diese Schicht, die den umfangreichen Transit Verstärkung, die auf die große Zahl von Körnerzellen im reifen Gehirns führt erfährt. Proliferation im EGL seit langem zum Teil pial Platz, in tangentiale Migration vom rhombischen Lippe 17 führt in Verbindung gebracht worden, wobei der Schalter auf den Zellzyklus verlassen und die neuronale Differenzierung von Vorläufern mit ihrem Austritt aus dem Außen EGL Schicht in der Mitte zugehörigen EGL 18. Umfangreiche tangentiale Migration von postmitotischen Körnerzellen im medial-laterale Achse erfolgt in der mittleren und inneren EGL 19, vor dem abschließenden radialen Wanderung in die innere Körnerschicht des reifen Kleinhirnrinde. Migration von Zellen aus dem rhombischen Lippe über der Kleinfläche abhängt CXCL12 Signalisierung vom pia 20-22 </sup&gt; Und Körnerzellen exprimieren das CXCL12-Rezeptor CXCR4. Ihre tangentiale Migration ist somit erinnert an die des Neokortex tangential Migration hemmenden Intern Bevölkerung 23-25. Interessanterweise elektronenmikroskopischen Untersuchungen 17 haben vorgeschlagen, dass die EGL-Zellen mit einer proliferativen Morphologie beizubehalten Pia-Kontakt, die Verknüpfung Zellverhalten mit proliferative Fähigkeit in einer Art und Weise erinnert an die basalen Vorläuferzellen der Säugetier Cortex 26. Dies wird in der vorgenannten Schichtung der EGL in drei Unterschichten, die durch verschiedene extrazelluläre Umgebungen und wo Körnchen Vorstufen haben verschiedene Genexpressions 18 definiert sind, reflektiert wird. Proliferation von Vorläufern im oEGL tritt mit einer Normalverteilung von Klon Größen, so dass zu einem Medianwert von 250-500 g postmitotischen wenn Progenitoren einzeln genetisch am Ende der Embryonalentwicklung der Maus markiert, sie gebenranule Neuronen 27,28. Proliferation ist abhängig von mitogenen SHH-Signalisierung von der zugrunde liegenden Purkinje Neuronen 29-32. Die Fähigkeit, auf Shh antworten hat sich gezeigt, völlig abhängig von zellautonomen Expression des Transkriptionsfaktors Atoh1 zu sein, sowohl in vitro als auch in vivo 33 34,35. Ebenso Zellzyklus verlassen und Differenzierung wurde gezeigt, abhängig von der Expression des Downstream-Transkriptionsfaktor NeuroD1 36, die wahrscheinlich eine direkte Repressor Atoh1 37 sein. Trotz dieser Fortschritte und erheblichen Fortschritt in der Entzifferung der zellbiologischen Grundlagen der Zellzyklus-Ausgang 38-42, die grundlegende molekulare Mechanismus (n), die die Entscheidung zugrunde liegen, die den Zellzyklus zu verlassen und von einem Stammvater zu einem differenzierenden Neuronen übergehen, und die assoziierten postmitotischen tangentiale Migration im inneren EGL sowie die später Schalterum die radiale Migration, bleiben unvollständig verstanden. Dies ist zu einem großen Teil aufgrund der experimentellen intractability der EGL: es spät entwickelnden und genetisch schwer gezielt da viele der neurogenen Moleküle sind auch entscheidend früher im Leben der Granulat Vorstufen am rhombischen Lippe. Um dieses Problem zu überwinden, wurden zahlreiche Autoren in vivo und ex vivo Elektroporation als eine Methode, um die postnatale Kleinhirn bei Nagern 43-48 Ziel entwickelt. Hier haben wir Pionierarbeit in der Verwendung von ex vivo Elektroporation in Küken, die EGL, die erhebliche Vorteile in Bezug auf Kosten und Bequemlichkeit stellt studieren. Unsere Methode der Elektroporation und ex vivo Schnittkultur von Chick Kleinhirngewebe verwendet Gewebe aus embryonalen Tag seziert 14 Küken auf dem Höhepunkt der EGL Verbreitung. Diese Methode ermöglicht es genetische Targeting des EGL unabhängig rhombischen Lippe und die Bühne für Genetik der Übergang vom Granulat eingestelltVorläufer zu postmitotischen Granulat Neuronen im Kleinhirn.

<table><tbody><tr><td>McIlwain Gewebehacker</td><td>Mickle Laboratory Engineering Ltd</td><td></td><td>Schnitt bei 300 &mu; m für beste Ergebnisse.</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle (Gibco)</td><td>Life Technologies</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>0,4 &mu; m Kultureinsatz</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>TSS20 Ovodyne Elektroporator&nbsp;</td><td>Intracel</td><td>01-916-02</td><td>Verwenden Sie 3 x 10 V, 10 ms Impulse für die Elektroporation.</td></tr></tbody></table>

ex-vivo-kultur von chick kleinhirn-slices und räumlich gezielte elektroporation von körnerzellvorstufen

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Die Kleinhirn externen Körnerschicht (EGL) ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn, und ein hervorragendes Modell für neuronale Proliferation und Differenzierung des Studiums. Darüber hinaus evolutionären Modifikationen ihrer Proliferationsfähigkeit wurden für die dramatische Ausweitung der Kleinhirngröße in den Amnioten verantwortlich, so dass das Kleinhirn ein hervorragendes Modell für Evo-Devo-Studien des Wirbeltiergehirns. Die konstituierenden Zellen der EGL, Kleinhirn-Körnervorläuferzellen, auch einen signifikanten Zellherkunfts stellen für Medulloblastom, die am häufigsten pädiatrischen neuronalen Tumor. Nach dem Transit-Amplifikation, Granulat Vorstufen migrieren radial in die innere Körnerschicht des Kleinhirns, wo sie den größten neuronalen Population im reifen Gehirn von Säugetieren dar. In chick, der Höhepunkt der EGL Proliferation tritt gegen Ende der zweiten Woche der Schwangerschaft. Um genetische Veränderung auf diese Schicht bei Targetder Peak der Proliferation, haben wir ein Verfahren zur genetischen Manipulation durch ex vivo-Elektroporation von Cerebellum Scheiben aus embryonalen Tag 14 Kükenembryos entwickelt. Dieses Verfahren faßt einige wichtige Aspekte der in vivo Granulatneuronenentwicklung und ist nützlich bei der Erzeugung ein gründliches Verständnis der Kleinhirn-Körnerzellproliferation und -differenzierung sein, und damit der Kleinhirn-Entwicklung, Evolution und Krankheit.

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele von Ergebnissen, die unter Verwendung von Scheiben Elektroporation und die Kultur des Kleinhirns aus embryonalen Tag 14 Küken gewonnen werden können. Die Präparation des Kleinhirns ist in Abbildung 1 veranschaulicht und die Elektroporationskammer einzurichten ist in Abbildung 2 dargestellt. Wir zeigen, dass es möglich ist, Kultur Kleinhirnschnitten, die ihre Struktur und Zellmorphologie in vitro ...

Die Kleinhirn externen Körnerschicht ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn. Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung, die diese Schicht an der Spitze der Proliferation unter Verwendung ex vivo Elektroporation und Kultur zerebelläre Scheiben aus embryonalen Tag 14 Hühnerembryonen zu zielen.

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, genetische Modifikationen gezielt auf die äußere Keimschicht des Kleinhirns des Huhns anzuwenden, um die Morphologie und das Verhalten von Granulazellen in einer ex vivo-Umgebung zu beobachten, zu untersuchen und zu verändern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsneurobiologie zu beantworten, beispielsweise wie sich neuronale Vorläuferzellen fortbewegen, proliferieren und differenzieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die erheblichen Vorteile hinsichtlich Kosten und Handhabung bietet, die mit solchen Untersuchungen verbunden sind.Obwohl diese Methode Einblicke in die Entwicklung von Granula bei Hühnern ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Modellorganismen wie Reptilien und Säugetiere anwendbar. Beginnen Sie damit, befruchtete braune Hühnereier in einen Brutkasten bei 38 Grad Celsius zu legen, bis sie den embryonalen Tag 14 erreichen. Am embryonalen Tag 14 schneiden Sie eine Öffnung in das Ei, um das Embryo freizulegen, und enthaupten das Kükenembryo in ovo.Legen Sie den Kopf in eine Petrischale mit eiskaltem PBS unter dem Stereomikroskop. Verwenden Sie eine Standardpinzette, um hinter jedem Auge einen Schnitt durch das Gewebe bis zum Durchtrennen der Augen und des Oberkiefers vorzunehmen. Anschließend führen Sie einen zweiten Schnitt vollständig durch den Pharynx durch, um den Unterkiefer zu entfernen.Verwenden Sie anschließend eine gewöhnliche Pinzette, um die Haut von der Schädeloberfläche abzuziehen. Entfernen Sie dann die Stirn- und Scheitelbeine, um das Gehirn von ventraler Seite freizulegen. Entfernen Sie den pharyngealen Knorpel und das begleitende Mesenchym.Danach das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben legen und vorsichtig das Mesenchym dorsal zum Hirnstamm entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, das p. nicht zu beschädigen. Anschließend einen vollständigen Schnitt durch das Gewebe zwischen Mittelhirn und Hirnstamm führen, um den Hirnstamm einschließlich des Kleinhirns zu lösen. Schnitte vollständig durch das Gewebe an beiden lateralen Übergängen zwischen Kleinhirn und Rautenplattenepithel des Hirnstamms anlegen.Entfernen Sie das gesamte Kleinhirn, wobei darauf geachtet werden muss, die Integrität der Pia während der Präparation zu erhalten. Entfernen Sie schließlich den sich bildenden Plexus chorioideus und überführen Sie das präparierte Kleinhirn in eiskaltes HBSS. Übertragen Sie das gesamte Kleinhirn mit einem Spatel oder einer dreimilliliter-Pasteurpipette mit abgeschnittener Spitze auf die sterile Plattform eines Gewebeschneidegeräts.Um die Öffnung zu vergrößern, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette. Stellen Sie die Schneidgeschwindigkeit des Gewebeschneiders auf 50 % des maximalen Werts ein. Schneiden Sie dann das Kleinhirn in der gewünschten Orientierung mit einer Dicke von 300 Mikrometern unter Verwendung einer dreimilliliter-Pasteurpipette. Bedecken Sie das geschnittene Kleinhirn mit kaltem HBSS. Überführen Sie dann den HBSS und die Schnitte mit einer dreiliterigen Pasteurpipette mit abgeschnittenem Ende in eine 60 Millimeter große Petrischale, die 20 Milliliter eiskalten HBSS enthält. Stellen Sie die Petrischale unter ein Stereomikroskop, das mit einer faseroptischen Lichtquelle beleuchtet wird. Trennen Sie anschließend mit einer Uhrmacherpinzette einzelne Schnitte des Gehirngewebes und identifizieren Sie die Schnitte, die elektroporiert werden sollen, anhand ihrer Gewebestrukturintegrität und ihrer mediale-lateralen Position.Konstruieren Sie eine Elektroporationskammer, indem Sie die Anode eines Elektros an der Unterseite einer 60 Millimeter großen Petrischale befestigen. Geben Sie mithilfe von Isolierband etwa ein Milliliter HBSS hinzu, um die Elektrode zu bedecken. Platzieren Sie anschließend eine 0,4-Mikrometer-Kultur.Platzieren Sie die Schnitte auf die mit HBSS bedeckte Elektrode. Verwenden Sie eine dreimilliliter-Pasteurpipette mit abgeschnittenem Spitzenende, um die identifizierten Schnitte – bis zu fünf pro Insert – auf das Kulturinsert zu überführen. Trennen Sie anschließend die Schnitte voneinander und lassen Sie sie auf der Kultur aufliegen. In sagittaler Ausrichtung einsetzen. Mit einer Pipette überschüssiges Medium von den Gehirnschnitten entfernen. Das Insert so auf der Elektrode ruhen lassen, dass Kontakt zwischen dem Insert und der Elektrode besteht.Bei diesem Aufbau ruht der Kulturinsert mit den Schnitten auf der Oberfläche des Mediums, wodurch die Schaltung erhalten bleibt, gleichzeitig aber eine räumliche Zielsteuerung der Kathode ermöglicht wird. Geben Sie mit einer P-10-Pipettenspitze fünf Mikroliter DNA, verdünnt mit 20 % Fast Green, auf die Oberfläche eines gezielten Bereichs jedes Schnitts.Der Zusatz von Fast Green stellt sicher, dass die DNA-Lösung ausreichend viskos ist, um eine weiträumige Verteilung der DNA zu verhindern. Anschließend platzieren Sie die Kathode am gewünschten Zielgewebe und elektrolytisch die Proben. Vermeiden Sie direkten Kontakt zwischen der Kathode und dem Gewebe, indem Sie die Kathode so nahe wie möglich an das Gewebe heranführen, ohne es tatsächlich zu berühren.Wiederholen Sie die Elektroporation nach Bedarf in mehreren Regionen der äußeren Granularschicht jeder einzelnen zerebellären Schnittpräparation. Sobald die Elektroporation abgeschlossen ist, überführen Sie den Kulturinsert in eine 30 Millimeter große Petrischale. Geben Sie je Kultur ein Milliliter vorgewärmtes Kulturmedium unter den Kulturinsert.Stellen Sie sicher, dass der Insert nicht auf dem Medium schwimmt. Der Kulturinsert sollte mit dem Medium in Kontakt stehen, aber die Schnitte dürfen nicht darin benetzt sein. Inkubieren Sie die Kulturen bis zu drei Tage lang und erneuern Sie dabei das gesamte Kulturmedium.Ersetzen Sie das Medium alle 24 Stunden durch frisches, vorgewärmtes Medium nach der Kultur. Überführen Sie die Schnitte auf die Kulturscheiben in eine 30-Millimeter-Schale, die 4 % Paraformaldehyd für eine Stunde enthält. Achten Sie darauf, den Paraformaldehyd auf die Kultur aufzutragen.Nach dem Fixieren einmal einlegen. Die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Anschließend mit Augenchirurgiescheren jeden der elektroporierten und kultivierten zerebellären Schnitte aus der Kultur herausschneiden.Fügen Sie ein, indem Sie um jeden Schnitt herumschneiden und diesen zusammen mit dem daran befestigten Bereich des Einsetzes entfernen. Versuchen Sie nicht, den Schnitt von der Oberfläche des Einsetzes zu lösen. Bringen Sie die Schnitte in etwa einem Milliliter eines gewünschten Einbettmediums unter einem Deckglas auf, wobei darauf geachtet werden sollte, keine Blasen einzuschließen.Nachdem die Objektträger trocken sind, sammeln Sie sie ein und nehmen Sie Bilder mithilfe eines Laserscanners auf. Konfokale Mikroskopie Calbindin. Die Färbung von E14-Kleinhirngewebe ist hier in Rot dargestellt nach Elektroporation mit einem Kontroll-GFP-Plasmid nach ein, zwei und drei Tagen im Reagenzglas.Die gleichmäßige Calbindin-Färbung zeigt, dass die Gewebestruktur in der Kultur mindestens drei Tage lang in vitro erhalten bleibt. Hier sind Aufnahmen mit geringer Vergrößerung von RFP- und GFP-kodierenden Plasmiden, die erfolgreich an verschiedenen Stellen in die äußere Granularschicht elektroporiert wurden. Das GFP-Plasmid wurde gezielt in ein einzelnes Fum eingeführt, wie durch den Stern (*) gekennzeichnet.Ein Beispiel zeigt hier einen Konstrukt, der GFP unter Kontrolle eines 8 0 1-Enhancers kodiert und in die äußere Granularschicht elektroporiert wurde. Die Expression von 8 0 1 definiert Vorläuferzellen der Granulazellen innerhalb der äußeren Granularschicht. Verschiedene Zellmorphologien sind nach drei Tagen in vitro deutlich sichtbar, und das Zellverhalten kann überwacht werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne zerebelläre Schnitte mit einer Vielzahl genetischer Werkzeuge elektroporiert, um die Entwicklung der Granulazellen zu beobachten und zu beeinflussen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur strukturellen Integrität des Gewebes und zu den relativen Positionen verschiedener Zelltypen, wie beispielsweise der Purkinje-Zellen oder Bergmann-Gliazellen, zu beantworten. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei richtiger Durchführung innerhalb von etwa zwei Stunden für ein Dutzend Hühnerembryonen durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und Kultur des Kleinhirns Granulat Neuron Vorläuferzellen und Kleinhirn Nervenzellen Granulat aus postnatalen Maus.

Isolierung und Kultivierung von Post-Natal-Maus Cerebellar Granule Neuron Vorläuferzellen und Neuronen

In diesem Video führen wir die Elektroporation von Kleinhirnschnitten von Kükenembryonen mit Reportergen-Plasmiden durch. Die Technik ermöglicht die Visualisierung der Entwicklung und Migration von Körnerzellvorläufern zur Bildung einer granularen Schicht.

Ex-vivo-Elektroporation von Kleinhirnschnitten von Kükenembryonen: Eine Methode zur Einführung von Plasmid-DNA, die für grün fluoreszierendes Protein kodiert, um die Entwicklung granularer Zellen zu visualisieren

Das Video zeigt die Vorbereitung von Kleinhirnschnitten. Es zeigt ein detailliertes Verfahren zur Isolierung des Kleinhirns aus einem Hühnerembryo. Die Scheiben werden dann aus dem präparierten Kleinhirn mit einem Gewebehacker für die weitere experimentelle Analyse präpariert.

Gewinnung von Kleinhirnschnitten aus einem embryonalen Kükengehirn

Quelle: Chan, U., et al., Verwendung der postnatalen In-vivo-Elektroporation zur Untersuchung der Morphologie von Kleinhirngranula-Neuronen und der Synapsenentwicklung. J. Vis. (2021).Dieses Video zeigt die Analyse der Entwicklung von Kleinhirngranula-Neuronen durch die Abbildung von vorfixierten Hirngewebeschnitten von Mäusen, die mit einem fluoreszierenden Protein markiert wurden, Aufnahme von hochauflösenden Z-Stack-Bildern mit einem konfokalen Mikroskop und Messung von Strukturparametern...

Visualisierung der Synaptogenese von Kleinhirn-Körnerneuronen in verschiedenen Entwicklungsstadien

Quelle: Bénard, M., et al. Ex-vivo-Bildgebung der postnatalen zerebellären Körnerzellmigration mittels konfokaler Makroskopie. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video demonstriert eine konfokale makroskopische Methode, um die ex vivo Migration von Körnerzellen in Kleinhirnschnitten aus postnatalen Rattengehirnen zu verfolgen.

Ex-vivo-Bildgebung der postnatalen zerebellären Körnerzellmigration mittels konfokaler Makroskopie

Neuronale Morphogenese und Migration sind entscheidende Ereignisse zugrunde liegenden richtige Entwicklung des Gehirns. Hier beschreiben wir Verfahren zur genetischen Manipulation kultivierten zerebellären Körnerzellen und die Entwicklung von Kleinhirn für die Beurteilung der Morphologie und der Migrationseigenschaften von Neuronen.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Während der postnatalen Kleinhirnentwicklung zeigen unreife Körnerzellen, die aus der Keimzone stammen, unterschiedliche Modalitäten der Migration, um ihr endgültiges Ziel zu erreichen und neuronale Netzwerke zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von Kleinhirnschnitten und den konfokalen makroskopischen Ansatz zur Untersuchung der Faktoren, die die neuronale Migration regulieren.

Ex-vivo-Bildgebung von Postnatale Kleinhirn-Körnerzellmigration mittels konfokaler Makros

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primäre Maustaste zerebralen Granulat Neuronen (CGNs) von 6-7 Tage alten Welpen, effizienten Transduktion von CGNs für Verlust und Gewinn von Funktionsstudien, und Modellierung NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Zelltod, DNA-Schäden und oxidativen Stress mit der gleichen Kultur-Modell.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Konventionelle Verlustfunktion-Studien von Genen mit Knockout-Tiere wurden oft kostspielig und zeitaufwendig. Elektroporation-basierte CRISPR-vermittelte somatische Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, gen in VivoFunktionen zu verstehen. Hier berichten wir über eine Methode, um Ko-Phänotypen in proliferierenden Zellen des Kleinhirns zu analysieren.

CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer

Hier beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung der Synaptogenese von Körnerneuronen im Kleinhirn der Maus über den zeitlichen Verlauf der postnatalen Gehirnentwicklung, wenn diese Zellen ihre synaptischen Strukturen verfeinern und Synapsen bilden, um sich in den gesamten Gehirnkreislauf zu integrieren.

Verwendung der postnatalen In-vivo-Elektroporation zur Untersuchung der Morphologie von Kleinhirngranula-Neuronen und der Synapsenentwicklung

Hier stellen wir ein reproduzierbares In-vitro-Elektroporationsprotokoll für die genetische Manipulation von primären Kleinhirn-Granulazellvorläufern (GCPs) vor, das kostengünstig, effizient und lebensfähig ist. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll auch eine einfache Methode für die molekulare Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Hedgehog-Signalwege in primären GCP-Zellen.

Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer

Lernen Sie die Ex-vivo-Elektroporation von Hühner-Kleinhirnschnitten zur Untersuchung von Körnerzellentwicklung. Diese Methode ermöglicht gezielte genetische Modifikationen zur Analyse neuronaler Vorläuferzellen.

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

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