Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen In-vivo-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA im Chromatin von Arabidopsis-Zellen aufzudecken. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Pflanzenbiologie zu beantworten, z. B. welche Gene durch einen bestimmten Transkriptionsfaktor reguliert werden oder welche Systemmodifikationen mit einem transkriptionellen Status von Genen verbunden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es durch den Vernetzungsschritt möglich ist, Veränderungen in der Chromatinorganisation, die während der Pflanzenentwicklung auftreten, zu fixieren und zu erfassen.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Proteininteraktion in Arabidopsis thaliana geben kann, kann sie auch auf verschiedene Pflanzenordnungen angewendet und an andere Pflanzenarten angepasst werden. Dieses Verfahren wird von Dorota Komar und Alfonso Mouriz, zwei Doktoranden in unserem Labor, demonstriert. Nachdem Sie Arabidopsis gemäß dem Textprotokoll gezüchtet haben, sammeln Sie 1,5 Gramm Pflanzenmaterial in 50-Milliliter-Röhrchen und halten Sie es während der Vernetzung auf Eis.

Verwenden Sie dann eine vom Laborbrenner erhitzte Nadel, um kleine Löcher in die Deckel der Röhrchen zu bohren. Geben Sie 40 Milliliter 1x pbs und 1,08 Milliliter Formaldehyd in die Röhrchen. Schrauben Sie die Deckel auf die Röhrchen und legen Sie die Röhrchen in einen Exsikkator.

Vakuuminfiltrieren Sie 10 Minuten lang und lassen Sie dann vorsichtig das Vakuum los, um ein Aufwirbeln der Lösung zu verhindern. Wiederholen Sie nach dem Mischen der Probe die Vakuum- und Mischschritte. Beobachte nach der Infiltration das Pflanzenmaterial und bestätige, dass es leicht durchscheinend wird und auf den Boden der Röhre sinkt.

Fügen Sie 2,5 Milliliter zweimolares Glycin zu einer Endkonzentration von 0,125 molar hinzu und wenden Sie das Vakuum fünf Minuten lang an. Nachdem Sie das Vakuum gelöst haben, verwerfen Sie die Lösung, indem Sie die Röhrchen umdrehen und durch die Löcher in den Deckeln tropfen lassen. Spülen Sie die Pflänzchen mit pbs zweimal ab und spülen Sie sie einmal mit Wasser ab.

Trocknen Sie dann die Pflänzchen auf einem Papiertuch, bevor Sie flüssigen Stickstoff zum Einfrieren verwenden. Bereiten Sie pro Immunpräzipitation 15 Mikroliter magnetische Kügelchen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Geben Sie einen Milliliter Chromatin-Immunpräzipitation oder Chip-Verdünnungspuffer zu den Kügelchen, mischen Sie durch Rotation und stellen Sie das 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in ein Magnetgestell.

Nachdem Sie die Kügelchen etwa eine Minute lang am Magneten befestigt haben, entfernen Sie mit einem Pipettierer den Überstand, bevor Sie den Waschvorgang wiederholen. Suspendieren Sie die Kügelchen erneut in 200 Mikrolitern Chipverdünnungspuffer. Für die Immunpräzipitation geben Sie die erforderliche Menge des spezifischen Antikörpers in eines der beiden Röhrchen, die für jede Pflanze vorbereitet sind.

Ein Schlüsselfaktor für ein erfolgreiches Chip-Experiment ist der gewählte Antikörper für die Immunpräzipitation des interessierenden Proteins. Antikörper, die gegen den pflanzlichen Transkriptionsfaktor gebildet werden, können für Chip-Experimente nützlich sein, aber das Serum muss gründlich getestet werden. Zum Beispiel sind Antikörper, die nur in der Western-Blot-Analyse überprüft werden, nicht unbedingt für den Chip gültig.

Als Negativkontrolle geben Sie die gleiche Menge an unspezifischem IGG in das zweite Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad, damit sich der Antikörper an die Kügelchen anheften kann. Mahlen Sie das gefrorene Pflanzenmaterial mit einem Mörser und Stößel gründlich in flüssigem Stickstoff, bis das Pulver homogen und hellgrün wird.

Füllen Sie das Pulver in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen um. Fügen Sie unter einem Abzug 30 Milliliter Extraktionspuffer hinzu und mischen Sie gut, um das Gewebepulver einzuweichen. Halten Sie die Proben von diesem Schritt an immer bei vier Grad Celsius und stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig aufgetaut ist, bevor Sie fortfahren.

Reinigen Sie die Gülle, indem Sie sie durch ein Filtrationsgewebe mit einer Porengröße von 22 bis 25 Mikrometern in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen leiten. Dann bei 1.000 mal g und vier Grad Celsius für 20 Minuten zentrifugieren. Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand aus dem Pellet, der ein Volumen von etwa zwei Millilitern haben sollte.

Mit fünf Millilitern Extraktionspuffer zwei das Pellet wieder aufhängen. Dann zentrifugieren Sie bei 1.000 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nach dem Dekantieren des Überstands wird das Pellet in 300 Mikrolitern Extraktionspuffer drei wieder suspendiert.

Geben Sie in ein separates Röhrchen 600 Mikroliter Extraktionspuffer drei und schichten Sie dann das resuspendierte Pellet vorsichtig auf den sauberen Puffer. Das Röhrchen wird eine Stunde lang bei 16.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert, gefolgt von einer Aspiration des Überstands mit einer Pipette. Verwenden Sie anschließend 300 Mikroliter Ultraschallpuffer, um das nukleare Pellet langsam wieder zu suspendieren und Blasenbildung zu vermeiden, die die Beschallungseffizienz beeinträchtigen kann.

Füllen Sie die Suspension vorsichtig in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen um. Beschallen Sie die Suspension, um die Kerne zu lysieren, und teilen Sie das Chromatin nach dem Zufallsprinzip in 200 bis 600 Basenpaarfragmente auf. Überprüfen Sie die Größe der DNA-Fragmente auf einem Agarose-Gel und drehen Sie die Lösung dann 10 Minuten lang bei 12.000 g und vier Grad Celsius.

Füllen Sie den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Aliquotieren Sie ein Zehntel des Überstands in ein neues Röhrchen und kennzeichnen Sie es als Input, bevor es bei minus 20 Grad Celsius gefriert. Zum Schluss wird das Chromatin in Chip-Verdünnungspuffer zehnfach verdünnt, um eine SDS-Endkonzentration von 0,1 Prozent zu erreichen.

Anschließend können die Proben eingefroren und mehrere Wochen bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Nachdem Sie die Kügelchen über Nacht mit Antikörpern inkubiert haben, verwenden Sie einen Milliliter Chipverdünnungspuffer, um die Kügelchen dreimal zu waschen, suspendieren Sie die Kügelchen dann wieder in einem Milliliter des verdünnten Chromatins und inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Kügelchen am nächsten Tag bei vier Grad Celsius auf das Magnetgestell und verwenden Sie nach dem Entfernen der Lösung einen Milliliter salzarmen Waschpuffer, um die Kügelchen zweimal zu waschen, und verwenden Sie dann einen salzreichen Waschpuffer, um die Kügelchen einmal zu waschen.

Nachdem Sie einmal einen Milliliter Lithiumchlorid-Waschpuffer zum Waschen der Kügelchen verwendet haben, verwenden Sie einen Milliliter TE-Puffer, um die Kügelchen zweimal zu waschen. Aspirieren, um den TE Waschpuffer gründlich zu entfernen. Sobald die Eingangsproben aufgetaut sind, werden jeweils fünf Mikroliter in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und anschließend ähnlich wie bei den Chipproben behandelt.

Kehren Sie die Vernetzung um, indem Sie 200 Mikroliter fünfprozentiges chelatbildendes Ionenaustauscherharz hinzufügen und 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius inkubieren, wobei Sie alle zwei bis drei Minuten schütteln. 30 Sekunden lang bei 16.000 g herunterschleudern und den Überstand vorsichtig in neue Mikrofugenröhrchen überführen. Fügen Sie zwei Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter Protonase K hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um Proteine zu verdauen und DNA freizusetzen.

Um die Reaktion zu stoppen, inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius, drehen Sie sich 30 Sekunden lang schnell bei 16.000 g und übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Nachdem Sie die DNA gemäß dem Textprotokoll gereinigt haben, verdünnen Sie ein bis zehn mit Wasser und verwenden Sie fünf Mikroliter pro Reaktion, um die Häufigkeit der Bindungsstellen durch qPCR zu messen. Analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll.

Aribidopsis-Blätter sind mit Wachsschichten bedeckt und Trichome begünstigen die Bildung von Luftblasen, die es den vernetzenden Reagenzien erschweren, in das Pflanzengewebe einzudringen. Hier sind vernetzte Sämlingsproben zu sehen, die vakuumvernetzt wurden, um die Fixierungseffizienz zu erhöhen. Diese Abbildung zeigt, dass eine erhöhte Anzahl von Beschallungszyklen die durchschnittliche Größe der DNA in Chipproben schrittweise reduziert und nach 20 bis 30 Zyklen die optimale Anreicherung im Bereich von 200 bis 600 Basenpaaren erreicht, wie hier gezeigt.

Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, wurden vier Regionen, die für die transkriptionelle Regulation des FT-Locus, eines Hauptgens der Blüte, wichtig sind, für die Analyse ausgewählt. Die Chip-Ergebnisse zeigen, dass das EBS-Protein eine der vier getesteten Regionen kombiniert, eine regulatorische Sequenz in der Nähe der transkriptionellen Startstelle von FT. Schließlich zeigten Chip-Assays, die mit einem Antikörper durchgeführt wurden, der gegen das in den Lysinen neun und 14 acetylierte Histon H3 gerichtet war und mit transkriptionell aktivem Chromatin korreliert, eine höhere Abundanz von H3K9/14ac in mutierten DBS im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen in allen vier getesteten genomischen Fragmenten von FT, was mit der beobachteten Hochregulation dieses Master-Gens der Blüte in dieser Mutante übereinstimmt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Die Befolgung dieses Verfahrens, zusammen mit anderen Maßnahmen wie der Genexpressionsanalyse, kann dazu beitragen, andere Fragen zu beantworten, wie z.B.: Welche biologische Rolle spielt die Bindung des Proteins an die DNA? Ist es die transkriptionelle Aktivierung oder die Repression? Und welche Histonmodifikationen sind damit verbunden?

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der pflanzlichen Epigenetik, um die Chromatinzustände in unseren reduktiven Zellen zu erforschen. Und das lässt sich auch auf andere Pflanzenarten ausweiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Bindung Ihres interessierenden Aribidopsis-Proteins an die DNA in vivo analysieren können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit 2-Methoxyethanol-, Formaldehyd- oder Ultraschallreagenzien, Krankheitserregern und Stammmutationen äußerst gefährlich sein kann und bei diesem Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie Schutzkleidung, Handschuhe oder Gehörschutz getroffen werden sollten.