Verbesserte Generierung induzierter Kardiomyozyten Mit einem Polycistronische Construct Ausdruck optimale Verhältnis von Gata4, Mef2c und Tbx5

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie induzierte Kardiomyozyten aus kardialen Fibroblasten mit einem poly-cyonischen MGT-Konstrukt effizient erzeugt werden können, das ein optimales Verhältnis von gata vier, F zwei C und TBX fünf exprimiert. Diese Methode bietet eine wertvolle Plattform für die Erforschung induzierter Kardiomyozyten und wird hohe Post-Screening- und mechanistische Studien der induzierten Kardiomyozyten-Programmierung ermöglichen und gleichzeitig das Feld in Richtung klinischer Anwendungen bringen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Kardiofibroblasten mit nur einem einzigen retroviralen Konstrukt effizient in Kardiomyozyten umgewandelt werden können.

Reinigen Sie die transgene embryonale Alpha-Myosin-Schwerketten-GFP-Maus mit 75 % Volumen zu Volumen. Ethanol führt Euthanasie durch. Öffnen Sie dann die Körperhöhle, indem Sie mit einer sterilen, stumpfen und gebogenen Pinzette einen horizontalen Schnitt von einer Achselhöhle zur anderen machen.

Präparieren Sie das Herz und legen Sie es in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Eis. Kalte PBS beobachten die GFP-Expression im gesamten Herzen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. Legen Sie drei bis 4G FP-positive Herzen mit einer sterilen Pinzette und einer Schere in eine 60-Millimeter-Kulturschale in der Mitte und zerkleinern Sie die Herzen in kleine Stücke von weniger als einem Kubikmillimeter.

Die gehackten Herzen in eine 10 Zentimeter große Schale geben und mit zwei Millilitern Fiberblast oder FB-Medium bedecken. Lassen Sie die Platten mindestens drei Stunden lang ungestört in einem 37 Grad heißen Inkubator. Nach der Inkubation langsam acht Milliliter vorwarmes FB-Medium in die Schale mit dem gehackten Herzgewebe geben.

Inkubieren Sie dann das Gewebe ungestört, außer dass das Medium alle drei Tage gewechselt wird. Am siebten Tag aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen die Zellen mit DPBS. Geben Sie drei Milliliter EDTA von 0,05 % auf jede Platte und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie fünf Milliliter FB-Medium hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren, und lösen Sie die Zellen dann vorsichtig mit einem Zellschaber ab. Sammeln Sie anschließend die Zellen und filtrieren Sie sie durch 40-Mikron-Zellsiebe, um eine Kontamination mit Herzgewebefragmenten zu vermeiden. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200-fachem G für fünf Minuten, beginnend mit isolierten neonatalen Mäuseherzen.

Schneide jedes Herz in vier Stücke, die noch lose miteinander verbunden sind. Die Herzen werden in ein konisches 15-Liter-Röhrchen mit acht Millilitern warmem EDTA von 0,05 % überführt und 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubation verwerfen Sie die Trips in EDTA und fügen Sie eine Minute lang bei mittlerer Geschwindigkeit fünf Milliliter warmen Kollagenase-Wirbel vom Typ 2 hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen dann drei bis fünf Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Wirbeln Sie dann die Tube erneut eine Minute lang ein. Lassen Sie die Gewebestücke sich absetzen und sammeln Sie den Überstand in einem neuen Röhrchen mit fünf Millilitern kaltem FB-Medium. Geben Sie fünf Milliliter frische Kollagenase vom Typ zwei zu den Gewebestücken und wiederholen Sie die Vortex- und Inkubationsschritte.

Kombinieren Sie alle Zellen, die Überstände enthalten, indem Sie sie durch ein 40-Mikron-Zellsieb filtrieren. Zentrifugieren Sie diese Zellen bei 200 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach einer der beiden Methoden zur Isolierung von Herzfibroblasten.

Waschen Sie das fertige Zellpellet einmal in 10 Millilitern magnetisch aktivierter Zellsortierung oder maximalem Puffer. Entnehmen Sie 10 Mikroliter für die Lebendzellzählung und zentrifugieren Sie die restlichen Zellen bei 200 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius für weniger als einmal 10 bis zu den siebten Zellen. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 Mikrolitern konjugierten magnetischen Mikrokügelchen am Oberschenkel 1,2 in 90 Mikrolitern gekühltem Max-Puffer und mischen Sie es.

Inkubieren Sie die Kügelchen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Um die Zellen zu pelletieren, fügen Sie 10 Milliliter maximalen Puffer hinzu und zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 200 mal G. Einmal mit 10 Millilitern max. Puffer waschen und das Zellpellet in einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern in einer Zellkulturhaube resuspendieren.

Richten Sie ein Max-Trennzeichen ein und fügen Sie eine LS-Spalte hinzu. Äquilibrieren Sie die Säule mit drei Millilitern maximalem Puffer. Lassen Sie die Zellsuspension durch die LS-Säule und waschen Sie sie dreimal mit zwei Millilitern maximalem Puffer.

Nehmen Sie dann die LS-Säule aus dem Separator und eluieren Sie dreimal mit zwei Millilitern maximalem Puffer. Sammeln des EIT in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das EIT fünf Minuten lang bei 200 mal G.

Resuspendieren Sie die isolierten Fibroblasten in 10 Millilitern FB-Medium und zählen Sie die Zellen, säen Sie die Zellen in Gewebekulturschalen in geeigneter Dichte in einer gelatinevorcodierten 24-Well-Platte aus, um kardiale Fibroblasten neu zu programmieren. Geben Sie 500 Mikroliter induzierte Kardiomyozyten oder ICM-Medium, das Polyhirn enthält, in jede Vertiefung der 24 Vertiefungsplatten, auf denen Zellen sitzen. Geben Sie 10 Mikroliter des Retrovirus in jede Vertiefung der isolierten Fibroblasten.

Inkubieren Sie die Platte mit retroviralen Partikeln für 24 bis 48 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie dann das virushaltige Medium durch 500 Mikroliter frisches ICM-Medium und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage. Beginnen Sie mit der positiven Selektion von viral transduzierten Zellen durch Supplementierung des ICM-Mediums mit zwei Mikrogramm pro Milliliter purem Mycin.

Nach dreitägiger Selektion wechseln Sie das Medium auf eine Erhaltungsdosis von einem Mikrogramm pro Milliliter purem Mycin, um die Umwandlung von kardialen Fibroblasten in Kardiomyozyten sichtbar zu machen. Beobachten Sie pur-mycin-selektierte Platten auf GFP-Expression mit einem inversen Mikroskop. 14 Tage nach der Virusbehandlung ist das ICM-Medium durch B 27 zu ersetzen.

Mittlere spontan schlagende Zellloci können drei bis vier Wochen nach der viralen Transduktionsexpression von kardialen Markern, einschließlich kardialem Troponin t und alpha, auftreten. Actinin kann an den Tagen 10 bis 14 immunchemisch nachgewiesen werden. Hier ist die kardiale Troponin-T-Expression im I-CMS zu sehen, das aus Fibroblasten umgewandelt wurde, die die GFP-alpha-Actinin-Expression in den ICMs exprimieren.

Die Analyse mittels Durchflusszytometrie zeigt einen ähnlichen Anstieg der kardialen Troponin-T-Expression, insbesondere nach reiner Mycin-Selektion von induzierten Kardiomyozyten. Die hier beschriebene Mythologie ermöglicht die effiziente Erzeugung von induzierten Kardiomyozyten auf der Grundlage der retroviralen Verabreichung von NGT-Transkriptionsfaktoren in einem einzigen Konstrukt.