Air-abgetastete Filteranalyse für Endotoxine und DNA-Gehalt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die genaue Analyse von Endotoxin- und DNA-Gehalt extrahierter luftgetragener Partikel, die auf Filtern gesammelt wurden, zu beschreiben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Forschung zu biologischen Aerosolen in Innen- und Außenräumen zu beantworten, beispielsweise im Hinblick auf gesundheitliche Ursachen. Die Demonstration des Filterprobennahmeverfahrens wird Yinon Mazar, ein Doktorand aus meinem Labor, durchführen.

Verwenden Sie für die Probenahme mit hohem Volumen Filter aus Quarzfasern. Oder wählen Sie den spezifischen Filtertyp sowie eine geeignete Filter-Cutoff-Größe, die am besten den Anforderungen der Forschung entspricht. Backen Sie die Filter, die für die Probenahme organischer und biologischer Verbindungen vorgesehen sind, vorab ein, indem Sie sie zunächst einzeln in Aluminiumfolie einwickeln.

Und anschließend werden sie fünf Stunden lang bei 450 Grad Celsius in einem Laborofen gebacken. Dadurch werden eventuelle vorhandene organische Rückstände zerstört. Die gebackenen Filter bis zur Verwendung für die Probenahme bei 20 Grad Celsius lagern.

Als Nächstes reinigen und desinfizieren Sie das Hochvolumen-Sampler, wie es im begleitenden Textprotokoll beschrieben ist. Danach setzen Sie den vorgebackenen Filter in die Filterkassette ein und betreiben das Sampler gemäß den Herstelleranweisungen, um eine geeignete Probe zu sammeln. In einem Sicherheitswerkbank der Klasse zwei schneiden Sie mit einem sauberen Korkbohrer mit einem Durchmesser von 1,12 cm 22 kreisförmige Stücke aus sauberem, vorgebackenem Filtermaterial aus.

Verwenden Sie diese Stücke, um eine Reihe von mit Endotoxin versetzten Filtern herzustellen, die als Kontrollen dienen sollen. Schneiden Sie anschließend die Filter, die die gesammelte Probe enthalten, mit einem sauberen Korkenzieher mit 1,12 cm Durchmesser aus und geben Sie jede Probe in eine eigene pyrogenfreie 2-mL-Röhrchen. Überführen Sie außerdem die getrockneten, mit Endotoxin versetzten Filter in separate pyrogenfreie 2-mL-Röhrchen.

Geben Sie ein Milliliter pyrogenfreies Wasser in jedes Reagenzglas und schütteln Sie die Proben 60 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Labor-Schüttler. Zentrifugieren Sie anschließend die Probenröhrchen in einer Mikrozentrifuge bei 375 × g für 10 Minuten.

Anschließend das Überstand, der die Endotoxine enthält, in ein neues pyrogenfreies 2-Milliliter-Gefäß überführen. Eine pyrogenfreie 96-Loch-Flachboden-Mikroplatte mit Deckel für den Endotoxin-Test vorbereiten, indem zunächst die Probenpositionen festgelegt werden.

Als Nächstes schalten Sie den Mikroplattenreader ein und programmieren ihn für eine kinetische Reaktion bei 37 Grad Celsius mit Schütteln alle fünf Minuten, gefolgt von Messungen bei 405 Nanometern. Wiederholen Sie das fünfminütige Schütteln und das Auslesen der Platte insgesamt 18-mal.

Geben Sie die Proben in die Mikrotiterplatte, indem Sie jeweils 50 µL der zuvor zum Anreichern der Filter verwendeten Standard-Endotoxin-Lösungen in die Reihen A1 bis A10 und B1 bis B10 pipettieren. Füllen Sie die Leerproben in A11, A12, B11 und B12 ein. Fügen Sie anschließend das Überstandsvolumen aus dem zentrifugierten angereicherten Filterextrakt und dessen Leerproben in die Reihen C und D hinzu. Danach werden die Überstände aus den experimentellen Proben und den entsprechenden Leerproben nach Bedarf in die verbleibenden Vertiefungen gegeben.

Um den Test zu aktivieren, pipettieren Sie schnell 50 Mikroliter der Limulus-Amebozyten-Glycat-Lösung in jedes Loch. Schütteln Sie die Platte vorsichtig horizontal. Bevor Sie sie in das Plattenlesegerät heben und die experimentelle Messung starten.

Entfernen Sie die Platte nach Abschluss vom Plattenlesegerät. Bestimmen Sie den Endotoxin-Gehalt jeder Probe mithilfe der Standardkurve und berechnen Sie außerdem die Effizienz, mit der die Endotoxine aus den Probenfiltern extrahiert wurden. Bereiten Sie zunächst die DNA-spikehaltigen Filter wie im begleitenden textbasierten Protokoll beschrieben vor.

Für jede Filterprobe bereiten Sie eine Mischung aus säuregewaschenen Glasperlen in 0,5-Milliliter-Sterilröhrchen vor, bestehend aus 0,1 Gramm Perlen mit einem Durchmesser von 425 bis 600 Mikrometern und 0,3 Gramm Perlen mit einem Durchmesser von weniger als oder gleich 106 Mikrometern. Schneiden Sie anschließend drei kreisförmige Stücke von zufällig ausgewählten Stellen jeder Filterprobe mit einem desinfizierten Korkbohrer mit einem Durchmesser von 1,12 Zentimetern aus. Geben Sie die Filterproben in einzelne Schraubverschlussröhrchen mit einem Fassungsvermögen von zwei Milliliter.

Fügen Sie dann die Glasperlenmischung zusammen mit 60 Mikroliter des mit dem DNA-Extraktionskit gelieferten Zelllysepuffers zu jedem Röhrchen hinzu. Schließen Sie die Röhrchen und stellen Sie die Proben in den Bead-Beater. Zerstören Sie die gefilterten Zellen mithilfe des Bead-Beaters mechanisch für eine Minute und kühlen Sie die Proben anschließend, indem Sie sie eine zusätzliche Minute lang auf Eis stellen.

Wiederholen Sie diesen Zyklus fünfmal. Fahren Sie fort, indem Sie dem Protokoll des Kit-Herstellers folgen und die DNA aus den lysierten Zellen extrahieren. Laden Sie die eluierte Probe nach der Elution ein zweites Mal durch die Extraktionssäule, um die DNA-Ausbeute zu verbessern.

Schalten Sie das quantitative PCR-Gerät im Voraus ein, damit es sich aufwärmen kann. Erstellen Sie in der Bediensoftware des Geräts eine neue Programmdatei, und tragen Sie dort die Details für den quantitativen PCR-Lauf ein. Desinfizieren Sie anschließend die Arbeitsfläche mit einem Oberflächen-DNA-Entkontaminierungsmittel und arbeiten Sie ausschließlich mit sterilen Röhrchen, Pipettenspitzen und Reagenzien.

Stellen Sie außerdem einen Eimer mit Eis neben den Arbeitsplatz und legen Sie die tac polemoraris-Mischung in den Eimer. Bereiten Sie die quantitative PCR-Reaktionsmischung gemäß Tabelle vier des begleitenden Textprotokolls vor. Lagern Sie die Reaktionsmischung bis zur Verwendung im Dunkeln und auf Eis.

Als Nächstes eine saubere Mikroplatte in einen Plattenhalter geben, um zu verhindern, dass sie die Arbeitsfläche berührt, und um sie sauber zu halten. Ein Mikroliter Standard-DNA, Proben-DNA oder nukleasefreies Wasser in die Vertiefungen der Quantitative-PCR-Mikroplatte im Dreifachansatz hinzufügen. Anschließend neun Mikroliter der Master-Reaktionsmischung in jede Reaktionsvertiefung geben.

Decken Sie die Platte nach Beendigung mit einer optischen Haftfolie ab und verschließen Sie sie dicht an allen Seiten. Zentrifugieren Sie die Platte in einem mit Plattenrotoren ausgestatteten Zentrifugen für eine Minute bei 1000 × g, bevor Sie sie in den Thermocycler geben. Schließlich aktivieren und führen Sie das vorbereitete quantitative PCR-Programm aus.

Während der Endotoxin-Extraktion werden Proben auf einem Filter zentrifugiert, um das Endotoxin aus dem Filter zu gewinnen. Unterschiedliche Zentrifugationsgeschwindigkeiten führen zu variierenden Extraktionswirkungsgraden, insbesondere bei höheren Endotoxin-Konzentrationen.

Ein vorläufiger Test zur Extraktionsausbeute sollte für den spezifischen gewählten Filter und den durchgeführten Protokollablauf durchgeführt werden. Höhere Extraktionsausbeuten werden durch die Spiking-Reinigung von Filtern im Vergleich zu Probenquarzfiltern erzielt, und beide Ausbeuten liegen unterhalb derjenigen, die durch die direkte Detektion der Standardlösung erreicht wird. Nach Beherrschung der Methode kann die Endotoxin-Analyse, sofern ordnungsgemäß durchgeführt, in dreieinhalb Stunden abgeschlossen werden.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die DNA-Sequenzierung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zum Transport von Organismen in der Atmosphäre zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Endotoxine und DNA effizient aus Luftprobenfiltern extrahiert und genau analysiert werden können.