Name: Die Transformation von probiotischen Hefe und ihre Erholung von Magen-Darm-Immun Geweben nach orale Gabe bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Lernen Sie die Transformation probiotischer Hefe und ihre Wiederherstellung aus Magen-Darm-Immungeweben nach oraler Gabe bei Mäusen. Diese Methoden ermöglichen die Entwicklung von Mutantenstämmen ohne Antibiotikaselektion.

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Die Autoren erkennen an Finanzierung durch das Zentrum der Kinder für Immunologie und Impfstoffe und ein NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) an Tracey J. Lamb ausgezeichnet. Die Autoren danken auch Natalya P. Degtyareva für die großzügige Spende von rad1 S. cerevisiae.

<ol><li>Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+and+physiological+characterization+of+Saccharomyces+boulardii%2C+the+probiotic+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).</li>
<li>Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Heterologous+Protein+Expression+by+Genetically+Engineered+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii.</a> PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Enzymology%2C+Volume+149%3A+Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , (1991).</li>
<li>DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+with+PCR+products+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 158, 113-117 (1995).</li>
<li>Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+Uracil+Auxotroph+Strain+of+the+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii+as+a+Host+for+the+Recombinant+Protein+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+Journal+of+Medical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).</li>
<li>Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).</li>
<li>Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+transformation+of+intact+yeast+cells+by+electroinjection+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).</li>
<li>Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBecker%2C+D+%22Methods+in+Enzymology%2C+Volume+149%3A+Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. , 182-187 (1991).</li>
<li>Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+yeast+transformation+method+for+the+generation+of+very+large+human+antibody+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+engineering%2C+design+%26+selection+%3A+PEDS%22%5BJournal%5D)">An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries.</a> Protein engineering, design & selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).</li>
<li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi%3A+methods+and+possible+underlying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered+bugs%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li>
<li>Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+transformation+process+studied+by+fluorescence+labeling+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique.</a> Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of yeast.</a> BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).</li>
<li>JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology</a>. , (2015).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).</li>
<li>Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Can%27t+Rodents+Vomit%3F+A+Comparative+Behavioral%2C+Anatomical%2C+and+Physiological+Study%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spoonful+of+sugar+helps+the+medicine+go+down%3A+a+novel+technique+to+improve+oral+gavage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).</li>
<li>Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+M+%22Animal+Models+in+Toxicology%22">Animal Models in Toxicology</a>. , 50-193 (2006).</li>
<li>Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+produced+by+gavage+administration+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+topics+in+laboratory+animal+science+%2F+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Stress produced by gavage administration in the rat.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).</li>
<li>Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacoby%2C+R+%22Laboratory+animal+medicine%22">Laboratory animal medicine</a>. , 35-133 (2002).</li>
<li>Schulz, O., Pabst, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+sampling+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen sampling in the small intestine.</a> Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).</li>
<li>McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Farache, J., Koren, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+bacteria+recruit+CD103%2B+dendritic+cells+into+the+intestinal+epithelium+to+sample+bacterial+antigens+for+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation.</a> Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).</li>
<li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+D+%22Methods+in+yeast+genetics%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).</li>
<li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5%27-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast%3A+5-fluoro-orotic+acid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+general+genetics+%3A+MGG%22%5BJournal%5D)">A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Molecular & general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).</li>
<li>Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+lys2+mutants+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+the+utilization+of+alpha-aminoadipate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate.</a> Genetics. 93, 51-65 (1979).</li>
<li>Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+counterselection+for+the+tryptophan+pathway+in+yeast%3A+5-fluoroanthranilic+acid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance.</a> Yeast. 16 (6), Chichester, England. 553-560 (2000).</li>
<li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+characterization+of+met15+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae%3A+a+selective+system+for+forward+and+reverse+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations.</a> Genetics. 81, 75-97 (1975).</li>
<li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+relationships+of+mercury+resistant+mutants+and+methionine+auxotrophs+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).</li>
<li>McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+binding+to+cell-surfaces+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc%2FSS-DNA%2FPEG+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li>
<li>Zhang, Z., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+stability+in+recombinant+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 14 (4), 401-435 (1996).</li>
<li>Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+Fluorescent+Protein+Is+Lighting+Up+Fungal+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li>
<li>Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+the+preparation+of+yeast+cells+for+transformation+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation.</a> Yeast. 14, 565-571 (1998).</li>
<li>Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gavage-related+reflux+in+rats%3A+identification%2C+pathogenesis%2C+and+toxicological+implications+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+pathology%22%5BJournal%5D)">Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review).</a> Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).</li>
<li>Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+uptake+of+biodegradable+nanoparticles%3A+effect+of+particle+size%5BTitle%5D)+AND+%22Pharma%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size.</a> Pharma. 13 (12), (1994).</li>
<li>Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+uptake+by+Peyer%27s+patches%3A+a+pathway+for+drug+and+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+delivery%22%5BJournal%5D)">Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery.</a> Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).</li>
<li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function%2C+interactions%2C+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921(2013).</li>
<li>Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Auxotrophic+Mutants+of+Diploid+Industrial+Yeast+Strains+after+UV+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis.</a> Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zusammen beschreiben die Protokolle hier die wesentlichen Schritte, die für die Entwicklung und Erprobung von auxotrophen probiotische Hefe-Stämme für die Lieferung von heterologen therapeutischen Proteins in den Darm. Diese Manipulation und Prüfung von rekombinanten probiotischen Hefe erfordert Techniken und Mittel, mit denen jeder einzelnen Labor derzeit nicht vertraut sind. Obwohl also zahlreiche frühere Studien, die über Protokolle für mehrere Hefe und Maus-Stämme beschrieben haben, haben diese Methoden nicht auf da...

Probiotische Mikroorganismen sind eine interessante Potential mittels effizient und wirtschaftlich heterologer Proteine ​​an den Gastrointestinaltrakt zu liefern. Diese Organismen sind in der Lage Passage durch den Magen-Darm-Trakt zu überleben noch nicht kolonisieren es nicht ein, so dass kontrollierte Dosierung und Reduzierung der Belastung durch das Medikament zum Ausdruck gebracht. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, leicht, diese Organismen Ingenieur heterologen Proteins in großem Maßstab zu produzieren macht sie eine kostengünstige Alternative zu synthetischen Lieferung Partikel. Jedoch Entwicklung eines solchen Konzepts, wie kürzlich einen auxotrophen Stamm der probiotischen Hefe Saccharomyces boulardii 2 gezeigt, verwenden, erfordert die Kenntnis von Labortechniken traditionell nicht innerhalb einer gegebenen Studie kombiniert, die von Hefen und Molekularbiologie Tierhandhabungstechniken und immunologische Verfahren. Obwohl also die sind beschrieben einzelnen Verfahren hier nicht in sich RomanLaborprotokolle ist das Ziel dieses Manuskripts eine einheitliche Einführung in Techniken zur experimentellen Erprobung probiotischer Hefen als Arzneimittelabgabevehikel zur murine Gastrointestinaltrakt erforderlich zu präsentieren. Vorausgesetzt ist eine Zusammenstellung der wesentlichen Protokolle für: 1) Erzeugung von auxotrophen Mutantenstämmen der Hefe, die leicht genetisch manipuliert werden kann; 2) Transformation von Hefe Kulturen zu exprimieren heterologes Protein; 3) Verabreichung von rekombinanten Hefe in den Darm durch orale Sondenfütterung; und 4) Wiederherstellung lebensfähiger rekombinanten probiotischen Hefe aus dem murinen Darm und die Bewertung ihrer heterologen Proteinexpression. Erstens, obwohl zahlreiche positive und negative Selektionsverfahren für die Manipulation von Hefe-Spezies vorhanden sind, negative Selektion, wie durch die Verwendung von auxotrophen Markern erhöht sowohl die Effizienz und Leichtigkeit, mit der Hefe kann transformiert und selektiert werden. Positive Selektion von Transformanten Antibiotika, in Zusammenarbeit mitntrast, erhöht die Kosten für die Hefe-Manipulation. Weiterhin Auswahl von Hefe auf antibiotikahaltigen festen Medien können für erhöhtes Wachstum von nicht-transformierten Hintergrund Kolonien in Bezug auf Auswahl von auxotrophen Hefe auf synthetischen Tropfen aus festen Medien (unveröffentlichte Beobachtungen) ermöglichen. Auxotrophen Hefe-Stämme, die Enzyme von entscheidender Bedeutung für die Synthese von essentiellen Aminosäuren oder Uracil fehlt. Solche Hefen können nur mit dem fehlenden Metaboliten oder Stoffwechselgens, so dass, wenn negative Selektion ergänzt wachsen, wenn Hefe auf synthetischen Tropfen aus Medien plattiert ist, die die essentiellen Metaboliten fehlt. Viele häufig verwendete Saccharomyces cerevisiae Laborstämme sind in der Tat bereits auxotrophen Mutanten 3. Industriellen, klinischen und probiotischen Hefestämme sind jedoch üblicherweise prototroph mit der Fähigkeit, alle erforderlichen Nährstoffe zu synthetisieren. So aktivieren effizienter genetische Manipulation solcher Hefe kann auxotrophen Gene ganz gezieltzu erzeugen, die ohne Antibiotika Stämme ausgewählt werden können. Spezifisches Targeting von auxotrophen Markergene können durch PCR-vermittelte Gen-Unterbrechung erreicht werden über eine homologe Rekombination zu verlassen oder in jüngerer Zeit durch CRISPR / Cas9 Targeting 4-6. Alternativ können UV-Mutagenese schnell auxotrophen Mutanten auch in Hefestämmen erzeugen, für die Transformation mit mehreren Plasmiden 7 technisch schwierig ist. Während PCR-Targeting und CRISPR / Cas9 haben ausführlich an anderer Stelle beschrieben worden ist, in Teil präsentiert eine dieser Handschrift ein detailliertes Protokoll ist ein UV-Mutagenese-Ansatz beschreibt auxotrophe Stämme zu schaffen, die für die negative Selektion erlauben, anstatt positive Antibiotika-Selektion von Hefe-Transformanten. Der nächste Schritt in der notwendigen Verwendung des auxotrophen Stämme für die orale Verabreichung von heterologen Protein ist Hefe-Transformation mit Plasmid-DNA. Seit der ersten erfolgreichen Transformation von Yeast Sphäroplasten für Saccharomyces cerevisiae 1978 berichtete 8 wurden zahlreiche Modifikationen charakterisiert worden, um die Effizienz zu erhöhen und die Leichtigkeit, mit der Hefe-Arten können genetisch modifiziert werden. Verwendung der Elektroporation für die erfolgreiche Transformation von DNA in S. cerevisiae wurde zuerst im Jahr 1985 beschrieben und 9 wurde durch Zugabe von 1 M Sorbit Inkubation osmotisch Stützzellen 10 seit verbessert. Elektroporation Effizienz ist zu den Hefearten und Dehnung gezeigt abzuhängen, Zellzahl und Wachstumsphase, Elektroporation Volumen Feldstärke weiterhin worden, und spezifische Puffer 11. Lithiumacetat (LiOAc) Transformation, die ursprünglich von Ito et al. 12, gehört zu den am häufigsten verwendeten Transformationsprotokolle, wie es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Weitere Analysen zeigten, dass die Effizienz der LiOAc Hefetransformation stark erhöht, wenn die Zellen in der mittleren logarithmischen Phase gesammelt werden,des Wachstums und in der Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG) und DNA bei 42 ° C 12 Hitzeschock. Inkubation von Voll intakte Hefe mit PEG ist wesentlich für eine effiziente Transformation, möglicherweise durch die Verbesserung der Befestigung von DNA an die Zellmembran wie auch über andere Auswirkungen auf die Membran 13. Lithium selbst erhöht auch die Durchlässigkeit von intakten Zellen 14. Obwohl die meisten Labor S. cerevisiae-Stämme LiOAc Transformation leicht transformiert werden können, 3, andere Hefearten effizienter werden können unter Verwendung alternativer Protokolle transformiert. Pichia pastoris, zum Beispiel die meisten effizient transformiert via Elektroporation statt LiOAc Transformation 13. Entscheidend ist daher zu prüfen, multiple Methoden der Transformation und Inkubationszeiten und Reagenzienkonzentrationen zu optimieren, wenn sie genetisch eine nicht charakterisierte Hefestamm ändern versucht. Dieses Manuskript beschreibt somit sowohl LiOAc transformation und Elektroporation als Techniken für die Transformation der auxotrophen Mutante und Wildtyp S. boulardii. Interessierte Leser sind für eine gründliche Beschreibungen über die Entwicklung der Hefe-Transformation, alternative Protokolle und weitere Diskussionen über mögliche Wirkmechanismen 13,15 auf die jüngsten Bewertungen gerichtet. Transformation von Hefe mit dem Plasmid ein leicht nachweisbares Protein codiert, ist weiterhin wesentlich für nachgeschaltete Tests, um eine geeignete Expression und Funktion des heterologen Proteins zu gewährleisten. Vielzahl verschiedener Proteine ​​kann in Abhängigkeit von dem Endzweck des therapeutischen Studie ausgewählt und die Antikörper zum Proteinnachweis durch Immunoblotting, ELISA und andere Techniken. Protokolle für diese Techniken gründlich anderswo 16,17 beschrieben worden sind, und kann verwendet werden Niveaus von heterologen Proteinproduktion durch Vergleich mit Standardkurven von transformierten Hefe zu bestimmen. Für die Zwecke der Demonstration und zu zeigen,erfolgreiche Produktion eines sehr häufig verwendeten Protein in Hefe Biologie, stellt dieses Manuskript Transformation mit Plasmid-Codierung grün fluoreszierende Protein (GFP), die unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie zum anschließenden Nachweis ermöglicht. Ebenso wichtig für die Herstellung von probiotischen Organismen, die heterologes Protein ist die richtige Verwaltung und Nachweis dieser Mikroorganismen in gastrointestinalen Geweben exprimieren, wie in Teilen drei und vier beschrieben. Verabreichung von rekombinanten Hefe per Schlundsonde ermöglicht die Abgabe von kontrollierten Mengen von Hefe direkt in den Magen, von der C57BL / 6-Mäuse von Erbrechen 18 natürlich nicht in der Lage sind. Allerdings, unsachgemäße Behandlung der Tiere und eine Magensonde kann zu Speiseröhrenschäden und Perforation, Magendurchbruch, Luftröhren Verwaltung führen und Aspirationspneumonie 19,20. Schlechte Technik und Unerfahrenheit kann weiterhin Variabilität in murine Immunantworten und experimentelle resu erhöhenLTS, die zu den Tier Stress auf orale Gabe 21,22 zugeschrieben wurden. Praxis in der richtigen Technik kann somit nicht nur Tier Beschwerden dämpfen, sondern auch Präzision der experimentellen Ergebnisse zu erhöhen. Dieses Manuskript beschreibt und veranschaulicht die Behandlung der Tiere und orale Gabe für die Verwaltung der kontrollierten Dosen von rekombinanten Hefe. Schließlich ist es wichtig, erfolgreiche Zustellung von rekombinanten Hefe zu bestätigen, indem lymphoide Gewebe auf das Vorhandensein von Hefen und heterologen Proteins zu analysieren. Die Magen-Darm-Gewebe, die Immun kann am einfachsten und vorhersehbar auf die Gegenwart von Hefe zu prüfen sind die Peyer-Plaques. Peyer-Plaques sind sekundären lymphatischen Organe entlang des Dünndarms, die wichtigsten Standorte der Schleimhautimmunantwort Induktion 23 sind. Antigene aus dem Lumen sind durch transzellulär microfold (M) Zellen im Epithel überführt und in den Peyer-Plaques freigegeben, so umschließen Aussetzend Antigen-präsentierenden Zellen Lumen Inhalt Darm. Obwohl Partikelaufnahme über das Darmepithel kann auch durch Becherzellen erreicht werden, haben diese Zellen nur Partikel nehmen weniger als 0,02 &amp; mgr; m im Durchmesser 24 gezeigt. Transepithelialen Dendriten erstreckte sich von CD103 + dendritische Zellen (DC) auch kleine Partikel aus dem Darmlumen 25 aufnehmen; gibt es jedoch noch keine Berichte zeigen, dass CD103 + DCs Partikel aufnehmen größer als Bakterien. Somit intakt probiotischen Hefe, des Durchschnittsgröße zwischen 3-6 um im Durchmesser, sind höchstwahrscheinlich durch M-Zellen aufgenommen zu werden und mit den Peyer-Plaques übertragen. Beschrieben ist hier ein Protokoll für die Sammlung und das Screening von Peyer-Plaques für lebensfähige rekombinante Hefen, obwohl dieses Verfahren auch leicht zur Auswertung Aufnahme von probiotischen Bakterien angepasst werden kann. Zusammenfassend Beurteilung rekombinanten probiotischen Hefe für die Lieferung von dierapeutic Proteine ​​in den Darm erfordert Kenntnisse in Labortechniken der Molekularbiologie auf die Behandlung der Tiere und Immunologie überspannt. Präsentiert hier sind Protokolle für 1) die Erzeugung und das Screening von auxotrophen Hefestämmen, die leicht negativ ohne Antibiotika ausgewählt werden können, 2) alternative Protokolle zu verwandeln Hefe und ermöglichen die Expression von heterologen Proteins, 3) Demonstrationen der richtigen Tierhandhabungstechniken und orale Gabe für intragastric Lieferung von rekombinanten Hefe, und 4) Protokolle für Patch Dissektion der Peyer und Screening für lebensfähige rekombinante Hefen und funktionellen heterologen Proteins. Zusammen werden diese Protokolle für die Erzeugung und Prüfung eines probiotischen Hefestamm ermöglichen Lage ist, an den Gastrointestinaltrakt heterologe therapeutische Protein zu liefern.

<table><tbody><tr><td>SmartSpec 3000 Spektralphotometer</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Beispiel für ein Spektralphotometer zur Bestimmung der Zellkonzentration und OD600 von Hefekulturen</td></tr><tr><td>New Brunswick Roller Drum</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Beispiel für eine Walzentrommel für die Inkubation von Hefekulturen</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Beispiel Stratalinker</td></tr><tr><td>Stuart Colony Counter SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Scientific</td><td>Plattenständer mit Vergrößerungsaufzeichnungen Koloniezahl bei Spüren des Drucks durch den Stift</td></tr><tr><td>Scienceware Colony Counter&nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>Handheld Colony Counter Pen</td></tr><tr><td>Replica Beschichtungsgerät</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Beispiel für Replica Plattierungsständer und Pads&nbsp;</td></tr><tr><td>Samtquadrate</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>L-förmige sterile Zellverbreiter&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonukleinsäure, einzelsträngig aus Lachshoden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Beispiel für Träger-DNA für Hefe LiOAc-Transformation</td></tr><tr><td>Sondennadeln</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp; 002</td><td>Für Mäuse von 15-20 g ist die empfohlene Nadel eine 22 Gauge (1,25 mm Kugel), 1 in langer, gerader, wiederverwendbarer Sondennadel. Für Mäuse mit einem Gewicht von mehr als 20&nbsp; g, 20 Gauge oder größere gerade oder gebogene Sondennadeln können verwendet werden</td></tr><tr><td>1 ml sterile Einweg-Tuberkulinspritze mit Slip-Spitze</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Stumpfe Pinzetten wie z.B. Elektronenmikroskopie Sciences 7" (178 mm) gezackte Pinzette mit breitem Griff</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>77937-28</td><td>Beispiel für eine stumpfe Pinzette, die zum Sezieren benötigt wird&nbsp;</td></tr><tr><td>Gerade und gebogene Dissektionsscheren</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>72966-02 und 72966-03</td><td>Beispiele für Scheren, die für die Dissektion benötigt</td></tr><tr><td>werden IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

die transformation von probiotischen hefe und ihre erholung von magen-darm-immun geweben nach orale gabe bei mäusen

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Die Entwicklung einer rekombinanten oralen Therapie würde ein direkteres Targeting des mukosalen Immunsystems ermöglichen und die Fähigkeit zur Bekämpfung von Magen-Darm-Erkrankungen verbessern. Insbesondere die Anpassung der probiotischen Hefe an diesen Ansatz bringt mehrere Vorteile mit sich. Diese Stämme haben nicht nur das Potenzial, eine Vielzahl komplexer heterologer Proteine zu synthetisieren, sondern sind auch in der Lage, diese Proteine während der Passage durch den Darm zu überleben und zu schützen. Entscheidend ist jedoch, dass dieser Ansatz Fachwissen in vielen verschiedenen Labortechniken erfordert, die normalerweise nicht zusammen verwendet werden. Obwohl einzelne Protokolle für die Hefetransformation für häufig verwendete Laborstämme gut charakterisiert sind, wird hier der Schwerpunkt auf alternative Ansätze und die Bedeutung der Optimierung der Transformation für weniger gut charakterisierte probiotische Stämme gelegt. Die Detaillierung dieser Methoden wird dazu beitragen, die Diskussion über die besten Ansätze für die Erprobung probiotischer Hefe als orale Wirkstoffträger zu erleichtern und die Entwicklung dieser neuartigen Strategie für die gastrointestinale Therapie voranzutreiben.

Erzeugung einer Überlebenskurve nach der UV-Bestrahlung erfordert Plattieren verdünnt Hefezellen so dass verschiedene koloniebildenden Einheiten (CFU) zu bilden vermögen. Jede 500 &amp; mgr; l Probe entnommen, wie oben beschrieben, enthält etwa 5 x 10 6 Zellen; jedoch größer als 100 Kolonien pro Platte sind schwierig, genau zu unterscheiden. Plattieren unverdünnten Probe sowie seriellen Verdünnungen von 1.10 bestrahlten Zellen gewährleistet somit, dass CFU kann an jeder UV-Dos...

Dargestellt ist hier die einheitliche Beschreibung von Techniken, die verwendet werden können, zu entwickeln, transformieren, zu verwalten und zu testen, die heterologe Proteinexpression der probiotischen Hefe Saccharomyces boulardii.

Die Transformation von probiotischen Hefe und ihre Erholung von Magen-Darm-Immun Geweben nach orale Gabe bei Mäusen

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, einen probiotischen Hefestamm zu entwickeln, der leicht transformiert werden kann, um heterologe Proteine im gastrointestinalen Trakt der Maus zu exprimieren und abzugeben. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass sie die schnelle Erzeugung von oxytrophen Stämmen probiotischer Hefen ermöglichen. Diese mutierten Hefen können anschließend genetisch verändert werden, ohne auf eine Antibiotikaselektion angewiesen zu sein.Die orale Gavage von Mäusen und die Gewinnung der Peyer-Plaques ermöglichen ebenfalls die Überprüfung der Adhärenz mutierter Hefe an die immunologischen Gewebe des Magen-Darm-Trakts. Diese Methoden tragen dazu bei, zentrale Fragen auf dem Gebiet der oralen Impfung zu beantworten, und erleichtern Experimente zur Prüfung von Probiotika für die Abgabe gastrointestinaler Therapeutika. Nach der Herstellung des YPD-Mediums und dem Anzüchten der Hefe über Nacht bis zur Sättigung verdünnen Sie die Zellen im Verhältnis 1:10 in Wasser in einer Kunststoffküvette.Anschließend kalibrieren Sie ein Spektrophotometer und bestimmen die optische Dichte der Übernachtkultur. Verdünnen Sie die Zellen mit 20 Milliliter steriler destillierter Wasser auf eine Konzentration von 10⁷ Zellen pro Milliliter. Gießen Sie anschließend die verdünnten Zellen in eine sterile Plastikpetrischale und stellen Sie die Schale bei geöffnetem Deckel in einen UV-Vernetzer.Als Nächstes setzen Sie die Zellsuspension schrittweise zunehmenden Dosen UV-Bestrahlung aus und entnehmen nach jeder Dosiserhöhung Aliquots von 500 Mikroliter, um eine Abtötungskurve aufzustellen und den optimalen Prozentsatz an überlebenden Zellen für die Selektion zu bestimmen. Verdünnen Sie die Zellen seriell mit steriler Wasser in Verdünnungsschritten von eins zu zehn. Anschließend pelletieren Sie die Zellen aus jeder Verdünnung durch Zentrifugation mit maximaler Geschwindigkeit für eine Minute.Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Volumen von 100 Mikroliter steriler Wasser, das für das Ausplattieren von Hefezellen geeignet ist. Pipettieren Sie anschließend das gesamte Volumen der resuspendierten Zellen auf Platten mit festem YPD-Medium und verteilen Sie die Zellen mit einem sterilen Spreader gleichmäßig auf jeder Platte. Erstellen Sie eine Überlebenskurve und bestimmen Sie gemäß dem Textprotokoll die für das Screening zu verwendende Dosis der UV-Bestrahlung.Nach der Exposition der Hefe gegenüber der für das Screening ausgewählten Dosis an UV-Bestrahlung, pelletieren Sie das gesamte Volumen der bestrahlten Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikroliter steriler Wasser. Platten Sie gemäß dem Textprotokoll auf Minimalmedium, das 5-FOA enthält, um Ihre drei oxytrophen Minus-Newton-Stämme zu selektieren. Bestätigen Sie das URA3-Minus-Phänotyp, indem Sie mit der Spitze eines sterilen Zahnstochers einen Teil einer einzelnen Kolonie von der 5-FOA-Platte entnehmen und diese erneut auf YPD-, 5-FOA- und Uracil-minus-Platten ausstrichen.Die Platten einwickeln und zwei bis vier Tage lang verkehrt herum bei 30 Grad Celsius inkubieren. Den oxytrophen Status bestätigen, indem das Wachstum von Kolonien auf YPD- und 5-FOA-Platten, jedoch nicht auf Uracil-freien Platten, überprüft wird. Nach Bestätigung des URA-3-negativen Status der bestrahlten Hefe eine Übernachtungsfilterung für die Lithiumacetat-Transformation vorbereiten, indem 10 Milliliter YPD mit einer einzelnen mutierten Kolonie beimpft und im Warmraum bei 30 Grad Celsius inkubiert werden.Am folgenden Tag 50 Milliliter frische, warme YPD verwenden, um die Übernachtkulturen auf einen OD600 von 0,16 bis 0,2 zu verdünnen, und die Zellen auf einem Rüttelplatform-Shaker, eingestellt auf 200 U/min, inkubieren, bis die Kultur etwa eine mal zehn hoch sieben Zellen pro Milliliter erreicht, was gewöhnlich etwa vier Stunden dauert. Nach dem Waschen der Zellen mit Wasser und Lithiumacetat gemäß dem Protokoll 50 Mikroliter resuspendierter Zellen zu einer Transformationsmischung aus Plasmid- und Träger-DNA hinzufügen. Anschließend 300 Mikroliter PEG, TE und Lithiumacetat hinzufügen und vortexen.Inkubieren Sie die Ansätze 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius auf einem Rüttelplatform-Shaker bei 200 U/min. Fahren Sie anschließend mit der Transformation gemäß dem schriftlichen Protokoll fort. Nach der Herstellung der Hefe-Kulturen gemäß dem schriftlichen Protokoll bestimmen Sie mithilfe eines Hämozytometers die Zellkonzentration und stellen Sie diese auf 10⁹ Zellen pro Milliliter ein.Die Zellen durch Zentrifugation bei 2500 × g für drei Minuten pelletieren. Dann den Überstand abgießen und die Zellen durch Zugabe des geeigneten Volumens sterilen Wassers resuspendieren, indem man vorsichtig mehrmals auf- und abpipettiert. Eine Gavage-Kanüle mit geeignetem Durchmesser an einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze befestigen und die Hefeprobe aufziehen, wobei sämtliche Luftblasen entfernt werden. Laden Sie eine zusätzliche Spritze mit steriler Wasser, um Kontrollmäuse zu gavagieren. Heben Sie mit der nicht-dominanten Hand die Maus an, die gavagiert werden soll, und greifen Sie mit Zeigefinger und Daumen fest die Haut um den Hals. Legen Sie den Schwanz unter den kleinen Finger.Stellen Sie sicher, dass der Griff fest sitzt und die Maus daran gehindert wird, ihren Kopf zu bewegen. Führen Sie anschließend vorsichtig die Gavagekanüle in die Speiseröhre der Maus ein, indem Sie die Kanüle entlang dem Gaumen und dem hinteren Rachenbereich nach hinten führen, dabei leicht links der Mittellinie verbleibend. Warten Sie, bis die Maus die Glaskugel der Kanüle geschluckt hat.Wenn ein Widerstand spürbar ist oder die Maus keucht, entfernen Sie die Nadel vorsichtig und versuchen Sie erneut, die Speiseröhre zu finden. Nachdem die Maus die Birnenspitze der Gavagenadel geschluckt hat, drücken Sie den Spritzenstempel vorsichtig herunter, um die Hefe direkt in den Magen der Maus zu verabreichen. Entfernen Sie die Gavagenadel vorsichtig aus dem Magen und der Speiseröhre der Maus und bringen Sie die Maus zurück in den Käfig.Überprüfen Sie, ob die Maus normal atmet und sich normal bewegt, um sicherzustellen, dass die Schlundsonde korrekt verabreicht wurde. Nach der Tötung der Maus gemäß dem Textprotokoll positionieren Sie sie so, dass der Bauch vollständig freiliegt, und besprühen Sie den Bauchbereich mit 70 % Ethanol. Machen Sie mit einer Schere einen quer verlaufenden Schnitt durch das Fell und die Haut.Öffnen Sie dann den Schnitt manuell, um das Peritoneum, die dünne seröse Auskleidung, die die Bauchorgane bedeckt, weiter freizulegen. Heben Sie das Peritoneum vorsichtig an und führen Sie einen Querschnitt durch, um den Dünndarm freizulegen. Verwenden Sie anschließend stumpfe Pinzette, um den Dünndarm vorsichtig von den mesenterischen Arterien, dem Fettgewebe und anderen Geweben zu lösen.Freilegen Sie den Dünndarm vom Magen im linken oberen Quadranten des Bauchs der Maus bis zum Zäkum, der großen Tasche aus Darmgewebe am Anfang des Dickdarms. Isolieren Sie anschließend die Peyer-Plaques, indem Sie nach ein bis zwei Millimeter großen, annähernd kreisförmigen Abschnitten aus undurchsichtigem Gewebe entlang des Dünndarms suchen. Schneiden Sie dann mit gebogenen Präzisionsscheren die Kuppel der Peyer-Plaque heraus und lassen Sie dabei Ränder stehen, um sicherzustellen, dass kein umgebendes Gewebe mitentnommen wird.Überführen Sie die dissezierten Peyer-Plaques in komplettes IMDM. Gießen Sie anschließend die Lösung mit den suspendierten Peyer-Plaques auf einen 40-Mikrometer-Zellsieb. Nach dem Waschen der Peyer-Plaques mit komplettem IMDM zerkleinern Sie das Gewebe vorsichtig mit einem Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze und sammeln die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen.Zentrifugieren Sie die filtrierten Zellen bei 1800 U/min für sieben Minuten. Anschließend die Zellen gemäß dem Textprotokoll ausplattieren und analysieren. Diese Abbildung zeigt eine Ausplattierung aus einer seriellen Verdünnung bestrahlter S. boulardii-Zellen.Die serielle Verdünnung gewährleistet, dass die koloniebildenden Einheiten (CFU) bei jeder UV-Dosis gezählt werden konnten. Anhand dieser Bilder von Hefeplatten zeigt das gleichmäßige Wachstum von Mutantenkolonien auf YPD- und 5-FOA-Platten, jedoch nicht auf Uracil-freien Platten, ein Uracil-abhängiges Oxytrophie-Phänotyp. Dieses Diagramm veranschaulicht die Transformations-Effizienz von wildtypischem S. boulardii im Vergleich zu S. cerevisiae unter Verwendung der Lithiumacetat-Methode sowie der Elektroporation.Obwohl die Lithiumacetat-Transformation für S. cerevisiae sehr effizient ist, wird die Transformationsrate für S. boulardii durch Elektroporation erheblich verbessert. In diesen Hellfeld- und Fluoreszenzbildern zeigt S. cerevisiae, das mit einem URA3-Plasmid transformiert wurde, das GFE kodiert, einen funktionalen Ausdruck des heterologen Proteins. In dieser Abbildung ist ein Beispiel für lebensfähige CFU, die nach der Sektion des Tieres aus Peyer-Plaques detektiert wurden, dargestellt.Eine typische Ausbeute an pro Maus gewonnenen CF liegt unter 10. Sie sollten nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man oxytrope Mutantenstämme von probiotischen Hefen mittels UV-Mutagenese erzeugt. Außerdem haben wir beschrieben, wie man die Fähigkeit dieser Hefen testet, heterologe Proteine zu exprimieren und an Peyersche Plaques des Dünndarms der Maus zu binden.Nach Durchführung dieser Verfahren können andere Methoden, wie ELISA und Fluoreszenzmikroskopie, verwendet werden, um die korrekte Faltung und Funktion heterolog exprimierter Proteine zu überprüfen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur fäkalen Mikrobiota-Transplantation bei einer Interleukin-10-defizienten Maus mit Dickdarmentzündung. Besiedelte fäkale Mikroben im Darm setzen sekundäre Metaboliten frei, die eine entzündungshemmende Zytokinfreisetzung auslösen und Dickdarmentzündungen reduzieren.

Bewertung der Auswirkungen einer fäkalen Mikrobiota-Transplantation bei einer Interleukin-10-defizienten Maus

Dieses Video zeigt die orale Verabreichung von transformierten Hefezellen in ein Mausmodell. Die transformierten Hefezellen werden oral mit einer Sondentechnik in den Magen der Maus verabreicht. Später wandern die Zellen in den Dünndarm, wo sie von mikrogefalteten Zellen umhüllt werden und ihren Transfer in Peyer-Pflaster erleichtern und Zugang zum Darmimmunsystem erhalten.

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Hier bieten wir ausführliche Protokolle für die orale Verabreichung von Antibiotika für Mäuse, Sammlung von Stuhlproben, DNA-Extraktion und Quantifizierung von fäkalen Bakterien durch qPCR.

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

Diese Studie beschreibt den Prozess der Gavaging genauen Mengen von Probiotika mit Neugeborenen Mäusen. Der Versuchsaufbau wurde optimiert, um gehören aber nicht beschränkt auf probiotische Dosierung, Methoden der Verwaltung und Quantifizierung der Bakterien im Darm.

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Therapeutische Bewertung der fäkalen Mikrobiota-Transplantation in einem Interleukin-10-defizienten Mausmodell

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung des Antibiotika-induzierten pseudo-keimfreien Dextransulfat-Natrium-induzierten Colitis-Mausmodells vor, um die Rolle der Darmmikrobiota bei der Regulierung der positiven Auswirkungen von Bacillus cereus auf Colitis zu untersuchen.

Untersuchung der lindernden Wirkung der Verabreichung von Bacillus cereus auf Colitis durch Modulation der Darmmikrobiota

Bakteriophagen (Phagen), Viren, die Bakterien infizieren, sind ein integraler Bestandteil des Darmmikrobioms. Obwohl diese symbiotischen Bewohner die bakterielle Fitness und Populationsdynamik vorantreiben, ist wenig darüber bekannt, wie sie sich auf die Darmhomöostase und -krankheit auswirken. Dieses Protokoll untersucht isolierte T4-Phagen in einem Mausmodell, die an andere Phagen-Bakterien-Paare angepasst werden können.

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

Dieses Protokoll beschreibt die Best Practices für den keimfreien Transfer von Mäusen zu und die Unterbringung in experimentellen Einzelkäfig-Isolatoren (Isokäfigen) unter Beibehaltung steriler Bedingungen. Methoden zur Stuhltransplantation in keimfreie Mäuse und die Gewinnung lebensfähiger Bakterien aus diesen darmisierten "humanisierten" Mäusen für weitere Anwendungen werden diskutiert.

Vorbereitung und Durchführung eines IsoPositiv-Käfig-Experiments zur Stuhltransplantation von Menschen in keimfreie Mäuse

Lernen Sie die Transformation probiotischer Hefe und ihre Wiederherstellung aus Magen-Darm-Immungeweben nach oraler Gabe bei Mäusen. Diese Methoden ermöglichen die Entwicklung von Mutantenstämmen ohne Antibiotikaselektion.

Die Transformation von probiotischen Hefe und ihre Erholung von Magen-Darm-Immun Geweben nach orale Gabe bei Mäusen

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