Name: Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie subzelluläre Organellen wie Mitochondrien und Zentrosomen in lebenden Zebrafisch-Embryonen mit Fluoreszenzmikroskopie abbilden. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die Untersuchung von Organell-Dynamiken in vivo.

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P.E. wird gefördert durch das Graduiertenkolleg 1373 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) und die Graduiertenschule der Technischen Universität München (TUM-GS). G.P. wurde gefördert durch die TUM-GS. L.T. wird durch ein EMBO-Stipendium unterstützt (EMBO ALTF 108-2013). Die Arbeiten von D.P. zum Zebrafisch wurden von der DFG im Rahmen des Sonderforschungsbereichs "Molekulare Mechanismen der Neurodegeneration" (SFB 596) gefördert; das Center for Integrated Protein Sciences (München) und das Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7/2007-2013) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 200611 (MEMOSAD). Derzeit ist er Stipendiat der New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller und wurde durch ein Stipendium der Deutschen Akademie der Naturforscher Leopoldina unterstützt. L.G. wird gefördert durch eine Förderung der DFG im Rahmen des SFB 870 "Aufbau und Funktion neuronaler Schaltkreise", Projekt A11. 
Wir danken Kristina Wullimann für die Instandhaltung unserer Fischanlage, Yvonne Hufnagel für den technischen Support und Thomas Misgeld für die Kommentare zum Manuskript. Wir danken R. Köster (Technische Universität Braunschweig) für die Bereitstellung des M1-Medusa-Vektors (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP), von dem wir Centrin-YFP kloniert haben, und S.C. Suzuki und T. Yoshimatsu (University of Washington) für die Bereitstellung der 14xUAS:MA-cerulean-Kassette, die wir zur Generierung des Reporterkonstrukts zur Herstellung von CentrinFish verwendet haben. Wir danken weiterhin S.C. Suzuki und T. Yoshimatsu (University of Washington) für die transgene Otx2:Gal4-Linie, A. Sagasti für das Sensory:Gal4-VP16-Konstrukt (UCLA) und M. Nonet (Washington University in St. Louis) für den pCold Heart Tol2-Vektor. Wir danken Bettina Schmid, Alexander Hruscha und Christian Haass (Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen München - DZNE) für ihren Beitrag zur Entwicklung von MitoFish.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier zeigen wir die Vielseitigkeit des Gal4-UAS - Expressionssystem zur fluoreszenz tag Mitochondrien Zentrosomen und die Zellmembranen von spezifischen Zelltypen in vivo in Zebrabärbling - Embryonen. Viele fluoreszierende Fusionsproteine ​​, die andere Organellen oder subzellulärer Strukturen beschriften kann in der veröffentlichten Literatur zu finden und kann von dem jeweiligen Labor, kommerziellen Quellen oder nichtkommerziellen Plasmid Hinterlegungsstellen (zB Addgene) erhalten werden. Zu entwerfe...

In - vivo - Bildgebung bietet eine direkte Visualisierung von zellulären Verhalten in der die meisten physiologischen Kontext. Die Transparenz der Genaktivität, deren schnelle und externe Entwicklung und eine reiche Auswahl an genetischen Werkzeugen , die Fluoreszenz - Markierung ermöglichen , sind alle auf den wachsenden Einsatz von In - vivo - Mikroskopie beigetragen , die Dynamik der wichtigsten Entwicklungsereignisse aufzuklären. Imaging - Studien von Entwicklung des Nervensystems in Zebrabärbling haben zum Beispiel unser Wissen über das Verhalten von neuralen Vorläuferzellen und das Schicksal ihrer Nachkommen einschließlich ihrer späteren Migration erweitert, Differenzierung und Schaltungsintegration 1-8. Die Bühne ist nun eingestellt, die subzellulären Dynamik zu untersuchen, diese zellulären Verhaltensweisen zugrunde liegen. Tatsächlich sind, Zebrabärbling bereits als Werkzeuge werden für die in vivo Zellbiologie ausgebeutet. Es ist nun möglich , die Mitochondrien zu visualisieren 9-11, Zentrosomen 2,8,12-14, Golgi 15, Die Mikrotubuli 4 und Aktin - Zytoskelett 16, Endosomen 17 und Komponenten des Apikalmembran komplexen 1.18 unter anderem subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo. Bisher viel von dem, was über die Funktion dieser Organellen bekannt ist, kommt von ihrem Verhalten in kultivierten Zellen zu studieren. Während in - vitro - Studien enormen Einblick in die Zellbiologie ergeben haben, Zellen in Kultur repräsentieren nicht vollständig die Komplexität der in vivo - Situation und daher nicht notwendigerweise die Funktion und Dynamik subzellulärer Organellen in vivo widerspiegeln. Zebrabärbling - Embryonen bieten eine tragfähige in vivo alternative subzellulären Dynamik zu untersuchen. Da Vertebraten besitzen Zebrabärbling viele Organsysteme (beispielsweise neurale Netzhaut), die mit denen in Säugetierspezies gefunden homolog sind. Zusätzlich werden Genaktivität zunehmend eingesetzt, um menschliche Krankheiten zu modellieren 19,20 </snach oben&gt; (Mikrozephalie 21 und Leber 22 kongenitale Amaurose zB) einschließlich und auf die mitochondriale Funktion im Zusammenhang mit zentrosomalen Funktion (zB Parkinson - Krankheit 23, Tauopathies 10,24 und Barth - Syndrom 25). In - vivo - Bildgebung auf zellulärer und subzellulärer Ebene in diesen Fällen wird ein besseres Verständnis der Zellbiologie erlauben diese pathologischen Zustände zugrunde liegen. Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Methoden ist es, eine umfassende Anleitung zur Verfügung zu stellen Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo Lichtmikroskopie zu untersuchen. Der gesamte Arbeitsablauf beteiligt bei der Visualisierung und Verfolgung von subzellulärer Strukturen in vivo beschrieben - von der genetischen Markierung Ansätze zur Erzeugung von transiente Expression und stabile transgene Fische und schließlich mit großem Feld und konfokale Mikroskopie auf Bildgebung. Während jedes dieser procedures von zahlreichen Zebrabärbling Laboratorien verwendet wird, die beschriebenen Protokolle werden optimiert und rationalisiert für die Dynamik subzellulärer Strukturen zu untersuchen. Zwei spezifische Aspekte der Arbeit hier beschriebenen rechtfertigen erwähnt: Erstens, die Verwendung des Gal4-UAS-Expressionssystems in verschiedenen Konfigurationen zu genetisch Etikett Organellen in bestimmten Zelltypen. Zweitens ist ein direkter Vergleich der Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild subzellulärer Strukturen in vivo. Aktuelle Strategien zur genetisch Label Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrabärbling entweder nutzen verkappte mRNA 1,4,8 oder DNA - basierte Konstrukte , wo Promotorelemente , die Expression von Fusionsproteinen 9,14,15 direkt fahren. In vitro transkribierten RNA gekappt Ergebnisse in schnelle und breite Ausdruck, das ist aber nicht gewebespezifisch. Zusätzlich verringern Expressionsniveaus im Laufe der Zeit als das verkappte RNA verdünnt wird oder abgebaut. Somit ist die Verwendung von RNA-basiertenKonstrukte zu Organell Dynamik in späteren Stadien in der Entwicklung beschränkt ist (in der Regel bis zu 3 Tage nach der Befruchtung) untersuchen. Diese Einschränkungen können durch die Verwendung von DNA-Konstrukten überwunden werden, wo räumliche und zeitliche Kontrolle der Expression durch spezifische Promotorelemente bestimmt wird. Wenn DNA - Konstrukte basieren in Kontext der Gal4-UAS - System wesentliche Verbesserungen an Transgen - Expressionsniveaus verwendet werden , werden 26,27 beobachtet. In diesem bipartite Expressionssystem, Zelltyp-spezifische Promotorelemente treiben, die Expression eines Transkriptionsaktivators Gal4, während Reportergenen stromabwärts von der Gal4-Bindungsstromaufwärts Aktivierungssequenz kloniert werden (UAS). Durch UAS Reporter mit entsprechenden Gal4 Treiber kombinieren, können die Expression auf bestimmte Zelltypen beschränkt werden, wodurch die Notwendigkeit umgangen werden jedes Mal zu klonen Reportergene hinter verschiedenen Promotoren eine spezifische Expressionsmuster gewünscht wird. Des Weiteren kann die Expression mehrerer UAS Reportergene seindurch einen einzigen Gal4 Aktivator angetrieben. Das Gal4-UAS-System stellt somit ein vielseitiges und flexibles genetischer Ansatz für subzelluläre Kennzeichnung. Breitfeld und konfokale Mikroskope sind die Arbeitstiere der meisten Laboratorien. Weitfeldsysteme typischerweise eine Bogenlampe als Lichtquelle verwenden, und das emittierte Licht mit einer empfindlichen Kamera erkennen, die am Ende des Lichtweges angeordnet ist. Diese Bildgebungsverfahren wird in der Regel auf dünne Proben beschränkt, wie Out-of Fokus Licht verschleiert im Fokus befindlichen Informationen in dickeren Proben. Die konfokale Mikroskope unterscheiden sich von Weitfeld - Systemen dadurch , dass sie gebaut werden Signale zu bevorzugen , die von der Fokusebene über diejenigen , die ihren Ursprung außerhalb des Fokus (dh &quot;optischen Schneidens&quot;) 28 stammen. Zu erreichen optischen Schneidens wird ein Pinhole im Emissionspfad in einer konjugierten Position zu der Punktlichtquelle angeordnet. Laser werden als Lichtquellen verwendet, und Signale werden mit Photomultipliern (PMTs) nachgewiesen. Praktisch wird ein LaserStrahl über die Probe Punkt-für-Punkt und der Fluoreszenzemission bei jedem Punkt (Pixel) swiped von der PMT detektiert wird. Hier Bild, das wir die gleichen subzellulärer Strukturen in Genaktivität leben beide mit großem Feld und konfokaler Mikroskopie mit einem direkten Vergleich der beiden Mikroskopie Modalitäten zur Verfügung zu stellen. Die zugrunde liegende Ziel solcher Vergleiche der Bereitstellung ist es, Richtlinien zu bieten für die am besten geeignete Mikroskopietechnik für die spezifische Frage auf der Hand entschieden haben. Mit Hilfe der beschriebenen Ansätze hier zeigen wir Gal4-UAS basiert die genetische Markierung der Mitochondrien und Zentrosomen. Diese Organellen sind in verschiedenen Zelltypen des Nervensystems und in Muskelzellen abzubildenden Verwendung Weitfeld und konfokale Mikroskopie die Eignung jedes Bildgebungsmodalität zu demonstrieren. Die hier beschriebenen Verfahren können leicht zur Untersuchung von anderen Organellen und subzellulären Strukturen im lebenden Zebrafischembryo angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Agarose (2-Hydroxyethylagarose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td> Typ VII Blockheizer mit <td>niedriger Geliertemperatur</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixer compact</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 Calciumnitrathydrat, 99,996%&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>Zur Vorbereitung von 30x Danieau's</td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Keramikbeschichtet Dumont #5 Pinzette</td><td>Dumont - Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td>#5 Pinzette</td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Kulturschalenheizung</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>DH-35</td><td>Heizring</td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfatsalz</td><td>PharmaQ</td><td>Tricaine PharmaQ-25g</td><td>Tricain (Anästhetikum)</td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Präpariermikroskop</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GeneClean Kit</td><td>MP Biomedicals</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenkulturschalen</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td>35 mm Petrischale, 14 mm Mikrotiterplatte, Nr. 0 Deckglas</td></tr><tr><td>Glasnadeln</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Für Mikroinjektionen</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td><td>Zur Herstellung von 30x Danieau's</td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>DCC000001242 150g</td><td>Siliziumdioxid-Fett</td></tr><tr><td>KCl 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>Zur Herstellung von 30x Danieaus</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O &nbsp; &nbsp; Magnesiumsulfat-Heptahydrat 98+% A.C.S. Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>Zur Herstellung von 30x Danieau's</td></tr><tr><td>Microinjector&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td>Microloader Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0.5-20 ul</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenhalter</td><td>Intracel</td><td>P/N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkriptionskit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Zur Transkription von PCS-Transposase</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra >99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td>Zur Vorbereitung von 30x Danieau's</td></tr><tr><td>Nanophotometer</td><td></td><td></td><td>Zur Messung der DNA/RNA-Konzentration</td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Flaming/Brown</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Wassertauchkegel-Objektiv</td></tr><tr><td>N-Phenylthioharnstoff Grade I, ca. 98%</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (verhindert Pigmentierung)</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Kunststoff-Formen&nbsp;</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>Für Mikroinjektionen</td></tr><tr><td>Plexiglasabdeckung - mit einem Loch</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>Das Loch in der Plexiglasabdeckung sollte 3 mm größer sein als der Durchmesser des Wassertauchkegels Objektiv</td></tr><tr><td>Teesieb (Kunststoff)</td><td></td><td></td> <td>Zum Sammeln von Zebrafischeiern</td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>Dual Automatic Temperature Controller</td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>86.1171</td><td>3,5 mL Kunststoff-Transferpipetten</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1.00W</td><td>Olympus</td><td></td><td>Wassertauchkonus-Objektiv</td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0.50W&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Wassertauchkegel-Objektiv</td></tr><tr><td>Weitfeldmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU (50x Stock)</td><td></td><td></td><td>76 mg PTU in 50 ml destilliertem Wasser auflösen Bei Raumtemperatur kräftig umrühren&nbsp; Bei -20 oC in 1 ml Aliquoten lagern Bei 1x Arbeitslösung</td></tr><tr><td>aufbewahren Tricain (20x Stamm)</td><td></td><td></td><td>200 mg Tricain in 48 ml destilliertem Wasser auflösen 2 ml 1M Tris-Base (pH9) hinzufügen Auf pH 7&nbsp; Lagerung bei -20 oC in 1 ml Aliquoten Verwendung bei 1x Arbeitslösung</td></tr><tr><td>Danieau's Solution (30x Lager)</td><td></td><td></td><td>1.740 mM&nbsp; NaCl&nbsp; 21 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl&nbsp; 12 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MgSO4.7H2O&nbsp; 18 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Ca (NO3)2 150 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; HEPES-Puffer&nbsp; Destilliertes Wasser bis zu 1 L&nbsp; Lagern bei 4 oC&nbsp; Einsatz bei 0,3x funktionierender Lösung</td></tr></tbody></table>

imaging subzellulärer strukturen in der living zebrafischembryo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo Bildgebung bietet einen beispiellosen Zugang zum dynamischen Verhalten zellulärer und subzellulärer Strukturen in ihrem natürlichen Kontext. Die Durchführung solcher bildgebenden Experimente an höheren Wirbeltieren wie Säugetieren erfordert in der Regel einen chirurgischen Zugang zu dem zu untersuchenden System. Die optische Zugänglichkeit von embryonalen und larvalen Zebrafischen ermöglicht es, solche invasiven Eingriffe zu umgehen und die Bildgebung im intakten Organismus zu ermöglichen. In der Tat ist der Zebrafisch heute ein gut etabliertes Modell, um dynamisches zelluläres Verhalten mit Hilfe der In-vivo-Mikroskopie in einer Vielzahl von Entwicklungskontexten zu visualisieren, von der Proliferation über die Migration bis hin zur Differenzierung. Eine neuere Entwicklung ist die zunehmende Verwendung von Zebrafischen zur Untersuchung subzellulärer Ereignisse, einschließlich des mitochondrialen Transports und der Zentrosomendynamik. Die relative Leichtigkeit, mit der diese subzellulären Strukturen durch fluoreszierende Proteine genetisch markiert werden können, und der Einsatz von lichtmikroskopischen Techniken, um sie abzubilden, verwandelt den Zebrafisch in ein In-vivo-Modell der Zellbiologie. Hier beschreiben wir Methoden zur Generierung genetischer Konstrukte, die Organellen fluoreszierend markieren, wobei Mitochondrien und Zentrosomen als spezifische Beispiele hervorgehoben werden. Wir verwenden das bipartite Gal4-UAS-System in mehreren Konfigurationen, um die Expression auf bestimmte Zelltypen zu beschränken und Protokolle zur Erzeugung transient exprimierender und stabiler transgener Fische bereitzustellen. Schließlich geben wir Richtlinien für die Auswahl lichtmikroskopischer Methoden, die am besten für die Abbildung der subzellulären Dynamik geeignet sind.

Hier wird die Verwendung von Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild Mitochondrien und Zentrosomen in Genaktivität leben direkt verglichen und gegenübergestellt. Je nach Lage der Zellen in dem Organell Dynamik untersucht und die Eigenfrequenz der spezifischen subzellulären Ereignisse zu werden, im allgemeinen entweder Weitfeld oder konfokalen Mikroskopie ist die bessere Wahl. Wir abzubildenden Organellen in RB Neuronen auf der Oberfläche des Embryos und in Netzhautzellen befindet tiefer....

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Das übergeordnete Ziel dieser Bildgebungsmethode besteht darin, subzelluläre Organellen in einem Wirbeltier in vivo zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der neuronalen Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise zur Dynamik von Mitochondrien oder Centrosomen unter in-vivo-Bedingungen. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass das gesamte Experiment an einem intakten Wirbeltier durchgeführt werden kann, ohne dass chirurgische Eingriffe erforderlich sind.Diese Methode kann nicht nur Einblicke in subzelluläre Dynamiken unter physiologischen Bedingungen geben, sondern eignet sich auch für Untersuchungen von Krankheitsmodellen, wie beispielsweise der Alzheimer-Krankheit. Nachdem man durch Mikroinjektion vorübergehend exprimierende Embryonen erzeugt oder Embryonen gemäß dem Textprotokoll aus stabilen transgenen Linien erhalten hat, selektiert man am Ende des ersten Tages tote oder unbefruchtete Eier aus. Mit einer Plastik-Transferpipette überführt man die lebensfähigen Embryonen in Danieaus Lösung mit 1x PTU, um die Pigmentbildung zu verhindern, und hält die Embryonen bis zur Überprüfung der Transgenexpression in Danieaus Lösung mit 1x PTU.Am Tag des Bildgebungsversuchs verwenden Sie ein Fluoreszenz-Stereomikroskop, um anästhetisierte Embryonen auf die Expression des Transgens zu überprüfen. Überführen Sie anschließend die ausgewählten Embryonen in eine separate Petrischale, die Danieaus Puffer mit 1x PTU und 1x Tricain enthält. Sobald die Embryonen anästhesiert sind, pipettieren Sie vorsichtig einige davon in den Niedrigschmelz-Agarose, der 1x PTU und 1x Tricain enthält, und überführen dabei so wenig Flüssigkeit wie möglich, um eine Verdünnung des Agarose zu vermeiden.Überführen Sie die Embryonen zusammen mit einer kleinen Menge Agarose in eine Glasboden-Petrischale. Positionieren Sie die Embryonen dann mit Hilfe einer Pinzette in der gewünschten Orientierung, je nach zu bildgebender Struktur, und arbeiten Sie dabei relativ schnell. Die Embryonen müssen beispielsweise zur Bildgebung der Netzhaut oder eines Rohon-Beard-Neurons seitlich flach ausgerichtet werden.Eine präzise Ausrichtung gewährleistet die beste Bildqualität und optimiert die Aufnahmegeschwindigkeit. Nachdem das Agarose für mindestens 15 Minuten verfestigt wurde, Danieaus Puffer mit 1x PTU und 1x Tricain hinzufügen, um die Embryonen zu bedecken. Um die Weitfeldmikroskopie durchzuführen, eine Schale mit montierten Fischen in einer Heizkammer bei 28,5 Grad Celsius äquilibrieren, auf die Mikroskoptischplatte stellen, einen interessierenden Bereich auswählen und die Mikroskop-Software öffnen.Unter Beleuchtung klicken Sie auf Konfigurationseinstellungen, um die richtigen Filterkombinationen für die gewünschte Wellenlänge festzulegen. Geben Sie unter Kameraeinstellungen die Belichtungszeit ein, die erforderlich ist, um ein geeignetes Bild aufzunehmen. Wählen Sie dann ein Objektiv mit langem Arbeitsabstand und Wassereintauchung, mit einer Vergrößerung zwischen 40x und 100x, das die höchste numerische Apertur aufweist und chromatisch korrigiert ist.Klicken Sie auf „Live“, um das Sichtfeld auszuwählen. Bei einem R-B-Neuron bilden Sie den mitochondrialen Transport im Stammaxon ab, der vom Zellkörper ausgeht, oder im peripheren Astwerk. Klicken Sie dann im ImageJ-Menü auf die rechteckige Auswahl-Schaltfläche und definieren Sie einen interessierenden Bereich (ROI).Klicken Sie im Micromanager-Fenster auf ROI. Nach der Auswahl des ROI für die Aufnahme klicken Sie auf „Stop“ und „Speichern“, um die neuronale Morphologie im YFP-Kanal aufzuzeichnen. Um den mitochondrialen Transport abzubilden, klicken Sie auf „Mehrdimensionale Aufnahme“.Danach im Fenster „Multi-dimensional Acquisition“ die Anzahl der Zeitpunkte und das Intervall zwischen den Zeitpunkten auswählen. Im Fenster „Multi-dimensional Acquisition“ auf „Channels“ klicken und die Wellenlänge für die Aufnahme sowie die Belichtungszeit hinzufügen und definieren. Auf „Save images“ klicken, um die Dateien automatisch im spezifischen Ordner zu speichern, der in der Verzeichnisadresse angegeben ist.Klicken Sie nun oben rechts auf „Acquire“, um die Zeitrafferaufnahmen zu starten. Bei der konfokalen Mikroskopie öffnen Sie nach dem Einsetzen der präparierten Embryonen in eine Heizkammer bei 28,5 Grad Celsius auf dem konfokalen Mikroskoptisch die Mikroskop-Software und klicken auf Trans Lamp oder Epi Lamp. Anschließend identifizieren Sie mithilfe der Okulare des Mikroskops den interessierenden Bereich entweder mit transmittiertem Licht oder mit Fluoreszenzlicht.Überprüfen Sie im Fenster „Acquisition settings“, ob das für die Bildaufnahme gewählte Objektiv mit dem Objektiv übereinstimmt, das in der Dropdown-Liste der verfügbaren Objektive angezeigt wird. Klicken Sie dann im Fenster „Image Acquisition Control“ auf die Schaltfläche „Dye List“ und wählen Sie die geeigneten Fluorophore aus. Alternativ klicken Sie auf die Schaltfläche „Light Path and Dyes“, um die Parameter manuell festzulegen.Passen Sie im Fenster „Acquisition Setting“ den Zoomfaktor und das Seitenverhältnis des gescannten Bildes an, um die Pixelgröße zu erreichen, die notwendig ist, um die abgebildeten Strukturen bestmöglich aufzulösen. Stellen Sie die Pixelgröße auf etwa die Hälfte der theoretischen Auflösung des Objektivs ein, um damit dem Nyquist-Abtastkriterium zu folgen. Um die Pixelgröße eines erfassten Bildes zu bestimmen, klicken Sie im Fenster „Image Acquisition Control“ auf die Schaltfläche I.Als Nächstes stellen Sie die Scan-Geschwindigkeit auf das Höchstmögliche ein. Klicken Sie dann im Fenster „Image Acquisition Control“ auf Kalman-Linienmittelung und stellen Sie einen Faktor von zwei oder drei ein, um das Rauschen zu reduzieren. Um einen sequenziellen Scanmodus für die Abbildung von Fluorophoren mit überlappenden Spektren auszuwählen, klicken Sie auf „Sequential“ und „Line“.Danach stellen Sie die Leistungsabgabe der entsprechenden Laserlinien ein. Um den ausgewählten Bereich kontinuierlich zu scannen, während Sie die Detektoreinstellungen für jeden Kanal anpassen, klicken Sie auf XY-Wiederholung oder Fokus x2 bzw. Fokus x4. Danach stellen Sie HV, Verstärkung und Offset für jeden Kanal ein, um Bilder mit dem höchsten dynamischen Bereich an Grauwerten aufzuzeichnen.Drücken Sie nun Strg + H, um die aufgenommenen Bilder mithilfe einer Farbtabelle anzuzeigen, die unterbelichtete Pixel in Blau und überbelichtete Pixel in Rot kennzeichnet, wobei beide Zustände vermieden werden sollten. Überprüfen Sie erneut die Leistungsabgabe der entsprechenden Laserlinien und die Detektoreinstellungen. Um die oberen und unteren Grenzen des zu bildgebenden Volumens festzulegen, klicken Sie in den Aufnahmeeinstellungen auf die Schaltfläche „Ende festlegen“ an der oberen Grenze, fokussieren Sie dann auf die untere Grenze und drücken Sie „Start festlegen“.Um die Z-Auflösung des Objektivs zu überprüfen, klicken Sie in der Bildaufnahmesteuerung auf das I-Symbol. Wählen Sie dann eine Schrittgröße, die der halben Z-Auflösung des verwendeten Objektivs entspricht. Geben Sie im TimeScan-Unterfenster die Frequenz ein, mit der Z-Stapel aufgenommen werden sollen, sowie die Anzahl der Wiederholungen der Aufnahmen, um eine Zeitreihe einzurichten, die den Dynamiken der zu bildgebenden subzellulären Struktur angemessen ist.Klicken Sie auf die Tasten „Depth“ und „Time“, um zu bestätigen, dass der Z-Stack und die Zeitreihe aufgenommen werden. Klicken Sie abschließend auf die Taste „XY Zt“, um die Aufnahme von Zeitrafferaufnahmen zu starten. Nach der Bildaufnahme klicken Sie in der Software-Oberfläche auf „Series Done“.Speichern Sie die Bilder im OIB-Format, um die Bilder und die zugehörigen Metadaten zu dokumentieren. Diese Abbildung zeigt Organellen und R-B-Neuronen, die an der Oberfläche des Embryos lokalisiert sind, mithilfe von Weitfeld- und konfokaler Mikroskopie. Hier wurde eine Zeitrafferaufnahme an einem Weitfeldmikroskop verwendet, um die Bewegung eines einzelnen Mitochondriums im peripheren Arbor eines R-B-Neurons zu verfolgen.Die konfokale Bildgebung ist deutlich langsamer und kann zu einer Unterschätzung der Dynamik bestimmter subzellulärer Vorgänge führen. Bilder von Netzhautzellen, die mittels Weitfeldmikroskopie aufgenommen wurden, weisen einen schlechten Kontrast auf, da fluoreszierende Signale aus einem großen Gewebevolumen Details in der Fokusebene überlagern. Hier verbessert die optische Schichtungsfähigkeit der konfokalen Mikroskopie den Kontrast deutlich.Die Vergrößerungen zeigen Details eines Bereichs der inneren Kernschicht mit Markierung der zellulären Membranen und Mitochondrien. Durch einen spezifischen Gau-4-Treiber der Sinnesneuronen angetrieben, ermöglicht die mosaikartige Expression nach Injektionen von UAS-mito-CFP und UAS MAY-FP das Verfolgen einzelner Zellen über mehrere Tage, wie hier bei einem R-B-Sinnesneuron zwei und drei Tage nach der Befruchtung zu sehen ist. Neben Mitochondrien können auch andere subzelluläre Organellen wie Zentrosomen fluoreszenzmarkiert werden.In diesem Beispiel steuerten zwei UAS-Kassetten auf einem einzigen zusammenhängenden Konstrukt die Expression von am Centrosom lokalisiertem YFP und an der Membran lokalisiertem Cerulean in retinalen Zellen. Die Vergrößerungen zeigen eine Zelle in der M-Phase. Dieses gesamte Verfahren erfordert mehrere Tage, beginnend mit der Paarung, Sammlung der Eier, Injektionen und schließlich der Bildgebung an drei bis vier Tagen nach der Befruchtung.Das eigentliche Abbildungsexperiment am Mikroskop kann mehrere Minuten bis zu einem ganzen Tag dauern. Nach dieser Vorgehensweise können andere Organellen wie Mikrotubuli oder Peroxisomen markiert und abgebildet werden, um ihre Dynamik in vivo zu verstehen. Vergessen Sie nicht, dass PTU karzinogen ist, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer-Analyse der Organentwicklung in Genaktivität durch ein Fluoreszenzmikroskop mit Lage ist, eine optische Schnitte und einfache Strategien der Neueinstellung Sezieren fokale und planaren Drift zu korrigieren.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

Mitose ist für jeden lebenden Organismus von entscheidender Bedeutung und Defekte führen oft zu Krebs und Entwicklungsstörungen. Mit diesem Bildgebungsprotokoll und dem Zebrafisch als Modellsystem können Forscher die Mitose in einem lebenden Wirbeltierorganismus und die Vielzahl von Defekten sichtbar machen, die entstehen, wenn mitotische Prozesse defekt sind.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Eine Probenvorbereitungsstrategie für die Abbildung früher Zebrafischembryonen in einem intakten Chorion mit einem Lichtblattmikroskop wird beschrieben. Es analysiert die verschiedenen Orientierungen, die Embryonen innerhalb des Chorions in den 70% Epibolie- und Knospenstadien annehmen, und beschreibt bildgebende Strategien, um mit Hilfe des Lichtblattsystems eine zelluläre Auflösung im gesamten Embryo zu erzielen.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Erfahren Sie, wie Sie subzelluläre Organellen wie Mitochondrien und Zentrosomen in lebenden Zebrafisch-Embryonen mit Fluoreszenzmikroskopie abbilden. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die Untersuchung von Organell-Dynamiken in vivo.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

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