Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Das übergeordnete Ziel dieser bildgebenden Methode ist es, subzelluläre Organellen in einem Wirbeltier in vivo zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der neuronalen Zellbiologie zu beantworten, wie z.B. die Dynamik von Mitochondrien oder Zentrosomen im in-vivo-Kontext. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das gesamte Experiment an einem intakten Wirbeltier durchgeführt werden kann, ohne dass ein chirurgischer Eingriff erforderlich ist.

Diese Methode kann nicht nur Einblicke in die subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen geben, sondern auch auf Studien von Dissertationsmodellen, wie z. B. der Alzheimer-Krankheit, angewendet werden. Nach der Erzeugung von vorübergehend exprimierenden Embryonen durch Mikroinjektion oder der Gewinnung von Embryonen aus stabilen transgenen Linien gemäß dem Textprotokoll am Ende des ersten Tages ist ein Screening auf tote oder unbefruchtete Eizellen durchzuführen. Übertragen Sie die lebensfähigen Embryonen mit einer Kunststoff-Transferpipette in eine Danieau-Lösung, die 1x PTU enthält, um die Pigmentbildung zu verhindern, und halten Sie die Embryonen in Danieau-Lösung mit 1x PTU bis zum Screening auf Transgenexpression.

Verwenden Sie am Tag des bildgebenden Experiments ein Fluoreszenzmikroskop, um anästhesierte Embryonen auf die Transgenexpression zu untersuchen. Übertragen Sie dann die ausgewählten Embryonen in eine separate Petrischale, die Danieau-Puffer mit 1x PTU und 1x Tricain enthält. Sobald die Embryonen betäubt wurden, pipettieren Sie vorsichtig einige davon in die niedrigschmelzende Agarose, die 1x PTU und 1x Tricain enthält, und übertragen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich, um eine Verdünnung der Agarose zu vermeiden.

Übertragen Sie die Embryonen mit einer kleinen Menge Agarose in eine Petrischale mit Glasboden. Dann, relativ schnell, verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen in der gewünschten Ausrichtung zu positionieren, abhängig von der abzubildenden Struktur. Die Embryonen müssen richtig ausgerichtet sein, zum Beispiel flach an der Seite, um die Netzhaut oder ein Rohon-Beard-Neuron abzubilden.

Eine präzise Ausrichtung sorgt für die beste Bildqualität und optimiert die Aufnahmegeschwindigkeit. Nachdem Sie die Agarose mindestens 15 Minuten lang verfestigt haben, fügen Sie Danieau-Puffer mit 1x PTU und 1x Tricain hinzu, um die Embryonen zu bedecken. Um eine Weitfeldmikroskopie durchzuführen, öffnen Sie die Mikroskopsoftware, nachdem Sie eine Schale mit montierten Fischen in einer Heizkammer bei 28,5 Grad Celsius auf dem Tisch eines Weitfeldmikroskops äquilibriert und einen Interessenbereich ausgewählt haben.

Klicken Sie unter Beleuchtung auf Konfigurationseinstellungen, um die richtigen Filtersätze für die interessierende Wellenlänge zu definieren. Geben Sie unter Kameraeinstellungen die Belichtungszeit ein, die erforderlich ist, um ein geeignetes Bild aufzunehmen. Wählen Sie dann ein Wassertauchkegelobjektiv mit großem Arbeitsabstand mit 40- bis 100-facher Vergrößerung, das die höchste numerische Apertur aufweist und chromatisch korrigiert ist.

Klicken Sie auf Live, um das Sichtfeld auszuwählen. Im Falle eines R-B-Neurons stellen Sie sich den mitochondrialen Transport am Stammaxon vor, der vom Zellkörper oder in der peripheren Laune ausgeht. Klicken Sie dann im Menü ImageJ auf die rechteckige Auswahlschaltfläche und definieren Sie einen Interessenbereich (ROI).

Und klicken Sie im Mikromanager-Fenster auf ROI. Nachdem Sie den ROI für die Bildgebung ausgewählt haben, klicken Sie auf Stopp und Speichern, um die neuronale Morphologie im YFP-Kanal aufzuzeichnen. Um den mitochondrialen Transport abzubilden, klicken Sie auf Multi-D-Erfassung.

Wählen Sie dann im Fenster Mehrdimensionale Erfassung die Anzahl der Zeitpunkte und das Intervall zwischen den Zeitpunkten aus. Klicken Sie im Fenster Mehrdimensionale Erfassung auf Kanäle und fügen Sie die Wellenlänge für die Bildgebung und die Belichtungszeit hinzu und definieren Sie sie. Klicken Sie auf Bilder speichern, um die Dateien automatisch in dem Ordner zu speichern, der in der Verzeichnisroute angegeben ist.

Klicken Sie nun in der oberen rechten Ecke auf Erfassen, um das Zeitraffer-Imaging zu starten. Für die konfokale Mikroskopie öffnen Sie nach dem Platzieren der montierten Embryonen in einer Heizkammer bei 28,5 Grad Celsius auf dem konfokalen Tisch die Mikroskopsoftware und klicken Sie auf Trans-Lampe oder Epi-Lampe. Verwenden Sie dann über das Okular des Mikroskops entweder Durchlicht- bzw. Fluoreszenzlicht, um den interessierenden Bereich zu identifizieren.

Überprüfen Sie im Fenster Aufnahmeeinstellungen, ob das für die Bildgebung ausgewählte Objektiv mit dem Objektiv übereinstimmt, das im Dropdown-Menü der verfügbaren Objektive angezeigt wird. Klicken Sie dann im Fenster "Bildaufnahmesteuerung" auf die Schaltfläche "Farbstoffliste" und wählen Sie die entsprechenden Fluorophore aus. Alternativ können Sie auch auf die Schaltfläche Lichtweg und Farbstoffe klicken, um die Parameter manuell einzustellen.

Passen Sie im Fenster "Aufnahmeeinstellungen" den Zoomfaktor und das Seitenverhältnis der Größe des gescannten Bildes an, um die Pixelgröße zu erhalten, die erforderlich ist, um die abzubildenden Strukturen am besten aufzulösen. Stellen Sie die Pixelgröße auf etwa die Hälfte der theoretischen Auflösung des Objektivs ein und folgen Sie damit den Nyquist-Abtastkriterien. Um die Pixelgröße eines aufgenommenen Bildes zu bestimmen, klicken Sie im Fenster "Bildaufnahmesteuerung" auf die Schaltfläche I.

Stellen Sie als Nächstes die Scangeschwindigkeit auf die schnellstmögliche Zeit ein. Klicken Sie dann im Fenster "Bildaufnahmesteuerung" auf Kalman-Linienmittelung und stellen Sie sie auf einen Faktor von zwei oder drei ein, um das Rauschen zu reduzieren. Um einen sequentiellen Scanmodus für die Abbildung von Fluorophoren mit überlappenden Spektren auszuwählen, klicken Sie auf Sequenziell und Linie.

Passen Sie dann die Ausgangsleistung der entsprechenden Laserlinien an. Um den ausgewählten Bereich kontinuierlich zu scannen und gleichzeitig die Detektoreinstellungen für jeden Kanal anzupassen, klicken Sie auf XY-Wiederholung oder den Fokus x2 oder Focus x4. Passen Sie dann HV, Gain und Offset für jeden Kanal an, um Bilder mit dem höchsten Dynamikbereich von Grauwerten aufzunehmen.

Drücken Sie nun Strg plus H, um die erfassten Bilder über eine Nachschlagetabelle zu visualisieren, die untersättigte Pixel in Blau und übersättigte Pixel in Rot identifiziert, die beide vermieden werden sollten. Bewerten Sie die Ausgangsleistung der relevanten Laserlinien und die Detektoreinstellungen neu. Um die Ober- und Untergrenze der abzubildenden Lautstärke zu definieren, klicken Sie in der Aufnahmeeinstellung auf die Schaltfläche End Set an der oberen Grenze, fokussieren Sie dann auf die untere Grenze und drücken Sie Start Set.

Um die Z-Auflösung des Objektivs zu überprüfen, klicken Sie in der Bildaufnahmesteuerung auf das I-Symbol. Wählen Sie dann eine Schrittweite aus, die der Hälfte der Z-Auflösung für das angegebene Ziel entspricht. Geben Sie im Unterfenster TimeScan die Häufigkeit ein, mit der Z-Stapel erfasst werden sollen, und die Häufigkeit, mit der die Bilder aufgenommen werden sollen, um eine Zeitreihe einzurichten, die für die Dynamik der abzubildenden subzellulären Struktur geeignet ist.

Klicken Sie auf die Schaltflächen Tiefe und Zeit, um zu bestätigen, dass der Z-Stapel und die Zeitreihe erfasst werden. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche XY Zt, um mit der Aufnahme von Zeitrafferbildern zu beginnen. Klicken Sie nach der Bildaufnahme auf der Softwareoberfläche auf Serie Fertig.

Speichern Sie die Bilder im OIB-Format, um die Bilder und die zugehörigen Metadaten aufzuzeichnen. Diese Abbildung zeigt Organellen und R-B-Neuronen, die sich auf der Oberfläche des Embryos mit Hilfe von Weitwinkeln und konfokaler Mikroskopie befinden. Hier wurde eine Zeitrafferbildgebung an einem Weitfeldmikroskop verwendet, um die Bewegung eines einzelnen Mitochondriums in der peripheren Dorne eines R-B-Neurons zu verfolgen.

Die konfokale Bildgebung ist deutlich langsamer und kann zu einer Unterschätzung der Dynamik bestimmter subzellulärer Ereignisse führen. Bilder von Netzhautzellen, die mit Hilfe der Weitfeldmikroskopie aufgenommen wurden, leiden unter einem schlechten Kontrast, da fluoreszierende Signale von einem großen Gewebevolumen Details in der Brennebene verdecken. Hier verbessert die optische Schnittfähigkeit der konfokalen Mikroskopie den Kontrast spürbar.

Die Einschübe zeigen Details einer Region der inneren Kernschicht, mit Markierung von Zellmembranen und Mitochondrien. Angetrieben durch den spezifischen Gau-4-Treiber eines sensorischen Neurons ermöglicht die Mosaikexpression aus den Injektionen von UAS-mito-CFP und UAS MAY-FP die Verfolgung einzelner Zellen über Tage, wie in diesem sensorischen R-B-Neuron zwei und drei Tage nach der Befruchtung zu sehen ist. Neben den Mitochondrien können auch andere subzelluläre Organellen wie Zentrosomen fluoreszenzmarkiert werden.

In diesem Beispiel steuerten zwei UAS-Kassetten auf einem einzigen zusammenhängenden Konstrukt die Expression von zentrosom-gesteuertem YFP und membran-zieltem Coelin-Plasma in Netzhautzellen. Die Einschübe zeigen eine Zelle in der M-Phase. Dieses gesamte Verfahren erfordert mehrere Tage von der Paarung, der Eizellentnahme, den Injektionen bis hin zur Bildgebung drei oder vier Tage nach der Befruchtung.

Das eigentliche bildgebende Experiment am Mikroskop kann mehrere Minuten bis zu einem ganzen Tag dauern. Nach diesem Verfahren können andere Organellen wie Mikrotubuli oder Peroxisomen markiert und abgebildet werden, um ihre in-vivo-Dynamik zu verstehen. Vergessen Sie nicht, dass PTU krebserregend ist und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.