Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, pflanzliche Chromosomen zu präparieren, die für die Fluoreszenz-in-C-Zwei-Hybridisierungstechnik unter Verwendung von Einzel- und High-Copy-DNA-Sonden geeignet sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zytogenetik und Genomforschung zu beantworten, wie z. B. den Nachweis von Chromosomenumlagerungen, die Anordnung genetischer Marker auf Chromosomen und die vergleichende Analyse zwischen verschiedenen Arten. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass die Vorbereitung der Chromosomenausbreitung schnell, einfach und effizient wird.

Die Zellsuspension kann bis zu zwei Monate bei minus 20 Grad gelagert und bei Bedarf zur Chromosomenvorbereitung verwendet werden. Auf die Idee zu dieser Methode kamen wir, als wir beobachteten, dass die Qualität und die Anzahl der geeigneten Chromosomen an menschlichen Tagen dramatisch zunahmen: 10 bis 20 Gerstensamen auf zwei Lagen feuchtem Filterpapier in einer Petrischale unter dunklen Bedingungen für zwei Tage bei 22 bis 24 Grad Celsius keimen lassen, zwei Tage lang. Schneiden Sie kräftige Wurzeln mit einer Länge von ein bis zwei Zentimetern vom Samen mit einer Rasierklinge ab.

Bereiten Sie anschließend eiskaltes Wasser zu, indem Sie eine 500-Milliliter-Glasflasche mit kaltem Leitungswasser in zerstoßenes Eiswasser legen. Belüften Sie das eiskalte Wasser und tauchen Sie die Wurzelspitzen 20 Stunden lang ein, um die Häufigkeit der Metaphase-Zellen zu erhöhen. Übertragen Sie die Wurzeln aus Wasser auf 50 Milliliter Ethanolessigsäure-Fixiermittel, um sie nach der Fixierung zwei Tage lang bei Raumtemperatur zu fixieren.

Waschen Sie 10 bis 20 Wurzeln zweimal fünf Minuten lang mit 30 Milliliter eiskaltem Leitungswasser in einem 50-Milliliter-Glaslautsprecher. Übertragen Sie die Wurzeln nacheinander mit einer Pinzette in 30 Milliliter Citratpuffer. Waschen Sie die Wurzeln, indem Sie den Glaslautsprecher zweimal fünf Minuten lang schütteln.

Legen Sie dann die Wurzeln auf Filterpapier, um die Flüssigkeit unter dem Mikroskop vollständig zu entfernen. Schneiden Sie das unerwünschte, nicht meristematische Gewebe mit einer Rasierklinge ab. Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die Bestimmung der richtigen Verdauungszeit, die zwischen verschiedenen Spezies variieren kann.

Hier werden bis zu 20 Wurzelspitzen in einem Milliliter Enzymgemisch bei 37 Grad Celsius für etwa 50 Minuten inkubiert. Um das Pflanzengewebe in einem Uhrglas unter dem Mikroskop weich zu machen, entfernen Sie das Enzym durch Pipettieren und waschen Sie die Wurzelspitzen auf Eis mit fünf Millilitern 0,01 molaren Citratpuffer, um das restliche Enzym zu ersetzen. Waschen Sie die Wurzelspitzen weiterhin zweimal vorsichtig mit einem Milliliter 96%igem Ethanol im selben Uhrenglas.

Ersetzen Sie dann das Ethanol durch 10 bis 15 Mikroliter frisch zubereitetes Fixiermittel pro Wurzelspitze. Übertragen Sie die Wurzelspitzen zusammen mit dem Fixiermittel in ein zwei Milliliter-Röhrchen und zerkleinern Sie die Wurzelstängel mit einer Präpariernadel oder Pinzette. Klopfen Sie 20 Mal auf das Röhrchen, um die Zellen wieder zu suspendieren und eine Zellsuspension zu erhalten.

Legen Sie anschließend zwei bis drei Lagen wassergetränktes Seidenpapier auf eine heiße Platte bei 50 Grad Celsius. Tauchen Sie die mikroskopisch kleinen Objektträger 30 Minuten lang in Eis, kaltes Leitungswasser im Kühlschrank. Legen Sie dann die Objektträger auf das feuchte Seidenpapier, pipettieren Sie sieben bis 10 Mikroliter Zellsuspension und lassen Sie sie aus einem Abstand von 20 Zentimetern auf den abgekühlten Objektträger fallen, der auf der heißen Platte platziert ist.

Anschließend 10 Mikroliter des Essigsäure-Ethanol-Gemischs an der gleichen Stelle wie die Zellsuspension auf dem Objektträger auftragen und den Objektträger auf der Heizplatte halten. Legen Sie die Schiene nach zwei Minuten ohne das feuchte Tuch auf die Herdplatte und lassen Sie sie eine weitere Minute trocknen. Überprüfen Sie die Objektträger mit einem Gesichtskontrastmikroskop, um die Qualität der Chromosomenausbreitung zu kontrollieren.

Verwenden Sie die Objektträger entweder am selben Tag oder lagern Sie sie, indem Sie sie in einem Coplinglas bei minus 20 Grad Celsius in 96%iges Ethanol tauchen, um die Objektträger vor dem Fischen vorzubehandeln. Legen Sie die Objektträger mit einer Pinzette fünf Minuten lang in ein Copin-Glas mit 50 Millilitern von zwei XSSC. Übertragen Sie die Objektträger für drei bis 10 Minuten in ein Coplan-Glas mit 50 Millilitern 45%iger Essigsäure.

Übertragen Sie anschließend die Objektträger für 10 Minuten in ein Coplan-Glas mit 50 Millilitern von zwei XSSC. Übertragen Sie dann die Objektträger in ein Coplin-Glas mit 50 Millilitern 4%igem Formaldehyd und tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang ein, um die Chromosomen zu fixieren. Entfernen Sie das Formaldehyd, indem Sie die Objektträger dreimal für jeweils vier Minuten in einem Coplin-Behälter mit 50 Millilitern von zwei XSSC spülen.

Entwässern Sie dann die Objektträger zwei Minuten lang in einer Reihe von 70 %, 90 % und 100 % Ethanol und trocknen Sie die Objektträger in vertikaler Position. Für jeden Objektträger wird eine Hybridisierungslösung von 20 Mikrolitern unter Verwendung von 10 Mikrolitern deionisierter Formamid, fünf Mikrolitern von vier X-Hybridisierungspuffern, drei Mikrolitern der Sonde und zwei Mikrolitern freiem D ns-Wasser hergestellt. Fügen Sie 20 Mikroliter Hybridisierungslösung pro Objektträger hinzu und decken Sie sie mit einem 24 x 32 Millimeter großen Deckglas ab.

Nachdem Sie den Deckglas mit Gummizement-Denaturierungsobjektträgern mit Sonden gleichzeitig bei 80 Grad Celsius für zwei Minuten auf einer Heizplatte verschlossen haben, werden die Objektträger in eine feuchte Kammer überführt und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Um Licht zu vermeiden, entfernen Sie die Deckgläser, indem Sie die Objektträger in einem Kupplungsglas mit zwei XSSC spülen. Legen Sie dann die Objektträger in ein Coplan-Glas mit 55 bis 60 Grad Celsius, zwei XSSC und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang.

Legen Sie anschließend die Objektträger in zwei XSSC für zwei Minuten bei Raumtemperatur in ein Coplan-Glas. Sicher. Dörren Sie die Objektträger zwei Minuten lang in einem Coplan-Glas in einer Reihe von 70 %, 90 % und 100 % Ethanol. Luft. Trocknen Sie die Dias und die Gegenfärbung mit Dappy in Antifa Eindeckmedium und vermeiden Sie dabei intensives Licht.

Analysieren Sie die Objektträger mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop. Die Auswahl des Filters hängt von dem Fluorochrom ab, das bei Bedarf für die Sondenmarkierung verwendet wird. Lagern Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius unter dunklen Bedingungen bis zu einem Jahr.

Mitotische Metaphasen-Spreads, die mit der Methode der schnellen Luft-Trocken-Dropping-Chromosomenpräparation hergestellt wurden, sind hier dargestellt. Die Fischanalyse wurde sowohl mit repetitiven als auch mit Einzelkopiesequenzen durchgeführt. Die Bilder wurden mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop mit einem Satz von Filtern aufgenommen, die die Anregung entsprechender Fluor-Vierer ermöglichen, und mit einer hochempfindlichen CCD-Monochromkamera aufgenommen.

Das Fischexperiment an mitotischen Metaphase-Chromosomen von Horden und Vulgari mit Einzelkopiesonden und fünf S-R-D-N-A ergab deutliche und qualitativ hochwertige Signale. Die Hybridisierung von CT CTT 10 Mikrosatelliten auf den Chromosomen von Hordy und BULBUS führte zu einem spezifischen und eindeutigen Muster. Das Fischexperiment an mitotischen Metaphase-Chromosomen der Sala-Serie mit der PSC 119 Zwei-Sonde führte zu spezifischen und qualitativ hochwertigen Signalen.

Offensichtliche Vorteile dieses Ansatzes sind gut verteilte, unbeschädigte und zahlreiche Metaphase-Chromosomen, die als perfekte Voraussetzung für eine erfolgreiche Fischanalyse dienen. Einmal gemeistert, kann dieser Vorgang in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden, wenn er richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den hochwertigen mitotischen Meta-Gesichtschromosomen-Raum-Shoot für Fisch-IDE und -former vorbereiten können, eine Höhe kann äußerst gefährlich sein, um bei der Durchführung dieser Verfahren immer Diagramme und Filmhauben zu verwenden.