Name: Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Lufttrocknungsmethode zur Chromosomenpräparation in Pflanzen für FISH-Analysen. Diese Technik liefert hochwertige Chromosomenpräparate für die Zytogenetik und Genomforschung.

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Wir danken der DFG für die finanzielle Unterstützung (HO 1779/21-1) sowie Katrin Kumke und Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) für die fachliche Beratung.

1. Chromosomenpräparation <ol><li> Keimung der Samen und die Fixierung des Wurzelspitzen <ol><li> Keimen 10-20 Gerstensamen auf zwei Lagen von feuchtem Filterpapier in einer Petrischale unter dunklen Bedingungen 2 Tage bei 22-24 ° C. Abgeschnitten kräftige Wurzeln mit der Länge von 1-2 cm vom Samen unter Verwendung einer Rasierklinge. </li><li> Bereiten Sie eiskaltes Wasser, indem ein 500 ml-Glasflasche mit kaltem Leitungswasser in zerstoßenes Eis-Wasser. Lüften Sie den eiskalten Wasser und tauchen Sie den Wurzelspitzen 20 Stunden, um die Frequenz des Metaphase-Zellen zu erhöhen. </li><li> Bringen Wurzeln aus dem Wasser, um 50 ml Ethanol: Essigsäure (3: 1) Fixierungsmittel, um sie bei Raumtemperatur für 2 Tage zu beheben. Speicher Wurzeln in eine frisch hergestellte Ethanol: Essigsäure (3: 1) Fixiermittel bei 4 ° C bis zur Verwendung bis zu einem Jahr. </li></ol></li><li> Waschen und Enzymbehandlung <ol><li> 5 min zweimal mit einem 50 ml Becherglas waschen 10-20 Wurzeln mit 30 ml eiskaltem Leitungswasser. Verwenden Binokular. Übertragen Wurzeln nacheinander in30 ml 0,01 M Citratpuffer (0,01 M Citronensäure + 0,01 M Natriumcitrat, pH 4,8) unter Verwendung einer Pinzette und wäscht zweimal durch Schütteln des Becherglas für 5 min. Platzieren Wurzeln auf Filterpapier, um die Flüssigkeit vollständig zu entfernen und Trenn unerwünschte nicht Meristemgewebe mit einer Rasierklinge. </li><li> Inkubieren bis 20 Wurzelspitzen in 1 ml Enzymgemisch bei 37 ° C für ca. 50 min, das Pflanzengewebe erweichen (Tabelle 1) in einem Uhrglas. Enzymmischung enthält 0,7% Cellulase R10, 0,7% Cellulase, 1% Pectolyase und 1% Cytohelicase in 0,01 M Citratpuffer verdünnt. Speichern das Enzymgemisch bei -20 ° C und bis zu fünf Mal wiederverwendet. </li><li> Entfernen Sie das Enzym durch Pipettieren und waschen Sie die Wurzelspitzen auf Eis mit 5 ml 0,01 M Citratpuffer zweimal, um das restliche Enzym zu ersetzen. </li></ol></li><li> Root Mazeration <ol><li> Wash Wurzelspitzen mit 1 ml 96% igem Ethanol zweimal vorsichtig auf die gleiche Uhrglas. Ethanol mit frisch zubereiteten Fixierungsmittel (25% Ethanol 75% Essigsäure) zu ersetzen. Verwenden Sie 10-15ul Fixiermittel pro Wurzelspitze. </li><li> Übertragungswurzelspitzen zusammen mit dem Fixierungsmittel in ein 2-ml-Röhrchen und zerfallen Wurzelmeristemen mit Seziernadel oder Pinzette. Tippen Sie auf das Rohr 20 mal zu resuspendieren Zellen, um eine Zellsuspension zu erhalten. Bewahren Sie die Zellsuspension bei -20 ° C bis zu zwei Monate. </li></ol></li><li> Dropping der Zellsuspension <ol><li> Man gibt 2-3 Schichten von mit Wasser getränkten Papiertuch auf einer heißen Platte bei 50 ° C. Tauchen Objektträger in eiskaltem Leitungswasser in den Kühlschrank für 30 Minuten. Ort und gleitet auf dem feuchten Papiertuch. </li><li> Pipette 7-10 ul der Zellsuspension und legen Sie sie in einem Abstand von 20 cm auf die gekühlten Schieber auf der Heizplatte gelegt. Je 10 &amp; mgr; l Essigsäure-Ethanol-Gemisch auf der gleichen Stelle wie Zellsuspension auf der Folie und halten Sie den Schieber auf der heißen Platte für weitere 2 min. Setzen Sie den Schieber auf der heißen Platte ohne die Feuchttuch und lassen Sie es für 1 min trocknen. </li></ol></li><li> Qualitätskontrolle und storage von Dias <ol><li> Überprüfen Sie Dias mit einem Phasenkontrastmikroskop, um die Qualität des Chromosoms Ausbreitung zu kontrollieren. Verwenden Sie Folien entweder am selben Tag oder Wert auf in 96% Ethanol bei -20 ° C eingetaucht in eine Coplin-Gefäß. </li></ol></li><li> Eine Vorbehandlung der Folien vor FISH; Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt <ol><li> Die Objektträger in eine Coplin-Gefäß mit 50 ml 2 × SSC (20x SSC enthält 3 M NaCl und 300 mM Trinatriumcitrat) für 5 min. Mit einer Pinzette, Transferfolien in einen Coplin-Gefäß mit 50 ml 45% Essigsäure für 3-10 min. </li><li> Objektträger in eine Coplin-Gefäß mit 50 ml 2 × SSC für 10 Minuten. Objektträger in eine Coplin-Gefäß mit 50 ml 4% Formaldehyd (in 2x SSC) und tauchen Folien für 10 Minuten, um Chromosomen zu beheben. </li><li> Entfernen Formaldehyd durch Spülen der Objektträger 3 mal pro 4 min, in einer Glasküvette mit 50 ml 2 × SSC. Dehydratisieren Folien in einer Coplin-Gefäß für 2 min in der Reihe von 70%, 90% und 100% Ethanol um und trocken gleitet in einem vertikalenPosition. </li></ol></li></ol> 2. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) <ol><li> Für jede Folie, bereiten eine Hybridisierungslösung von 20 ul insgesamt mit 10 ul deionisiertem Formamid, 5 &amp; mgr; l 4x Hybridisierungspuffer (200 ul Puffer enthält 80 ul 20x SSC, 8 ul 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 ul 0,5 M EDTA, 11,2 &amp; mgr; l 10 ug / ul Lachssperma und 99,2 ul DNase-freies Wasser), 3 &amp; mgr; l der Sonde und 2 ul DNase-freiem Wasser. </li><li> In 20 ul Hybridisierungslösung pro Folie und Deckel mit einem 24 x 32 mm Deckglas und die Festnahme des Deckglas mit Gummi-Zement. Denaturieren Folien mit Sonden gleichzeitig bei 80 ° C für 2 Minuten auf einer heißen Platte. </li><li> Objektträger in eine feuchte Kammer und inkubieren Objektträger bei 37 ° CO / N Vermeidung von Licht. Entfernen Sie Deckgläser durch Spülen der Objektträger in eine Coplin-Gefäß mit 2x SSC. Die Objektträger in eine Glasküvette mit 55-60 ° C 2 × SSC und Inkubation für 20 min. </li><li> Legen Sie die Folien an SSC in einer Coplin-Gefäß für 2 min bei RT 2x. Dehydratisieren Folien in einer Coplin-Gefäß für 2 min in der Reihe von 70%, 90% und 100% Ethanol auf. </li><li> Der Luft trocknen die Folien und Gegenfärbung mit 1 ug / ml 4 &#39;, 6-Diamidino-2-Phenylindolin (DAPI) in Antibleich Eindeckmedium, vermeiden Sie intensives Licht. </li></ol> 3. Die mikroskopische Analyse und Speicherung <ol><li> Analysieren Sie die Folien mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop. Die Auswahl der Filter hängt von der Fluorochrom für die Sondenmarkierung eingesetzt. Falls erforderlich, speichern gleitet bei 4 ° C bei schlechten Lichtverhältnissen bis zu einem Jahr. </li></ol>

<ol><li>Geber, G., Schweizer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+heterochromatin+differentiation+in+Sinapis+alba+%28Cruciferae%29+using+a+simple+air-drying+technique+for+producing+chromosome+spreads%5BTitle%5D)+AND+%22Pl+Syst+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads.</a> Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).</li>
<li>Andras, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drop-spreading+technique+to+produce+cytoplasm-free+mitotic+preparations+from+plants+with+small+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes.</a> Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).</li>
<li>Rothfels, K. H., Siminovitch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+air-drying+technique+for+flattening+chromosomes+in+mammalian+cells+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro.</a> Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).</li>
<li>Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+preparation+of+plant+chromosomes+for+high-resolution+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy.</a> Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).</li>
<li>Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+fluorescence+in+situ+hybridization+signal+detection+in+maize+using+directly+labeled+probes+produced+by+high+concentration+DNA+polymerase+nick+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation.</a> Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).</li>
<li>Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+%27SteamDrop%27+method+for+high+quality+plant+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation.</a> Mol. Cytogenet. 7, 21(2014).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synteny+between+Brachypodium+distachyon+and+Hordeum+vulgare+as+revealed+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH.</a> Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).</li>
<li>Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+painting+using+repetitive+DNA+sequences+as+probes+for+somatic+chromosome+identification+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).</li>
<li>Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+cell+synchronization+in+plant-roots+by+hydroxyurea+and+amiprophos-methyl+or+colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine.</a> Genome. 36 (2), 387-390 (1993).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+karyotyping+of+sorghum+by+in+situ+hybridization+of+landed+BACs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs.</a> Genome. 45 (2), 402-412 (2002).</li>
<li>Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+physical+mapping+with+barley+BAC+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FISH physical mapping with barley BAC clones.</a> Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).</li>
<li>Aliyeva-Schnorr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mapping+with+centromeric+BAC+contigs+shows+that+this+recombination-poor+region+comprises+more+than+half+of+barley+chromosome+3H%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H.</a> Plant J. 84, 385-394 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Chromosom Vorbereitung Experiment wurde unter Verwendung von jungen Wurzeln von Getreide zu der Familie der Gräser (Poaceae) gehören, durchgeführt. Alle untersuchten Arten haben 14 relativ lange mitotischen Metaphase-Chromosomen (11-15 &amp; mgr; m) in der diploiden Genom-Set und gehören zu großen Genom-Arten (5,1-7,9 GBP). Länge der gekeimten Wurzeln nicht mehr als 2 cm, maximal Meristemgewebe erhalten. Synchronisation von sich teilenden Zellen wurde durch eine 20 Stunden lang Eis-Wasse...

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist ein effektives Werkzeug für die physische Zuordnung von Ein- und hohe Kopien Sequenzen an der chromosomalen Ebene. Voraussetzung ist die Herstellung von qualitativ hochwertigen Chromosomenspreads. Es gibt keine allgemeine Chromosomen Vorschrift, die gleichermaßen für die Tier- und Pflanzenzellen wären. Herstellung von Pflanzenchromosomen ist besonders herausfordernd aufgrund der starren Zellwand und Zellplasma verschiedener Konsistenz innerhalb verschiedener Arten. Einer der vorteilhaften Verfahren zur Herstellung von Pflanzenchromosomen ist eine sogenannte Drop-Technik auch als Drop Spreiztechnik und lufttrocknenden Technik 1,2 bekannt. Diese Methode wurde erstmals 1958 von Rothfels und Siminovitch für die in vitro gezüchtet Säugerzellen 3 eingeführt. Später Martin et al. 4 und Kato et al. 5 geeignet ist diese Methode für die Pflanzen. In jüngerer Zeit ist ein Verfahren namens &#39;&amp; SteamDrop# 39; entwickelt, das Wasserdampf zur Herstellung von nicht überlappenden Chromosomen 6 verwendet. Zwar wurde der positive Einfluss der hohen Luftfeuchtigkeit früheren 7 beobachtet, &#39;SteamDrop&#39; liefert eine gesteuerte Workflow von hochwertigen Chromosomenpräparate 6. Die Dampfbehandlung bewirkt Dehnung der Chromosomen wahrscheinlich zu einigen Änderungen der chromosomalen Proteinen verbunden. Die Qualität der resultierenden Metaphasespreitungen ist sehr hoch, obwohl der Halte ausreichende Anzahl von kompletten Metaphasespreitungen zur anschließenden FISH Experimente erfordert technisches Know-how. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Herstellung von Getreide mitotischen Chromosomen für die FISH Nachweis einzelner und hohe Kopier Sonden 5,8. Dieses Verfahren ist eine verbesserte Variante des von Kato 9 unter einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50% bis 55% durchgeführt (Abbildung 1) beschriebenen lufttrockenen Tropfverfahren. Dieses Protokoll eine reduzierte Anzahl umfasstder Waschschritte machen seine Anwendung einfach, effizient und reproduzierbar. Unter Verwendung dieses Protokolls erlangten hochwertigen Chromosomenspreads und FISH-Ergebnisse für Hordeum vulgäre, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum und Secale cereale.

<table><tbody><tr><td>Heizplatte</td><td>MEDAX GmbH</td><td>12603</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase R10</td><td>Duchefa</td><td>C8001</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase&nbsp;</td><td>CalBioChem</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>Sigma</td><td>P3026</td><td></td></tr><tr><td>Cytohelicase</td><td>Sigma</td><td>C8274</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-12-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C3176</td><td>direktes Fluorochrom&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluor488-5-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C11397</td><td>direktes Fluorochrom</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus BX61</td><td>BX61</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Orca ER, Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Fluorecsent Farbstoff</td></tr></tbody></table>

eine schnelle klima trockenen dropping chromosom herstellungsverfahren geeignet für fish in pflanzen

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Herstellung von Chromosom-Spreads ist eine Voraussetzung für die erfolgreiche Durchführung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH). Herstellung von hochwertigen Pflanzenchromosom Spreads ist eine Herausforderung durch die starre Zellwand. Eine der anerkannten Methoden zur Herstellung von Pflanzenchromosomen ist eine so genannte Drop Zubereitung, die auch Drop Verstreuen oder lufttrocknende Technik bekannt. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die schnelle Herstellung von mitotischen Chromosomen-Spreads für die FISH Nachweis einzelner und hohe Kopier DNA-Sonden. Dieses Verfahren ist eine verbesserte Variante des lufttrockenen Tropfenverfahren unter einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50% bis 55% durchgeführt. Dieses Protokoll besteht aus einer verringerten Anzahl von Waschschritten machte die Anwendung einfach, effizient und reproduzierbar. Offensichtliche Vorteile dieses Ansatzes sind gut verbreitet, unbeschädigt und zahlreiche Metaphasechromosomen als eine perfekte Voraussetzung für eine erfolgreiche FISH-Analyse dient. Mit diesem Protokoll hochwertigen chrom wir erhaltenOsome Spreads und reproduzierbare FISH-Ergebnisse für Hordeum vulgäre, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum und Secale cereale.

Objektträger mit den mitotischen Metaphase-Spreads wurden mit dem oben beschriebenen schnellen Luft trocknen Tropf Chromosom Herstellungsverfahren hergestellt (Suppl. 1). FISH-Analyse wurde unter Verwendung von beiden, sich wiederholende und Einzelkopie-Sequenzen durchgeführt. Bilder wurden durch ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Satz von Filtern ermöglicht Anregung entsprechender Fluorophore erhalten und durch eine hochempfindliche CCD monochrome Kamera eingefangen. Für die Bildaufnahme verwendet ...

Es wird ein Protokoll für die Vorbereitung hochwertiger mitotischer pflanzlicher Chromosomenausbreitungen durch eine schnelle Air-Dry-Dropping-Methode beschrieben, die für den FISH-Nachweis von Einzel- und High-Copy-DNA-Sonden geeignet ist.

Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, pflanzliche Chromosomen vorzubereiten, die für die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung unter Verwendung von Einzel- und Mehrfachkopie-DNA-Sonden geeignet sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Zytogenetik und Genomforschung zu beantworten, wie beispielsweise die Detektion von Chromosomenumordnungen, die Anordnung genetischer Marker auf Chromosomen sowie die vergleichende Analyse zwischen verschiedenen Arten. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass die Herstellung von Chromosomenpräparaten schnell, einfach und effizient wird.Die Zellsuspension kann bis zu zwei Monate bei minus 20 Grad gelagert und bei Bedarf für die Chromosomenpräparation verwendet werden. Wir hatten diese Idee zuerst bei dieser Methode, als wir beobachteten, dass die Qualität und die Anzahl geeigneter Chromosomen dramatisch anstiegen, als menschliche Tage 10 bis 20 Gerstenkörner auf zwei Schichten feuchtem Filterpapier in einer Petrischale unter Dunkelbedingungen für zwei Tage bei 22 bis 24 Grad Celsius keimten. Nach zwei Tagen schneiden Sie kräftige Wurzeln mit einer Länge von ein bis zwei Zentimetern mithilfe eines Rasiermessers von den Körnern ab.Bereiten Sie als Nächstes eiskaltes Wasser vor, indem Sie eine 500-Milliliter-Glasflasche mit kaltem Leitungswasser in zerkleinertes Eiswasser stellen. Belüften Sie das eiskalte Wasser und tauchen Sie die Wurzelspitzen 20 Stunden lang ein, um die Häufigkeit von Metaphase-Zellen zu erhöhen. Überführen Sie die Wurzeln nach der Fixierung von Wasser in 50 Milliliter Ethanol-Essigsäure-Fixansatz und fixieren Sie sie zwei Tage lang bei Raumtemperatur.Waschen Sie 10 bis 20 Wurzeln zweimal je fünf Minuten lang mit 30 Milliliter eiskaltem Leitungswasser in einem 50-Milliliter-Glaskolben. Überführen Sie die Wurzeln einzeln mit einer Pinzette in 30 Milliliter Citratpuffer. Waschen Sie die Wurzeln, indem Sie den Glaskolben zweimal je fünf Minuten lang schütteln.Legen Sie die Wurzeln anschließend auf Filterpapier, um die Flüssigkeit vollständig unter dem Mikroskop zu entfernen. Schneiden Sie das unerwünschte, nicht meristematische Gewebe mit einer Rasierklinge ab. Der kritischste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, die geeignete Digestionszeit zu bestimmen, die zwischen verschiedenen Arten variieren kann.Hier werden bis zu 20 Wurzelspitzen in einem Milliliter Enzymgemisch bei 37 Grad Celsius für etwa 50 Minuten inkubiert. Um das Pflanzengewebe in einer Petrischale unter dem Mikroskop aufzuweichen, entfernen Sie das Enzym durch Pipettieren und waschen Sie die Wurzelspitzen auf Eis mit fünf Milliliter 0,01-molarer Citratpufferlösung, um das restliche Enzym zu ersetzen. Waschen Sie die Wurzelspitzen anschließend vorsichtig zweimal mit je einem Milliliter 96 %igem Ethanol in derselben Petrischale weiter.Ersetzen Sie anschließend den Ethanol durch 10 bis 15 Mikroliter frisch zubereitetes Fixativ pro Wurzelspitze. Überführen Sie die Wurzelspitzen zusammen mit dem Fixativ in ein 2-Milliliter-Röhrchen und zerpflücken Sie die Wurzelmeristemathe mit einer Nadel oder einer Pinzette. Schlagen Sie das Röhrchen 20-mal leicht an, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen, und erhalten so eine Zellsuspension.Als Nächstes zwei bis drei Schichten mit Wasser getränktes Papiertuch auf ein Heizgerät bei 50 Grad Celsius legen. Die Objektträger für 30 Minuten in Eis, kaltes Leitungswasser im Kühlschrank eintauchen. Danach die Objektträger auf das feuchte Papiertuch legen, sieben bis zehn Mikroliter Zellsuspension aufpipettieren und sie aus einer Höhe von 20 Zentimetern auf den gekühlten Objektträger, der auf dem Heizgerät liegt, fallen lassen.Danach 10 Mikroliter der Essigsäure-Ethanol-Mischung an derselben Stelle wie die Zellsuspension auf dem Objektträger auftragen und den Objektträger auf der Heizplatte belassen. Nach zwei Minuten den Objektträger ohne das feuchte Tuch auf der Heizplatte trocknen lassen, weitere eine Minute lang. Die Objektträger mithilfe eines Phasenkontrastmikroskops überprüfen, um die Qualität der Chromosomenausstriche zu kontrollieren.Verwenden Sie die Objektträger entweder am selben Tag oder lagern Sie sie, indem Sie sie bei minus 20 Grad Celsius in einem Coplin-Behälter in 96 % Ethanol eintauchen, um die Objektträger vor der FISH-Behandlung vorzubehandeln. Legen Sie die Objektträger mit einer Pinzette für fünf Minuten in einen Coplin-Behälter, der 50 Milliliter 2x SSC enthält. Überführen Sie die Objektträger anschließend in einen Coplin-Behälter mit 50 Milliliter 45 %iger Essigsäure für drei bis zehn Minuten.Als Nächstes überführen Sie die Objektträger in ein Coplan-Gefäß mit 50 Milliliter 2×SSC für 10 Minuten. Danach überführen Sie die Objektträger in ein Coplin-Gefäß mit 50 Milliliter 4 % Formaldehyd und tauchen die Objektträger 10 Minuten lang ein, um die Chromosomen zu fixieren. Entfernen Sie das Formaldehyd, indem Sie die Objektträger dreimal je vier Minuten in einem Coplin-Gefäß mit 50 Milliliter 2×SSC spülen.Anschließend die Objektträger zwei Minuten lang in einer Reihe von 70 %, 90 % und 100 % Ethanol dehydrieren und die Objektträger in vertikaler Position trocknen. Für jeden Objektträger eine Hybridisierungslösung von 20 Mikrolitern herstellen, bestehend aus 10 Mikrolitern deionisiertem Formamid, 5 Mikrolitern 4× Hybridisierungspuffer, 3 Mikrolitern der Sonde und 2 Mikrolitern DNA-freiem Wasser. Pro Objektträger 20 Mikroliter Hybridisierungslösung hinzufügen und mit einem 24 mal 32 Millimeter großen Deckglas abdecken.Nachdem Sie den Deckel mit Kautschukzement versiegelt haben, denaturieren Sie die Objektträger mit den Sonden gleichzeitig zwei Minuten lang bei 80 Grad Celsius auf einem Heizblock, überführen Sie die Objektträger in eine feuchte Kammer und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Vermeiden Sie Licht, entfernen Sie die Deckel, indem Sie die Objektträger in einem Kopplungsgefäß mit zwei XSSC spülen. Anschließend legen Sie die Objektträger in ein Gefäß mit 55 bis 60 Grad Celsius warmem zwei XSSC und inkubieren sie 20 Minuten lang.Als Nächstes die Objektträger für zwei Minuten bei Raumtemperatur in zwei XSSC in einem Coplin-Behälter geben. Die Objektträger in einem Coplin-Behälter nacheinander für jeweils zwei Minuten in 70 %, 90 % und 100 % Ethanol dehydrieren. Die Objektträger an der Luft trocknen und mit DAPI in Antifade-Mounting-Medium kontrastfärben, dabei intensives Licht vermeiden.Analysieren Sie die Objektträger mithilfe eines Epi-Fluoreszenzmikroskops. Die Auswahl des Filters hängt gegebenenfalls von dem zur Markierung der Sonde verwendeten Fluorochrom ab. Lagern Sie die Objektträger bis zu einem Jahr bei vier Grad Celsius im Dunkeln.Hier gezeigte metaphasische Mitosespreizungen wurden mittels der schnellen Lufttrocknungsmethode zur Chromosomenpräparation hergestellt. Die FISH-Analyse wurde unter Verwendung sowohl repetitiver als auch einzelner Kopiensequenzen durchgeführt. Die Bilder wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einem Filtersatz zur Anregung der entsprechenden Fluorochrome, aufgenommen und mittels einer hochsensitiven monochromen CCD-Kamera erfasst.Das FISH-Experiment an mitotischen Metaphasechromosomen von Hoard und Vulgari unter Verwendung einer Einzelkopie-Sonde und fünf S-R-D-N-A zeigte deutliche und hochwertige Signale. Die Hybridisierung des CT CTT 10-Mikrosatelliten an den Chromosomen von Hordy und Bulbus ergab ein spezifisches und deutliches Muster. Das FISH-Experiment an mitotischen Metaphasechromosomen von Sala serial unter Verwendung der PSC 119.2-Sonde ergab spezifische und hochwertige Signale.Offensichtliche Vorteile dieses Ansatzes sind gut verteilte, unbeschädigte und zahlreiche Metaphase-Chromosomen, die eine hervorragende Voraussetzung für eine erfolgreiche FISH-Analyse darstellen. Sobald man die Methode beherrscht, kann das Verfahren bei korrekter Durchführung in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochwertige mitotische Metaphase-Chromosomenpräparationen für FISH, IDE und andere Verfahren herstellt. Da die Arbeit mit Chemikalien äußerst gefährlich sein kann, sollten Sie beim Durchführen dieser Verfahren stets Handschuhe tragen und eine Abzugshaube verwenden.

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Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Hinten von CRISPR/Cas9 Genom-Knockout-Elektrofischen vorgestellt. Im Detail beschrieben sind die erforderlichen Molekularbiologie-, Zucht- und Haltungsanforderungen für eine Gymnotiform und ein Mormyrid sowie Injektionstechniken zur Herstellung von Cas9-induzierten Indel F0 Larven.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Nukleare Oberflächenausbreitungen sind ein unverzichtbares Werkzeug, um Chromosomenereignisse während der Meiose zu untersuchen. Hier zeigen wir eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung meiotischer Chromosomen während der Prophase I aus Zebrafisch-Spermatozyten.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen.

Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

Dieses Protokoll beschreibt ein modifiziertes Verfahren zur schnellen Isolierung sauberer Eizellen im Stadium I in Zebrafischen ohne Granulosazellen und bietet damit eine geeignete Methode für die eizellspezifische Forschung.

Schnelle Isolierung von Eizellen im Stadium I bei Zebrafischen ohne Granulosazellen

Erfahren Sie eine schnelle Lufttrocknungsmethode zur Chromosomenpräparation in Pflanzen für FISH-Analysen. Diese Technik liefert hochwertige Chromosomenpräparate für die Zytogenetik und Genomforschung.

Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen

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