Stammzell-ähnlichen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Blastozystendach- oder Animal-Cap-Explantate von X. laevis zur Untersuchung der molekularen Mechanismen und zellulären Prozesse, die der neuronalen Entwicklung in vitro und in vivo zugrunde liegen, zu verwenden. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Entwicklungsbiologie und Stammzellbiologie bezüglich der Zellschicksalsbestimmung, Zellmigration sowie der zellautonomen und nicht-zellautonomen Eigenschaften neuronaler Zellen zu beantworten. Die vorgestellten Techniken bieten einfache, kostengünstige, vielseitige und effiziente Werkzeuge, um die grundlegenden Mechanismen entscheidender Verhaltensweisen neuronaler Zellen zu erforschen.

Mithilfe dieser Assays lässt sich die neuronale Schicksalsbestimmung für die Umprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen sowie die reife Generierung von neuronalen Zelltypen zur weiteren Untersuchung testen. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da die Techniken manuelle Geschicklichkeit erfordern. Ich hatte die erste Idee zu diesen Methoden, als ich über die Analyse des Zellsegregationsverhaltens nachdachte.

Um einen Xenopus laevis-Vorderhirnschlauch flach zu montieren, verwenden Sie eine Plastik-Transferpipette, um ein fixiertes, dehydriertes und rehydriertes Embryo in eine 60-Millimeter-Petri-Schale zu überführen, die bis zum Rand mit PBT gefüllt ist. Als Nächstes führen Sie ein Paar feiner Pinzetten zwischen die Augen und den Neuralrohrabschnitt auf Höhe des Sehnervs ein und lösen die Augen ab. Danach führen Sie die Pinzette vorsichtig unter das Ektoderm, das über dem Neuralrohr hinter dem Kopf liegt, und lösen das Ektoderm behutsam ab.

Nach Durchführung der entsprechenden NC2-Hybridisierungsetikettierung das Embryo in eine neue 60-Milliliter-Petri-Schale mit PBT überführen und feine Pinzette verwenden, um den vorderen Neuralrohr grob vom Embryo zu isolieren. Anschließend vorsichtig die locker am Neuralrohr befestigte Chorda von dessen Unterseite entfernen. Gegebenenfalls auch die Ohrbläschen und die verbleibenden Teile des Mesoderms.

Wenn alle Anhängsel des Neuralrohrs abgetrennt wurden, lösen Sie das vordere Neuralrohr vom Embryo. Überführen Sie anschließend das isolierte Neuralrohr in ein konisches 1,5-Milliliter-Röhrchen, das mit 50 % Glycerin und PBS gefüllt ist, und lagern Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach einer zweiten Übernachtlagerung in 90 % Glycerin überführen Sie das Neuralrohr in einer kleinen Menge Glycerin auf einen Objektträger und dissezieren die Neuralrohre entlang der dorsalen und ventralen Mittellinien mit Wolframenadeln.

Verwenden Sie anschließend Verstärkungsringe, die mit einem Glasdeckel abgedeckt sind, um die beiden Seiten des Neuralrohrs in 90 % Glycerin und PBS zu montieren. Um die Beads für die Induktion von Animal-Cap-Explantaten vorzubereiten, teilen Sie mit einer P200-Mikropipette die Hälfte eines Aliquots an mit BSA behandelten Harzperlen auf ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen auf. Ersetzen Sie dann das sterile destillierte Wasser im neuen Röhrchen durch 200 Mikroliter Medium, das zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius das experimentelle Molekül der Untersuchung enthält.

Am Ende der Inkubation die Blastula- oder sehr frühen Gastrula-Embryonen in PBS mit Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 0,2 % BSA, überführen. Anschließend unter einem Stereomikroskop die Vitellinmembran mit der Seite eines Pinzettenpaares festhalten und mit einem zweiten Pinzettenpaar die Membran langsam von der vegetativen Seite des Embryos ablösen, wobei darauf geachtet werden muss, die animale Seite nicht zu beschädigen. Danach mit feiner Pinzette ein kleines Quadrat vom animen Pol jedes Embryos ausschneiden.

Unter Verwendung einer mit BSA beschichteten Pipettenspitze werden die Kappen in einzelne Vertiefungen einer Terasaki-Mehrfachplatte in 0,5× modifizierter Barth-Lösung überführt, wobei die pigmentierte animalseitige Oberfläche mit dem runden Boden der Vertiefung in Kontakt gebracht wird. Mit einer P20-Mikropipette werden die dunkelsten rosa Perlen aus dem Behandlungsgefäß ausgewählt und jeweils eine Perle mit einer Pinzette zentral auf jede Kappe platziert. Sobald die letzte Perle platziert ist, wird die Platte auf mit Wasser getränkte Papiere gestellt und vor der Inkubation mit einem Plastikbehälter abgedeckt.

Um dissoziierte und neuaggregierte Animal-Cap-Explantate herzustellen, isolieren Sie 15 bis 30 Animal Caps, wie eben gezeigt. Schneiden Sie mit feinen Pinzetten ein kleines quadratisches Gewebestück von den Animalpolen aus. Überführen Sie die Animal Caps in eine mit Agarose beschichtete Vertiefung, die mit kalziumfreier Holtfreter-Lösung gefüllt ist, wobei die pigmentierten Seiten nach oben zeigen.

Nach einigen Minuten sollte eine Desaggregation beobachtet werden. Verwenden Sie feine Pinzette, um die pigmentierten Schichten vom restlichen Gewebe zu trennen. Danach verwerfen Sie das Pigment mit einer P20-Mikropipette.

Wenn die meisten pigmentierten Schichten entfernt sind und die Zellen vollständig dissoziiert wurden, schwenken Sie die Platte, um die Zellen zu zentrieren, und entfernen Sie mit einer P1000-Mikropipette so viel wie möglich vom Medium, wobei Sie darauf achten, die Zellen nicht zu berühren. Geben Sie dann ein Milliliter Holtfreter-Salzlösung mit Calcium in die Vertiefung. Überführen Sie die dissoziierten Animal Caps in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Nachdem die Zellen abzentrifugiert wurden, entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer P1000-Mikropipette und resuspendieren das Pellet in 20 Mikroliter Holtfreter-Salzlösung mit Calcium. Lassen Sie die Zellen drei bis sechs Stunden bei Raumtemperatur wieder aggregieren. Geben Sie dann langsam ein Milliliter 3/4 NAM hinzu, um die Explantate vorsichtig vom Boden des Röhrchens zu lösen, und verteilen Sie die Explantate mit einer Plastik-Transferpipette auf einzelne unbeschichtete Platten.

Um Tierkappen-Explantate auf Xenopus laevis-Neuralplatten zu übertragen, beschichten Sie zunächst 60-Millimeter-Petri-Schalen mit 3 % Agarose und 3/4 NAM, in die kleine Löcher gestanzt wurden. Überführen Sie anschließend frühe Neurula-Embryonen in PBS mit Kalzium und Magnesium, das mit 0,2 % BSA ergänzt wurde, um die Vitellinmembran zu entfernen. Füllen Sie dann die mit Agarose beschichtete Präparierschale mit frischem 3/4 NAM und übertragen Sie die Embryonen mit der dorsalen Seite nach oben in die Präparierschale.

Übertragen Sie nun ein reaggregiertes Explant des Animal Caps auf die Dissektionsplatte, wobei das Explantat langsam durch die Schwerkraft in die Schale absinken kann, sobald die Pipettenspitze die Oberfläche des NAM durchbrochen hat. Halten Sie dann unter einem Stereomikroskop das Embryo mit abgerundeten Pinzetten fest, während Sie mit einer Wolframnadel einen Schnitt in die Neuralplatte für das Explantat führen. Schneiden Sie ein kleines Stück des reaggregierten Animal-Cap-Explantats mit abgerundeten Pinzetten und einem Augenbrauenmesser aus.

Verwenden Sie das Gewebefragment, um ein Explantatstück für die Transplantation zuzuschneiden. Diese Abbildung zeigt die anterior neuralen Röhren von X laevis und X tropicalis, die wie gerade demonstriert als Flachpräparate in den Stadien 30, 32 und 35 nach einer Ganzpräparat-Doppel-NC2-Hybridisierung dargestellt sind. Wie in diesen Bildern zu sehen ist, wird die Expression von xenopus sonic hedgehog in Zellen nachgewiesen, die mit Perlen in Kontakt stehen, die in konditioniertem Medium inkubiert wurden, das mit dem endständigen Abschnitt des sonic-hedgehog-Gens ergänzt wurde, jedoch nicht in Zellen, die mit Perlen in Kontakt stehen, die mit Kontrollmedium behandelt wurden.

Nach der Dissoziation und erneuten Aggregation, wie gerade gezeigt, wurden diese Explantate mit anteriorisierten Animal-Cap-Zellen mit anteriorisierten Animal-Cap-Zellen, die Otx2 exprimieren, vermischt. Wie beobachtet, sonderten sich diese Otx2-exprimierenden Zellen nicht von den Zellen ohne Otx2-Expression ab. Beide Zelltypen vermischten sich frei innerhalb des Explantats.

Im Gegensatz dazu bildeten multigenexprimierende Zellen in Explanten, in denen Otx2-exprimierende Zellen mit BAR HL-2-, Otx2- und IRX3-exprimierenden Zellen gemischt wurden, zusammenhängende Zellinseln, die sich nicht gleichmäßig innerhalb des reaggregierten Explantats ausbreiteten. Wenn gemischte Exemplante, die aus Zellen bestanden, die BAR HL-2, Otx2 und IRX3 koexprimieren, zusammen mit Zellen, die den N-Terminus von sonic hedgehog exprimieren, wie eben gezeigt in die vordere Neuralplatte von Xenopus laevis-Embryonen transplantiert wurden, zeigten sie endogene sonic hedgehog-Expression und grenzten sich von den vorderen neuralen epithelialen Zellen ab. Hingegen wiesen transplantierte Zellen, die aus Explanten bestanden, die Otx2- und N-Terminus-sonic hedgehog-exprimierende Zellen enthielten und in die Neuralplatte von Xenopus laevis eingepflanzt wurden, weder sonic hedgehog-Expression auf noch grenzten sie sich von ihren Nachbarzellen ab.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann das Transplantieren des Animal-Cap-Explantats auf embryonale Neuralplatten innerhalb von zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der transplantierten Embryonen. Es handelt sich um eine sehr robuste und äußerst lohnende Methode. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, äußerst vorsichtig bezüglich bakterieller und pilzlicher Kontaminationen zu sein.

Nach den Transplantationsverfahren können weitere Methoden wie die In-situ-Hybridisierung an Ganzpräparaten durchgeführt werden, um das Schicksal und das Verhalten der transplantierten Zellen zu verfolgen. Die Entwicklungsprogramme, die der Organogenese des Neuralrohrs zugrunde liegen, sind insbesondere bei Wirbeltieren weitgehend konserviert. Daher hat die an Amphibien gewonnene Erkenntnis unser Verständnis der zellulären und molekularen Prozesse, die der Wirbeltierentwicklung zugrunde liegen, vertieft.