Name: Stammzell-ähnlichen Xenopus Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren In-vitro- Und In-vivo- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Lernen Sie Blastocoel-Dach-Explantate von Xenopus laevis zur Untersuchung neuronaler Entwicklungsmechanismen in vitro und in vivo. Diese vielseitigen Methoden ermöglichen Einblicke in Zellmigration und Schicksalsbestimmung.

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Der Autor dankt Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef und Anne Hélène Monsoro-Burq für ihre Hilfe und ihren Rat sowie der Tierschutzeinrichtung des Institut Curie. Der Autor dankt Paul Johnson für seine Lektoratsarbeit an dem Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) und durch Zuschüsse der "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 und ARC 5115; FRC DOC20120605233 und LABEX Memolife) und die Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Experimente mit nationalen und europäischen Verordnung über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit international etablierten Prinzipien der Vermeidung, Verminderung und Verbesserung verwendet, entsprechen. 1. Flach Montage von Xenopus laevis Kaulquappen Anterior Neuralrohr Nach Whole-mount in situ Hybridisierung <ol><li> Erhalten X. laevis Embryonen nach Standardverfahren 4 und älter werden, bis sie Neurulastadium 26 und älter (nach Nieuwkoop und Faber Entwicklungstabelle 17 zu erreichen. </li><li> Fix X. laevis Kaulquappen durch Inkubation in einer Lösung von 4% Paraformaldehyd (PFA). Rock, drehen und die Embryonen in eine 2 ml-Glasampulle werden 1 bis 1,5 h bei RT Stufe 26 bis 38 Embryonen, 2 h bei RT für Embryos in einem späteren Stadium der Bühne. ACHTUNG: PFA ist durch Kontakt und möglicherweise krebs giftig. Es sollte unter einer Haube manipuliert werden. HINWEIS: One X. laevis Brutüblicherweise in einem 2 ml-Glasampulle fest, aber eine größere Glasfläschchen verwendet werden können. </li><li> Die Embryonen in der gleichen Ampulle mit 1x PBS mit 0,1% Tween (PBT), 3 min bei RT waschen, zweimal. HINWEIS: Sofern nicht anders angeben PBS verwendet wird, ist mit oder ohne Kalzium und Magnesium. </li><li> Dehydratisieren die Embryos in 100% Methanol (MeOH) für mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur in der gleichen Ampulle. Ändern Sie den MeOH 100% mindestens zweimal unter der Haube mit einem Kunststoff-Mikropipette. HINWEIS: Die MeOH leicht gelb gefärbt, wie Lipide darin gelöst. VORSICHT Das MeOH ist beim Einatmen giftig und sollte unter einer Haube manipuliert werden. </li><li> Rehydrieren die Embryonen mit der gleichen Ampulle durch eine abgestufte Reihe von MeOH Bäder: MeOH 75% in PBS, MeOH 50% in PBS, MeOH 25% in PBS, PBS zweimal, jedes Bad 5-10 min bei RT. Die MeOH-Lösungen werden unter der Haube mit einem Kunststoff-Mikropipette geändert. </li><li> Mit einem Kunststoff-Pipette der Embryo in einem 60 mm-Petrischale an die Spitze mit PBT gefüllten seziert werden. Mit Hilfe von zwei feinen Pinzette Pflegedie Augen, indem Sie einen feinen Pinzette zwischen den Augen und dem Neuralrohr, auf der Ebene der Optik Stiel vollständig entfernen. Lösen Sie die Augen aus dem Neuralrohr. Vorsichtig einführen die Zange unter dem Ektoderm über dem Neuralrohr. Mit Sorgfalt, ziehen Sie die Ektoderm ab hinter dem Kopf und entsorgen Sie sie. </li><li> Führen Sie ein Doppel- oder Einzel ISH unter Verwendung von Digoxigenin-markierten oder Fluorescein-markierten Sonden, wie oben beschrieben 18,19. </li><li> Nachdem der ISH Übertragung der Embryonen in einem neuen 60 mm Petrischale an die Spitze mit PBT mit einer Plastikpipette gefüllt. </li><li> Verwenden feinen Pinzette vorsichtig lösen das Neuralrohr vom Rest des Embryos. In diesem Stadium löst sich die vordere Neuralrohr von posterior Neuralrohr. Vorsichtig lösen übrigen Teile des Ektoderms über dem Neuralrohr, Chorda, die lose unter dem Neuralrohr oticum Vesikeln und übrigen Teile des Mesoderms befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass das Neuralrohr ist frei von irgendwelchen Anlagenauf dieser Stufe. HINWEIS: Um eine Beschädigung des Neuralrohrs zu vermeiden führen alle Neuralrohr / Embryotransfer mit einem Kunststofftransferpipette oder einer Mikropipette bei Bedarf mit einer Spitze Schnitt an seinem Ende. Der Durchmesser des Spitzenendes an die Größe des Neuralrohrs eingestellt. </li><li> Übertragen Sie die seziert Neuralrohr (siehe Hinweis Schritt 1.9) in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 50% Glycerin in PBS gefüllt. Warten, bis die Neuralrohren haben zur Unterseite der Glycerinlösung gefallen ist, in der Regel O / N bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Lösung von 50% Glycerin / PBS mit einer Mikropipette P1000 und fügen Sie in der gleichen 1,5-ml-Röhrchen mit einer Lösung von 90% Glycerin / PBS mit einer Mikropipette P1000. Warten Sie, bis die neuronalen Rohre an der Unterseite der 90% Glycerin / PBS-Lösung fallen, in der Regel O / N bei 4 ° C. Hinweis: für die langfristige Lagerung, verwenden 90% Glycerin / PBS plus Antibiotika, um bakterielle Entwicklung zu verhindern. </li><li> Übertragen Sie die neuronale Rohre auf einer Glasplatte oder einem Objektträger mit einer Kunststofftransferpipette. </li><li> DisSekte die neuronalen Rohre entlang der dorsalen und ventralen Mittellinien mit Wolfram-Nadeln. Während dieser Stufe werden die neuronalen Röhrchen werden in 90% Glycerin / PBS aufbewahrt. </li><li> Montieren Sie die beiden Seiten des Neuralrohrs in 90% Glycerin / PBS mit Verstärkungsringen mit einem Deckglas bedeckt. </li><li> Befestigen Sie die Deckgläser mit Lack und halten bei 4 ° C. </li></ol> 2. Tier Kappe Explantate Induction Mit Anionenaustauschharzkügelchen <ol><li> Übertragen Sie 100 ul Anionenaustauschharzkügelchen in ein 2-ml-Röhrchen mit einer Mikropipette P1000. Mindestens fünf Mal mit sterilem destilliertem Wasser Waschen der Kügelchen. Lassen Sie die Perlen am Boden des Röhrchens sedimentieren und ersetzen Sie die sterilem destilliertem Wasser mit einer Mikropipette P1000. Berühren Sie nicht die Perlen. </li><li> Ließ die Perlen tränken O / N in einem 2 ml-Röhrchen mit sterilem destilliertem Wasser mit Rinderserumalbumin (BSA) (10 mg / ml) bei 4 ° C gefüllt. </li><li> Zwei Stunden vor dem Sammeln des ACs, statt die Hälfte der Perlen in ein neues 1,5 mlRohr mit einer Mikropipette P1000. Ersetzen den sterilem destilliertem Wasser mit 500 &amp; mgr; l des Mediums, enthaltend das Molekül in seiner induktive Potential getestet werden oder bekanntermaßen eine spezifische Schicksal induzieren. Zu halten, die andere Hälfte der Perlen, wie sie als negative Kontrolle verwendet werden. </li><li> Die Perlen Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 2 Std. </li><li> Führen Sie alle nachfolgenden Schritte unter dem Stereomikroskop und führen alle AC Transfer mit einer Mikropipette. </li><li> Bringen Blastula oder sehr frühen Gastrula Embryonen in PBS mit Calcium und Magnesium mit 0,2% BSA mit einem Kunststofftransferpipette ergänzt. HINWEIS: Die Embryonen entwickeln bei 12 ° C Reichweite Blastula und Gastrula Stufen in 20 bis 24 Stunden. </li><li> Entfernen des Embryos Dotterhaut mit einer Pinzette, wie zuvor beschrieben 20. Befestigen Sie den Embryo mit einer Pinzette. Klemmen die Dotterhaut mit der Seite der anderen Zange. Hält die Membran langsam abziehen den Embryo. Führen Sie dieses Verfahren auf dem ventrale (pflanzlichen) Seite des Embryos. Den Tier Seite des Embryos nicht beschädigen. </li><li> Isolieren kleiner ACs, wie zuvor beschrieben 21. Das Tier Pol pigmentierte Teil des Embryos. Verwenden feinen Pinzette schneiden Sie ein kleines Quadrat von Gewebe aus der Tiermast. Die AC-Gewebe enthält nur die Ektodermzellen. Sicherzustellen, dass das Gewebe von gleichförmiger Dicke. Wenn nicht, entfernen Sie den AC aus der Analyse. </li><li> Platzieren Sie jede AC in einer Terasaki Multiwell-Platten in 0,5x Geändert Barths Saline (MBS) 4. Setzen Sie den AC in den Brunnen mit pigmentierten Tierseite nach unten in Kontakt mit der runden Boden des Bohrlochs. HINWEIS: Beschichtungs Pipetten mit einer 0,1% BSA-Lösung verhindert das Anhaften von kleinen Stücken von Klebstoff mit dem Kunststoffgewebe. </li><li> Setzen Sie einen Wulst an jeder Kappe mit einer Mikropipette P20. Verwenden Sie bei Bedarf Pinzette vorsichtig die Perle in der Mitte der Kappe. HINWEIS: Wenn in einem konditionierten Medium getränkt werden die Perlen in rosa gefärbt. Wählen Sie die meisten Colored Perlen. </li><li> Inkubieren bei RT (18-22 ° C) für 6 Stunden ohne Bewegung der Terasaki Multiwellplatte. Der Wulst hält sich an die AC in weniger als 2 Stunden. </li><li> Legen Sie das Terasaki Multiwellplatte auf der Oberseite der Papiere in Wasser eingeweicht. Die Platte mit einem Kunststoffbehälter. HINWEIS: Diese &quot;feuchte Kammer&quot; verhindert ein vorzeitiges Verdampfen der Brunnen. </li><li> Kultur der ACS in 0,5x MBS oder 3/4 NAM (siehe Schritt 4.1) in der feuchten Kammer bei 15-20 ° C, bis die Geschwister-Embryonen die richtige Bühne, um die Wirkung Ihrer Faktor testen erreicht. </li><li> Befestigen Sie den ACs für 1 Stunde in frisch zubereiteten 4% PFA. Entwässern des ACS in 100% Methanol, wie zuvor beschrieben (Schritt 1.4). </li></ol> 3. Tier Cap Zelldissoziation und Reaggregation vor dem Pfropfen in einer Xenopus laevis Neurula <ol><li> Mantel-Petrischalen (60 mm) oder 12 Loch-Platten mit 3% Agarose in sterilem Wasser oder in PBS ohne Calcium und Magnesium. Fügen Sie genug, um die Agarose b abdeckenottom der Petrischale oder den Brunnen. Pre-erwärmen Sie die Platten bei Raumtemperatur (18-22 ° C). Optional gespeichert die Platten für zwei Tage bei 4 ° C, um Austrocknung zu verhindern. </li><li> Vorbereitung calciumfreien HOLTFRETER der Kochsalzlösung (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) und HOLTFRETER der Kochsalzlösung (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,6) 5. HINWEIS: die Lösung von CaCl 2 kann nicht autoklaviert werden. </li><li> Füllen Sie die Agarose-beschichteten auch an die Spitze mit Calcium-freien Holtfreter die Kochsalzlösung. </li><li> Vorbereitung Blastula oder sehr frühen Gastrula Embryonen ihre ACs isolieren, wie zuvor beschrieben (Schritte 2,5 bis 2,7). </li><li> Isolieren mindestens 15 oder bis zu 30, kleine ACs 21. Verwenden feinen Pinzette schneiden Sie ein kleines Quadrat von Gewebe aus der Tiermast. Die AC-Gewebe enthält nur ektodermale Zellen und ist daher gleichmäßiger Dicke. Wenn nicht, entfernen Sie den AC aus der Analyse. HINWEIS: Das Tier Pol ist der Embryo Die pigmentierte Teil. </li><li> Übertragen Sie die ACs in einem Agarose-beschichteten auch an die Spitze mit Calcium-freien Holtfreter die Kochsalzlösung gefüllt. Legen Sie die ACs mit pigmentierten Seite nach oben. HINWEIS: Die Dissoziation Prozess startet schnell in calciumfreien Holtfreter die Kochsalzlösung. </li><li> Warten Sie ein paar Minuten für die Zellen zu starten distanziert. Beachten Sie dies durch Disaggregation der Gewebe. Verwenden feinen Pinzette, trennen Sie die pigmentierte Schicht von dem Rest des AC und entsorgen Sie sie mit einer Mikropipette P20. Vollständige Zelle Dissoziation angibt Trennung von Zellen voneinander. HINWEIS: Ein oder zwei pigmentierte Schichten können innerhalb der Rück aggregiert Explantat gelassen werden, um die Visualisierung während der Pfropfung zu helfen. </li><li> Zentrieren Sie die Zellen mit kreisenden Bewegungen der Platte. Mit einer Mikropipette P1000 vorsichtig so viel Medium wie möglich. Achten Sie darauf, um die Zellen zu berühren. </li><li> 1 ml HOLTFRETER die Salzlösung mit Calcium zu der Bohrung. Übertragen Sie die distanzierte ACsin ein 1,5-ml-Röhrchen. HINWEIS: 2-ml-Röhrchen kann nicht aufgrund ihrer Rund verwendet werden. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation 5 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 2.000 rpm für eine Tischzentrifuge (500 xg). Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Mikropipette P1000. </li><li> Zu den dissoziierten Zellen 20 ul HOLTFRETER die Salzlösung mit Calcium (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (Sigma A-7888, pH 7,6) 5. </li><li> Halten des dissoziierten ACs, 3-6 Stunden bei Raumtemperatur (18-22 ° C). Anmerkung: Dies ist notwendig, Zeit für die Zellen neu zu aggregieren. Die erneute Aggregation sichtbar ist, wenn die Zellen zu bilden, eine kleine Kugel an der Unterseite des Rohres. </li><li> Nehmen Sie das Explantat vorsichtig aus dem Boden des Röhrchens durch Zugabe von 1 ml 0,5x MBS oder von 1 ml 3/4 NAM (siehe Schritt 4.1). Übertragen Sie die Explantation in einer un-beschichtete Platte mit einem Kunststofftransferpipette. </li><li> Stufe werden die Explantate mit ihren Steuer Geschwister. Für Langzeitkultur Einsatz von Antibiotika: kanamycin (50 ug / ml), Ampicillin (50 ug / ml) und Gentamycin (50 ug / ml). </li></ol> 4. Pfropfen von Tier Caps Explantate in der Neuralplatte von X. laevis Embryo <ol><li> Vorbereitung 3/4 NAM (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0,2 × PBS, 50 ug / ml Gentamycin). Nicht länger als 1 Woche zu halten für die Präparation und bei 4 ° C. Älteren NAM können zur Herstellung von Agarose-beschichteten Präparation Schalen (unten) verwendet werden. </li><li> Coat Petrischalen (60 mm) mit 3% Agarose in 3/4 NAM, in die kleinen Löcher wurden entweder mit einer Silikonform, oder die Abdeckung eines Tischtennisschläger gemacht. HINWEIS: Die Agarose den Boden der Petrischale bedeckt. Lassen Sie etwas Platz, so dass die Petrischale mit 3/4 NAM zu füllen. Alternativ machen Dissektion Gerichte mit nicht-trocknende Knetmasse. Innerhalb der Ton, drücken Sie die Embryonen leicht während der Präparation Verfahren. Graben kleine Löcher in derAgarose mit abgerundeten Pinzette dieser &quot;Dissektion Gericht &#39;hilft, um die Embryonen während der Präparation Verfahren zu halten. </li><li> Sammeln Dissektion Werkzeuge: Kunststofftransferpipetten, ein &quot;Augenbraue-Messer &#39;22, zwei feinen Sezierung einer Pinzette, P1000 Mikropipette und Tipps, einem stereosmicroscope mit Vergrößerungs 8-40X (mit Augenbrauen Haare in Paraffin an der Spitze einer Glaspasteurpipette eingebettet ist), eine helle Lichtquelle mit Lichtwellenleiterführungen. Halten Sie alle Sezieren Werkzeuge sauber; Nach jedem Versuch, spülen Sie sie zweimal mit destilliertem Wasser, einmal mit 100% Ethanol und trocknen lassen. Lager weg von Staub und ggf. Autoklaven Metall Sezieren Werkzeuge. </li><li> Lassen Sie das dissoziiert und erneut aggregiert ACs (Protokoll 3) und ihre Geschwister X. laevis Embryonen entwickeln, bis sie Stufe 13 (Neurula) erreichen nach Nieuwkoop und Faber Entwicklungstabelle 17. Für die Transplantation in der Neuralplatte Stufe 13 bis 15 Embryonen der Bühne verwendet. </li><li> Führen Sie allenachfolgenden Schritte unter dem Stereomikroskop. </li><li> Mit einem Kunststofftransferpipette, übertragen Sie die Embryonen in PBS mit Calcium und Magnesium mit 0,2% BSA ergänzt. Entfernen des Embryos Dotterhaut, wie zuvor beschrieben 20. Befestigen Sie den Embryo mit einer Pinzette. Klemmen die Dotterhaut mit der Seite der anderen Zange. Halten der Membran fest, langsam abziehen den Embryo. HINWEIS: Führen Sie diese Prozedur auf der ventralen (pflanzlichen) Seite des Embryos. Die Embryonen nicht beschädigen Neuralplatte. Wenn Embryonen während der Dotterhaut Entfernungsschritt beschädigt wurde, übertragen Sie die Embryonen in eine 60 mm Petrischale mit 3/4 NAM mit einem Kunststofftransferpipette und warten Sie 15 Minuten, eine ausreichende Zeit für die Heilung eintritt. </li><li> Füllen Sie das Sezieren Gericht an die Spitze mit frischen 3/4 NAM. </li><li> Mit einem Kunststofftransferpipette, übertragen Sie die Embryonen ohne ihre Dotterhaut in das Sezieren Gericht. Legen Sie die Embryonen Rückenseite nach oben indie Brunnen. Während der Übertragung nicht zulassen, dass der Embryo, in Kontakt mit der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, da X. geben laevis durch Oberflächenspannung lysiert. </li><li> Übertragen Sie die AC Explantat in das Sezierung Platte mit einem Kunststofftransferpipette oder einer Mikropipette P1000 gepfropft werden. Nachdem die Pipette innerhalb der Flüssigkeit, damit die Explantate langsam sinken durch Schwerkraft, oder drücken Sie ganz sanft. </li><li> Pflegen Sie die Embryonen mit abgerundeten Pinzette. Mit der Augenbraue Messer einen Einschnitt in das neuronale Platte, wo Sie beabsichtigen, Ihre Explantat piece pfropfen. HINWEIS: In der Stufe 14 die vordere Biegung der Neuralplatte kann Gebrauch als ein Wahrzeichen sein, das Zwischenhirn Gebiet (Abbildung 4) markiert. </li><li> Schneiden Sie ein kleines Stück Neuroepithel, mit abgerundeten Pinzette und eine Augenbraue Messer. Schneiden Sie ein kleines Stück von dem Explantat mit der Augenbraue Messer. HINWEIS: Das Stück Explantation sollte etwa die gleiche Größe und Form wie die Neuroepithel abgetragenen Bereich sein. </li&gt; <li> Legen Sie das Stück Explantat in die Neuroepithel Einschnitt mit der Augenbraue Messer und feinen Pinzette. Stellen Sie sicher, dass die Explantation schnell wird an der Embryo. </li><li> Alternativ legen Sie ein Stück Deckglas auf die aufgepfropften Embryo, um das Transplantat an Ort und Stelle zu halten. Um dies zu tun, machen eine gute Deckglas in sehr kleine Stücke mit grobem Pinzette. Sicherzustellen, dass die Größe etwa 1,5 mm 2. Tauchen Sie die Stücke in eine Petrischale mit 3/4 NAM oder PBS mit einer Pinzette. Wählen Sie ein Stück Glas größer als der Embryo um Beschädigungen zu vermeiden. Der Embryo wird ein wenig abgeflacht. </li><li> Warten Sie mindestens 30 Minuten ohne Bewegung oder nur die Sektionsplatte bewegen sanft. Lassen Sie den Embryo zu erholen für 30 Minuten bis 2 Stunden und entfernen Sie vorsichtig das Deckglas, wenn nötig. Die gepfropft Embryonen vorsichtig Pipette in ein sauberes Geschirr mit 3/4 NAM gefüllt ist, mit Hilfe der Kunststofftransferpipette. HINWEIS: Gepfropfte Embryonen neigen dazu, Bakterien oder Pilze Kontamination zu entwickeln. Für langfristige culture verwenden Antibiotika: Kanamycin (50 ug / ml), Ampicillin (50 ug / ml) und Gentamycin (50 ug / ml). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Neuralen Entwicklung wird durch ein komplexes Wechselspiel zwischen zellulären Entwicklungsprogrammen und Signale von dem umgebenden Gewebe (Bewertet in 3,31,32) instrumentiert. Eine Reihe von Protokollen, die in X verwendet werden kann Hier beschreiben wir laevis Embryonen extrinsischen und intrinsischen Faktoren in neuronalen Schicksal Entschlossenheit und neuronalen Morphogenese in vitro und in vivo beteiligt zu erkunden. Diese Protokolle können als solche auf X...

Wirbelnervensystem geht aus dem neuronalen Platte als homogene Schicht von Neuroepithelzellen. Zu verstehen, wie Entwicklungsprogramme werden induziert, codiert, und gründete während Regionalisierung der Neuralplatte ist gegenwärtig eines der Hauptziele in der Entwicklungsbiologie. Im Vergleich zu anderen Systemen ist die experimentell zugänglich Xenopus Embryo ein Modell der Wahl für die Analyse von frühen Schritte der neuralen Entwicklung 1,2. Es ist leicht, eine große Zahl von Embryonen zu erhalten, und externe Entwicklung ermöglicht den Zugang zu den ersten Schritten der Neurulation 3. Viele Werkzeuge zur Verfügung, um experimentell zu manipulieren Xenopus laevis (X. laevis) Embryonalentwicklung. Mikroinjektion von mRNAs oder Morpholinos (MO), einschließlich der induzierbaren MOs zusammen mit biochemischen und pharmakologischen Werkzeugen ermöglicht kontrollierte gain of function (GOF) und Funktionsverlust (LOF) und spezifische Änderung der Signalwege 4,5. Der blastocoel Dach Ektoderm, um das Tier Pol einer Blastula oder einem sehr frühen Gastrula Embryo entfernt und bezeichnet als &quot;animal cap&quot; (AC), eine Quelle von pluripotenten Zellen, die durch Manipulation der Genexpression vor programmiert werden kann, Explantaten Vorbereitung. In diesem Manuskript sind ausführliche Protokolle zu verwenden X. laevis AC Explantaten in vitro und in vivo molekularen und zellulären Prozesse zugrunde liegenden neuralen Entwicklung zu testen. Es wird eine Technik vorgestellt, wobei eine feine Beobachtung von Genexpressionsmustern in einer Xenopus Kaulquappe Neuralrohr, einen vorläufigen Schritt bei der Identifizierung von Schicksal Bestimmung Cues. Während die Beobachtung der Flachgewebe angebracht wird allgemein bei der Untersuchung von Hühnerembryonen 6 verwendet wird, ist nicht korrekt in Xenopus beschrieben. Manipulation der Genexpression durch Einspritzen von Kunst mRNA oder MO in die Blastomeren von 2 oder 4 Zellen Embryonen ermöglicht die Programmierung ACExplantaten 4. B. Inhibierung des Bone Morphogenetic Protein (BMP) Weg durch die Expression des anti-BMP Faktor Noggin, gibt ein neuronales Identität AC Zellen 3. Das Protokoll wird zum Ausführen von lokalen und zeitgesteuerte Belichtung AC Explantate auf extrinsische Cues durch direkten Kontakt mit einem Anionenaustauscherharz Wulst beschrieben. Schließlich wird eine Technik zur Prüfung von Entwicklungs Merkmale der neuralen Vorläuferzellen in vivo durch Transplantation von gemischten Explantaten aus verschiedenen programmierten Zellen dissoziiert und Wieder assoziiert beschrieben hergestellt. Der Frosch Embryo ist ein leistungsfähiges Modell zu frühen Wirbeltiere neuralen Entwicklung zu studieren. Die Kombination Manipulation der Genexpression in vitro-Kulturen Explantation liefert wichtige Informationen in der Studie von Neuroepithel Regionalisierung, Proliferation und Morphogenese 7-12. Die Programmierung der AC Explantate gestattet Entwicklung eines funktionellen Herz ex vivo 13,14. Die VerwendungExplantatmedium Pfropfen 15 führte zur Identifizierung des minimalen Transkriptionsschalter Induzieren der Neuralleiste Differenzierungsprogramms 16. Die Zona limitans intrathalamica (ZLI) ist ein Signalisierungszentrum, das Sonic Hedgehog (Shh), um das Wachstum und die Regionalisierung der Schwanzvorderhirn steuern absondert. Wenn kontinuierlich auf Shh ausgesetzt Neuroepithelzellen Koexpression der drei Genen für Transkriptionsfaktoren - Barh artigen homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (OTX2) und Iroquois-3 (irx3) - zu erwerben zwei Eigenschaften der ZLI Fach: die Kompetenz, shh auszudrücken, und die Fähigkeit, von anterior Neuralplatte Zellen zu trennen. Als Modellsystem wird die Induktion einer ZLI Schicksal in Neuroepithelzellen präsentiert 8 werden. Diese Protokolle zielen darauf ab, einfach, billig und effiziente Werkzeuge für die Entwicklungsbiologen und andere Forscher, die fundamentale mec erkundenhanisms von Schlüssel neuronalen Zell Verhaltensweisen. Diese Protokolle sind sehr vielseitig und ermöglichen die Untersuchung einer großen Palette von extrinsischen und intrinsischen neuronalen Bestimmung Cues. Es ermöglicht langfristig in vivo Analyse neuronaler Abstammung Engagement, induktive Wechselwirkungen und Zell Verhaltensweisen.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 20909.290</td><td>Giftige</td></tr><tr><td>Anionenaustauscherharzkügelchen</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>Für die Kultivierung von tierischen KapselnpH 7,6</td></tr><tr><td>Gentamycin&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&nbsp;</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&nbsp; zur Raupenvorbereitung</td></tr></tbody></table>

stammzell-ähnlichen<em&gt; xenopus</em&gt; embryonale explantate bis früh neurale entwicklungs- eigenschaften studieren<em&gt; in-vitro-</em&gt; und<em&gt; in-vivo-</em

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Das Verständnis der genetischen Programme, die der neuronalen Entwicklung zugrunde liegen, ist ein wichtiges Ziel der Entwicklungs- und Stammzellbiologie. In der amphibischen Blastula sind Zellen aus dem Dach des Blastocoels pluripotent. Diese Zellen können isoliert und so programmiert werden, dass sie durch Manipulation der Genexpression oder Induktion durch Morphogene verschiedene Gewebe erzeugen. In diesem Manuskript werden Protokolle für die Verwendung von Xenopus laevis Blastocoel-Dachexplantaten als Assay-System zur Untersuchung wichtiger in vivo und in vitro Merkmale der frühen neuronalen Entwicklung beschrieben. Diese Protokolle ermöglichen die Untersuchung des Schicksalserwerbs, des Zellmigrationsverhaltens sowie der zellautonomen und nicht-autonomen Eigenschaften. Die Blastocoel-Dachexplantate können in einem serumfreien, definierten Medium kultiviert und in Wirtsembryonen transplantiert werden. Diese Transplantation in einen Embryo ermöglicht die Untersuchung der langfristigen Abstammungsbindung, der induktiven Eigenschaften und des Verhaltens der transplantierten Zellen in vivo. Diese Assays können genutzt werden, um molekulare Mechanismen, zelluläre Prozesse und genregulatorische Netzwerke zu untersuchen, die der neuronalen Entwicklung zugrunde liegen. Im Rahmen der regenerativen Medizin bieten diese Assays die Möglichkeit, neuronale Zelltypen in vitro zu erzeugen, die im Wirkstoffscreening eingesetzt werden könnten.

Basis morphologischer Überlegungen in verschiedenen Arten, embryo Manipulationen und des Expressionsmusters von regulatorischen Genen, hält einem konzeptionellen Modell, daß das neuronale Platte in Längs- und Quersegmente, die einen Entwicklungsgittererzeugungs deutliche histogenic Felder definieren unterteilt. In der Neuralplatte, die Anlagen der Vorderhirn, Mittelhirn, Hinterhirn und Rückenmark sind alle bereits entlang der anteroposterioren (AP) Achse während der Gastrulation (in <sup...

In Xenopus-Embryonen sind Zellen aus dem Dach des Blastocoels pluripotent und können so programmiert werden, dass sie verschiedene Gewebe erzeugen. Hier beschreiben wir Protokolle zur Verwendung von amphibischen Blastocoel-Dachexplantaten als Assay-System, um in vivo und in vitro wichtige Merkmale der frühen neuronalen Entwicklung zu untersuchen.

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Blastozystendach- oder Animal-Cap-Explantate von X. laevis zur Untersuchung der molekularen Mechanismen und zellulären Prozesse, die der neuronalen Entwicklung in vitro und in vivo zugrunde liegen, zu verwenden. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Entwicklungsbiologie und Stammzellbiologie bezüglich der Zellschicksalsbestimmung, Zellmigration sowie der zellautonomen und nicht-zellautonomen Eigenschaften neuronaler Zellen zu beantworten. Die vorgestellten Techniken bieten einfache, kostengünstige, vielseitige und effiziente Werkzeuge, um die grundlegenden Mechanismen entscheidender Verhaltensweisen neuronaler Zellen zu erforschen. Mithilfe dieser Assays lässt sich die neuronale Schicksalsbestimmung für die Umprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen sowie die reife Generierung von neuronalen Zelltypen zur weiteren Untersuchung testen. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da die Techniken manuelle Geschicklichkeit erfordern. Ich hatte die erste Idee zu diesen Methoden, als ich über die Analyse des Zellsegregationsverhaltens nachdachte.Um einen Xenopus laevis-Vorderhirnschlauch flach zu montieren, verwenden Sie eine Plastik-Transferpipette, um ein fixiertes, dehydriertes und rehydriertes Embryo in eine 60-Millimeter-Petri-Schale zu überführen, die bis zum Rand mit PBT gefüllt ist. Als Nächstes führen Sie ein Paar feiner Pinzetten zwischen die Augen und den Neuralrohrabschnitt auf Höhe des Sehnervs ein und lösen die Augen ab. Danach führen Sie die Pinzette vorsichtig unter das Ektoderm, das über dem Neuralrohr hinter dem Kopf liegt, und lösen das Ektoderm behutsam ab.Nach Durchführung der entsprechenden NC2-Hybridisierungsetikettierung das Embryo in eine neue 60-Milliliter-Petri-Schale mit PBT überführen und feine Pinzette verwenden, um den vorderen Neuralrohr grob vom Embryo zu isolieren. Anschließend vorsichtig die locker am Neuralrohr befestigte Chorda von dessen Unterseite entfernen. Gegebenenfalls auch die Ohrbläschen und die verbleibenden Teile des Mesoderms.Wenn alle Anhängsel des Neuralrohrs abgetrennt wurden, lösen Sie das vordere Neuralrohr vom Embryo. Überführen Sie anschließend das isolierte Neuralrohr in ein konisches 1,5-Milliliter-Röhrchen, das mit 50 % Glycerin und PBS gefüllt ist, und lagern Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach einer zweiten Übernachtlagerung in 90 % Glycerin überführen Sie das Neuralrohr in einer kleinen Menge Glycerin auf einen Objektträger und dissezieren die Neuralrohre entlang der dorsalen und ventralen Mittellinien mit Wolframenadeln.Verwenden Sie anschließend Verstärkungsringe, die mit einem Glasdeckel abgedeckt sind, um die beiden Seiten des Neuralrohrs in 90 % Glycerin und PBS zu montieren. Um die Beads für die Induktion von Animal-Cap-Explantaten vorzubereiten, teilen Sie mit einer P200-Mikropipette die Hälfte eines Aliquots an mit BSA behandelten Harzperlen auf ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen auf. Ersetzen Sie dann das sterile destillierte Wasser im neuen Röhrchen durch 200 Mikroliter Medium, das zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius das experimentelle Molekül der Untersuchung enthält.Am Ende der Inkubation die Blastula- oder sehr frühen Gastrula-Embryonen in PBS mit Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 0,2 % BSA, überführen. Anschließend unter einem Stereomikroskop die Vitellinmembran mit der Seite eines Pinzettenpaares festhalten und mit einem zweiten Pinzettenpaar die Membran langsam von der vegetativen Seite des Embryos ablösen, wobei darauf geachtet werden muss, die animale Seite nicht zu beschädigen. Danach mit feiner Pinzette ein kleines Quadrat vom animen Pol jedes Embryos ausschneiden.Unter Verwendung einer mit BSA beschichteten Pipettenspitze werden die Kappen in einzelne Vertiefungen einer Terasaki-Mehrfachplatte in 0,5× modifizierter Barth-Lösung überführt, wobei die pigmentierte animalseitige Oberfläche mit dem runden Boden der Vertiefung in Kontakt gebracht wird. Mit einer P20-Mikropipette werden die dunkelsten rosa Perlen aus dem Behandlungsgefäß ausgewählt und jeweils eine Perle mit einer Pinzette zentral auf jede Kappe platziert. Sobald die letzte Perle platziert ist, wird die Platte auf mit Wasser getränkte Papiere gestellt und vor der Inkubation mit einem Plastikbehälter abgedeckt.Um dissoziierte und neuaggregierte Animal-Cap-Explantate herzustellen, isolieren Sie 15 bis 30 Animal Caps, wie eben gezeigt. Schneiden Sie mit feinen Pinzetten ein kleines quadratisches Gewebestück von den Animalpolen aus. Überführen Sie die Animal Caps in eine mit Agarose beschichtete Vertiefung, die mit kalziumfreier Holtfreter-Lösung gefüllt ist, wobei die pigmentierten Seiten nach oben zeigen.Nach einigen Minuten sollte eine Desaggregation beobachtet werden. Verwenden Sie feine Pinzette, um die pigmentierten Schichten vom restlichen Gewebe zu trennen. Danach verwerfen Sie das Pigment mit einer P20-Mikropipette.Wenn die meisten pigmentierten Schichten entfernt sind und die Zellen vollständig dissoziiert wurden, schwenken Sie die Platte, um die Zellen zu zentrieren, und entfernen Sie mit einer P1000-Mikropipette so viel wie möglich vom Medium, wobei Sie darauf achten, die Zellen nicht zu berühren. Geben Sie dann ein Milliliter Holtfreter-Salzlösung mit Calcium in die Vertiefung. Überführen Sie die dissoziierten Animal Caps in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.Nachdem die Zellen abzentrifugiert wurden, entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer P1000-Mikropipette und resuspendieren das Pellet in 20 Mikroliter Holtfreter-Salzlösung mit Calcium. Lassen Sie die Zellen drei bis sechs Stunden bei Raumtemperatur wieder aggregieren. Geben Sie dann langsam ein Milliliter 3/4 NAM hinzu, um die Explantate vorsichtig vom Boden des Röhrchens zu lösen, und verteilen Sie die Explantate mit einer Plastik-Transferpipette auf einzelne unbeschichtete Platten.Um Tierkappen-Explantate auf Xenopus laevis-Neuralplatten zu übertragen, beschichten Sie zunächst 60-Millimeter-Petri-Schalen mit 3 % Agarose und 3/4 NAM, in die kleine Löcher gestanzt wurden. Überführen Sie anschließend frühe Neurula-Embryonen in PBS mit Kalzium und Magnesium, das mit 0,2 % BSA ergänzt wurde, um die Vitellinmembran zu entfernen. Füllen Sie dann die mit Agarose beschichtete Präparierschale mit frischem 3/4 NAM und übertragen Sie die Embryonen mit der dorsalen Seite nach oben in die Präparierschale.Übertragen Sie nun ein reaggregiertes Explant des Animal Caps auf die Dissektionsplatte, wobei das Explantat langsam durch die Schwerkraft in die Schale absinken kann, sobald die Pipettenspitze die Oberfläche des NAM durchbrochen hat. Halten Sie dann unter einem Stereomikroskop das Embryo mit abgerundeten Pinzetten fest, während Sie mit einer Wolframnadel einen Schnitt in die Neuralplatte für das Explantat führen. Schneiden Sie ein kleines Stück des reaggregierten Animal-Cap-Explantats mit abgerundeten Pinzetten und einem Augenbrauenmesser aus.Verwenden Sie das Gewebefragment, um ein Explantatstück für die Transplantation zuzuschneiden. Diese Abbildung zeigt die anterior neuralen Röhren von X laevis und X tropicalis, die wie gerade demonstriert als Flachpräparate in den Stadien 30, 32 und 35 nach einer Ganzpräparat-Doppel-NC2-Hybridisierung dargestellt sind. Wie in diesen Bildern zu sehen ist, wird die Expression von xenopus sonic hedgehog in Zellen nachgewiesen, die mit Perlen in Kontakt stehen, die in konditioniertem Medium inkubiert wurden, das mit dem endständigen Abschnitt des sonic-hedgehog-Gens ergänzt wurde, jedoch nicht in Zellen, die mit Perlen in Kontakt stehen, die mit Kontrollmedium behandelt wurden.Nach der Dissoziation und erneuten Aggregation, wie gerade gezeigt, wurden diese Explantate mit anteriorisierten Animal-Cap-Zellen mit anteriorisierten Animal-Cap-Zellen, die Otx2 exprimieren, vermischt. Wie beobachtet, sonderten sich diese Otx2-exprimierenden Zellen nicht von den Zellen ohne Otx2-Expression ab. Beide Zelltypen vermischten sich frei innerhalb des Explantats.Im Gegensatz dazu bildeten multigenexprimierende Zellen in Explanten, in denen Otx2-exprimierende Zellen mit BAR HL-2-, Otx2- und IRX3-exprimierenden Zellen gemischt wurden, zusammenhängende Zellinseln, die sich nicht gleichmäßig innerhalb des reaggregierten Explantats ausbreiteten. Wenn gemischte Exemplante, die aus Zellen bestanden, die BAR HL-2, Otx2 und IRX3 koexprimieren, zusammen mit Zellen, die den N-Terminus von sonic hedgehog exprimieren, wie eben gezeigt in die vordere Neuralplatte von Xenopus laevis-Embryonen transplantiert wurden, zeigten sie endogene sonic hedgehog-Expression und grenzten sich von den vorderen neuralen epithelialen Zellen ab. Hingegen wiesen transplantierte Zellen, die aus Explanten bestanden, die Otx2- und N-Terminus-sonic hedgehog-exprimierende Zellen enthielten und in die Neuralplatte von Xenopus laevis eingepflanzt wurden, weder sonic hedgehog-Expression auf noch grenzten sie sich von ihren Nachbarzellen ab.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann das Transplantieren des Animal-Cap-Explantats auf embryonale Neuralplatten innerhalb von zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der transplantierten Embryonen. Es handelt sich um eine sehr robuste und äußerst lohnende Methode. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, äußerst vorsichtig bezüglich bakterieller und pilzlicher Kontaminationen zu sein.Nach den Transplantationsverfahren können weitere Methoden wie die In-situ-Hybridisierung an Ganzpräparaten durchgeführt werden, um das Schicksal und das Verhalten der transplantierten Zellen zu verfolgen. Die Entwicklungsprogramme, die der Organogenese des Neuralrohrs zugrunde liegen, sind insbesondere bei Wirbeltieren weitgehend konserviert. Daher hat die an Amphibien gewonnene Erkenntnis unser Verständnis der zellulären und molekularen Prozesse, die der Wirbeltierentwicklung zugrunde liegen, vertieft.

stem-cell-like-xenopus-embryonic-explants-to-study-early-neural

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Imaging embryonalem Gewebe in Echtzeit wird über längere Zeit eine Herausforderung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Test zur Überwachung der zellulären und subzellulären Veränderungen im Rückenmark Küken für längere Zeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Diese Technik kann für andere Regionen des Nervensystems und sich entwickelnden Embryo angepasst werden.

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Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das...

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Dieses Protokoll beschreibt, wie premigratory Schädel Neuralleiste (NC) von Xenopus laevis neurulas sezieren. Diese Explantate können sich auf Fibronektin und in vitro kultiviert beschichtet werden, oder zurück in die Wirts Embryonen gepfropft wird. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der NC-Epithel-Mesenchym-Übergang an, Migration und Differenzierung.

Dissektion der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Explantation Kultur oder<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

Der Xenopus laevis Embryo ist aufgrund seiner Größe und Leichtigkeit der Manipulation weiterhin außerordentlich nützlich bei der Erforschung der frühen Entwicklung.   Es wird ein vereinfachtes Protokoll für das Whole Mount in situ Hybridisierungsprotokoll zur Verfügung gestellt, das bei der Identifizierung spezifischer Organe in diesem Modellsystem verwendet werden kann.

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Dieser Artikel stellt eine bequeme und schnelle Methode für die verschiedenen neuronalen Zellpopulationen im zentralen Nervensystem von Xenopus - Embryonen zu visualisieren mit Immunfluoreszenzanfärbung auf Abschnitte.

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

Wir präsentieren ein zweiteiliges Protokoll, das fluoreszierende Calcium-Bildgebung mit In-situ-Hybridisierung kombiniert, so dass der Experimentator Muster der Calciumaktivität mit Genexpressionsprofilen auf einzelzelligem Niveau korrelieren kann.

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Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten werden erzeugt, indem embryonale Zellen aus endogenen Signalzentren innerhalb des frühen Embryos isoliert werden, wodurch relativ naive Zellcluster erzeugt werden, die leicht manipulierbar und ex vivokultiviert werden können. Dieser Artikel enthält Anweisungen zur Herstellung solcher Expflanzen und demonstriert ihren Nutzen, indem er die Rollen für die Knotensignalisierung während der Gastrulation abfragt.

Erzeugung naiver Blastoderm-Expflanzen aus Zebrafisch-Embryonen

Lernen Sie Blastocoel-Dach-Explantate von Xenopus laevis zur Untersuchung neuronaler Entwicklungsmechanismen in vitro und in vivo. Diese vielseitigen Methoden ermöglichen Einblicke in Zellmigration und Schicksalsbestimmung.

Stammzell-ähnlichen

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