Stammzell-ähnlichen Xenopus Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren In-vitro- Und In-vivo-

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, x laevis blastocoel, Dach- oder Tierkappenexplantate zu verwenden, um die molekularen Mechanismen und zellulären Prozesse, die der neuronalen Entwicklung in vitro und in vivo zugrunde liegen, zu testen. Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Entwicklungs- und Stammzellbiologie über Schicksalsakquise, Zellmigration und die zellautonomen und nicht-autonomen Eigenschaften von Nervenzellen zu beantworten. Die vorgestellten Techniken bieten einfache, kostengünstige, vielseitige und effiziente Werkzeuge zur Erforschung des grundlegenden Mechanismus des Verhaltens wichtiger neuronaler Zellen.

Diese Assays ermöglichen die Testung von neuronalen Schicksalsdeterminen für die Reprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen und die reife Generierung von neuronalen Zellbindungen, die das Screening fördern. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Techniken manuelle Geschicklichkeit erfordern. Die Idee zu diesen Methoden kam mir, als ich darüber nachdachte, das Zellseigerungsverhalten zu analysieren.

Um ein vorderes Neuralrohr von Xenopus laevis flach zu montieren, verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um einen fixierten, dehydrierten und rehydrierten Embryo in eine 60-Millimeter-Petrischale zu übertragen, die bis zum Rand mit PBT gefüllt ist. Führen Sie dann eine feine Pinzette zwischen den Augen und dem Neuralrohr auf Höhe des Sehstiels ein und lösen Sie die Augen. Führen Sie dann vorsichtig die Pinzette unterhalb des Ektoderms über das Neuralrohr hinter dem Kopf ein und ziehen Sie das Ektoderm vorsichtig ab.

Nach Durchführung der entsprechenden NC2-Hybridisierungsmarkierung wird der Embryo in eine neue, mit PBT gefüllte 60-Milliliter-Petrischale übertragen und mit einer feinen Pinzette das vordere Neuralrohr grob vom Embryo isoliert. Entfernen Sie dann vorsichtig das lose befestigte Notochord unterhalb des Neuralrohrs. Falls erforderlich, die Vesikel oticus und die restlichen Teile des Mesoderms.

Wenn alle Anhänge des Neuralrohrs durchtrennt wurden, trennen Sie das vordere Neuralrohr vom Embryo. Übertragen Sie dann das isolierte Neuralrohr in ein konisches 1,5-Milliliter-Röhrchen, das mit 50 % Glycerin und PBS gefüllt ist, um es über Nacht bei vier Grad Celsius zu behandeln. Nach einer zweiten Behandlung über Nacht in 90%igem Glycerin übertragen Sie das Neuralrohr mit einer kleinen Menge Glycerin auf einen Objektträger und verwenden Sie Wolframnadeln, um die Neuralrohre entlang der dorsalen und ventralen Mittellinien zu präparieren.

Verwenden Sie dann Verstärkungsringe, die mit einem Glasdeckglas bedeckt sind, um die beiden Seiten des Neuralrohrs mit 90% Glycerin und PBS zu befestigen. Zur Vorbereitung der Perle für die Induktion des Explantats der Tierkappe wird mit einer P200-Mikropipette ein halbes Aliquot der mit BSA behandelten Harzkügelchen in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen aufgeteilt. Ersetzen Sie dann das sterile destillierte Wasser im neuen Röhrchen durch 200 Mikroliter Medium, das das experimentelle Molekül von Interesse enthält, zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation übertragen Sie Blastula oder sehr frühe Gastrula-Embryonen in PBS mit Kalzium und Magnesium, die mit 0,2 % BSA ergänzt sind. Als nächstes kneifen Sie unter einem Stereomikroskop die Vitellinmembran mit der Seite einer Pinzette zusammen und verwenden Sie eine zweite Pinzette, um die Membran langsam von der pflanzlichen Seite des Embryos zu schälen, wobei Sie darauf achten, die tierische Seite nicht zu beschädigen. Schneide dann mit einer feinen Pinzette ein kleines Quadrat aus dem Tierstab jedes Embryos aus.

Übertragen Sie die Kappen mit einer BSA-beschichteten Pipettenspitze in einzelne Vertiefungen einer Terasaki-Multiwell-Platte in 0,5-fach modifizierter Barth-Kochsalzlösung, wobei Sie die pigmentierte Tierseite in Kontakt mit dem runden Boden der Vertiefung bringen. Wählen Sie mit einer P20-Mikropipette die dunkelsten rosa Kügelchen aus dem Behandlungsröhrchen aus und platzieren Sie eine Perle auf jeder Kappe, wobei Sie die Kügelchen mit einer Pinzette auf den Kappen zentrieren. Wenn die letzte Perle platziert ist, legen Sie die Platte auf wassergetränktes Papier und decken Sie die Platte vor der Inkubation mit einem Plastikbehälter ab.

Zur Herstellung dissoziierter und reaggregierter tierischer Kappenexplantate isolieren Sie 15 bis 30 tierische Kappen, wie gerade gezeigt. Schneiden Sie mit einer feinen Pinzette ein kleines Quadrat Gewebe aus den Tierstangen heraus. Übertragen Sie die tierischen Kappen mit den pigmentierten Seiten nach oben in eine mit Kalzium gut gefüllte Agarose-beschichtete Holtfreter-Kochsalzlösung.

Nach einigen Minuten sollte eine Disaggregation beobachtet werden. Trennen Sie die Pigmentschichten mit einer feinen Pinzette vom restlichen Gewebe. Verwenden Sie dann eine P20-Mikropipette, um das Pigment zu verwerfen.

Wenn die meisten pigmentierten Schichten entfernt wurden und die Zellen vollständig dissoziiert sind, schwenken Sie die Platte, um die Zellen zu zentrieren, und verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um so viel wie möglich vom Medium zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die Zellen nicht zu berühren. Geben Sie dann einen Milliliter Holtfreter's Kochsalzlösung mit Kalzium in die Vertiefung. Übertragen Sie die dissoziierten tierischen Kappen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen und das Pellet in 20 Mikrolitern Holtfreter-Kochsalzlösung mit Kalzium wieder zu suspendieren. Lassen Sie die Zellen drei bis sechs Stunden lang bei Raumtemperatur reaggregieren. Geben Sie dann langsam einen Milliliter 3/4 NAM hinzu, um die Explantate vorsichtig vom Boden des Röhrchens zu lösen, und verteilen Sie die Explantate mit einer Kunststoff-Transferpipette auf einzelne unbeschichtete Platten.

Um Tierkappenexplantate auf Xenopus laevis Neuralplatten zu explantieren, beschichten Sie zuerst 60 Millimeter Petrischalen mit 3% Agarose und 3/4 NAM, in die kleine Löcher gebohrt wurden. Als nächstes übertragen Sie frühe Neuralembryonen in PBS mit Kalzium und Magnesium, ergänzt mit einem 0,2%igen BSA, um die Vitellinmembran zu entfernen. Füllen Sie dann die mit Agarose beschichtete Sezierschale mit frischem 3/4 NAM und übertragen Sie die Embryonen mit der Rückenseite nach oben in die Präparierschale.

Übertragen Sie nun ein reaggregiertes Explantat mit Tierkappe auf die Sezierplatte, so dass das Explantat durch die Schwerkraft langsam in die Schale sinken kann, sobald die Pipettenspitze die NAM-Oberfläche durchbrochen hat. Verwenden Sie dann unter einem Stereomikroskop eine abgerundete Pinzette, um den Embryo an Ort und Stelle zu halten, während Sie mit einer Wolframnadel einen Schnitt in die Neuralplatte für das Explantat setzen. Schneiden Sie mit einer abgerundeten Pinzette und einem Augenbrauenmesser ein kleines Stück des reaggregierten Tierkappen-Explantats aus.

Verwenden Sie das Gewebefragment, um ein Stück Explantat für das Transplantat zu dimensionieren. Diese Abbildung zeigt X laevis und X tropicalis anteriore Neuralrohre flach montiert, wie gerade in den Stadien 30, 32 und 35 nach der Doppel-NC2-Hybridisierung der gesamten Montierung gezeigt. Wie in diesen Bildern zu sehen ist, wird die Expression von Xenopus sonic hedgehog in Zellen nachgewiesen, die mit Kügelchen in Kontakt kommen, die in konditioniertem Medium getränkt sind, das mit dem Endterminus des sonic hedgehog-Gens ergänzt wurde, aber nicht in Zellen, die mit Kügelchen in Kontakt kommen, die mit Kontrollmedium behandelt wurden.

Nach Dissoziation und Reaggregation, wie gerade gezeigt, wurden diese Explantate mit anteriorisierten tierischen Kappenzellen mit anteriorisierten tierischen Kappenzellen gemischt, die Otx2 exprimierten. Wie beobachtet, trennten sich diese Otx2-exprimierenden Zellen nicht von den nicht-Otx2-exprimierenden Zellen. Beide Zelltypen vermischten sich frei im Explantat.

Im Gegensatz dazu bildeten in Explantaten, bei denen Otx2-exprimierende Zellen mit BAR HL-2-, Otx2- und IRX3-exprimierenden Zellen gemischt wurden, die Multigen-exprimierenden Zellen kohäsive Flecken, die sich innerhalb des reaggregierten Explantats nicht gleichmäßig ausbreiteten. Bei der Transplantation in die anteriore Neuralplatte von x laevis-Embryonen, wie gerade gezeigt, zeigten gemischte Explantate, die aus Zellen bestanden, die BAR HL-2, Otx2 und IRX3 koexprimierten, gemischt mit N-terminus sonic hedgehog exprimierenden Zellen, eine indogene sonic hedgehog Expression und segregierten von den vorderen neuralen Epithelzellen. Wenn hingegen gemischte Explantate, die aus Otx2- und N-terminus-Sonic Hedgehog exprimierenden Zellen bestanden, in die x laevis Neuralplatte transplantiert wurden, exprimierten die geriebenen Zellen weder Sonic Hedgehog noch trennten sie sich von ihren Nachbarn.

Sobald die Beherrschung der Kappe des Tieres auf embryonale Neuralplatten abgeschlossen ist, kann sie je nach Anzahl der transplantierten Embryonen in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden. Es ist eine sehr robuste und sehr lohnende Technik. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, äußerst vorsichtig mit Bakterien und Pilzen zu sein.

Im Anschluss an die Transplantationsverfahren können andere Methoden wie die In-situ-Hybridisierung durchgeführt werden, um das Schicksal und das Verhalten der transplantierten Zellen zu verfolgen. Die Entwicklungsprogramme, die der Organogenose des Neuralrohrs zugrunde liegen, sind vor allem bei Wirbeltieren weitgehend konserviert. Die bei Amphibien gewonnenen Informationen haben unser Verständnis der zellulären und molekularen Prozesse, die der Entwicklung von Wirbeltieren zugrunde liegen, erweitert.