Name: Milchsammlung in der Ratte Mit Kapillarröhrchen und Schätzung der Milchfettgehalt von Creamatocrit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Lernen Sie die manuelle Milchgewinnung bei laktierenden Ratten mit Kapillarröhrchen und die Creamatocrit-Methode zur Fettgehaltsschätzung. Dieses Verfahren ermöglicht Einzelpersonen die Analyse der Milchzusammensetzung ohne spezialisierte Ausrüstung.

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Dies funktioniert, wurde durch Zuschüsse aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (RGPIN 238.382-2011) und Canadian Institutes of Health Research (MOP115076) unterstützt. Heather Paul wurde von einem Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada Postgraduierten-Stipendium und einem Alberta Innovates Health Solutions Stipendium unterstützt. Megan Hallam wurde von einem Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council Postgraduate Stipendium, ein Frederick Banting und Charles Best Kanada Graduate Scholarship und ein Kinderkrankenhaus Alberta Research Institute Trainingspreis in Genetics, Child Development und Health.

Dieses Protokoll wurde von der University of Calgary Animal Care Committee genehmigt und angepasst an den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Separate Dam von Offspring <ol><li> Trennen Sie die Staumauer aus ihren Nachwuchs für mindestens 5 Minuten vor dem Melken 12. HINWEIS: Der Damm kann bis zu 5-6 Stunden nach der Trennung 1,6,13 gemolken werden jedoch Zeiten der Trennung länger als 4 Stunden kann die Zusammensetzung der Milch 14 zu ändern. Während Trennzeit scheint nicht zu beeinflussen Milchsammelvolumen 12, ist es ratsam, dass eine konsequente Trennung der Zeit während der Studie beibehalten werden. Milchzusammensetzung kann während der Stillzeit 15 zu ändern, daher sollte versucht werden, den Tag des Milchsammel konsistent zu halten ist. Maximale Milchproduktion wird vorgeschlagen, auf Still Tag 14 12 erfolgen. </li><li> Unter Verwendung einer Wärmekammer, sicherzustellen, dass die Welpen sind in der Lage, die richtige Körper temperatu pflegenre ohne die Anwesenheit der Mutter für die Dauer des Melkvorganges. HINWEIS: In der Studie wie folgt dar, Melken wurde bei der Entwöhnung, wenn die Dämme waren etwa 22 Wochen alt, und die Nachkommen 21 Tage alt durchgeführt, daher keine Wärmekammer verwendet wurde. </li></ol> 2. Aufbau und Vorbereitung <ol><li> Sammeln Sie alle für den Melkvorgang benötigten Materialien. HINWEIS: Alle Materialien können in den Materialien und Geräte Tabelle. </li><li> Legen Sie ein Heizkissen auf der Bank, wo Melken stattfinden wird und decken Sie das Pad mit einem saugfähigen Bank unter-Pad. </li><li> Einrichten des Narkosesystem. Sicherzustellen, dass das System über ausreichend Sauerstoff und Isofluran vor Beginn. Befestigen Sie den Narkosemaske, die für die erste Narkose an der Maschine verwendet werden. Legen Sie die Maske, die für die Anästhesie Wartung der Nähe, wenn anders als die ersten Narkosemaske verwendet wird. </li><li> Befestigen Sie eine 25 G Nadel in eine 1 ml Spritze für OxytocinInjektion unter aseptischen Bedingungen. </li><li> Einschalten des Heizkissen sodass mütterlichen Körpertemperatur während des Melkvorgangs erhalten bleibt. HINWEIS: Überwachen Sie die Temperatur des Heizungsauflage, um das Kissen zu gewährleisten nicht zu heiß werden und Verbrennungen verursachen. Alternativ können Sie auch eine Wärmequelle, wie einen beheizten Operationstisch, die auf eine bestimmte Temperatur eingestellt werden kann. </li></ol> 3. Anesthetize den Dam Mit Isofluran <ol><li> Öffnen Sie den Sauerstofftank und schalten den Strom auf 1 l (1.000 cc) pro min. Schalten Sie den Fluss von Isofluran und auf 5% eingestellt. ACHTUNG: Vermeiden Sie direkte Inhalation von Narkosemittel und verhindern, dass Anhäufung von Narkosedämpfen. </li><li> Betäuben den Damm. </li><li> Schalten Sie um auf die Wartungsmaske, falls erforderlich, indem die Staumauer in Rückenlage auf dem absorbierenden Pad Bank. Anesthetization Bestätigen fehlende Pedalreflex. </li><li> Reduzieren Sie den Fluss von Isofluran auf 2-3% für Aufrechterhaltung von Narkosen. Damm während des gesamten Verfahrens kontinuierlich zu überwachen, um sicherzustellen, depression der Atmung nicht auftritt. HINWEIS: Nachdem unter Anästhesie, sollte die Augen des Damms mit einem sterilen Augen Schmiermittel, um die Augen vor dem Austrocknen oder zu verkratzen geschützt werden. </li></ol> 4. Oxytocin Injection <ol><li> Stellen Sie sicher, das Oxytocin (20 USP-Einheiten / ml) hat seine Ablaufdatum überschritten. Desinfizieren Sie die Fläschchen von Oxytocin mit einem sterilen Alkoholtupfer / Alkohol Reinigung Pad. </li><li> Unter aseptischen Bedingungen aufzustellen 2 IE (0,1 ml) von Oxytocin in die Spritze. Verwenden Sie eine neue Nadel und Spritze für jeden Damm, die gemolken wird. HINWEIS: Oxytocin Dosen reichen im Allgemeinen von Einzelinjektionen von 1 bis 5 IU 1,6,12,16. Alternativ kann eine Dosis von 4 IU / kg Körpergewicht verwendet werden 12. Eine Einzeldosis von 2 IU kann einmal wiederholt werden, wenn Schwierigkeiten Melken angetroffen wird. </li><li> Spritzen Sie die Oxytocin intraperitoneal. Führen Sie die Nadel in den unteren rechten Quadranten des Bauches mit der Nadel zeigt in Richtung des Kopfes, in einem Winkelvon 15-30 °, etwa 0,5 cm tief. </li><li> Ziehen Sie am Kolben, um Unterdruck vor der Injektion zu gewährleisten. Wenn eine Flüssigkeit (Blut, Urin, Darminhalt, etc.) in die Spritze angesaugt, entfernen Sie die Nadel und versuchen, die Injektion mit einer neuen Nadel und Spritze. Wenn keine Flüssigkeit angesaugt injizieren die Oxytocin und entsorgen Sie die Nadel und Spritze sofort in einen Behälter für biologischen. </li><li> Warten Sie ca. 5-15 min für die Oxytocin, Milch zu Enttäuschung zu stimulieren. </li></ol> 5. Herstellung von Milking Seiten <ol><li> Wählen Sie die Websites / Zitzen, von denen Milch werden nicht erhoben. Milch kann aus jeder Zitze 12 gesammelt werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Fell um die Zitzen mit den Trimmern gemolken werden, so Fell kann Schwierigkeiten bei der Probenentnahme führen durch Dochtwirkung der Milch. Seien Sie sanft - die Haut um die Zitzen ist extrem empfindlich und kann trocken sein und als solche ist anfällig für Kratzer und Risse. </li><li> Sterilisation des Zitzen iist nicht notwendig, aber optional, reinigen Sie die Zitze mit lauwarmem Wasser, nachdem das Fell entfernt. Bereiten Sie mindestens zwei Gebiete als mehr als einem Standort kann für Milchsammel erforderlich. HINWEIS: Wenn die Milch Analyse umfasst mikrobielle Profilierung kann der Zitzenbereich Sterilisation mit Jod 5 erforderlich. </li></ol> 6. Milchauffang <ol><li> Drücken Sie leicht den Boden der Zitze, manuell Austreiben der Milch für die Sammlung. HINWEIS: Wenn die Milch Analyse umfasst mikrobielle Profilierung, sollten die ersten paar Tropfen Milch verworfen werden. </li><li> Sammeln der Milchtröpfchen in ein Kapillarröhrchen, Füllen der Kapillare. Kapillaren, die größere Mengen (zB 50 ul) erleichtern den Prozess anzupassen. HINWEIS: Wenn Schwierigkeiten, eine Milch festgestellt wird, kann eine zweite Dosis von Oxytocin verabreicht werden. Es wird empfohlen, die Dosis 4 IU insgesamt nicht überschreiten. </li><li> Abgeben der Milch aus der Kapillare in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen durchBerühren des Endes des Rohres, das verwendet wurde, um die Milch aus der Zitze an die Seite des Mikrozentrifugenröhrchens zu ziehen - zu beobachten, die die Milch durch Kapillarwirkung aus dem Kapillarrohr gezogen. HINWEIS: &quot;ausblasen&quot; die Milch, die nicht in das Rohr unter Verwendung einer 18 G-Nadel in eine 1 ml Spritze befestigt gezogen wird. </li><li> Der Damm auf Anzeichen von Schmerzen oder Atemdepression kontinuierlich zu überwachen und die Strömung von Isofluran entsprechend anzupassen. </li><li> Weiterhin Milch zu sammeln, wie in diesem Abschnitt beschrieben, bis genügend Milch für die gewählte Milchanalyse gesammelt. Für das unten beschriebene creamatocrit und Proteinkonzentrationsbestimmung, sammeln 0,25 ml Milch. HINWEIS: Verwenden Sie einen anderen Melkplatz, wenn Milch letdown verlangsamt oder die gewählte Website nicht ausreichend Milch zu vertreiben. Ein Maximum von ungefähr 2,5 ml Milch pro Tier gesammelt werden 17 oder bis zu 0,5 ml pro Zitze. Die Autoren empfehlen, Gesamtzeit unter Narkose auf ca. 45-60 min begrenzt werden, or 45 min nach dem Melken. </li><li> Sammlung der Milch in einen Mikrohämatokritröhrchen für creamatocrit Messung von Frischmilchproben und abzudichten das Ende des Rohres mit Ton Versiegelung. Beschriften Sie die Mikrohämatokritröhrchen mit dem Damm-ID und die Milchprobe aufrecht zu speichern. </li><li> Beim Melken beendet ist, schalten Sie den Strom von Isofluran und Sauerstoff. Entfernen Sie die Maske von der Staumauer und weiter zu Staumauer bis wach zu überwachen. Es wird empfohlen, wenn nicht bei vollem Bewusstsein, der Damm sollte auf einem absorbierenden Pad Bank während der Erholungsphase gelegt werden, anstatt direkt auf dem Käfig Bettwäsche, die Bettwäsche aus angesaugt oder in die Augen der Mutter Verkratzen während der Wiederherstellung zu verhindern. HINWEIS: Die Staumauer nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustbeinfestliegen zu halten. </li><li> Wenn keine weitere Analysen erforderlich sind, frieren Milch bei -80 ° C. Andere haben vorgeschlagen, dass die Milch kann für bis zu 3 Stunden bei 4 ° C oder 5 Monate bei -20 ° C 18 gespeichert werden. </li></ol> 7. Creamatocrit Mess <ol><li> Schätzung der Fettgehalt in der Milch, die durch Berechnen der Milch creamatocrit (der Prozentsatz der Creme in der Milchprobe) 19. Hinweis: Messungen mit der Muttermilch haben gezeigt, dass entweder frische oder gefrorene Milch kann für eine creamatocrit Messung verwendet werden, jedoch frischer Milch ist mehr hoch korreliert (r = 0,92 im Vergleich zu r = 0,90) mit Lipidkonzentration 11. Die Verwendung von frischen oder gefrorenen Milch für creamatocrit Messungen sollten in der Studie konsistent gehalten werden, wie es aufgetaut Milch wird mit einem kleinen Rückgang der creamatocrit zugehörigen Werte 11. </li><li> Für Frischmilch, sammeln eine Probe der Milch aus der Zitze in eine Mikrohämatokritröhrchen; füllen Sie mindestens ¾ voll (ca. 15-20 ul). Alternativ ziehen frische Milch von der gesammelten Probe in die Kapillare nach dem Mischen gut. Dichten Sie das Ende mit Lehm Dichtstoff. </li><li> Legen Sie die Kapillare in die Hämatokrit-Spinner, mit derEndverschluß nach außen gerichteten, wodurch die Zentrifuge ausgeglichen ist. </li><li> Beginnen Sie den Hämatokrit Spin (120 sec bei 13.700 xg). HINWEIS: Spin Zeit oder Geschwindigkeit kann je nach dem Modell der Zentrifuge verwendet, ändern. </li><li> Nehmen Sie die Röhre aus der Zentrifuge nach dem Spin abgeschlossen ist, und führen Sie die Messungen für die Berechnung der creamatocrit. Trennung der Probe zu beobachten in eine Creme-Schicht und einer klaren Schicht. </li><li> Messen und aufzeichnen, die Gesamtlänge des Fluids in dem Rohr und der Länge der Fett (Creme) -Schicht mit Bremssätteln oder ein Lineal. HINWEIS: Die creamatocrit ist als der Prozentsatz der Cremeschicht innerhalb der Milchprobe 19, berechnet als (Länge der Creme-Schicht / Gesamtlänge von Milchsäule) x 100 (1A). Berechnen Fettkonzentration und Energiewerte aus dem creamatocrit Messung wie folgt: Fat-Konzentration (g / l) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (1B) 19; Energiewert (kcAl / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (1C) 19. </li></ol> 8. Proteinkonzentationsbestimmung <ol><li> Verwendung von Rinderserumalbumin als Proteinstandard zur Bestimmung des Gesamt- Milchproteinkonzentration unter Verwendung eines Standard-Protein-Assay, wie eine Proteinbestimmung nach Lowry 6. HINWEIS: Die Verdünnung der Milch kann notwendig sein, für die Milchproteinmessungen innerhalb der Standardkurve des Assays fallen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen. Alle Tierversuche wurden gemäß CCAC genehmigten Protokollen durchgeführt.

Die Untersuchungen zu den Bestandteilen der Muttermilch haben mit dem zunehmenden Interesse an der Forschung zur Entwicklung des frühen Lebens zugenommen. Als einzige Nahrungsquelle während der Neugeborenenperiode sind die bioaktiven Verbindungen in der Milch für ein ideales Wachstum und eine ideale Entwicklung unerlässlich, insbesondere im Zusammenhang mit der Darm- und Immungesundheit3. Bei dem hier vorgestellten Verfahren handelt es sich um ein einfaches, nicht-invasives Verfahren zur Entnahme von Milch von...

Milch ist die einzige Nahrungsquelle für neugeborene Säugetiere, die Bereitstellung von Energie und Nährstoffe für das Kinderwachstum und Entwicklung 1,2. Während Milch besteht hauptsächlich aus Zellen, Lipide und Protein-1, es enthält auch eine Vielzahl von bioaktiven Verbindungen, die frühen Lebens Entwicklung der Nachkommenschaft einschließlich Enzyme, Kohlenhydrate, Hormone, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Exosomen, Mikrovesikel und kleinen RNAs wie zu modulieren wie microRNA 1,2. Die grundlegende Rolle der Muttermilch in der Gründung der Nachkommen Immun- und Darmgesundheit 3, verbunden mit dem Nachweis, dass gestillte Kinder sind weniger anfällig für Krankheiten 2, unterstreicht die Bedeutung der Identifizierung der Milchbestandteilen mit Krankheitsprozesse in der frühen Leben verbunden und die molekularen Mechanismen beteiligt in ihren Handlungen. Die Entwicklungs Ratte ist ein beliebtes Modell für die Untersuchung der Wirkung von verschiedenen Ernährungs, physiologischen und chemischen Eingriffen an frühen-life Entwicklung 4. Die Analyse von Rattenmilch kann daher bieten neue Einblicke in mütterlichen und Nachkommen Gesundheit. Aktuelle wissenschaftliche Fortschritte bieten jetzt die Verbesserung der Chancen für eine eingehende Untersuchung der Auswirkungen von bestimmten Milchbestandteilen auf Gesundheit und Krankheit. Beispielsweise wurde die Sequenzierung von Milchbakterienprofile ihre Rolle in der frühen Darmbesiedlung des Säuglings gut 5 erläutert, Massenspektrometrieanalyse Milch-Oligosaccharide haben Einblick in die Veränderung der Milch Oligosaccharid-Profile über die Ernährung der Mutter 6 und tiefe Sequenzierung MikroRNA in sezerniert bereitgestellt die Fettkügelchen der Muttermilch unterstreicht möglichen Rollen in Gen-Transkription, den Stoffwechsel und die Immunfunktion 7. Rattenmodelle stellen eine der im mütterlichen Studien 8,9 verwendet beliebtesten Modellorganismen. Ein Vorteil ist die kurze Schwangerschaft und Stillzeiten von nur approximately 21 Tage je; Daher ist die Gesamtzeit vom Beginn der Schwangerschaft bis Laktation für eine kurze Zeitdauer, in der wichtige Daten erzeugt werden. Die größere Größe von Ratten im Vergleich zu Mäusen, im Zusammenhang mit der Milchsammlung kann einen signifikanten Vorteil in Bezug auf Milchvolumen und Leichtigkeit der Milchsammlung bereitzustellen; Milchproduktion in der Maus, zum Beispiel, scheint abhängig von Gesamtkörpergewicht mit schwereren Mäuse produzieren mehr Milch 10 zu sein. Hier wird eine allgemeine Beschreibung für die manuelle Sammlung von Milch von säugenden Ratten wird. Dieses Protokoll erfordert eine Minimalausstattung ist nicht-invasiv, billig und kann verwendet werden, um eine ausreichende Milchmengen zur weiteren Downstream-Analysen zu sammeln. In Kürze wird der Damm mit Isofluran, Milch Reinfall wird durch Oxytocin stimuliert und Milch wird über manuelle Ausdruck der Milch in Kapillarröhrchen gesammelt. Schließlich wird, wie zwei Hauptkomponenten von Milchfett und Proteine ​​sind, eine kurze description der Schätzung Milchfettgehalt unter Verwendung creamatocrit Messungen 11 und Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration unter Verwendung eines Standard-Protein-Assay wird vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>Equipment - Melken</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritzen</td><td>BD-Canada</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>25 G Nadeln</td><td>BD-Canada</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>18 G Nadeln</td><td>BD-Canada</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>50 μmu; l Mikrospender Kapillarröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-169D</td><td></td></tr><tr><td>Oxytocin (20 USP Einheiten/ml)</td><td>Bimeda-MTC</td><td>1OXY015</td><td></td></tr><tr><td>PPC Vet Isofluran Inhalationsanästhetikum, 250 ml</td><td>Fresenius Kabi</td><td>M60302</td><td>Wird auf Bestellung eines Tierarztes</td></tr> verwendet <tr><td>Steriles Alkoholvorbereitungspad</td><td>Dukal</td><td>853</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent Bench Pad</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td></td></tr><tr><td>Maxi-Therm Hyper/Hypothermie-Decke</td><td>Cincinnati Sub-Zero</td><td>274</td><td></td></tr><tr><td>Nagetier-Anästhesiegerät mit Verdampfer</td><td>Benson Medical Industries Inc.</td><td></td><td>Abhängig von den individuellen Laboranforderungen</td></tr><tr><td>: Tiermasken,</td><td>Benson Medical Industries, Inc.</td><td>50100/50102</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>ChroMini Professional Trimmer</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment - Creamatocrit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>StatSpin SafeCrit Mikrohämatokritröhrchen aus Kunststoff (unbehandelt)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-274-914</td><td></td></tr><tr><td>Critoseal Kapillarrohr-Dichtstoffwanne</td><td>VWR</td><td>470161-478</td><td></td></tr><tr><td>StatSpin CritSpin Mikrohämatokrit-Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td>X00-004999-001</td><td></td></tr></tbody></table>

milchsammlung in der ratte mit kapillarröhrchen und schätzung der milchfettgehalt von creamatocrit

Milk Collection in the Rat Using Capillary Tubes and Estimation of Milk Fat Content by Creamatocrit

Milch liefert als einzige Nahrungsquelle für das neugeborene Säugetier die notwendigen Nährstoffe und Energie für das Wachstum und die Entwicklung der Nachkommen. Es enthält auch eine große Anzahl von bioaktiven Verbindungen, die die Entwicklung des Neugeborenen stark beeinflussen. Die Analyse der Milchbestandteile wird dazu beitragen, Schlüsselfaktoren aufzuklären, die den Stoffwechsel und die Gesundheit der Mutter mit dem Wachstum und der Entwicklung der Nachkommen verbinden. Die Laborratte stellt einen beliebten Modellorganismus für mütterliche Studien dar, und Rattenmilch kann verwendet werden, um die Wirkung verschiedener mütterlicher physiologischer, ernährungsphysiologischer und pharmakologischer Eingriffe auf Milchbestandteile zu untersuchen, die sich dann auf die Gesundheit der Nachkommen auswirken können. Hier wird eine einfache Methode zur manuellen Entnahme von Milch von der laktierenden Ratte beschrieben, die von einem einzigen Untersucher durchgeführt werden kann, keine spezielle Vakuum- oder Absaugausrüstung erfordert und ausreichend Milch für die nachfolgende Analyse liefert. Ein Verfahren zur Schätzung des Fettgehalts von Milch durch Messung des Sahneanteils in der Milchprobe, bekannt als Creamatocrit, wird ebenfalls vorgestellt. Diese Methoden können letztendlich verwendet werden, um den Einblick in die Gesundheit von Mutter und Kind zu verbessern und mütterliche Faktoren aufzuklären, die am richtigen Wachstum und der Entwicklung der Nachkommen beteiligt sind.

Milch wurde wie bei der Entwöhnung von Wistar Dämme beschrieben gesammelt (ca. 22 Wochen alt, mit einem Gewicht von 350 bis 400 g), das ein Steuerelement, protein verbraucht (AIN-93G-5, n =) (40% Casein wt / wt, n = 5) oder Hoch präbiotische Ballaststoffe (21,6% Gewicht / Gewicht, 1: 1-Verhältnis von Oligofructose und Inulin, n = 4) Ernährung während der Schwangerschaft und Stillzeit. Die Oxytocin-Dosis betrug 2 IU. Milch wurde gesammelt unter Verwendung von Kapillaren und einem Rohr wurde mit einem Hämatokrit Spinner c...

Milch ist eine primäre Nahrungsquelle für das Neugeborene. Die Analyse von Milchbestandteilen kann Aufschluss über mütterliche Faktoren geben, die sich auf die Gesundheit der Nachkommen auswirken. Dieses Protokoll beschreibt eine manuelle Methode zur Entnahme von Milchproben von der laktierenden Ratte, die dann für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden können.

Milchsammlung in der Ratte Mit Kapillarröhrchen und Schätzung der Milchfettgehalt von Creamatocrit

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die manuelle Sammlung von Milch von einer laktierenden Ratte zur laboranalytischen Untersuchung der Milchzusammensetzung zu beschreiben. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Gesundheit von Mutter und Kind zu beantworten, beispielsweise, wie sich die mütterliche Ernährung auf die Milchzusammensetzung auswirken kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie von einer einzelnen Versuchsperson ohne spezielle Vakuum- oder Sauggeräte durchgeführt werden kann.Als Erstes trennen Sie die Mutter von ihrem Nachwuchs für mindestens fünf Minuten vor der Melkprozedur. Sammeln Sie anschließend alle Materialien, die für die Melkprozedur benötigt werden, wie hier gezeigt. Legen Sie dann eine saugfähige Unterlage auf einen beheizten Operationstisch oder verwenden Sie eine separate Heizauflage, um Wärmeverluste der Mutter während der Melkprozedur zu verhindern.Als Nächstes überprüfen Sie das Anästhesiesystem, um sicherzustellen, dass ausreichend Sauerstoff und Iso-Fluoran vor dem Eingriff vorhanden sind. Anschließend befestigen Sie die Maske, die für die initiale Anästhesieinduktion verwendet wird, am Gerät und legen die Maske für die Erhaltungsanästhesie in unmittelbarer Nähe bereit. Öffnen Sie den Sauerstofftank und stellen Sie den Fluss auf einen Liter pro Minute ein.Schalten Sie dann den Fluss von Isofluran ein und stellen Sie ihn auf 5 % ein. Sobald die Betäubung eingetreten ist, wechseln Sie die Dame zur Wartungsmaske. Überprüfen Sie einen ausreichenden Betäubungsgrad durch Kontrolle des Fehlens eines Fußreflexes. Anschließend bringen Sie die Dame in Rückenlage auf die saugfähige Unterlage.Verringern Sie den Fluss von Isofluran auf zwei bis 3 %. Überwachen Sie die Gebärmutter während des gesamten Verfahrens kontinuierlich und passen Sie den Isofluranfluss bei Bedarf an, um Schmerzen und Atemdepression zu vermeiden. Des Weiteren desinfizieren Sie mit einem sterilen Alkoholtupfer oder Reinigungspad ein Fläschchen mit Oxytocin; verwenden Sie dazu eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel und ziehen Sie 0,1 Milliliter Oxytocin auf. Stechen Sie anschließend die Nadel in das untere rechte Quadrant des Abdomens der Gebärmutter, wobei die Nadel in einem Winkel von 15 bis 30 Grad in Richtung des Kopfes zeigt und etwa 0,5 Zentimeter tief eindringt.Ziehen Sie den Kolben zurück, um vor der Injektion einen Unterdruck sicherzustellen. Wenn keine Flüssigkeit angesaugt wird, injizieren Sie das Oxytocin und entsorgen Sie die Nadel und den Spritzenkolben unverzüglich in einem Bioabfallbehälter. Warten Sie etwa fünf bis 15 Minuten, bis das Oxytocin die Milchbildung anregt.Lassen Sie in dieser Zeit die Zitzen herunter, aus denen die Milch gesammelt werden soll. Verwenden Sie einen Trimmer, um vorsichtig das Fell um die ausgewählten Zitzen zu entfernen, da das Fell die Probenentnahme erschweren könnte. Reinigen Sie anschließend die Zitzen mit lauwarmem Wasser.Bereiten Sie mindestens zwei Stellen vor, da möglicherweise mehr als eine Stelle für die Milchentnahme erforderlich ist. Sobald die Milch abgegangen ist, drücken Sie sanft die Basis der Zitze, um die Milch manuell auszupressen. Zum Sammeln werden die Milchtropfen in ein 50-Mikroliter-Kapillarrohr aufgefangen.Wenn die Kapillare voll ist, geben Sie die Milch aus der Kapillare in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen ab, indem Sie das Ende der Kapillare, das zum Absaugen der Milch von der Zitze verwendet wurde, an die Wand des Mikrozentrifugenröhrchens anlegen. Verwenden Sie dann eine mit einer Ein-Milliliter-Spritze verbundene 18-Gauge-Nadel, um verbliebene Milchreste, die nicht in die Kapillare aufgenommen wurden, herauszublasen. Wiederholen Sie die Milchentnahme und übertragen Sie die Milch in das Mikrozentrifugenröhrchen, bis eine ausreichende Menge an Milch gesammelt wurde.Begrenzen Sie für die gewählte Analyse die Gesamtzeit, in der das Tier sich unter Narkose befindet, auf weniger als eine Stunde. Sobald die Milchgewinnung abgeschlossen ist, schalten Sie den Fluss von Isofluran und Sauerstoff ab und entfernen Sie die Maske von dem Tier. Überwachen Sie das Tier weiterhin, bis es ausreichend bei Bewusstsein ist, um die Brustlage aufrechtzuerhalten.Falls keine weiteren Analysen erforderlich sind, lagern Sie die Milch bei minus 80 Grad. Zum Vorbereiten der CCR-Messung pipettieren Sie 15 bis 20 Mikroliter Milch direkt aus der Tet-Flasche in ein Mikro-Hämatokritrohr. Verschließen Sie anschließend das Ende des Rohrs mit einem Tongrund. Platzieren Sie das Kapillarrohr in den Hämatokrit-Zentrifugen, wobei die Versiegelungsnut nach außen zeigen muss, und stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge ausbalanciert ist. Zentrifugieren Sie die Probe anschließend zwei Minuten lang mit 13.700 × g. Sobald die Zentrifugation beendet ist, nehmen Sie das Rohr aus der Zentrifuge heraus.Beobachten Sie die Probentrennung in eine Rahmschicht und eine klare Schicht. Messen und notieren Sie mithilfe eines Lineals oder eines Messschiebers die Gesamtlänge der Flüssigkeit im Reagenzglas sowie die Länge der Fett- oder Rahmschicht. Verwenden Sie diese Angaben, um den CCR gemäß der begleitenden Textanleitung zu berechnen, um festzustellen, wie sich die Ernährung während Schwangerschaft und Stillzeit auf die Milchzusammensetzung auswirkt.Milchproben wurden bei der Entwöhnung von Worcester-Müttertieren gesammelt, die entweder eine proteinreiche, eine präbiotisch faserreiche oder eine kontrollierte Diät erhielten. Die Milch der Müttertiere, die die präbiotisch faserreiche Diät erhielten, wies den numerisch höchsten C-Hämatokrit, die höchste Bad-Konzentration und den höchsten Energiegehalt auf. Diese Unterschiede waren jedoch bezüglich des Proteingehalts nicht statistisch signifikant.Jedoch wies die Milch, die von den Müttern auf der proteinreichen Diät gesammelt wurde, die höchste Protein­konzentration auf. Auch hier war dieser Unterschied jedoch nicht statistisch signifikant. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als einer Stunde ab dem Zeitpunkt der Anästhetisierung der Mutter durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den Damm kontinuierlich zu überwachen, um sicherzustellen, dass es unter der Anästhesie nach diesem Eingriff nicht zu einer Depression der Atmung kommt. Andere Methoden wie die Massenspektrometrie können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Bestimmung der Oligosaccharidzusammensetzung der Milch. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die manuelle Sammlung von Milch von einer laktierenden Ratte durchgeführt wird.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Milchsammlung in der Ratte Mit Kapillarröhrchen und Schätzung der Milchfettgehalt von Creamatocrit

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