Quantifizieren Fisch Schwimmverhalten in Reaktion auf akute Exposition von wässrigen Kupfer Form von computergestützten Video und digitale Bildanalyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu zeigen, wie die Verhaltensreaktionen von Weißen Stören auf subletale Exposition gegenüber wässrigem Kupfer quantifiziert werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Ökotoxikologie zu beantworten, z. B. wie sich die subletale Exposition gegenüber Schadstoffen auf das Schwimmverhalten von Fischen auswirkt. Diese Methode kann wichtige Informationen für den Schutz des Weißen Störs liefern.

Es kann auch problemlos auf andere Fischarten, Amphibien und Wirbellose angewendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Reaktion hochempfindlich ist, einen frühen Hinweis auf die Toxizität liefert und für das Überleben des Organismus relevant ist. Anfangs kann diese Methode eine Herausforderung darstellen, wenn die Person mit der Durchführung von Verhaltensmessungen nicht vertraut ist.

Das Protokoll wird von meiner Co-Autorin Holly Puglis demonstriert. Bereiten Sie zunächst zwei Liter wässriges Kupfer-Zwei-Sulfat-Pentahydrat in Reagenzqualität vor. Äquilibrieren Sie anschließend das Verdünnungssystem und die Expositionstanks.

Legen Sie den Ansaugschlauch aus dem automatischen Spritzenspender in den Stammkolben der Lösung. Stellen Sie dann das automatische Pumpenspitzenvolumen auf einen Milliliter ein und schalten Sie den Verdünner ein. Das System führt eine 50%ige Verdünnungsreihe von fünf Konzentrationen und eine Kontrolle durch.

Über einen Vier-Wege-Splitter werden diese Lösungen in die vier replizierten Belichtungskammern abgegeben. Schalten Sie dann die Pumpe für den Kühler ein, um das Wasserbad auf 15 Grad Celsius zu halten. Stellen Sie nun mit dem automatischen Timer des Verdünners den Zyklus alle 30 Minuten ein.

Der Wasserstand in den Tanks wird durch einen Standrohrablauf aufrechterhalten. Bereiten Sie die Belichtungskammern vor, indem Sie ein vier Zentimeter langes Loch in die Seite setzen und das Loch mit einem 30-Mikron-Edelstahlnetz abdecken. Achten Sie darauf, Expositionskammern zu wählen, die mindestens einen Liter Wasser pro 10 Gramm Fisch fassen.

Zum Beispiel wiegt ein 89 Tage alter weißer Stör etwa 373 Milligramm und kann somit in einer 28 Zentimeter mal 13 Komma fünf Zentimeter mal 25 Zentimeter großen quadratischen Kammer getestet werden. Zu Beginn, in der Mitte und am Ende eines Experiments sind 24 Milliliter große Teilproben der Testlösung für die chemische Analyse zu entnehmen. Verwenden Sie Sipper-Strohhalme, die an Plastikspritzen befestigt sind.

Ersetzen Sie den Sipper-Strohhalm durch einen Nullkomma-Vier-Fünf-Mikron-Polyethersulfonfilter und geben Sie vier Milliliter Testwasser durch den Filter ab. Entsorgen Sie dieses Wasser. Filtrieren Sie dann die restlichen 20 Milliliter Wasser in eine mit Säure gereinigte Polyethylenflasche.

Die Probe wird mit 16 molaren Salpetersäure auf 1 Vol.-% angesäuert. Diese Proben können dann bis zu drei Monate gelagert werden. Sobald die Testexpositionen bestätigt sind, werden in jeder Wiederholungstestkammer drei Störe für etwa 172 Milligramm Fisch pro Literkammer gehalten.

Sammeln Sie den Stör mit einem nicht scheuernden Netz und geben Sie ihn in einen kleinen Eimer. Insgesamt werden 144 Fische benötigt, um Daten von sechs Testlösungen zu sammeln. Füttern Sie die Fische während der 96-stündigen Exposition nicht.

Konsistente tägliche Beobachtungen müssen durchgeführt werden, um die Mortalität und abnormales Verhalten zu bewerten. Der Morgen ist die beste Tageszeit dafür, und im Idealfall ist der Beobachter blind für die Testbedingungen. Gleichgewichtsverlust ist definiert als die Unfähigkeit von Fischen, eine aufrechte Position in der Wassersäule zu halten.

Immobilität ist definiert als die Unfähigkeit von Fischen, sich zu bewegen oder zu schwimmen, es sei denn, sie werden angestoßen. Notieren Sie auch alle anderen Anomalien wie Lethargie, Hyperaktivität, Zunahme oder Abnahme der Atmung, Farbveränderungen, Zittern, Krämpfe, aufgeblähte Bauchmuskeln, Position in der Wassersäule und andere ungewöhnliche Schwimmmuster. Tote Fische sollten immer sofort entfernt werden.

Messen Sie jeden Tag auch den Gehalt an gelöstem Sauerstoff mit einem Handmessgerät aus zwei Wasserproben. Erstellen Sie am Ende der 96-stündigen Exposition Videos zur Analyse des Schwimmverhaltens. Positionieren Sie die Testarena in einem Expositionsbecken.

Achten Sie darauf, eine Testarena auszuwählen, die groß genug ist, damit die Fische frei schwimmen können. Stellen Sie direkt über jeder Testarena eine tragbare Videokamera auf einem Stativ auf. Wählen Sie nun aus den behandelten Fischen nach dem Zufallsprinzip bis zu drei Überlebende aus.

Bringen Sie drei mit einem kleinen Maschennetz in die Testarena. Lassen Sie den Fisch ca. 30 Minuten lang in der Arena akklimatisieren. Während sich der Fisch akklimatisiert, fokussieren Sie das Bild, minimieren Sie die Blendverzerrungen durch bewegtes Wasser und maximieren Sie den Kontrast des Fisches zum Hintergrund, indem Sie die Ansicht so anpassen, dass der Fisch nicht verdeckt wird.

Sobald sich der Fisch akklimatisiert hat, starten Sie die Aufnahme und sammeln Sie zwei Minuten Videodaten. Nachdem Sie das Video aufgenommen haben, euthanasieren Sie den Fisch und entsorgen Sie ihn. Nachdem Sie die Videodateien in das für die digitale Analysesoftware erforderliche Format konvertiert haben, öffnen Sie die Tracking-Software und wählen Sie auf dem Hauptbildschirm unter der Option Neues Experiment erstellen die Option Neues Standardexperiment aus.

Füllen Sie die Eingabeaufforderungen aus und drücken Sie auf OK. Gehen Sie dann unter "Einrichten" zur Option "Experimenteinstellungen" und wählen Sie unter "Videoquelle" die Option "Videodatei" aus. Legen Sie die Anzahl der Arenen auf eins fest.

Legen Sie die Anzahl der Probanden pro Arena auf drei fest. Wählen Sie als Nächstes unter Verfolgte Merkmale die Option Mittelpunkterkennung aus, und wählen Sie die gewünschten Einheiten aus. Wählen Sie nun unter "Einrichten" die Option "Testliste" aus und klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf "Videos hinzufügen".

Wählen Sie im Dialogfeld die alphabetische Reihenfolge. Klicken Sie auf Durchsuchen. Navigieren Sie zu dem Ordner, in dem sich die Videos befinden, markieren Sie die entsprechenden Dateien und klicken Sie auf Öffnen.

Nachdem Sie die Videodateien ausgewählt haben, fahren Sie mit der Definition des Umfangs des Experiments in der Software fort. Klicken Sie zunächst oben auf dem Bildschirm auf Variable hinzufügen und geben Sie die Konzentration in das Beschriftungsfeld ein. Geben Sie die Kupferkonzentration in Mikrogramm pro Liter in das Beschreibungsfeld ein.

Wählen Sie als Nächstes numerisch aus der Dropdown-Liste für Typ aus. Klicken Sie auf das Feld für vordefinierte Werte und wählen Sie die Option Individuelle Werte definieren aus dem Dialogfeld. Geben Sie die für das Experiment verwendeten Konzentrationen ein, indem Sie zwischen den einzelnen Zahlenadditionen auf "Hinzufügen" klicken.

Deaktivieren Sie dann die Option Andere Werte zulassen und klicken Sie auf OK. Wählen Sie Testversion aus dem Dropdown-Menü im Feld für den Geltungsbereich aus. Geben Sie die entsprechende Konzentration für jeden Versuch in die dafür vorgesehenen Felder ein.

Klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf Variable hinzufügen. Geben Sie replicate in das Beschriftungsfeld ein. Geben Sie die Replikationsnummer in das Beschreibungsfeld ein.

Wählen Sie numerisch aus der Dropdown-Liste für den Typ aus. Klicken Sie anschließend auf das Feld für vordefinierte Werte und wählen Sie die Option Individuelle Werte definieren aus dem Dialogfeld. Geben Sie eins, zwei, drei und vier ein, und deaktivieren Sie die Option Andere Werte zulassen.

Klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie nun die Testoption aus dem Dropdown-Menü im Bereichsfeld aus. Geben Sie für jede Studie die entsprechende Replikationsnummer ein.

Die nächste Aufgabe besteht darin, die Arenaräume einzurichten. Beginnen Sie mit der Auswahl der Arena-Einstellungen auf der Registerkarte "Setup" und benennen Sie die erste Einstellung als Testeinstellung. Wählen Sie im Dialogfeld die Option Hintergrundbild abrufen und klicken Sie auf Durchsuchen.

Suchen Sie die Videodatei für die erste Testversion und klicken Sie auf Öffnen. Nachdem das Video angezeigt wird, klicken Sie im Dialogfeld für das Hintergrundbild auf Greifen. Klicken Sie anschließend auf das weiße Kreissymbol am oberen Bildschirmrand unter den Arena-Einstellungen und bearbeiten Sie den Kreis, der den Schwimmbereich zu umgeben scheint.

Klicken Sie dann auf das Symbol für die Kalibrierungsskala unter den Arena-Einstellungen. Verwenden Sie eine Klick-Halten-Ziehen-Bewegung, um den Arenabereich auszuwählen. Geben Sie nun unter dem Feld für die reale Entfernung in der Kalibrierungsentfernung 10 Komma fünf ein.

Klicken Sie dann auf OK. Stellen Sie bei Bedarf die Kalibrierlinie so ein, dass sie den gesamten Durchmesser der kreisförmigen Arena überspannt. Klicken Sie im Feld für die Arena-Einstellungen auf die Option Arena-Einstellungen validieren und beheben Sie alle Probleme in den Einstellungen, die nicht validiert wurden.

Wiederholen Sie nun diesen Vorgang, bis alle Arenen für jede Prüfung definiert sind. Stellen Sie als Nächstes die Parameter für die Fischerkennung ein. Wählen Sie zunächst die Erkennungseinstellungen unter der Option "Einrichten" in der Symbolleiste zum Erkunden von Experimenten auf der linken Seite des Bildschirms aus.

Wählen Sie dann die Option Dynamische Subtraktion aus dem Dropdown-Menü unter Methode im Dialogfeld Erkennungseinstellungen eins. Wählen Sie außerdem für jedes Motiv unter Motividentifikation im Dialogfeld eine Füllfarbe aus. Wählen Sie als Nächstes Video auswählen und suchen Sie das Video für die erste Testversion.

Füllen Sie in den Erkennungseinstellungen einen Dialog das Feld für die Abtastrate unter Video mit fünf Komma neun neun vier eins aus. Klicken Sie im selben Feld unter Erkennung auf Einstellungen für die Option Referenzbild. Klicken Sie dann auf die Option C lernen beginnen im Dialogfeld für das Referenzbild.

Sobald das Bild im Dialogfeld für das Referenzbild ohne Tiere angezeigt wird, klicken Sie unter den Aufnahmeeinstellungen im Dialogfeld auf Dynamisches Referenzbild verwenden und schließen Sie dieses Dialogfeld. Wählen Sie nun dunkler aus dem Dropdown-Menü für das Motiv befindet sich in den Erkennungseinstellungen eins. Für den Dunkelkontrast bei der Erkennung setzen Sie die kleinere Zahl auf 33 und die größere Zahl auf 153.

Klicken Sie dann unten rechts auf Änderungen speichern. Vergewissern Sie sich nun, dass diese Software Tiere und nicht nur Schatten oder Schmutz erfolgreich verfolgt. Klicken Sie im Dialogfeld zur Wiedergabesteuerung auf die Schaltfläche "Wiedergabe" und passen Sie die Zahlen für den dunklen Kontrast nach Bedarf an.

Achten Sie darauf, alle vorgenommenen Anpassungen zu speichern. Die Software ist nun so eingestellt, dass sie Daten aus dem Video sammelt, so dass die nächste Aufgabe darin besteht, die Fische in jedem Versuch zu verfolgen. Wählen Sie zunächst unter der Setup-Option in der Symbolleiste des Experiment-Explorers auf der linken Seite des Bildschirms die Option Erfassung.

Klicken Sie anschließend im Dialogfeld "Akquisitionseinstellungen" auf "Nächste geplante Testversion verfolgen" und vergewissern Sie sich, dass die richtigen Test-, Video- und Arena-Einstellungen unter den Einstellungen im Dialogfeld "Akquisitionseinstellungen" angezeigt werden. Aktivieren Sie dann die Option "Erkennung bestimmt Geschwindigkeit" im Dialogfeld für die Erfassungssteuerung. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem grünen Kreis, der von einem weißen Quadrat umschlossen ist, um den Erfassungsprozess zu starten.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Versuche nachverfolgt wurden. Jetzt können die verfolgten Objekte, die die Fische sind, analysiert werden. Klicken Sie zunächst unter der Analyseoption in der Symbolleiste des Experiment-Explorers auf der linken Seite des Bildschirms auf Datenprofile.

Wählen Sie dann unter der Verschachtelungsoption in der Komponentensymbolleiste die Option Zeit aus. Passen Sie unter der Einstellung "Zeitintervall verfolgen" im Zeitdialogfeld den Wert auf zwei Minuten an und klicken Sie auf "OK". Ziehen Sie dann den Nistkasten zwischen dem Startfeld und dem Ergebnisfeld in den Bereich Datenprofile auf der rechten Seite des Bildschirms.

Klicken Sie in der Symbolleiste des Experiment-Explorers auf der linken Seite des Bildschirms unter der Analyseoption auf Analyseprofil. Klicken Sie dann in der Symbolleiste für abhängige Variablen unter der Überschrift Entfernung und Zeit auf Geschwindigkeit. Klicken Sie auf Hinzufügen, und klicken Sie in der Symbolleiste für abhängige Variablen unter der Überschrift "Entfernung" und "Zeit" auf "Entfernung verschoben".

Klicken Sie dann im Dialogfeld "Entfernung verschoben" auf "Hinzufügen" und klicken Sie in der Symbolleiste für abhängige Variablen unter der Überschrift "Individuelles Verhalten" auf "Bewegung". Schauen Sie im Dialogfeld "Bewegung" unter die Überschrift "Ausreißerfilter" und stellen Sie das Mittelungsintervall auf eins ein. Stellen Sie dann unter der Überschrift Schwellenwert die Startgeschwindigkeit auf zwei Komma Null Null und die Stoppgeschwindigkeit auf eins Komma sieben fünf ein.

Aktivieren Sie unter der Überschrift "Statistik berechnen für" die beiden Kontrollkästchen für "Verschieben" und "Nicht verschieben". Klicken Sie dann auf Hinzufügen, und klicken Sie unter der Option Ergebnisse in der Symbolleiste des Experiment-Explorers auf der linken Seite des Bildschirms auf Analyseausgabe. Klicken Sie nun auf Berechnen.

Nachdem die abhängigen Variablen berechnet wurden, klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf Exportieren. Wählen Sie im Dialogfeld für die Ausgabe der Exportanalyse den Zielordner aus, und wählen Sie Excel aus dem Dropdown-Menü Dateityp aus. Klicken Sie dann auf OK.

Klicken Sie abschließend auf der Registerkarte Datei oben auf dem Bildschirm auf Experiment speichern. Schließen Sie die digitale Tracking-Software. Importieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulationsdatei und analysieren Sie sie mit einem kommerziellen Softwarepaket für statistische Analysen.

Nach nur 72 Stunden Exposition gegenüber verschiedenen Kupferkonzentrationen zeigten Störe zwei Tage nach dem Schlüpfen viele beobachtbare Anomalien. Es gab einen offensichtlichen Einfluss auf das Schwimmverhalten. Videodaten halfen bei der Definition dieser Verhaltensstörung.

In weiteren Tests erwies sich der Stör 30 Tage nach dem Schlüpfen als empfindlich gegenüber einer 96-stündigen Kupferexposition. Die Schwimmgeschwindigkeit, die Zeit, die man in Bewegung verbrachte, und die zurückgelegte Strecke nahmen mit zunehmender Kupferkonzentration signifikant ab. Auch die Schwimmwege wurden mit zunehmender Kupferkonzentration reduziert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Verhalten in einem Toxizitätstest quantifiziert. Diese Technik kann Umweltmanagern die Möglichkeit geben, verhaltensdefinierte Kriterien zu verwenden, um Umweltschäden zu dokumentieren und die Wiederherstellung zu leiten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, bei der Aufzeichnung von Verhaltensbeobachtungen konsequent zu sein.

Andere Verhaltensweisen, wie z.B. Fressen und Aggression, können durch dieses Verfahren quantifiziert werden, um zusätzliche Fragen zu den langfristigen Auswirkungen der Schadstoffbelastung auf das Überleben zu beantworten.