Name: Quantifizieren Fisch Schwimmverhalten in Reaktion auf akute Exposition von wässrigen Kupfer Form von computergestützten Video und digitale Bildanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 21 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie das Schwimmverhalten von Weißstören bei subletaler Kupferexposition quantitativ erfassen. Diese computergestützte Videoanalyse liefert objektive Daten für ökotoxikologische Studien und Artenschutz.

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Wir danken den Mitarbeitern der Abteilung für Ökologie, Toxikologie und Umweltchemie des U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center für technische und analytische Unterstützung. Die Finanzierung wurde teilweise von Teck American Incorporated im Rahmen einer Vereinbarung mit der US-Umweltschutzbehörde (USEPA) Region 10 zur Verfügung gestellt, wobei die USEPA dem US Geological Survey (USGS) über den Central Hazmat Fund des Innenministeriums zur Verfügung stellte.

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Verhaltensänderungen aufgrund der Exposition gegen Verunreinigung häufig als Endpunkt für die subletale Toxizität verwendet, kann aber schwierig sein, zu messen. Im Allgemeinen werden Verhalten Antworten durch visuelle Beobachtungen und manuelle Datenanalyse gemessen, die sehr viel Zeit erfordert, zu verarbeiten. Allerdings Technologie mit fortschreitendem haben Methoden zur Quantifizierung von Schwimmaktivität konzentrierte sich auf mit Videografie 18 und Bewegungsanalyse oder digitale Tracking - Software , die die Verarbeitung und Analyse Zeit reduziert. Bei der Analyse der Video erfassten Daten, Quantifizierung Schwimmen Variablen manuell sehr zeitaufwendig gewesen wäre, so die Verwendung von Videodaten Aufnahmen und Fisch-Tracking-Software, eine effektive und effiziente Möglichkeit zur Analyse von Stör Schwimmverhalten zur Verfügung gestellt. Obwohl das Verfahren hervorgehoben Verhalten eines Fisches schwimmen, für andere Organismen, wie Amphibien und wirbellose Wasser Anpassung würden einfache Modifikationen erfordern. Je nachdem, was Verhaltens Endpunts werden adressiert, experimentelles Design und Kamerasysteme können mit fast jedem handelsüblichen Tracking-Software-Paket für den Einsatz entwickelt werden. Das Verfahren wird unter Verwendung von gelöstem Kupfer gezeigt, ist aber auch auf andere wässrige Verunreinigungen oder Eigenschaften wie Temperatur oder Sauerstoffgehalt. Die Protokolle in dieser Arbeit entwickelt und präsentiert dazu verwendet, eine einfache digitale Videokamera als Aufzeichnungsgerät. Die digitalen Dateien werden einfach auf einen Computer übertragen und in die Bewegungsanalyse-Software hochgeladen. Die Methoden werden ständig modifiziert und verfeinert, um die Quantifizierung Prozess zu optimieren. Es ist zwingend notwendig, dass die Videoqualität für die Analyse-Software, um in High-Definition sein, jede einzelne Fische zu identifizieren, für die Verfolgung. Jeder Hintergrund, die mit den Fisch nicht Kontrast wird zu Problemen führen, wenn man versucht, die Datendateien zu verarbeiten. Ein weiteres häufiges Problem mit zweidimensionalen Videotracking ist Identifizierung von Personenbeim Schwimmen Wege kreuzen. Dies kann manuell korrigiert werden, indem jeder Fisch während des Bahnübergang zu identifizieren und die Pfadsegmente innerhalb der Software-Verknüpfung. Alternativ kann die Gesamtaktivität von jeder Wiederholungskammer als Gruppendurchschnitt bestimmt werden. Mehreren einzelnen Kammern mit jeweils einem einen Fisch enthalten, können im gleichen Sichtfeld gefilmt werden Bewegungen einzelner Fisch zu berechnen. Zur Zeit haben wir über den Expositionskammern mit einer Reihe von Kopfüberwachungskameras aufgerüstet, das Aufzeichnungsgerät digitale Video zu einer High-Definition (HD-DVR) verbunden sind. die Verwendung eines Kamerasystems jedoch, die High-Definition-MPEG-4-Videos aufzeichnen kann funktionieren. Der HD-DVR kann zu einem bestimmten Zeitpunkt und programmiert für bis zu 7 Tage zum Datensatz gesetzt werden. Diese hands-off automatisierten Ansatz ermöglicht die Erfassung von mehreren Videos gleichzeitig die Konsistenz zu halten, während externe Störungen zu minimieren, die Fischverhalten beeinträchtigen könnten. Der HD-DVR Systems sind mit einem internen Netzwerk so der Übertragung von Dateien ist relativ einfach. Während die automatische Kamerasystem eine viel bessere Technik für die Quantifizierung von Schwimmverhalten ist, ist es immer noch vorteilhaft visuelle Beobachtungen durchzuführen als zusätzliche unterstützende Informationen zur Dokumentation von Verhaltens Beeinträchtigung bei Toxizitätstests dienen. Es gibt eine lange Geschichte der Literatur Dokumentieren verändert Fischverhalten von der Exposition gegenüber Metallen resultierenden aus dem Anfang der 1960er Jahre 19,20,21. Kupfer hat sich gezeigt , um zu bewirken Veränderungen im Tätigkeitsniveau wie Hypoaktivität in bluegill 22 (Lepomis macrochirus Rafinesque) und Veränderungen in der Bewegungs- und der Nahrungsaufnahme von Bachforelle 23 (Salvelinus fontinalis). Wenigstens einige Jungfische verlassen sich auf ihren Geruchssinn zu erkennen und Räuber zu vermeiden, und Kupfer-induzierte chemosensorische Deprivation kann Verhaltensweisen beeinflussen 24,25,26 in Bezug auf Erkennung Alarm Chemikalien </sup&gt;. Das Riechepithel ist beschädigt durch Kupfer Exposition dadurch sensorischen Mechanismen beeinflussen , die in Desorientierung, Verhaltensvermeidung, reduziert Fütterung und alle anderen Verhaltensweisen , die geführt werden von olfaction 27 führen könnte. Diese veränderten Verhaltensweisen wurden im Einklang mit dem, was während der Expositionen beobachtet wurde. Das Schwimmverhalten von weißen Stör wurde stark bei subletalen Exposition gegenüber wässrigen Kupferkonzentrationen beeinflusst .. Diese Ergebnisse veranschaulichen, wie das Verhalten bei subletalen Konzentrationen von Kupfer beeinflusst und kann als Indikator für toxische Belastung verwendet werden. Die Video-basierte Analyse erwies sich als wirksam bei der Schwimmverhalten zu quantifizieren und diente auch als qualitative visuelle Dokumentation der schwerwiegende Auswirkungen auf die Stör Kupfer ausgesetzt. Die Analyse-Software ist auch in der Lage andere verschiedene Verhaltensendpunkte zu quantifizieren. Siehe Tabelle 1 für eine Liste. Das Belichtungssystem kann modifiziert werden, um jeden Endpunkt zu adressieren inEchtzeit-Modus und kann verwendet werden, Unterschiede im Verhalten mit der Exposition gegenüber verschiedenen Verunreinigungen von Belang zu quantifizieren. Die Verwendung von Verhaltensendpunkte in Wasser toxikologischen Forschung ist zunehmend beschäftigt und sollte in Betracht gezogen werden , wenn die Auswirkungen von Verunreinigungen Auswertung , da adaptive Verhaltensfunktion bei der Bestimmung von Umweltschäden 9 von entscheidender Bedeutung ist. Die Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf Fischverhalten ist oft subjektiv und eine Herausforderung vor allem, wenn mit subletalen Endpunkte in Abwesenheit von Standard-Methoden zu tun .. als quantifiziert Schwimmaktivität durch diese Verfahren verwenden, können streng überwacht werden, ist zerstörungsfrei mit minimaler Spannung auf den Organismus und wiederholt werden kann. Verhalten Schwimmen ist eine gültige und konsistente Index der subletale Toxizität , die in Testprotokolle aufgenommen werden sollte 5 die Empfindlichkeit der Standard - Toxizitätstests zu erweitern.

Zu verstehen, wie Schadstoffbelastung Verhalten beeinflussen kann manchmal sehr schwierig und subjektiv. Verhalten wird typischerweise als eine Reihe von manifesten, beobachtbar, Ganzkörper-Aktivitäten definiert, die durch das zentrale Nervensystem betreiben und einen Organismus ermöglichen, zu überleben, zu wachsen und sich vermehren. Verhaltensänderungen aufgrund der Exposition zu einer toxicant gehören zu den sensibelsten Indikatoren für Umweltstress oft zwischen 10-100 - mal empfindlicher als im Vergleich zum Überleben 1. Die meisten dieser Studien untersuchten Schwimmaktivität, Belüftung und Verhalten der Fische 2,3,4 Nahrungssuche. Aktivität Schwimmen ist die am häufigsten verwendete subletalen Endpunkt in 5 eine Verhaltensänderung in Reaktion auf eine Verunreinigung in Toxizitätstests zu bestimmen. Schwimmen Variablen umfassen die Häufigkeit und Dauer der Bewegung, Geschwindigkeit und zurückgelegte Strecke, die Frequenz und die Winkel der Drehungen, die Position in der Wassersäule und das Muster des Schwimmens. Schwimmen Aktivitäteine wirksame Maßnahme der Schwimmverhalten , wenn die Empfindlichkeit auf einen toxicant über die Kriterien vorgeschlagen in Kapitel 9 von Rand 6 in dem Buch Fundamentals of Aquatic Toxicology Basis der Bewertung. Dieser Beitrag stellt eine toxikologische Untersuchung als ein Beispiel dafür , wie die Toxizität von Kupfer zu Frühstadium von weißen Stör (Acipenser transmontanus) in verschiedenen Stadien der frühen Entwicklung in wasser nur der Engagements Schwimmverhalten zu Stör wurde ausgewertet und stellt Methoden zum Schwimmen Quantifizierung Verhalten. In früheren Studien waren die Nebenverhaltensreaktionen offensichtlich mit frühem Beginn in den ersten Tagen der akuten und chronischen Exposition gegenüber Kupfer und wurde immer schwerer über Expositionsdauer und Konzentration 7.8.9. Die Größe und der Zeitpunkt des Beginns dieser Verhaltensreaktionen sind wahrscheinlich ausreichend langfristige Überleben zu begrenzen und somit bedenklich sind angesichts der Auswirkungen auf recruitment Ausfall 10. Um wurden die Bedeutung dieser Empfindlichkeit gegenüber Metallexposition Methoden und Verfahren, um genau zu interpretieren zur Quantifizierung der zeitlichen Verlauf und Ausmaß von Verhaltensstörungen in Bezug auf Kupferkonzentrationen entwickelt. Testprotokolle für die Verhaltensfunktion und Entwicklung wurden durch die Analyse von Überkopfvideoproben von Stör in Expositionskammern hergestellt. Die Videoproben qualitative Bewertung der Entwicklung und Funktion unter Kupfer-Behandlungen in der gesamten Belichtungszeit zur Verfügung gestellt. Verhalten und Schutz suchenden Aktivität wurden bei Expositionen gegenüber wässrigen Kupferkonzentrationen ausgewertet, um die Zeit zu bestimmen, zu bewirken und die zeitliche Abfolge der Beeinträchtigung zu charakterisieren, die Zuflucht such betrifft, Lethargie, Schwimmen Koordination, Gleichgewicht und Atmung. Darüber hinaus wurden Videoaufnahmen von Stör aus jeder unterabgetasteten replizieren zum Zwecke der quantitativ zu dokumentieren spontane Schwimmen aktivität. Diese Endpunkte umfassten Maßnahmen von Dauer oder die Zeit bewegen, Schwimmen Geschwindigkeit und Distanz 5,11 gereist eines im Handel erhältlichen digitalen Bildanalyse - Software - Paket. Diese Software definiert den Umriss jedes Bild innerhalb eines Sichtfeldes und von diesem, definiert den Schwerpunkt für jedes Bild. Die Software kann in einem Frame für Frame nacheinander bestimmen die Wege der Bewegung der Position jedes Schwerpunktverfolgungs. Diese Studie mit allen anwendbaren Abschnitten der Schlussregeln der Tierschutzgesetz Vorschriften (9 CFR) und mit allen institutionellen Richtlinien für die humane Behandlung der Testorganismen während der Kultur und des Experimentierens halten. Nach Beendigung der Studie wurden alle Fische nach entsprechenden Richtlinien eingeschläfert wie von der Institutional Animal Care und Use Committee für die US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center genehmigt.

<table><tbody><tr><td>Kupfer-II-Sulfat-Pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich-Verunreinigung</td><td></td><td>besorgniserregende</td></tr><tr><td>Spritzenspender</td><td>Hamilton MicroLab 600 Series</td><td></td><td>Gerät zum Aufspießen von Chemikalien</td></tr><tr><td>2 L Messkolbenbehälter</td><td></td><td></td><td>zur Aufbewahrung von Stammlösung</td></tr><tr><td>24-1,5 L Glasgefäße</td><td></td><td></td><td>Testkammer für 2 dph Stör-Videokamera</td></tr><tr><td></td><td>Sony Handycam HDR-CX550V</td><td></td><td></td></tr><tr><td>digitale Tracking-Software</td><td>Noldus Ethovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-17" Flachbildschirme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Überwachungskameras</td><td>Modell CL101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-16 Kanal digitale Aufzeichnungsgeräte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DO-Messgerät</td><td>YSI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Orion 940</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ph-Sonde</td><td>Orion&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak-Messgerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak-Sonde</td><td>Orion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kühleinheit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Umwälzpumpe</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizieren fisch schwimmverhalten in reaktion auf akute exposition von wässrigen kupfer form von computergestützten video und digitale bildanalyse

Quantifying Fish Swimming Behavior in Response to Acute Exposure of Aqueous Copper Using Computer Assisted Video and Digital Image Analysis

Verhaltensreaktionen von Wasserorganismen auf Umweltschadstoffe können Vorläufer anderer Effekte wie Überleben, Wachstum oder Fortpflanzung sein. Diese Reaktionen können jedoch subtil sein, und die Messung kann eine Herausforderung darstellen. Anhand von juvenilen Weißen Stören (Acipenser transmontanus) mit Kupfer-Expositionen werden in dieser Arbeit Techniken zur Quantifizierung von Verhaltensreaktionen mittels computergestützter Video- und digitaler Bildanalyse veranschaulicht. In früheren Studien wurden bei Weißen Stören im frühen Lebensstadium bei akuten und chronischen Kupferexpositionen starke Beeinträchtigungen des Schwimmverhaltens beobachtet. Das Verhalten der Störe wurde schnell beeinträchtigt und zwar in einem solchen Ausmaß, dass das Überleben im Feld gefährdet war, da Fische flussabwärts gespült oder leicht von Raubtieren gefangen wurden. Das Ziel dieser Untersuchung war es, Protokolle zur Quantifizierung der Schwimmaktivität während einer Reihe von akuten Kupferexpositionen zu veranschaulichen, die Zeit bis zur Wirkung während der frühen Lebensphase zu bestimmen und die Bedeutung dieser Reaktionen im Verhältnis zum Überleben dieser gefährdeten Fische im frühen Lebensstadium zu verstehen. Da die Sterblichkeit auf einem Zeitkontinuum liegt, hilft uns die Bestimmung, wann Kupfer zum ersten Mal die Schwimmfähigkeit beeinflusst, die Auswirkungen auf die Auswirkungen auf Populationsebene zu verstehen. Die verwendeten Techniken lassen sich leicht an experimentelle Designs mit anderen Organismen und Stressoren anpassen.

Manuelle Verarbeitung zeigte die visuellen Beobachtungsdaten Prozent mit steigender Kupferkonzentration erhöht Anomalien nach nur 72 Stunden der Exposition mit 2 Tage nach dem Schlüpfen (DPH) Stör (Abbildung 2) eingeleitet. Die Videoproben dokumentiert die extreme Auswirkungen von Kupfer-Exposition auf die Stör Schwimmverhalten (Video 2) und bei der Festlegung der Verhaltens Beeinträchtigung als Folge unterstützt. In einem anderen Beispiel Stör bei 30 dph erwies sich als empfindlich gegenüber Kupfer Exposition mit einer 96 h mittlere letale Wirkung Konzentration (LC50) von 40,3 g / l, bezogen auf die Mortalität nur. Wenn jedoch subletalen Verhaltensendpunkte der Verlust des Gleichgewichts und der Immobilisierung werden zusammen mit der Sterblichkeit nimmt die Empfindlichkeit mit einem geschätzten 96 Stunden Median-Effekt-Konzentration enthalten (EC50) im Bereich von 2,4 bis 5,0 g / L. Videodokumentation erfasst diese subletale Effekte und weitere validiert menschlichen Beobachtungen von Verhaltensauffälligkeiten aufgezeichnetwährend der Belichtung. Die Verwendung von digitalen Tracking-Software deutlich reduziert die Nachbearbeitung Zeit, als Schwimmaktivität zu analysieren. Fische schwimmen Geschwindigkeit, verbrachte die Zeit zu bewegen, und die zurückgelegte Strecke alle deutlich zurückgegangen (Abbildung 3) mit zunehmender Kupferkonzentration. Schwimmwege wurden ebenfalls mit zunehmender Kupferkonzentration (Abbildung 4) reduziert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig1.jpg" /> Abbildung 1:.. Computer - Screenshot einer Tabellenvorlage verwendet , um Test - Stammlösung Konzentration bestimmen Chemische Stoffaufbereitung für die Diluters Toxizitätstests wurde unter Verwendung eines Tabellenvorlage bestimmt basierend auf einer Zielkonzentration <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2:. Diluter Setup und experimentelles Design Verschiedene Lebensphasen der weißen Stör wurden Kupfer ausgesetzt. Die Größe des Verdünners für die Belichtungen verwendet wurde, basierend auf der Größe des Fisches ausgewählt. (A) Frühstadium von Stör wurden mit einem kleinen Diluters Setup ausgesetzt und (b) ältere Lebensphasen Stör wurden mit einem großen Diluters Setup ausgesetzt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig3.jpg" /> Abbildung 3: Schwimmverhalten resultiert aus einem Frühstadium von weißen Stör (Acipenser transmontanus) 72 Stunden Kupfer Exposition (beginnend mit 30 Tage nach dem Schlüpfen [dph] Fisch). Schwimmen Aktivität Endpunkte (a) die Dauer der Bewegung unter 30 dph weißen Stör; (B) Geschwindigkeit des Schwimmens; und (c </strong&gt;) Abstand bewegt sank mit 96 h ausgesetzt Kupferkonzentration unter weißen Stör zu erhöhen. Asterisk zeigt signifikanten Unterschied von der Kontrolle, Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig4.jpg" /> Abbildung 4: Ergebnisse von einem frühen Lebensstadium weißen Stör (Acipenser transmontanus) 96 Stunden Kupfer Exposition (beginnend mit 2 Tage nach dem Schlüpfen [dph] Fisch) Surviving weißen Stör bei 2 dph ausstellenden Verlust des Gleichgewichts und der Immobilisierung nach 72 h ein. 96 Stunden Belichtung mit Kupferkonzentration zu erhöhen. Asterisk zeigt signifikanten Unterschied von der Kontrolle, Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig5.jpg" /> Abbildung 5: Beispiel Schwimm Weg ergibt sich aus einer frühen Lebensstadium weißen Stör (Acipenser TRANSMOntanus) 96 Stunden Kupfer Exposition (starrt mit 30 Tage nach dem Schlüpfen [dph] Fisch). Schwimmen Wege von Stör mit digitalisierten digitalen Tracking - Software aus (a) Kontrollreplikat (n = 5 Fisch) und (b) von einer hohen Behandlung (50 ug / l) Wiederholung (n = 3 Fisch) nach einer 96 Stunden Exposition. Notieren Sie die Anzahl der Schwimmbahnen nicht die Anzahl der Fische in der Kammer dar , weil einige Fische inaktiv waren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> quantifizierbare Parameter </td><td> Beobachtende Parameter </td></tr><tr><td> Geschwindigkeit </td><td> Lethargie / Hyperaktivitäts </td></tr><tr><td> Entfernung bewegt </td><td> Der Verlust des Gleichgewichts </td></tr><tr><td> Dauer der Zeit, in der Zone ausgegeben </td><td> Spasmen / Zittern / Kopfnach unten </td></tr><tr><td> Zone Übergangs Anzahl der Male Organismus bewegt sich zwischen ausgewählten Zonen </td><td> Position in der Wassersäule </td></tr><tr><td> Unterwegs zu punkt berechnet die Abweichung von dem Weg des Tieres zu einem Point of Interest </td><td> Respiration (schnell / langsam) </td></tr><tr><td> Überschrift berechnet die Überschrift der ausgewählten Körperstelle </td><td> Färbung </td></tr><tr><td> Drehwinkel-Differenz in der Position zwischen zwei Proben </td><td> Ausblenden </td></tr><tr><td> Winkelgeschwindigkeit berechnet, indem der Drehwinkel durch die Probenintervall dividiert </td><td></td></tr><tr><td> Meander-berechnet, indem der Drehwinkel dividiert durch den Abstand bewegt. Verwendet in den Tieren zu vergleichen drehen sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen </td><td></td></tr><tr><td> Die Zeit, zu bewegen </td><td></td></tr><tr><td> Mobilitätszustand-berechnet die Dauer, für die die gesamte Fläche als Tier detektiert verändert sich, selbst wenn der center Punkt bleibt gleich </td><td></td></tr><tr><td> Rotations eine Umdrehung beendet ist, wenn der ausgewählte Körperstelle einen kumulativen Drehwinkel von 360 ° aufweist. Dreht sich in die entgegengesetzte Richtung von weniger als der Schwellenwert sind, ignoriert. </td><td></td></tr><tr><td> Mobilitäts kontinuierlichen berechnet den Prozentsatz von Mobilität für den gesamten Bereich des Tieres erfasst wird, selbst wenn der Mittelpunkt gleich bleibt. </td><td></td></tr><tr><td> Die Entfernung zwischen den Themen-berechnet Distanz zwischen allen Akteuren und den ausgewählten Empfängern </td><td></td></tr><tr><td> Proximity-berechnet die Dauer, für die der Schauspieler ist oder nicht in der Nähe des Empfängers </td><td></td></tr><tr><td> Relative Bewegung </td><td></td></tr><tr><td> Net gewichtete Bewegungs Die Bewegung des Schauspieler (positiv) und von (negativen) der Empfänger, um den Abstand zwischen ihnen gewichtet </td><td></td></tr><tr><td> Die gewichteten Bewegung von-moveme<html> nt des Aktors von dem Empfänger, um den Abstand zwischen ihnen gewichtet. </td><td></td></tr><tr><td> Gewichtete Bewegung to- Bewegung des Darstellers zu dem Empfänger, um den Abstand zwischen ihnen gewichtet </td><td></td></tr><tr><td> Teststeuerrechnung Zeitraum zwischen zwei Ereignissen der Elemente Teststeuerung oder innerhalb eines Elements </td><td></td></tr><tr><td> Teststeuerung Ereignis-Moment, in dem ein Ereignis innerhalb eines Elements Sie in Teststeuerung definiert haben auftritt. </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Verhaltensendpunkte quantifiziert durch digitale Tracking - Software Diese Endpunkte können auf Einzelpersonen oder Gruppen verwendet werden und auch als Liste für die visuelle Beobachtung Kontrollen von Verhaltens Beeinträchtigung während der Belichtung dienen. <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie1.jpg" /> /www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi &quot;&gt; Video . 1: Visuelle Definition von abnormalem Verhalten von betroffenen weißen Stör ausgestellt (Rechtsklick zum Download) Eine tägliche Beobachtungscheckliste verwendet wurde , Anomalien zu dokumentieren Der. Verlust des Gleichgewichts und der Immobilisierung waren die am häufigsten während der Expositionen beobachtet Anomalien. Geändert von Calfee et al. 7 <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video2.avi">Video 2: Visuelle Dokumentation ein Beispiel für weißen Stör Schwimmverhalten hervorheben. (Rechtsklick zum Download)</a> Weiße Stör Schwimmaktivität wurde stark reduziert mit der Exposition gegenüber steigenden Kupferkonzentration. Der Stör in diesem Video dargestellt sind von einer Steuer, mittel gering und eine hohe Behandlung am Ende einer 96 h wässrigen KupferBelichtung. Obwohl die weißen Stör noch am Leben waren, ist es der Fisch offensichtlich stark in den Vergleich zu den Kontrollen Behandlungen beeinträchtigt wurden. Geändert von Calfee et al. 7

Die Messung der Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf Fischverhalten ist oft subjektiv und eine Herausforderung vor allem, wenn mit subletalen Endpunkten zu tun haben. Wir beschreiben Methoden , einschließlich Videotechnik Schwimmverhalten der frühen Lebensphase weißen Stör (Acipenser transmontanus) während und nach 96 Stunden akute Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Kupfer zu quantifizieren.

Quantifizieren Fisch Schwimmverhalten in Reaktion auf akute Exposition von wässrigen Kupfer Form von computergestützten Video und digitale Bildanalyse

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction.  ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie man die Verhaltensreaktionen von weißen Stören auf subletale Exposition gegenüber wässrigem Kupfer quantifiziert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Ökotoxikologie zu beantworten, beispielsweise wie subletale Exposition gegenüber Schadstoffen das Schwimmverhalten von Fischen beeinflusst. Diese Methode kann wichtige Informationen für den Schutz des weißen Störs liefern.Sie kann außerdem leicht auf andere Fischarten, Amphibien und Wirbellose angewendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Reaktion äußerst emp empfindlich ist, einen frühen Hinweis auf Toxizität liefert und für das Überleben des Organismus relevant ist. Anfangs kann diese Methode schwierig sein, wenn der Anwender keine Erfahrung mit der Durchführung von Verhaltensmessungen hat.Die Durchführung des Protokolls wird meine Ko-Autorin Holly Puglis übernehmen. Bereiten Sie zunächst zwei Liter wässrige, reagenziengereinigte Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat-Lösung vor. Anschließend bringen Sie das Verdünnungssystem und die Expositionstanks ins Gleichgewicht.Stellen Sie das Zulaufrohr aus der automatischen Spritzenpumpe in den Vorratsflakon der Stammlösung. Danach stellen Sie das Spike-Volumen der automatischen Pumpe auf einen Milliliter ein und schalten Sie den Verdünner ein. Das System erzeugt eine 50%-ige Verdünnungsreihe mit fünf Konzentrationen und einer Kontrolle.Über einen Vier-Wege-Verteiler werden diese Lösungen an die vier Replikat-Expositions­kammern abgegeben. Schalten Sie als Nächstes die Pumpe des Kühlgeräts ein, das so eingestellt ist, dass das Wasserbad bei 15 Grad Celsius gehalten wird. Stellen Sie nun mithilfe des automatischen Zeitgebers am Verdünnungsgerät ein, dass dieser alle 30 Minuten zyklisch arbeitet.Der Wasserstand in den Tanks wird durch einen Überlauf mit Standrohr geregelt. Bereiten Sie die Expositionsgefäße vor, indem Sie eine vier Zentimeter große Öffnung in die Seite einbringen und diese mit einem 30-Mikrometer-Edelstahlgitter abdecken. Achten Sie darauf, Expositionsgefäße auszuwählen, die mindestens einen Liter Wasser pro 10 Gramm Fisch fassen können.Beispielsweise wiegt ein 89 Tage alter weißer Stör etwa 373 Milligramm und kann daher in einer quadratischen Kammer mit den Maßen 28 Zentimeter mal 13,5 Zentimeter mal 25 Zentimeter getestet werden. Zu Beginn, zur Mitte und am Ende eines Experiments entnehmen Sie 24-Milliliter-Teilproben der Testlösung zur chemischen Analyse. Verwenden Sie dazu Saugröhrchen, die an Plastikspritzen befestigt sind.Ersetzen Sie das Saugröhrchen durch einen 0,45 µm großen Polyethersulfon-Filter und geben Sie 4 mL Testwasser durch den Filter ab. Entsorgen Sie dieses Wasser. Danach filtrieren Sie die restlichen 20 mL Wasser in eine säuregereinigte Polyethylenflasche. Versäuern Sie die Probe mit 16-molarer Salpetersäure auf 1 % (Volumen pro Volumen). Diese Proben können dann bis zu drei Monate gelagert werden. Sobald die Testexpositionen bestätigt sind, besetzen Sie jeweils drei Störe in jeder Testkammer der Replikate mit etwa 172 Milligramm Fisch pro Kammerliter.Sammeln Sie den Stör mit einem nicht abrasiven Netz und überführen Sie ihn in einen kleinen Eimer. Insgesamt werden 144 Fische benötigt, um Daten aus sechs Testlösungen zu gewinnen. Füttern Sie die Fische während der 96-stündigen Exposition nicht.Konsistente tägliche Beobachtungen müssen durchgeführt werden, um Mortalität und abnormes Verhalten zu erfassen. Der Morgen ist die beste Tageszeit dafür, und idealerweise ist der Beobachter gegenüber den Testbedingungen blind. Der Verlust der Gleichgewichtsfähigkeit wird definiert als die Unfähigkeit der Fische, eine aufrechte Position innerhalb der Wassersäule beizubehalten.Immobilisierung ist definiert als die Unfähigkeit der Fische, sich zu bewegen oder zu schwimmen, es sei denn, sie werden angestoßen. Notieren Sie außerdem alle anderen Auffälligkeiten, wie Lethargie, Hyperaktivität, erhöhte oder verminderte Atmung, Farbveränderungen, Zittern, Krämpfe, aufgeblähte Bauchregionen, Position in der Wassersäule und jegliche anderen ungewöhnlichen Schwimmverhalten. Tote Fische sollten stets sofort entfernt werden.Messen Sie täglich auch den gelösten Sauerstoffgehalt mit einem handgehaltenen Messgerät an zwei Wasserproben. Am Ende der 96-stündigen Exposition erstellen Sie Videos zur Analyse des Schwimmverhaltens. Platzieren Sie die Testarena innerhalb eines Expositionstanks.Wählen Sie mit Sicherheit eine Testarena, die groß genug ist, damit die Fische sich frei bewegen können. Richten Sie direkt über jeder Testarena eine handgehaltene Videokamera auf einem Stativ ein. Wählen Sie nun aus den behandelten Fischen zufällig bis zu drei Überlebende aus. Überführen Sie drei Exemplare mit einem kleinen Netz in die Versuchsarena. Lassen Sie die Fische sich etwa 30 Minuten lang an die Umgebung gewöhnen. Während dieser Akklimatisierung fokussieren Sie das Bild, minimieren störende Lichtreflexionen durch das Wasser und maximieren den Kontrast der Fische gegenüber dem Hintergrund, indem Sie die Ansicht so anpassen, dass die Fische nicht verdeckt werden.Sobald sich der Fisch akklimatisiert hat, beginnen Sie mit der Aufnahme und sammeln Sie zwei Minuten Videomaterial. Nach der Videoaufnahme euthanasieren und entsorgen Sie den Fisch. Nachdem Sie die Videodateien in das für die digitale Analyse-Software benötigte Format konvertiert haben, öffnen Sie die Tracking-Software und wählen Sie unter der Hauptbildschirmoption „Neues Experiment erstellen“ die Option „Neues Standardexperiment“.Füllen Sie die Eingabefelder aus, und drücken Sie „OK“. Gehen Sie dann zur Option „Experimenteinstellungen“ unter „Einrichten“ und wählen Sie „aus Videodatei“ unter „Videosquelle“. Stellen Sie die Anzahl der Arenen auf eins ein.Stellen Sie die Anzahl der Versuchstiere pro Arena auf drei ein. Wählen Sie anschließend unter „verfolgte Merkmale“ die Erkennung des Mittelpunkts aus und wählen Sie die gewünschten Einheiten. Gehen Sie nun unter „Einrichtung“ zur Option „Versuchsliste“ und klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf „Videos hinzufügen“.Wählen Sie im Dialogfeld die alphabetische Reihenfolge aus. Klicken Sie auf Durchsuchen. Navigieren Sie zu dem Ordner, in dem sich die Videos befinden, markieren Sie die relevanten Dateien und klicken Sie auf Öffnen.Nun, da die Videodateien ausgewählt wurden, definieren Sie als Nächstes den Versuchsrahmen in der Software. Klicken Sie zuerst oben auf der Bildschirmseite auf „Variable hinzufügen“ und geben Sie im Feld „Bezeichnung“ die Bezeichnung Konzentration ein. Geben Sie im Feld „Beschreibung“ die Kupferkonzentration in Mikrogramm pro Liter ein.Wählen Sie anschließend im Dropdown-Menü bei Typ die Option „numerisch“. Klicken Sie auf das Feld für vordefinierte Werte und wählen Sie im Dialogfeld die Option „Einzelne Werte definieren“. Geben Sie die für das Experiment verwendeten Konzentrationen ein, wobei Sie nach jeder Zahl auf „Hinzufügen“ klicken.Dann deaktivieren Sie die Option „weitere Werte zulassen“ und klicken Sie auf „OK“. Wählen Sie im Dropdown-Menü im Bereichsfeld den Eintrag „Versuch“. Geben Sie die entsprechende Konzentration für jeden Versuch in die dafür vorgesehenen Felder ein.Klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf „Variable hinzufügen“. Geben Sie „Replikat“ in das Bezeichnungsfeld ein. Geben Sie „Replikatnummer“ in das Beschreibungsfeld ein.Wählen Sie in der Dropdown-Liste für „Typ“ die Option „Numerisch“. Klicken Sie anschließend auf das Feld „Vordefinierte Werte“ und wählen Sie im Dialogfeld die Option „Individuelle Werte festlegen“. Geben Sie eins, zwei, drei und vier ein und deaktivieren Sie die Option „Weitere Werte zulassen“.Klicken Sie dann auf „Okay“. Wählen Sie nun die Testoption aus dem Dropdown-Menü im Bereichsfeld aus. Geben Sie die entsprechende Wiederholungsanzahl für jeden Test ein.Die nächste Aufgabe besteht darin, die Arena-Bereiche einzurichten. Beginnen Sie damit, unter dem Reiter „Setup“ die Arena-Einstellungen auszuwählen, und benennen Sie die erste Einstellung als „Versuch 1“. Wählen Sie im Dialogfeld die Option „Hintergrundbild erfassen“ und klicken Sie auf „Durchsuchen“.Suchen Sie die Videodatei für den ersten Versuch und klicken Sie auf „Öffnen“. Nachdem das Video erscheint, klicken Sie im Dialogfeld „Hintergrundbild erfassen“ auf „Erfassen“. Klicken Sie danach auf das weiße Kreissymbol nahe der oberen Bildschirmkante unter „Arena-Einstellungen“ und passen Sie den angezeigten Kreis so an, dass er den Schwimmbereich umschließt.Klicken Sie anschließend auf das Kalibrierungsskalen-Symbol unter den Arena-Einstellungen. Wählen Sie den Arena-Bereich mit einer Klick-Halte-Zieh-Bewegung aus. Geben Sie nun im Feld „Reale Distanz“ unter Kalibrierdistanz 10,5 ein.Klicken Sie dann auf „Okay“. Passen Sie gegebenenfalls die Kalibrierungslinie so an, dass sie den gesamten Durchmesser der kreisförmigen Arena überspannt. Klicken Sie auf die Option „Arena-Einstellungen überprüfen“ im Fenster für die Arena-Einstellungen und beheben Sie alle Probleme bei den Einstellungen, die nicht bestätigt wurden.Wiederholen Sie nun diesen Vorgang, bis für jeden Versuch alle Arenen definiert sind. Als Nächstes legen Sie die Fischaufspürparameter fest. Wählen Sie zunächst die Erkennungseinstellungen unter der Option „Setup“ aus der Experiment-Explorer-Symbolleiste auf der linken Seite des Bildschirms.Danach wählen Sie im Dialogfeld „Erkennungseinstellungen“ unter „Methode“ im Dropdown-Menü die dynamische Subtraktion aus. Wählen Sie außerdem unter „Probandenidentifikation“ im Dialogfeld eine Füllfarbe für jeden Probanden aus. Wählen Sie anschließend „Video auswählen“ und suchen Sie das Video für den ersten Versuch.Geben Sie in den Erkennungseinstellungen in einem Dialogfeld das Abtastratenfeld unter Video mit fünf Komma neun neun vier eins ein. Klicken Sie im selben Feld auf Einstellungen für die Referenzbildoption unter Erkennung. Klicken Sie dann im Dialogfeld Referenzbild auf die Option C Lernen starten.Sobald im Referenzbild-Dialogfeld ein Bild ohne Tiere angezeigt wird, klicken Sie in den Aufnahmeeinstellungen innerhalb des Dialogfelds auf „dynamisches Referenzbild verwenden“ und schließen Sie dieses Dialogfeld. Wählen Sie nun im Dropdown-Menü unter „Erkennung“ im Dialogfeld „Erkennungseinstellungen“ die Option „dunkler“. Stellen Sie für den dunklen Kontrast unter „Erkennung“ die kleinere Zahl auf 33 und die größere Zahl auf 153 ein.Klicken Sie dann unten rechts auf „Änderungen speichern“. Überprüfen Sie nun, ob die Software erfolgreich Tiere verfolgt, anstatt Schatten oder Ablagerungen. Klicken Sie auf die Wiedergabetaste im Wiedergabesteuerungsfenster und passen Sie die Werte für die dunkle Kontraststufe nach Bedarf an.Stellen Sie sicher, dass alle vorgenommenen Anpassungen gespeichert werden. Die Software ist nun darauf eingestellt, Daten aus dem Video zu sammeln. Die nächste Aufgabe besteht darin, den Fisch in jedem Versuchsdurchlauf zu verfolgen. Wählen Sie zunächst unter der Option Einrichtung im Experiment-Explorer-Werkzeugkasten auf der linken Seite des Bildschirms die Datenaufnahme aus.Klicken Sie anschließend im Dialogfeld „Einstellungen zur Datenaufnahme“ auf „Nächsten geplanten Versuch verfolgen“ und vergewissern Sie sich, dass der korrekte Versuch, das richtige Video und die richtigen Arena-Einstellungen unter den Einstellungen im Dialogfeld „Einstellungen zur Datenaufnahme“ angezeigt werden. Aktivieren Sie dann die Option „Erkennung bestimmt Geschwindigkeit“ im Dialogfeld „Steuerung der Datenaufnahme“. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem grünen Kreis, der in einem weißen Quadrat eingeschlossen ist, um den Datenaufnahmeprozess zu starten.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Versuche erfasst wurden. Nun können die verfolgten Objekte, also die Fische, analysiert werden. Klicken Sie zunächst im Analysebereich unter der Registerkarte „Analyse“ in der Experiment-Explorer-Symbolleiste auf der linken Seite des Bildschirms auf „Datenprofile“.Danach wählen Sie in der Komponenten-Symbolleiste unter der Schachtelungsoption die Zeit aus. Passen Sie im Zeit-Dialogfeld unter der Einstellung „Zeitintervall auswählen“ den „bis“-Wert auf zwei Minuten an und klicken Sie auf „OK“. Ziehen Sie danach die Schachtelbox zwischen die Startbox und die Ergebnisbox im Datenprofilbereich auf der rechten Seite des Bildschirms.Suchen Sie in der Experiment-Explorer-Symbolleiste auf der linken Seite des Bildschirms unter der Option Analyse nach Analyseprofil und klicken Sie darauf. Klicken Sie anschließend in der Symbolleiste für abhängige Variablen unter dem Abschnitt Entfernung und Zeit auf Geschwindigkeit. Klicken Sie auf Hinzufügen und anschließend unter dem Abschnitt Entfernung und Zeit in der Symbolleiste für abhängige Variablen auf zurückgelegte Strecke.Klicken Sie anschließend im Dialogfeld „Distanz bewegt“ auf „Hinzufügen“ und dann im Bereich „Einzelverhalten“ in der Symbolleiste der abhängigen Variablen auf „Bewegung“. Öffnen Sie im Dialogfeld „Bewegung“ den Abschnitt „Ausreißerfilter“ und stellen Sie das Mittelungsintervall auf eins ein. Danach wechseln Sie zum Abschnitt „Schwellenwerte“ und stellen die Startgeschwindigkeit auf zwei Komma null null und die Stoppgeschwindigkeit auf eins Komma sieben fünf ein.Unter der Überschrift „Statistiken berechnen“ beide Felder für bewegte und unbewegte Objekte aktivieren. Anschließend auf „Hinzufügen“ klicken und im Bereich „Ergebnisse“ in der Symbolleiste des Experiment-Explorers auf der linken Seite des Bildschirms auf „Analyseausgabe“ klicken. Danach auf „Berechnen“ klicken.Nachdem die abhängigen Variablen berechnet wurden, klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf „Exportieren“. Wählen Sie den Zielordner im Dialogfeld „Analyseergebnisse exportieren“ und wählen Sie „Excel“ aus dem Dropdown-Menü für den Dateityp. Klicken Sie anschließend auf „OK“.Klicken Sie abschließend im Dateimenü oben auf dem Bildschirm auf „Experiment speichern“. Schließen Sie die Software für die digitale Nachverfolgung. Importieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulationsdatei, und analysieren Sie sie mithilfe einer kommerziellen Software für die statistische Analyse.Bereits nach 72-stündiger Exposition gegenüber verschiedenen Kupferkonzentrationen zeigten zwei Tage nach dem Schlüpfen stehende Störe zahlreiche auffällige Abnormalitäten. Es war ein deutlicher Einfluss auf das Schwimmverhalten festzustellen. Videodaten halfen dabei, diese Verhaltensstörung zu beschreiben.In weiteren Tests erwiesen sich Störe 30 Tage nach dem Schlupf als empfindlich gegenüber 96-stündigen Kupferexpositionen. Die Schwimmgeschwindigkeit, die Bewegungsdauer und die zurückgelegte Distanz nahmen alle signifikant mit steigenden Kupferkonzentrationen ab. Auch die Schwimmpfade verkürzten sich mit zunehmenden Kupferkonzentrationen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Verhalten in einem Toxizitätstest quantifiziert. Diese Methode kann Umweltmanagern eine Möglichkeit bieten, verhaltensbasierte Kriterien zu nutzen, um ökologische Schäden zu dokumentieren und die Wiederherstellung zu leiten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, bei der Aufzeichnung verhaltensbezogener Beobachtungen konsistent zu sein.Andere Verhaltensweisen, wie Fressverhalten und Aggression, können durch die Anwendung dieses Verfahrens quantifiziert werden, um zusätzliche Fragen zu den Langzeiteffekten von Schadstoffexposition auf das Überleben zu beantworten.

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