Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine spezifische genomische Region unter Beibehaltung molekularer Wechselwirkungen zu isolieren, um Moleküle zu identifizieren, die mit der genomischen Region interagieren. Diese Methode kann helfen, Fragen in den Bereichen genomische Funktionen wie Transkription und epigenetische Regulation zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die direkte Identifizierung von Molekülen ermöglicht, die mit einer bestimmten Genomregion interagieren.

Das Verfahren wird von Toshitsugu Fujita, einem Assistenzprofessor aus meinem Labor, vorgeführt. Befolgen Sie das Textprotokoll und entwickeln Sie die DNA-bindenden Moleküle, die Sie interessieren. Dabei wird die interessierende gBlock-Sequenz erzeugt und in ein Retrovirus eingefügt, um beispielsweise die mit drei FLAG-dCas9 komplexierte Guide-RNA herzustellen.

Alternativ können drei FLAG-TAL-Proteine erzeugt werden, die die Zielsequenz erkennen. Infizieren Sie dann die Zellen gemäß dem Textprotokoll mit dem vorbereiteten Retrovirus. Bestätigen Sie die Expression der manipulierten DNA-bindenden Moleküle und etablieren Sie die Zelllinie.

Fahren Sie nun fort, indem Sie die Zellen mit Formaldehyd vernetzen. Suspendieren Sie 20 Millionen transfizierte Zellen in 30 Millilitern regulärem Kulturmedium und fügen Sie 810 Mikroliter 37 % Formaldehyd für eine Endkonzentration von 1 % hinzu. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach fünf Minuten beenden Sie die Vernetzungsreaktion, indem Sie 3,1 Milliliter 1,25 molares Glycin hinzufügen.

Lassen Sie die Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, bevor Sie fortfahren. Anschließend zentrifugieren Sie das Küvettenröhrchen bei 300 g fünf Minuten lang in einer gekühlten Zentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie das Küvettenpellet in 30 Millilitern PBS durch Mischen und Zentrifugieren.

Führen Sie zwei PBS-Wäschen durch. Bei Bedarf kann das gewaschene Pellet aus fixierten Zellen bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Fahren Sie fort und sammeln Sie das Chromatin aus den Zellen.

Suspendieren Sie sie in 10 Millilitern Lysepuffer und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis. Sammeln Sie dann mit einer gekühlten Zentrifuge die Zellen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Suspendieren Sie nun das Zellpellet in einem Kernlysepuffer und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis.

Alle paar Minuten während der Inkubation die Mischung kurz durchwirbeln. Sammeln Sie die Zellen erneut durch Zentrifugation. Waschen Sie nun das Pellet mit 10 Millilitern PBS und entfernen Sie die Waschlösung mit einer weiteren Zentrifugation.

Dabei entsteht die Chromatinfraktion, die auf Wunsch schockgefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden kann. Fahren Sie fort, indem Sie das Chromatinpellet in 800 Mikrolitern modifiziertem Lysepuffer drei suspendieren und die Suspension in ein kleineres 1,5-Milliliter-Röhrchen übertragen. Schalten Sie nun eine Ultraschallsonde auf Stufe drei mit kontinuierlichem Betrieb ein.

Um das Chromatin zu fragmentieren, wechseln Sie manuell zwischen 10 Sekunden Ultraschall und 20 Sekunden auf Eis. Verlängern Sie bei jedem 5. oder 6. Zyklus die Eisphase auf zwei Minuten, damit die Probe nicht überhitzt. Führen Sie diesen Ultraschallzyklus 10 bis 18 Mal durch, wobei Sie die Spitze der Sonde vom Boden des Röhrchens fernhalten, um ein Aufschäumen der Probe zu vermeiden.

Nach der Beschallung wird die Probe mit einer schnellen gekühlten Zentrifugation entnommen. Übertragen Sie dann den Überstand mit dem fragmentierten Chromatin in ein neues Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Im Textprotokoll erfahren Sie, wie Sie die Fragmentierung bewerten können.

Um sich auf die Immunpräzipitation vorzubereiten, konjugieren Sie zunächst die Antikörper an Dynabeads. Diese Immunpräzipitation wird auf Proben von 20 Millionen Zellen skaliert. Fügen Sie dem fragmentierten Chromatin ein 1/5 Volumen modifizierten Lysepuffer drei mit Triton X-100 hinzu, um eine Endkonzentration von 1%Triton zu erhalten.

Fügen Sie als Nächstes die Mischung zu den magnetischen Kügelchen hinzu, die mit normalem Maus-IgG konjugiert sind. Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang auf einem Rotator mit Kühlung. Ziehen Sie später die Kügelchen aus der Lösung drei Minuten lang auf einem Magnetständer an.

Sammelt dann den Überstand ein. Der Überstand wird auf das Röhrchen mit magnetischen Kügelchen übertragen, die mit Anti-FLAG-Antikörpern konjugiert sind. Führen Sie diese Konjugationsreaktion über Nacht auf einem Rotator bei vier Grad Celsius durch.

Bringen Sie am nächsten Morgen einen Magneten für drei Minuten an der Tube an, um die Kügelchen zu sammeln. Pipettieren Sie dann den Überstand heraus und entsorgen Sie ihn. Waschen Sie nun die Perlen.

Suspendieren Sie sie in einem Milliliter salzarmem Puffer und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf einem Rotator bei vier Grad Celsius. Isolieren Sie nach der Inkubation die Magnetisierung der Kügelchen und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt mit salzarmem Puffer noch einmal.

Führen Sie mit der gleichen Technik zwei weitere Wäschen mit Puffer mit hohem Salzgehalt durch. Fahren Sie mit der Methode fort, um die Kügelchen zweimal in Lithiumchloridpuffer zu waschen. Zum Schluss die Kügelchen nur einmal mit TBS-IGEPAL CA-630 waschen.

Nach den sieben Waschschritten suspendieren Sie die Kügelchen in 200 Mikrolitern Elutionspuffer und inkubieren sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Ziehen Sie dann die Kügelchen durch Magnetisierung an und sammeln Sie den Überstand in einer neuen Röhre. Wiederhole diesen Elutionsschritt, um die Ausbeute zu erhöhen.

Reinige dann etwa 5 % der DNA, um die Ausbeute zu schätzen. Beginnen Sie damit, den Großteil des Eluats in eine Fällungsreaktion einzumischen. Fältitieren Sie das Chromatin über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.

Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Probe und verwerfen Sie den Überstand. Spülen Sie das Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol und wiederholen Sie die Zentrifugation für 10 Minuten. Entsorgen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 40 Mikrolitern 2x Probenpuffer.

Wirbeln Sie nun die Suspension volle fünf Minuten lang durch. Inkubieren Sie es dann 30 Minuten lang bei 100 Grad Celsius, um es zu denaturieren und die Vernetzung umzukehren. Nach dem Kochen werden 40 Mikroliter der Probe auf ein SDS-PAGE-Gel aufgetragen

In der Regel wird eine Steigung von vier bis 20 % verwendet. Lassen Sie das Gel laufen, bis der Farbstoff einen Zentimeter unter die Vertiefung gelangt. Färbe dann das Gel und schneide es in fünf Stücke, die etwa 2 Millimeter lang sind.

Verdünnen Sie das Protein aus den Gelstücken und verwenden Sie es für die Massenspektrometrie. Die Aufreinigung der RNA, gefolgt von der Sequenzierungsanalyse, wird im Textprotokoll behandelt. Insgesamt können bis zu 10 % der genomischen Zielregionen mit enChIP aufgereinigt werden.

Hier sind die Ergebnisse von Analysen zu sehen, die auf die Promotorregion des IRF-1-Gens im Vergleich zum unspezifischen Sox2-Locus abzielen. Ein weiteres Beispiel sind die Zieltelomere im Vergleich zu unspezifischen Gammasatelliten-Locus. enChIP SILAC identifizierte mehrere Proteine, die mit dem IRF-1-Promotor assoziiert sind, auf Interferon-Gamma-spezifische Weise.

Telomere-bindende Proteine wurden ebenfalls mittels enChIP in Kombination mit Massenspektrometrie identifiziert. Die enChIP-RNA-Sequenzierung wurde dann verwendet, um die RNAs zu identifizieren, die mit den Telomeren assoziiert sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Transkription und epigenetischen Regulation, um solche Mechanismen in verschiedenen biologischen Systemen zu erforschen.