Name: Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Erfahren Sie die enChIP-Technik zur Isolierung spezifischer genomischer Regionen und Identifizierung assoziierter Proteine und RNAs. Diese Methode ermöglicht direkte Analysen molekularer Interaktionen für transkriptionelle und epigenetische Regulationsstudien.

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Diese Arbeit wurde von Takeda Science Foundation (TF) unterstützt; die Asahi Glass Foundation; die Uehara Memorial Foundation (HF); die Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation (TF und HF); Grant-in-Aid für junge Wissenschaftler (B) (# 25830131), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (# 15K06895) (TF); und eine Grant-in-Aid for Scientific Research für innovative Bereiche &#39;Transcription Zyklus&#39; (# 25118512 &amp; # 15H01354), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (# 15H04329), Grant-in-Aid for Exploratory Research ( # 26650059) und &quot;Genome Support &#39;(# 221S0002) (HF) aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan.

1. Design von Engineered DNA-bindende Moleküle in Anerkennung der Target-Locus <ol><li> Für enChIP Verwendung CRISPR Komplexe, verwenden Sie die CRISPRdirect Web-Tool (http://crispr.dbcls.jp) Kandidaten gRNA Zielsequenzen in der genomischen Region von Interesse, wie zuvor beschrieben 18 zu identifizieren. Dieses Web-Tool liefert 23 bp genomischer Websites der Form 5&#39;-N 20 NGG-3 &#39;im Zielbereich. </li><li> Synthetisieren eine gBlock einschließlich der U6-Promotor-Sequenz und die Sequenz der 5&#39;-N 20 in 5&#39;-N 20 NGG-3 &#39;unter Verwendung von kommerziellen Diensten (siehe 2), 19,20. Zur Subklonierung Zwecke umfassen geeignete Restriktionsenzymstellen außerhalb des gBlock. </li><li> Legen Sie die gBlock in einen geeigneten Vektor, wie zuvor beschrieben 16. Mehrere retrovirale Vektoren für gBlocks stehen zur Verfügung (siehe Materialien). </li><li> Für enChIP mit TAL-Proteinen, entwerfen TAL-Proteinen in Anerkennung der target loci. Generieren Plasmide TAL-Proteinen unter Verwendung von kommerziellen Dienstleistungen, kodiert. Generieren Expressionsvektoren, die TAL-Proteinen mit einem oder mehreren Tags wie 3 × FLAG verschmolzen, wie zuvor beschrieben 15 enthält. </li></ol> 2. Zeitpunkt der Gründung der Zellen für die Analyse enChIP <ol><li> Ausdruck 3 × FLAG-dCas9 und der gRNA (CRISPR-basierte Verfahren) oder 3 × FLAG-TAL (TAL Proteinbasis Verfahren) in den Zellen, wie zuvor beschrieben, um 14-17 analysiert. <ol><li> Verwenden transiente Transfektion, wenn die Transfektionseffizienz ist hoch. Ein Expressionsvektor, enthaltend 3 × FLAG-dCas9 und den CMV-Promotor ist verfügbar (siehe Materialien). </li><li> In Erwägung ziehen, stabile Transformanten unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wenn die transiente Transfektion Effizienz gering ist. Zusätzlich zu den oben genannten retroviralen Vektoren für gBlock, sind retrovirale Vektoren von 3 × FLAG-dCas9 verfügbar (siehe Materialien). </li></ol></li><li&gt; Bestätigen der Expression des 3xFLAG-dCas9 oder 3xFLAG-TAL-Proteins in den transfizierten Zellen durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines Anti-FLAG-Antikörper (Ab), wie zuvor beschrieben, 14-17. Anmerkung: Die Expression dieser markierten Proteine ​​können auch durch intrazelluläre Färbung mit anti-FLAG-FITC und anschließender FACS-Analyse bestätigt werden. Ein Protokoll für die intrazelluläre Färbung steht auf unserer Homepage (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html) heruntergeladen werden. </li><li> Ausdruck der gRNA durch Standard-RT-PCR-Technik zu bestätigen. </li><li> Für quantitative Identifizierung von Proteinen in Wechselwirkung mit der genomischen Region von Interesse, zu prüfen Verwendung eines Silac (SILAC) Analyse kombiniert mit enChIP (enChIP-SILAC). Hinweis: Medien für das SILAC Analyse kann von kommerziellen Anbietern erworben werden. SILAC ist mächtig im Nachweis von spezifischen Wechselwirkungen. <ol><li> Kulturzellen in SILAC schweren Medium. Bereiten Zellen culturot im SILAC Lichtmedium als negative Kontrolle. Verwenden Sie mindestens 5 x 10 7 Zellen pro SILAC Medium (schwer oder leicht). Für eine effiziente Markierung hinzufügen, sowohl L-Lysin-2 HCl, 13 C 6 und L-Arginin-HCl, 13 C 6, 15 N 4 in den SILAC Schwere Medien. Hinweis: Mindestens fünf Zellteilungen erforderlich, Label-Proteine ​​sind. <ol><li> Beispielsweise Kultur menschlichen Fibrosarkom-HT1080-Zellen, die 3xFLAG-dCas9 und gRNA bei 37 ° C und 5% CO 2 in DMEM-Medium für SILAC und dialysiertem fötalem Rinderserum mit Lysin-2HCl plus L-Arginin-HCl (Light-Medium) oder 13 C 6 L-Lysin-2 HCl plus 13 C 6 15 N 4 L-Arginin-HCl (Heavy-Medium) (siehe Materialien) 16. Fügen Sie 50 mg von leichten oder schweren L-Lysin-2 HCl und L-Arginin-HCl in 500 ml Medium. </li><li> Trypsinize und Ausstrich Zellen, bevor sie konfluent werden, so dass Zellen aufrechtzuerhalten exponentiellen growth. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Vernetzung der Zellen mit Formaldehyd <ol><li> Für Zellen in Suspensionskultur, Transfer 2 x 10 7 Zellen, 3xFLAG-TAL-Proteinen oder 3xFLAG-dCas9 zzgl gRNA und Aussetzung in 30 ml regelmäßigen Kulturmedium in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen. Wenn mehr Zellen verwendet werden, erhöhen Sie die Mengen und Mengen von Reagenzien proportional. Für SILAC Experimenten, mischen Sie die Zellen, die in schweren Medium oder eine Lichtmedium (5 x 10 7 Zellen pro Stück) kultiviert und unterteilen die Gesamtzahl von 1 x 10 8 Zellen in 5 Röhrchen mit 2 x 10 7 Zellen. </li><li> Add 810 ul 37% Formaldehyd zu 30 ml der Zellsuspension (Endkonzentration 1%) und bei 37 ° C für 5 min. Für adhärente Zellen, direkt beheben Zellen in Kulturschalen durch Zugabe von 810 ul 37% Formaldehyd und 30 ml Kulturmedium. </li><li> Stoppen Sie die Vernetzung durch Zugabe von 3,1 ml von 1,25 M Glycin-Lösung (Endkonzentration 127 mM) undInkubation bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Sammeln Zellen durch Zentrifugation (300 × g für 5 min bei 4 ° C). Vorsichtig den Überstand verwerfen einschließlich Formaldehyd und speichern sie in einem geeigneten Abfallflasche. <ol><li> Für adhärente Zellen, lösen die Zellen mit einem Zellschaber und der Ernte in einem 50-ml-Tube, und sammeln Zellen, wie in diesem Schritt beschrieben. </li><li> Für SILAC Experimenten, mischen Sie die abgelösten Zellen in schweren Medium oder eine Lichtmedium (5 x 10 7 Zellen je) kultiviert, teilen Sie die Gesamtzahl von 1 x 10 8 Zellen in 5 Röhrchen mit 2 x 10 7 Zellen, und sammeln Zellen, wie in diesem beschrieben Schritt. </li></ol></li><li> Zweimaliges Waschen des Zellpellets mit 30 ml PBS pro Röhrchen. Vorsichtig den Überstand verwerfen einschließlich Formaldehyd und speichern Sie es in einen geeigneten Abfall bottle.Handle Formaldehyd Abfall nach chemischen Sicherheitsrichtlinien. Die fixierten Zellen können eingefroren und bei -80 ° C gelagert werden. </li></ol> 4. Herstellung von Chromatin (je 2 x 107-Zellen) <ol><li> Aussetzung der fixierten Zellen in 10 ml Zelllysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630 und 1 × Protease-Inhibitoren) und Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe (830 × g bei 4 ° C für 8 min) und den Überstand verwerfen sorgfältig. </li><li> Aussetzen des Pellets in 10 ml Atom Lysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,5% Lauroylsarkosin und 1x Proteaseinhibitoren). Inkubieren auf Eis für 10 min und Vortex alle 2-3 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe (830 × g bei 4 ° C für 8 min) und den Überstand verwerfen sorgfältig. </li><li> In 10 ml PBS Waschen des Pellets. Das Pellet (Chromatin-Anteil) kann bei -80 ° C nach der sofortigen Einfrieren in flüssigem Stickstoff gelagert werden. </li></ol> 5. Beschallung Chromatin (pro 2 x 10 7 Zellen) <ol><li> Hängen Sie das Chromatin Fraktion in 800 &amp; mgr; lmodifizierte Lysepuffer 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% Natriumdeoxycholat, 0,1% SDS und Proteaseinhibitoren 1x) aufnehmen und in ein 1,5 ml Röhrchen. </li><li> Beschallen das Chromatin mit einem Ultraschallgerät (siehe Materialien), und die folgenden Bedingungen: Ausgang: 3; Pflicht: 100% (Dauerbetrieb); und Zeit: kostenlos. Zuführen 10-18 Zyklen der Ultraschallbehandlung für 10 s und Abkühlen auf Eis für 20 Sekunden. Eine zu starke Erwärmung zu vermeiden, läßt man die Proben auf Eis für 2 Minuten alle 5-6 Zyklen. Schaumbildung zu vermeiden, halten die Position der Spitze des Beschallungssonde 0,5 cm über dem Boden des Röhrchens. </li><li> Zentrifuge die Probe bei (16000 × g bei 4 ° C für 10 min) und den Überstand in ein 1,5 ml Röhrchen. Die beschallt Chromatin kann bei -80 ° C nach der sofortigen Einfrieren in flüssigem Stickstoff gelagert werden. </li></ol> 6. Auswertung der Chromatin Fragmentation <ol><li> Mischen Sie 10 ul der fragmentierten Chromatin mit 85 ul destilliertem Wasser. </li><li> In 4 ul5 M NaCl und Inkubation bei 65 ° CO / N. </li><li> 1 ul 10 mg / ml RNase A und bei 37 ° C für 45 min. </li><li> Add 2 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 ul 1 M Tris (pH 6,8) und 1 ul 20 mg / ml Proteinase K, und dann bei 45 ° C inkubieren, für 1,5 Std. </li><li> Separate 10 ul der Probe durch Elektrophorese in einem 1% Agarose-Gel, das keine Verfärbung Farbstoffe wie SYBR Green enthält. </li><li> Fleck des Gels, um die Verteilung der Längen der fragmentierten Chromatin bewerten. Bedingungen, die eine mittlere Länge von 0,5 bis 2 kbp (Bereich von 0,2 bis 4 kbp) zu erzeugen, sind zu empfehlen. </li><li> Reinigen DNA von den verbleibenden Proben durch Phenol-Chloroform-Extraktion oder mit Hilfe eines DNA-Extraktions-Kits (siehe Materialien). Die gereinigte DNA kann als Eingabe-DNA verwendet werden, um die Ausbeuten an enChIP Analysen (siehe 8.11) zu schätzen. </li></ol> 7. Herstellung von Dynabeads Conjugated Antibodies mit (je 2 x 10 7 Zellen) <ol><li> Prepare zwei 1,5-ml-Röhrchen, eine für Pre-Clearing mit normalem Maus-IgG und die andere für die Inkubation mit dem Anti-FLAG-Ab. Zugabe von 150 &amp; mgr; l Protein G-konjugierten magnetischen Beads (siehe Materialien) in jedes Röhrchen. </li><li> Die Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren. </li><li> Aussetzung der Kügelchen in 1 ml PBS, enthaltend 0,01% Tween-20 (PBS-T). Die Röhrchen auf einem Magnetständer und warten Sie 2 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren, und wiederholen Sie den Schritt. </li><li> Aussetzung der Kügelchen in 1 ml PBS-T, enthaltend 0,1% BSA. </li><li> In 15 &amp; mgr; g normalem Maus-IgG oder anti-FLAG Ab und drehen bei 4 ° CO / N. </li><li> Spin down kurz, dann legen Sie die Rohre auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren. </li><li> Suspend die Perlen in 1 ml PBS-T. Kehren Sie die Probe mehrmals und Spin-down kurz. Die Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 Minuten, dann den Überstand verwerfen durch Pipettieren. Wiederholen Sie den Waschzwei weitere Male mit PBS-T (insgesamt drei Waschschritte). </li></ol> 8. Chromatin Immunopräzipitation (je 2 x 10 7 Zellen) <ol><li> Mischen das fragmentierte Chromatin in 5.3 hergestellten) (etwa 800 ul) mit einem Fünftel des Volumens (etwa 200 ul) von modifizierten Lysepuffer 3, enthaltend 5% Triton X-100 (Endkonzentration 1% Triton X-100). </li><li> Fügen Sie die Chromatin-Lösung für das Rohr, in dem Protein G-konjugierten mit normalem Maus-IgG, konjugiert magnetischen Kügelchen wurden hergestellt. Rotieren bei 4 ° C für 1 Stunde. </li><li> Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. </li><li> Den Überstand in das Rohr, in dem G-Protein konjugiert mit anti-FLAG Ab konjugierten magnetischen Beads wurden hergestellt. Rotieren bei 4 ° CO / N. </li><li> Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren. </li><li> Aussetzung der Kügelchen in 1 ml salzarme Puffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS und Proteaseinhibitoren 1x) und drehen sich bei 4 ° C für 5 min. Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren und wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Der Kügelchen mit Hochsalzpuffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS und Proteaseinhibitoren 1x) zweimal zu waschen. </li><li> Der Kügelchen mit LiCl-Puffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% Natriumdesoxycholat und 1x Proteaseinhibitoren) zweimal zu waschen. </li><li> Der Kügelchen mit TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630 und 1x Proteaseinhibitoren) einmal zu waschen. </li><li> Suspendieren die Kügelchen in 200 &amp; mgr; l Elutionspuffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x Proteaseinhibitoren und 500 ug / ml 3 × FLAG-Peptid) und bei 37 ° C 20 min. Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Tube und wiederholen Sie den ElutIonenschritt. </li><li> Reinigen DNA von kleiner Teil (zB 5%) des Eluats durch Phenol-Chloroform-Extraktion oder mit Hilfe eines DNA-Extraktions-Kits (siehe Materialien). Die gereinigte DNA kann für die PCR verwendet werden, mit spezifischen Primer-Sets, um die Erträge zu schätzen von enChIP Analysen durch Vergleich mit in Schritt 6.7, hergestellt wie zuvor 14,16 beschriebenen Eingangs DNA. </li></ol> 9. SDS-PAGE, Färbung und Massenspektrometrische Analyse <ol><li> Mischen das Eluat (400 ul) mit 1 ml 2-Propanol wurden 50 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 5 ul 20 mg / ml Glykogen. Fällt das Chromatin bei -20 ° CO / N. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe (16.000 × g bei 4 ° C für 30 Minuten) und den Überstand verwerfen. Spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und erneut abzentrifugiert (16000 × g bei 4 ° C für 10 min). Überstand verwerfen vollständig durch Pipettieren. </li><li> Aussetzen des Pellets in 40 ul 2x Probenpuffer (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% Saccharose und 0,004% Bromphenolblau). Wirbel für 5 Minuten, um das Pellet vollständig aufzulösen, und dann bei 100 ° C für 30 min inkubiert, um die Proteine ​​zu denaturieren, und umgekehrt die Vernetzung. </li><li> Für SDS-PAGE, führen 40 ul der Probe auf das Gel, bis der Farbstoff erreicht 1 cm unterhalb der Bohrung. Hinweis: Wir verwenden normalerweise 4-20% Gradienten-Gele, aber andere% Gele verwendet werden. </li><li> Fleck das Gel mit Coomassie Brilliant Blue oder Silberfärbung. </li><li> Schneiden Sie das Gel in fünf Stücke (2 mm Höhe). </li><li> Führen Sie in Gel-Verdauung und massenspektrometrische Analyse wie zuvor 13-16 beschrieben. </li><li> Für SILAC Experimente mit 5 x 10 7 Zellen jeweils (insgesamt 1 × 10 8 Zellen), auszusetzen Pellet aus den ersten fünf Rohre in 40 ul 2x Probenpuffer (es ist nicht notwendig zu skalieren). </li></ol> 10. Reinigung von RNA und RNA-Seq Analysis <ol><li> Um die RNA nach enChIP reinigen, fügen Sie 5 U / ml RNase Inhibitor (see Materials), um alle Pufferlösungen, ausgenommen modifizierte Lysepuffer 3 und Elutionspuffer, an die 40 U / ml RNase-Inhibitor hinzuzufügen. </li><li> Mischen das Eluat (400 ul) mit 16 ul 5 M NaCl und Inkubation bei 65 ° C für 2 Std. </li><li> 1 ml säure Guanidinium-Phenol-Reagens (siehe Materialien) zur Probe. Vortex für 15 Sekunden und dann Inkubation bei Raumtemperatur für 5-15 min. Zentrifugieren Sie die Probe für 15 min bei 12000 g und RT. </li><li> Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 5 ul p-Bromanisol. Vortex für 15 Sekunden und dann Inkubation bei Raumtemperatur für 3-5 min. Zentrifugieren Sie die Probe für 10 min bei 12000 g und RT. </li><li> Den Überstand (etwa 1 ml) in ein neues 2-ml-Tube und 1 ml 2-Propanol. Das Röhrchen und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. Laden Sie die Mischung auf eine Spalte in einer RNA-Reinigungskits (siehe Materialien). Zentrifugieren Sie die Säule für 1 min bei 12000 g und RT. </li><li> Waschendie Säule wurde mit 400 ul Waschpuffer RNA in einem RNA-Reinigungs-Kits (siehe Materialien). </li><li> Werden 80 &amp; mgr; l DNase I-Cocktail (Mischung von 5 ul DNase I (1 U / ul), 8 &amp; mgr; l von 10 × DNase I-Reaktionspuffer, 3 ul DNase / RNase-freies Wasser und 64 ul RNA Waschpuffer eine RNA-Reinigungs-Kits (siehe Materialien)) auf die Säule. Inkubieren der Probe bei 37 ° C für 15 min und dann zu zentrifugieren für 30 Sekunden bei 12.000 × g und RT. </li><li> Mit 400 &amp; mgr; l RNA PreWash Puffer in einer RNA-Reinigungs-Kits (siehe Materialien), wasche zweimal die Spalte. </li><li> Elution der RNA mit 50 ul DNase / RNase-freies Wasser. Die eluierte RNA zur RNA-Sequenzierung verwendet werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben ein Patent auf enChIP angemeldet (Patentname: "Verfahren zur Isolierung spezifischer genomischer Regionen unter Verwendung von DNA-bindenden Molekülen, die endogene DNA-Sequenzen erkennen"; Patentnummer: PCT/JP2013/74107). H.F. ist Mitglied des Beirats von Addgene.

Hier beschreiben wir die Aufreinigung spezifischer genomischer Regionen mit Hilfe von gentechnisch veränderten DNA-bindenden Molekülen wie dem CRISPR-System und TAL-Proteinen sowie die Identifizierung von Proteinen und RNAs, die an diese genomischen Regionen gebunden sind. Die Bindung von gentechnisch hergestellten DNA-bindenden Molekülen an das Genom kann die Chromatinstruktur, einschließlich der Positionierung von Nukleosomen, beeinflussen und genomische Funktionen außer Kraft setzen, wie in CRISPR-Interferenzexperimentenbeschrieben 21. Um diese potenziell abweichenden Effekte zu vermeiden, schlagen wir spezifische Richtlinien für die Auswahl der genomischen Zielregionen vor. Erstens, um eine mögliche Hemmung der Rekrutierung von RNA-Polymerasen und Transkriptionsfaktoren sowie eine Störung der Nukleosomenpositionierung um die Transkriptionsstartstelle zu vermeiden, sollten die Zielregionen für die Analyse von Promotorregionen mehrere hundert Basenpaare stromaufwärts von (5' zu) der Transkriptionsstartstelle liegen. Im Gegensatz dazu können bei der Analyse genomischer Regionen mit unterschiedlichen Grenzen, wie z. B. Enhancern und Schalldämpfern, genomische Regionen, die diesen Regionen direkt gegenüberstehen, ins Visier genommen werden, da es weniger wahrscheinlich ist, dass die Bindung von manipulierten DNA-bindenden Molekülen deren Funktionen beeinflusst. Darüber hinaus ist es am besten, die Verwendung von Zielregionen zu vermeiden, die bei verschiedenen Spezies konserviert sind, da wichtige DNA-bindende Moleküle oft an evolutionär konservierte Regionen binden und eine Hemmung ihrer Bindung die Funktionen der genomischen Zielregionen stören könnte. In diesem Zusammenhang ist immer zu überprüfen, ob die Funktion der genomischen Zielregion in den etablierten Zellen, die für enChIP-Analysen verwendet werden, erhalten bleibt. Da mehrere gRNAs leicht getestet werden können und es mühsam und teuer ist, mehrere Versionen von TAL- oder Zinkfingerproteinen zu erzeugen, die verschiedene genomische Zielregionen erkennen, ist enChIP mit CRISPR vorteilhafter als enChIP mit anderen Proteinen.
Es wurde gezeigt, dass dCas9 an Off-Target-Sites bindet, obwohl die Affinität zu diesen Sites schwächer sein kann als die zu den Ziel-Sites22-25. Es gibt mehrere Möglichkeiten, die Kontamination von Molekülen zu bewältigen, die an diese Off-Target-Stellen gebunden sind. Zunächst wird die Verwendung von mehreren, mindestens zwei verschiedenen gRNAs empfohlen. Die Moleküle, die häufig in enChIP mit unterschiedlichen gRNAs beobachtet werden, wären richtig positiv. Zweitens wäre der Vergleich verschiedener Bedingungen für enChIP wirksam, um die Kontamination von unspezifischen Molekülen und Molekülen, die an Off-Target-Stellen gebunden sind, aufzuheben. Beispiele für diese Vergleichssätze wären (i) Stimulation (-) und (+) oder (ii) verschiedene Zelltypen wie T-Zellen vs. B-Zellen. Schließlich sollte eine quantitative Analyse der Bindung von Kandidatenmolekülen durchgeführt werden, um ihre spezifische Bindung an die Zielstellen zu bestätigen. Es ist vorzuziehen, Zellen als Negativkontrolle herzustellen, die nur dCas9, aber keine gRNA exprimieren.
Mit Hilfe von enChIP-Analysen konnten wir erfolgreich eine Reihe von bekannten und neuen Molekülen identifizieren, die mit spezifischen genomischen Regionen interagieren (Tabellen 1-3)14-17. Diese Technik konnte jedoch einige andere bekannte Proteine, die mit diesen Regionen interagieren, nicht nachweisen. Zum Beispiel assoziiert STAT1 Berichten zufolge mit dem IRF-1-Promotor bei IFNγ-Stimulation8, aber unsere enChIP-SILAC-Analyse wies STAT1 nicht als ein Protein nach, das induziert wird, um mit dieser genomischen Region zu interagieren16. Darüber hinaus konnten wir in der enChIP-MS-Analyse von Telomeren keine Shelterin-Proteine nachweisen, die aus TRF-1 und TRF-2bestehen 15, von denen gezeigt wurde, dass sie mit den Telomereninteragieren 26. Es gibt einige mögliche Gründe für diese Diskrepanzen. Erstens könnte die Stöchiometrie der Bindung von Stat1 an den IRF-1-Promotor sehr gering sein. Es ist vernünftig, dass enChIP-MS, einschließlich enChIP-SILAC, Proteine nachweist, die häufiger mit genomischen Zielregionen assoziiert sind; Daher könnte die Analyse von mehr Zellen notwendig sein, um diese Proteine nachzuweisen. Eine Erhöhung der Sensitivität von MS-Instrumenten würde auch zur effizienten Detektion von Proteinen mit geringer stöchiometrischer Bindung beitragen. Zweitens könnten einige Proteine, möglicherweise einschließlich Stat1 und Shelterine, schwierige Ziele für MS-Analysen sein. Drittens könnten in unserer Analyse der Telomere-bindenden Proteine15 die 3×FLAG-TAL-Proteine, die Telomere (3×FN-Tel-TAL) erkennen, die Bindung von Shelterinen an Telomere auf kompetitive Weise blockiert haben.
Im Gegensatz zu der relativen Schwierigkeit, Transkriptionsfaktoren, die an bestimmte genomische Regionen binden, mit enChIP nachzuweisen, konnten wir mit enChIP-Analysen erfolgreich epigenetische Regulatoren wie Histonmodifikationsenzyme identifizieren. Der Erfolg dieser Technik könnte auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass epigenetische Regulatoren an eine breite Palette von Genomregionen binden; Daher stehen für MS mehr Proteine pro Genomregion zur Verfügung. Da epigenetische Regulatoren zunehmend als wichtige Angriffspunkte für Medikamente gegen hartnäckige Krankheiten wie Krebs anerkannt werden, wäre enChIP ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung epigenetischer Wirkstoffziele.

Die Identifizierung von Molekülen mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse verbunden ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation von genomischer Funktionen wie Transkription und epigenetischen Regulation verstehen. Obwohl mehrere Techniken für die biochemische Analyse von spezifischen genomischen Regionen 1-7 entwickelt wurden, werden sie nicht in großem Umfang zu diesem Zeitpunkt wegen ihrer inhärenten Probleme wie begrenzte Anwendung (beispielsweise nur für eine hohe Kopienzahl Loci oder Loci mit repeats) und gebrauchte zu viel Zeit und Anstrengungen erforderlich. Um biochemische Analyse spezifischer Genomregionen leicht durchzuführen, haben wir zwei locusspezifische Chromatinimmunpräzipitation (Chip) Technologien, nämlich Insertions- Chip (Ichip) 8-13 und ausgeführt, DNA-bindendes Molekül vermittelte Chip (enChIP) entwickelt 14-17 . In Ichip wird eine Locus von Interesse durch Insertion Erkennungssequenzen eines exogenen DNA-bindendes Protein wie Lex taggedA. Die Ortskurve wird dann durch Affinitätsreinigung unter Verwendung der markierten DNA-bindenden Protein isoliert. In enChIP, konstruiert DNA-bindende Moleküle, wie Zinkfinger-Proteinen, Transkriptionsaktivator-like (TAL) Proteine ​​und gruppierten regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) -Komplexe verwendet werden, um einen Ort von Interesse zu markieren (Abbildung 1). Anschließend wird die Genomregion durch Affinitätsreinigung des markierten DNA-bindenden Moleküle isoliert. Einer der Vorteile der enChIP über Ichip dass Insertion Erkennungssequenzen eines exogenen DNA-bindendes Protein ist nicht notwendig. Targeting von Loci unter Verwendung CRISPR-Komplexe, bestehend aus einer katalytisch inaktiven Form Cas9 (dCas9) und einer Führungs RNA (gRNA) ist viel einfacher als Targeting dieser Regionen durch Ichip oder enChIP Verwendung TAL und Zinkfinger-Proteine. Hier beschreiben wir einen Schritt-für-Schritt-Protokoll für enChIP kombiniert mit Massenspektrometrie und RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) locus-Assoziationen zu identifizierented Proteinen und RNAs, die jeweils.

<table><tbody><tr><td>gBlock-Synthese-Service</td><td>Life Technologies</td><td>Gensynthese von GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>gBlock-Synthese-Service</td><td>IDT (Integrated DNA Technologies)</td><td>gBlocks Genfragmente</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-neo</td><td>Addgene</td><td>51128</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-GFP</td><td>Addgene</td><td>51134</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-DsRed-Express2</td><td>Addgene</td><td>51135</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-hCD2</td><td>Addgene</td><td>51143</td><td></td></tr><tr><td>TAL-Syntheseservice</td><td>Life Technologies</td><td>GeneArt Precision TALs</td><td></td></tr><tr><td>3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1</td><td>Addgene</td><td>47948</td><td></td></tr><tr><td>3&fach; FLAG-dCas9/pMXs-puro</td><td>Addgene</td><td>51240</td><td></td></tr><tr><td>3&fach; FLAG-dCas9/pMXs-IG</td><td>Addgene</td><td>51258</td><td></td></tr><tr><td>3&fach; FLAG-dCas9/pMXs-I2</td><td>Addgene</td><td>51259</td><td></td></tr><tr><td>3&fach; FLAG-dCas9/pMXs-neo</td><td>Addgene</td><td>51260</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 Ab</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes anti-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium für SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89985</td><td>Anderes Medium kann bei Life Technologies erworben</td></tr><tr><td>werden Dialysiertes FBS für SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89986</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysin-2HCl für SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89987</td><td>für leichtes Medium</td></tr><tr><td>L-Arginin-HCl für SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89989</td><td>für leichtes Medium</td></tr><tr><td>L-Lysin-2HCl, 13C6 für SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89988</td><td>für schweres Medium</td></tr><tr><td>L-Arginin-HCl, 13C6, 15N4 für SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89990</td><td>für schweres Medium</td></tr><tr><td>Vollständig, mini, EDTA-freier</td> Roche <td>Diagnostics</td><td>4693159</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Disruptor UD-201</td><td>Tomy Seiko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChIP DNA Clean & Konzentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D5205</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads-Protein G</td><td>Life Technologies</td><td>DB10004</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Isogen II</td><td>Nippon Gen</td><td>311-07361</td><td></td></tr><tr><td>Direct-Zol RNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Eine Komponente eines nanoLC-MS/MS-Systems für die MS-Analyse</td></tr><tr><td>nanoLC</td><td>Advance, Michrom Bioresources</td><td></td><td>Eine Komponente eines nanoLC-MS/MS-Systems für die MS-Analyse</td></tr><tr><td>HTC-PAL Autosampler</td><td>CTC Analytics</td><td></td><td>Eine Komponente eines nanoLC-MS/MS-Systems für die MS-Analyse</td></tr></tbody></table>

isolierung von spezifischen genomischen regionen und identifizierung von assoziierten moleküle durch enchip

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Die Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse assoziiert sind, ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation der Funktionen dieser Regionen zu verstehen. Um die unvoreingenommene Identifizierung von Molekülen zu ermöglichen, die mit einer bestimmten genomischen Region von Interesse interagieren, haben wir kürzlich die Technik der DNA-bindenden Molekül-vermittelten Chromatin-Immunpräzipitation (enChIP) entwickelt. Hier beschreiben wir, wie man mit enChIP spezifische genomische Regionen isoliert und die zugehörigen Proteine und RNAs identifiziert. Zunächst wird eine genomische Region von Interesse mit einem Transkriptionsaktivator-ähnlichen (TAL) Protein oder einem CRISPR-Komplex (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) markiert, der aus einer katalytisch inaktiven Form von Cas9 und einer Guide-RNA besteht. Anschließend wird das Chromatin durch Beschallung vernetzt und fragmentiert. Der markierte Locus wird dann immunpräzipitiert und die Vernetzung wird umgekehrt. Schließlich werden die Proteine oder RNAs, die mit dem isolierten Chromatin assoziiert sind, massenspektrometrischen bzw. RNA-Sequenzierungsanalysen unterzogen. Dieser Ansatz ermöglicht die erfolgreiche Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit einer genomischen Region von Interesse assoziiert sind.

Insgesamt kann 1-30% des Ziels genomischen Regionen mittels enChIP gereinigt werden. Figur 3 enthält repräsentative Daten, die die Ausbeuten an enChIP Analysen Targeting Telomeren und den Promotor der Interferon (IFN) regulatory factor-1 (IRF-1) -Gen. Als Beispiele für typische Ergebnisse, Tabelle 1 sind die Proteine ​​mit der IRF-1-Promotors in einer IFN-spezifischen Weise durch enChIP-SILAC Tabelle identifiziert zugeordnet 2 listet die Telomer-bindenden Proteinen durch enChIP kombiniert mit Massenspektrometrie identifiziert (enChIP-MS) und Tabelle 3 zeigt die RNAs mit Telomeren enChIP-RNA-Seq identifiziert verbunden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig1.jpg" /> Abbildung 1. Übersicht über enChIP. enChIP Verwendung CRISPR (A, B) und Elemente (C, D, E </strong&gt;) angezeigt. Ein Ort von Interesse in Verbindung mit technisch DNA-bindende Moleküle wie einen TAL Proteins oder des CRISPR-System, bestehend aus einer katalytisch inaktiven Form Cas9 (DCAS) markiert und Führungs RNA (gRNA). Die molekularen Wechselwirkungen mit Formaldehyd oder anderen Vernetzern, gegebenenfalls fixiert. Anschließend fixiert Chromatin durch Beschallung oder enzymatische Verdauung fragmentiert. Die markierten genomischen Regionen werden durch Affinitätsreinigung gereinigt. Schließlich wird die Vernetzung umgekehrt, und wechselwirkenden Molekülen (genomischen Regionen, RNAs und Proteine) werden unter Verwendung der nächsten Generation Sequenzierung und Massenspektrometrie identifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53478/53478fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig2.jpg" /> Abbildung 2. Reihenfolge der gBlock. Die U6-Promotor (in schwarz), die G-Nukleotid-bevor die Führungssequenz (in blau), die Führungssequenz (gRNA Spacer) (in rot), das Gerüst-Sequenz (in grün) und die Terminator-Sequenz (in orange) angezeigt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Renditen von repräsentativen enChIP Analysen. (A) Prozentuale Eingänge für das Soll-IRF-1-Locus und dem Nicht-Ziel Sox2 Locus. (B) Prozentsatz Eingänge für die Ziel Telomere und Nichtziel-γ-Satelliten. Die Zahlen wurden angepasst und aus früheren Veröffentlichungen 15,16 modifiziert. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Kategorien </td><td> Proteine </td></tr><tr><td> Transkription </td><td> DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo Homolog, PURβ, aktiviert RNA Polymerase II Transkriptionsaktivator p15, BTF3, Myb-bindendeProtein 1A </td></tr><tr><td> Histondeacetylierung, Corepressor Komponenten </td><td> RBBP4, PA2G4, TBL3 </td></tr><tr><td> Acetyltransferase </td><td> Protein-Arginin-N-Methyltransferase 1 </td></tr><tr><td> DNA-Topoisomerase </td><td> DNA-Topoisomerase 2α </td></tr><tr><td> Histone </td><td> Histone H2A.Z, Histon H3.2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Beispiele für Proteine, die mit dem menschlichen IRF-1-Promotor-Region in einem IFN-spezifischen Weise durch enChIP-SILAC identifizierten zugehörigen Die Tabelle ist aus einer früheren Veröffentlichung 16 angepasst. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Kategorien </td><td> Proteine </td></tr><tr><td> Säugetier Telomer-bindenden Proteinen </td><td> PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 </td></tr><tr><td> Telomer-binden Proteine ​​in Hefe oder anderen Organismen </td><td> IMAP4 </td></tr><tr><td> Proteine ​​interagieren mit Telomer-Binde Proteinen assoziiert [Telomer-bindenden Protein] </td><td> DNA-Polymerase α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CtBP1 [FoxP2-POT1], Exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], Exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] </td></tr><tr><td> Proteine ​​zu lokalisieren, um Heterochromatin </td><td> BEND3 </td></tr><tr><td> Proteine ​​regulieren epigenetische Markierungen </td><td> KDM5C </td></tr><tr><td> Proteine, deren Mutationen betreffen Telomerfunktion </td><td> DNA-Polymerase α (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, Glutamat-Cystein-Ligase Glutaredoxin SMRC1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Beispiele für Proteine ​​mit Maus Telomeren enChIP-MS identifiziert, assoziiert Tabelle bereits adapted aus einer früheren Veröffentlichung 15. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Kategorien </td><td> RNAs </td></tr><tr><td> Telomerase-Komponenten </td><td> Terc, rMRP </td></tr><tr><td> Telomer-RNAs </td><td> Terras </td></tr><tr><td> scaRNAs </td><td> Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 </td></tr><tr><td> H / ACA snoRNAs </td><td> Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a </td></tr><tr><td> C / D snoRNAs </td><td> Snord17, Snord15a, Snord118 </td></tr><tr><td> lncRNA </td><td> Neat1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Beispiele für RNAs mit der Maus Telomere durch enChIP-RNA-Seq Die Tabelle hat sich von einer früheren Veröffentlichung 17 angepasst wurden identifiziert verbunden..

Die Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse assoziiert sind, ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation der Funktionen dieser Regionen zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Durchführung einer technischen DNA-bindenden Molekül-vermittelten Chromatin-Imunopräzipitation (enChIP) zur Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit einer bestimmten genomischen Region assoziiert sind.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen spezifischen genomischen Bereich zu isolieren, wobei molekulare Wechselwirkungen erhalten bleiben, um Moleküle zu identifizieren, die mit diesem genomischen Bereich interagieren. Diese Methode kann helfen, Fragen aus dem Bereich der genomischen Funktionen wie Transkription und epigenetische Regulation zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die direkte Identifizierung von Molekülen ermöglicht, die mit einem bestimmten genomischen Bereich interagieren.Den Ablauf wird Toshitsugu Fujita, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstrieren. Konstruieren Sie gemäß dem schriftlichen Protokoll die gewünschten DNA-bindenden Moleküle. Dies beinhaltet die Erzeugung der gewünschten gBlock-Sequenz und deren Einbau in ein Retrovirus, um beispielsweise den Leit-RNA-Komplex in Verbindung mit drei FLAG-dCas9 zu erzeugen.Alternativ können drei FLAG-TAL-Proteine, die die Zielsequenz erkennen, generiert werden. Anschließend infizieren Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll mit dem hergestellten Retrovirus. Bestätigen Sie die Expression der konstruierten DNA-bindenden Moleküle und etablieren Sie die Zelllinie.Fahren Sie nun mit der Vernetzung der Zellen mittels Formaldehyd fort. Suspendieren Sie 20 Millionen transfizierte Zellen in 30 Milliliter regulärem Kulturmedium und geben Sie 810 Mikroliter 37%iges Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 1% zu erreichen. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Beenden Sie nach fünf Minuten die Vernetzungsreaktion durch Zugabe von 3,1 Milliliter 1,25-molarer Glycinlösung.Lassen Sie die Zellen vor der Weiterverarbeitung 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugieren Sie danach das Zellröhrchen fünf Minuten lang bei 300 G in einer gekühlten Zentrifuge. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie das Zellpellet durch Mischen und erneutes Zentrifugieren in 30 Milliliter PBS.Führen Sie zwei PBS-Spülungen durch. Gegebenenfalls kann das gewaschene Pellet fixierter Zellen bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Danach sammeln Sie das Chromatin aus den Zellen.Suspendieren Sie sie in 10 Milliliter Lysepuffer und inkubieren Sie sie 10 Minuten auf Eis. Sammeln Sie die Zellen dann mittels einer gekühlten Zentrifuge und entsorgen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig. Suspendieren Sie das Zellpellet nun in nukleärem Lysepuffer und inkubieren Sie es 10 Minuten auf Eis.Vortexen Sie die Mischung alle paar Minuten während der Inkubation kurz. Sammeln Sie die Zellen erneut durch Zentrifugation. Waschen Sie das Pellet nun mit 10 Milliliter PBS und entfernen Sie die Waschlösung durch eine weitere Zentrifugation.Dadurch entsteht die Chromatin-Fraktion, die gegebenenfalls schockgefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden kann. Fahren Sie fort, indem Sie das Chromatin-Pellet in 800 Mikroliter modifiziertem Lysepuffer drei suspendieren und die Suspension in ein kleineres 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Schalten Sie nun eine Ultraschallsonde auf Stufe drei mit kontinuierlichem Betrieb ein.Um die Chromatin zu fragmentieren, manuell zwischen 10 Sekunden Beschallung und 20 Sekunden auf Eis wechseln. Bei jeder 5. oder 6. Wiederholung die Eispause auf zwei Minuten verlängern, damit die Probe nicht überhitzt. Diesen Beschallungszyklus 10 bis 18 Mal durchführen und dabei die Spitze des Probes vom Boden des Röhrchens fernhalten, um Schaumbildung in der Probe zu vermeiden.Nach der Beschallung sammeln Sie die Probe durch eine schnelle gek&uuml;hlte Zentrifugation ein. Anschlie&szlig;end &uuml;berf&uuml;hren Sie das &Uuml;berstand enthaltende fragmentierte Chromatin in ein neues R&ouml;hrchen und verwerfen das Pellet. Im Textprotokoll finden Sie Angaben dazu, wie die Fragmentierung bewertet wird.Um die Immunpräzipitation vorzubereiten, koppeln Sie zuerst die Antikörper an Dynabeads. Diese Immunpräzipitation ist für Proben ausgelegt, die von 20 Millionen Zellen stammen. Geben Sie ein Fünftel Volumen des modifizierten Lysepuffers drei mit Triton X-100 zum fragmentierten Chromatin hinzu, um eine Endkonzentration von 1 % Triton zu erreichen.Fügen Sie als Nächstes das Gemisch zu den magnetischen Kügelchen hinzu, die mit normalem mausigem IgG konjugiert sind. Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang auf einem Rotator unter Kühlung. Ziehen Sie anschließend die Kügelchen mithilfe eines Magnethalters drei Minuten lang aus der Lösung.Dann sammeln Sie den Überstand. Überführen Sie den Überstand in das Röhrchen mit magnetischen Kügelchen, die mit Anti-FLAG-Antikörpern konjugiert sind. Führen Sie die Konjugationsreaktion über Nacht auf einem Rotator bei vier Grad Celsius durch.Am nächsten Morgen wenden Sie einen Magneten auf das Gefäß an, um die Kügelchen drei Minuten lang zu sammeln. Danach pipettieren Sie den Überstand ab und entsorgen ihn. Waschen Sie nun die Kügelchen.Suspendieren Sie sie in einem Milliliter Puffer mit niedriger Salzkonzentration und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf einem Rotator bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation isolieren Sie die Beads mittels Magnetisierung und verwerfen den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmalig mit Puffer mit niedriger Salzkonzentration.Unter Verwendung derselben Technik zwei weitere Waschungen mit Puffer mit hohem Salzgehalt durchführen. Die Methode weiterverwenden, um die Kügelchen zweimal mit Lithiumchlorid-Puffer zu waschen. Abschließend die Kügelchen nur einmal mit TBS-IGEPAL CA-630 waschen.Nach den sieben Waschschritten die Kügelchen in 200 Mikroliter Elutionspuffer suspendieren und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Kügelchen durch Magnetisierung anziehen und den Überstand in ein neues Röhrchen sammeln. Diesen Elutionsschritt wiederholen, um die Ausbeute zu erhöhen.Danach etwa 5 % der DNA reinigen, um die Ausbeute abzuschätzen. Beginnen Sie damit, den Großteil des Eluats in eine Fällungsreaktion einzumischen. Fällen Sie das Chromatin über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.Am nächsten Tag die Probe zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Den Pellet mit einem Milliliter 70 %igem Ethanol waschen und die Zentrifugation für 10 Minuten wiederholen. Anschließend den Überstand verwerfen und den Pellet in 40 Mikrolitern 2x Probenpuffer suspendieren.Vortexen Sie die Suspension nun fünf Minuten lang vollständig. Anschließend inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 100 Grad Celsius, um die Vernetzungen zu denaturieren und rückgängig zu machen. Nach dem Kochvorgang werden 40 Mikroliter der Probe auf einem SDS-PAGE-Gel aufgetragen.Üblicherweise wird ein Gradient von vier bis 20 % verwendet. Laufen Sie das Gel, bis sich der Farbstoff um einen Zentimeter unterhalb der Mulde bewegt hat. Danach färben Sie das Gel und schneiden es in fünf etwa zwei Millimeter lange Stücke. Verdünnen Sie das Protein aus den Gelecken und verwenden Sie es für die Massenspektrometrie-Analyse. Die Aufreinigung der RNA, gefolgt von der Sequenzierungsanalyse, ist im Textprotokoll beschrieben. Insgesamt können bis zu 10 % der Zielgenomregionen mittels enChIP aufgereinigt werden.Hier sind die Ausbeuten von Analysen dargestellt, die auf den Promotorbereich des IRF-1-Gens abzielen, im Vergleich zum unspezifischen Sox2-Lokus. Ein weiteres Beispiel ist die gezielte Untersuchung von Telomeren im Vergleich zum unspezifischen Gamma-Satelliten-Lokus. Die enChIP-SILAC-Analyse identifizierte mehrere Proteine, die auf spezifische Weise mit dem IRF-1-Promotor im Zusammenhang mit Interferon-Gamma assoziiert sind.Telomer-bindende Proteine wurden ebenfalls mittels enChIP in Kombination mit Massenspektrometrie identifiziert. Anschließend wurde die enChIP-RNA-Sequenzierung verwendet, um die mit den Telomeren assoziierten RNAs zu identifizieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf den Gebieten der Transkription und epigenetischen Regulation den Weg, solche Mechanismen in verschiedenen biologischen Systemen zu untersuchen.

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Biology

Biologie

Hier präsentieren wir eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Verfahren zur genomweiten Ort Analyse von Protein-Isoformen, die in einer Histon-bindende Domäne unterscheiden. Wir wenden es ChIP-Seq-Analyse, um die Ziele des KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Eine Schritt für Schritt-Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von RNA assoziiert Komplexe durch RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

In diesem Video demonstrieren wir die Chromatin-Immunpräzipitationstechnik zur Identifizierung von Proteinbindungsstellen an spezifischen Regionen der genomischen DNA von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch die selektive Immunpräzipitation von proteingebundenen Chromatinfragmenten. Diese Methode hilft, das Zusammenspiel mehrerer regulatorischer Proteine zu untersuchen, einschließlich Transkriptionsfaktoren, die an der Genregulation beteiligt sind.

Chromatin-Immunpräzipitation zur Identifizierung von Zielprotein-Bindungsstellen auf genomischer DNA

Dieses Video Artikel beschreibt ein in vitro-Mikroarray-basierte Methode, um die Gen-Targets und Bindungsstellen für Zweikomponentensystem Antwortregulatoren bestimmen.

DNA-Affinitäts-gereinigten Chip (DAP-Chip)-Methode, um Gene für bakterielle Ziele fest, Zwei-Komponenten-Systeme Regulatory

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um eine Auflösung nahe der Basenpaarauflösung von Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erreichen. Dies wird durch eine Exonuklease-Behandlung von DNA-Fragmenten erreicht, die selektiv durch Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP-exo) angereichert sind, gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung.

Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vitro Selektion von technisch hergestellten Transkriptionsrepressoren (ETRs) mit hoher, langfristiger, stabiler On-Target-Silencing-Effizienz und geringer genomweiter Off-Target-Aktivität vor. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es, ein anfängliches, komplexes Repertoire von ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste zu reduzieren, die für die weitere Evaluierung in therapeutisch relevanten Umgebungen geeignet ist.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Die iChip-Technik nutzt ein kostengünstiges und einfaches In-situ-Isolationsgerät , das die Raten der Entdeckung neuartiger Mikroorganismen aus dem Boden erhöht. Neuartige Mikroorganismen können unter anderem für weitere Studien im Zusammenhang mit dem Bodenmikrobiom oder der Entdeckung von Naturstoffen verwendet werden.

Isolierung von Bodenmikroorganismen mit der iChip-Technologie

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur Identifizierung direkter lncRNA-Protein-Interaktionen.

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur verifizierbaren Identifikation von Proteinen, die direkt mit LncRNA interagieren: Von kultivierten Zellen bis zum Maus-Hoden

Erfahren Sie die enChIP-Technik zur Isolierung spezifischer genomischer Regionen und Identifizierung assoziierter Proteine und RNAs. Diese Methode ermöglicht direkte Analysen molekularer Interaktionen für transkriptionelle und epigenetische Regulationsstudien.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

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