Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP
20. Januar 2016
Die Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse assoziiert sind, ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation der Funktionen dieser Regionen zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Durchführung einer technischen DNA-bindenden Molekül-vermittelten Chromatin-Imunopräzipitation (enChIP) zur Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit einer bestimmten genomischen Region assoziiert sind.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen spezifischen genomischen Bereich zu isolieren, wobei molekulare Wechselwirkungen erhalten bleiben, um Moleküle zu identifizieren, die mit diesem genomischen Bereich interagieren. Diese Methode kann helfen, Fragen aus dem Bereich der genomischen Funktionen wie Transkription und epigenetische Regulation zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die direkte Identifizierung von Molekülen ermöglicht, die mit einem bestimmten genomischen Bereich interagieren.
Den Ablauf wird Toshitsugu Fujita, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstrieren. Konstruieren Sie gemäß dem schriftlichen Protokoll die gewünschten DNA-bindenden Moleküle. Dies beinhaltet die Erzeugung der gewünschten gBlock-Sequenz und deren Einbau in ein Retrovirus, um beispielsweise den Leit-RNA-Komplex in Verbindung mit drei FLAG-dCas9 zu erzeugen.
Alternativ können drei FLAG-TAL-Proteine, die die Zielsequenz erkennen, generiert werden. Anschließend infizieren Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll mit dem hergestellten Retrovirus. Bestätigen Sie die Expression der konstruierten DNA-bindenden Moleküle und etablieren Sie die Zelllinie.
Fahren Sie nun mit der Vernetzung der Zellen mittels Formaldehyd fort. Suspendieren Sie 20 Millionen transfizierte Zellen in 30 Milliliter regulärem Kulturmedium und geben Sie 810 Mikroliter 37%iges Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 1% zu erreichen. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Beenden Sie nach fünf Minuten die Vernetzungsreaktion durch Zugabe von 3,1 Milliliter 1,25-molarer Glycinlösung.
Lassen Sie die Zellen vor der Weiterverarbeitung 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugieren Sie danach das Zellröhrchen fünf Minuten lang bei 300 G in einer gekühlten Zentrifuge. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie das Zellpellet durch Mischen und erneutes Zentrifugieren in 30 Milliliter PBS.
Führen Sie zwei PBS-Spülungen durch. Gegebenenfalls kann das gewaschene Pellet fixierter Zellen bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Danach sammeln Sie das Chromatin aus den Zellen.
Suspendieren Sie sie in 10 Milliliter Lysepuffer und inkubieren Sie sie 10 Minuten auf Eis. Sammeln Sie die Zellen dann mittels einer gekühlten Zentrifuge und entsorgen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig. Suspendieren Sie das Zellpellet nun in nukleärem Lysepuffer und inkubieren Sie es 10 Minuten auf Eis.
Vortexen Sie die Mischung alle paar Minuten während der Inkubation kurz. Sammeln Sie die Zellen erneut durch Zentrifugation. Waschen Sie das Pellet nun mit 10 Milliliter PBS und entfernen Sie die Waschlösung durch eine weitere Zentrifugation.
Dadurch entsteht die Chromatin-Fraktion, die gegebenenfalls schockgefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden kann. Fahren Sie fort, indem Sie das Chromatin-Pellet in 800 Mikroliter modifiziertem Lysepuffer drei suspendieren und die Suspension in ein kleineres 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Schalten Sie nun eine Ultraschallsonde auf Stufe drei mit kontinuierlichem Betrieb ein.
Um die Chromatin zu fragmentieren, manuell zwischen 10 Sekunden Beschallung und 20 Sekunden auf Eis wechseln. Bei jeder 5. oder 6. Wiederholung die Eispause auf zwei Minuten verlängern, damit die Probe nicht überhitzt. Diesen Beschallungszyklus 10 bis 18 Mal durchführen und dabei die Spitze des Probes vom Boden des Röhrchens fernhalten, um Schaumbildung in der Probe zu vermeiden.
Nach der Beschallung sammeln Sie die Probe durch eine schnelle gekühlte Zentrifugation ein. Anschließend überführen Sie das Überstand enthaltende fragmentierte Chromatin in ein neues Röhrchen und verwerfen das Pellet. Im Textprotokoll finden Sie Angaben dazu, wie die Fragmentierung bewertet wird.
Um die Immunpräzipitation vorzubereiten, koppeln Sie zuerst die Antikörper an Dynabeads. Diese Immunpräzipitation ist für Proben ausgelegt, die von 20 Millionen Zellen stammen. Geben Sie ein Fünftel Volumen des modifizierten Lysepuffers drei mit Triton X-100 zum fragmentierten Chromatin hinzu, um eine Endkonzentration von 1 % Triton zu erreichen.
Fügen Sie als Nächstes das Gemisch zu den magnetischen Kügelchen hinzu, die mit normalem mausigem IgG konjugiert sind. Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang auf einem Rotator unter Kühlung. Ziehen Sie anschließend die Kügelchen mithilfe eines Magnethalters drei Minuten lang aus der Lösung.
Dann sammeln Sie den Überstand. Überführen Sie den Überstand in das Röhrchen mit magnetischen Kügelchen, die mit Anti-FLAG-Antikörpern konjugiert sind. Führen Sie die Konjugationsreaktion über Nacht auf einem Rotator bei vier Grad Celsius durch.
Am nächsten Morgen wenden Sie einen Magneten auf das Gefäß an, um die Kügelchen drei Minuten lang zu sammeln. Danach pipettieren Sie den Überstand ab und entsorgen ihn. Waschen Sie nun die Kügelchen.
Suspendieren Sie sie in einem Milliliter Puffer mit niedriger Salzkonzentration und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf einem Rotator bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation isolieren Sie die Beads mittels Magnetisierung und verwerfen den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmalig mit Puffer mit niedriger Salzkonzentration.
Unter Verwendung derselben Technik zwei weitere Waschungen mit Puffer mit hohem Salzgehalt durchführen. Die Methode weiterverwenden, um die Kügelchen zweimal mit Lithiumchlorid-Puffer zu waschen. Abschließend die Kügelchen nur einmal mit TBS-IGEPAL CA-630 waschen.
Nach den sieben Waschschritten die Kügelchen in 200 Mikroliter Elutionspuffer suspendieren und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Kügelchen durch Magnetisierung anziehen und den Überstand in ein neues Röhrchen sammeln. Diesen Elutionsschritt wiederholen, um die Ausbeute zu erhöhen.
Danach etwa 5 % der DNA reinigen, um die Ausbeute abzuschätzen. Beginnen Sie damit, den Großteil des Eluats in eine Fällungsreaktion einzumischen. Fällen Sie das Chromatin über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.
Am nächsten Tag die Probe zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Den Pellet mit einem Milliliter 70 %igem Ethanol waschen und die Zentrifugation für 10 Minuten wiederholen. Anschließend den Überstand verwerfen und den Pellet in 40 Mikrolitern 2x Probenpuffer suspendieren.
Vortexen Sie die Suspension nun fünf Minuten lang vollständig. Anschließend inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 100 Grad Celsius, um die Vernetzungen zu denaturieren und rückgängig zu machen. Nach dem Kochvorgang werden 40 Mikroliter der Probe auf einem SDS-PAGE-Gel aufgetragen.
Üblicherweise wird ein Gradient von vier bis 20 % verwendet. Laufen Sie das Gel, bis sich der Farbstoff um einen Zentimeter unterhalb der Mulde bewegt hat. Danach färben Sie das Gel und schneiden es in fünf etwa zwei Millimeter lange Stücke.
Verdünnen Sie das Protein aus den Gelecken und verwenden Sie es für die Massenspektrometrie-Analyse. Die Aufreinigung der RNA, gefolgt von der Sequenzierungsanalyse, ist im Textprotokoll beschrieben. Insgesamt können bis zu 10 % der Zielgenomregionen mittels enChIP aufgereinigt werden.
Hier sind die Ausbeuten von Analysen dargestellt, die auf den Promotorbereich des IRF-1-Gens abzielen, im Vergleich zum unspezifischen Sox2-Lokus. Ein weiteres Beispiel ist die gezielte Untersuchung von Telomeren im Vergleich zum unspezifischen Gamma-Satelliten-Lokus. Die enChIP-SILAC-Analyse identifizierte mehrere Proteine, die auf spezifische Weise mit dem IRF-1-Promotor im Zusammenhang mit Interferon-Gamma assoziiert sind.
Telomer-bindende Proteine wurden ebenfalls mittels enChIP in Kombination mit Massenspektrometrie identifiziert. Anschließend wurde die enChIP-RNA-Sequenzierung verwendet, um die mit den Telomeren assoziierten RNAs zu identifizieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf den Gebieten der Transkription und epigenetischen Regulation den Weg, solche Mechanismen in verschiedenen biologischen Systemen zu untersuchen.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die mittels konstruierter DNA-bindender Moleküle vermittelte chromatinimmunpräzipitations-Technik (enChIP) zur Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit spezifischen genomischen Regionen assoziiert sind. Es stellt eine detaillierte Methodik zur Isolierung molekularer Wechselwirkungen bereit, die entscheidend für das Verständnis genomischer Funktionen sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Genomik
- Epigenetik
- Molekularbiologie
Hintergrund
- Das Verständnis molekularer Wechselwirkungen mit genomischen Regionen ist entscheidend, um regulatorische Mechanismen aufzuklären.
- enChIP ermöglicht die direkte Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Bereichen interagieren.
- Diese Methode ist anwendbar in Studien zur Transkription und epigenetischen Regulation.
- Sie verbessert die Fähigkeit, komplexe genomische Funktionen zu untersuchen.
Zweck der Studie
- Isolierung spezifischer genomischer Regionen und Identifizierung der daran bindenden Moleküle.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung transkriptioneller und epigenetischer Regulation.
- Effektive Demonstration der enChIP-Technik.
Verwendete Methoden
- Herstellung von DNA-bindenden Molekülen unter Verwendung von gBlock-Sequenzen und Retroviren.
- Vernetzung von Zellen und Isolierung von Chromatin.
- Fragmentierung von Chromatin durch Sonifikation.
- Durchführung der Immunpräzipitation mit konjugierten Antikörpern.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Chromatin aus transfizierten Zellen.
- Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit spezifischen genomischen Regionen assoziiert sind.
- Nachweis einer effektiven Anreicherung gezielter genomischer Regionen mittels enChIP.
- Ausbeutebestimmung durch Massenspektrometrie-Analyse.
Schlussfolgerungen
- enChIP ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um molekulare Wechselwirkungen an spezifischen genomischen Stellen zu untersuchen.
- Die Methode liefert Einblicke in die transkriptionelle und epigenetische Regulation.
- Sie kann für verschiedene Anwendungen in der genomischen Forschung genutzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
enChIP ermöglicht die direkte, unvoreingenommene Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit spezifischen genomischen Regionen interagieren, und unterstützt die mechanistische Risikominderung bei der Target-Validierung. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit, indem genomische Loci mit funktionellen molekularen Interaktionen in der Transkription und epigenetischen Regulation verknüpft werden. Er bietet eine skalierbare Methode für die frühe entdeckungsorientierte Biologie, um die Portfolio-Priorisierung zu informieren und biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien zu verringern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen, indem direkte molekulare Interaktoren genomischer Regionen von Interesse identifiziert werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch unvoreingenommene proteomische und transkriptomische Profilierung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem der Pfadkontext und regulatorische Mechanismen geklärt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte Chromatin-Präparationen für die nachgeschaltete Untersuchung molekularer Wechselwirkungen vor.
- Operativer Wert: Standardisiert die Isolierung spezifischer genomischer Regionen mit quantifizierbarer Ausbeute (bis zu 10 % Reinigungseffizienz).
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform an verschiedenen Loci (z. B. Promotoren, Telomere) mittels TAL- oder CRISPR-dCas9-Technologie.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet genomische Befunde im Entdeckungsstadium mit krankheitsrelevanten Mechanismen durch Identifizierung assoziierter Moleküle.
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht biomarkerbasierte Nachuntersuchungen mittels Massenspektrometrie oder RNA-Sequenzierung isolierter Komplexe.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt die Priorisierung präklinischer Zielstrukturen, indem kontextspezifische Interaktoren aufgedeckt werden (z. B. interferon-gamma-spezifische IRF-1-Assoziationen).
Pipeline- und Workflow-Integration
enChIP fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung eines Zielmoleküls bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen ein und liefert molekulare Interaktionsdaten, die genomische Annotation und funktionelle Validierung verbinden.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Isolierung genomischer Regionen unter Erhaltung nativer molekularer Wechselwirkungen.
- Screening: Erzeugt assaysbereite Chromatin-Fraktionen zur Profilierung von Wechselwirkungen unter chemischen oder genetischen Störungen.
- Analytik: Ermöglicht den quantitativen Vergleich assoziierter Moleküle über verschiedene Bedingungen hinweg anhand von Massenspektrometrie- oder RNA-seq-Auswertungen.
- Translationale Forschung: Verbindet genomische Loci mit phänotypischen Mechanismen über identifizierte Proteine und RNAs.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Kapazität zur lokus-spezifischen Interaktom-Aufklärung über Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten bei Genomfunktionsstudien durch die direkte Identifizierung von Interaktionspartnern.
- Operationaler Wert: Ermöglicht reproduzierbare, standardisierte Isolierung markierter genomischer Regionen mittels antikörperbasierter Immunpräzipitation.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem der Zielmechanismus früh im Entdeckungsprozess validiert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung basierend auf dem molekularen Kontext genomischer Zielstrukturen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in molekularer Klonierung zur Konstruktion von TAL- oder gBlock-CRISPR-DNA-bindenden Molekülen.
- Benötigt Zugang zu Beschallungsgeräten, magnetischen Trennwerkzeugen und analytischen Methoden der nachgeschalteten Analytik (Massenspektrometrie, RNA-Seq).
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Epitopmarkierung (z. B. FLAG) und den Antikörper-Konjugationsabläufen voraus.
- Muss die Chromatinzugänglichkeit und die Effizienz der Epitope in unterschiedlichen genomischen Regionen und Zelltypen berücksichtigen.
- Praktische Einschränkung: Die Effizienz hängt vom erfolgreichen Anbringen der Markierung und der Expression der konstruierten DNA-bindenden Moleküle in den Zielzellen ab.
