Name: Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Erfahren Sie die semi-automatisierte Vorbereitung von Antikörper-Cocktails für die Immunphänotypisierung von menschlichem peripherem Blut. Diese Methode minimiert die Variabilität bei der Reagenzienzufuhr und erhöht die Pipettiergenauigkeit erheblich.

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Wir danken Hannah Puzas für die Unterstützung beim Systemdesign und der Konfiguration und Kevin Khovananth für die technische Beratung. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde von den Hearst Foundations und der Providence Portland Medical Foundation zur Verfügung gestellt.

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YK, ILG, TLM, WLM, DPH und KSB: Keine konkurrierenden finanziellen Interessen. ANT ist ein Mitarbeiter von Beckman Coulter, Inc. Die Veröffentlichung dieses Video-Artikel wird von Beckman Coulter, Inc. gesponsert

Immunphänotypisierung der peripheren Blut ist von entscheidender Bedeutung für Einblicke in individuelle Reaktionen auf die Immuntherapie gewinnt. Die Herausforderung liegt in Test Standardisierung Experiment zu Experiment Variabilität 1,14 zu steuern. Eine Hauptquelle der Veränderlichkeit liegt im menschlichen Manipulation von Proben. Daher ist es denkbar, dass eine teilweise oder vollständige Automatisierung der Probenaufbereitung eine dramatische Reduktion in Experiment zu Experiment Variabilität 1,14 erleichtert. In diesem Protokoll, können wir unsere erfolgreichen Bemühungen Assay Variabilität zu minimieren, indem eine automatisierte Flüssigkeitshandhabungs ausgestattet mit 2D-Barcode-Leser für die Probenfärbung im Vollblut Immunophänotypisierung einzuführen. Im Design ist unser Verfahren vielseitig und kann durch Hinzufügen zusätzlicher &quot;Basis Cocktails&quot; zu definieren sie andere Immununtergruppen überwachen. Solche Untergruppen umfassen T-Helferzellen, T regulatorischen Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, dendritische Zellen und Monozyten (Manuskript inVorbereitung) 18. Wir passten die empfohlene Antikörper-Panels des Konsortiums durch zusätzliche Marker eingeführt werden 1. Zellpopulationen wurden mit &quot;Basis Cocktail&quot; konjugiert mit Fluorochromen mit minimalen Emissionen in der brillanten Violett 421 (BV421), Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC) Detektoren identifiziert, wie wir diese Kanäle für den Nachweis der induzierbaren Antigene zu reservieren wollte. Diese Funktion sorgt nicht nur für die höchste Empfindlichkeit Aktivierungsstatus von Immunzellen zu überwachen, sondern ermöglicht auch eine flexible Unterkunft neuer Aktivierungsmarker wie diese drei Fluorochrome werden am häufigsten mit Antikörpern gegen induzierbare Marker konjugiert. Deshalb ist unsere Methode nicht nur für Cocktail Vorbereitung für Vollblut Immunphänotypisierung geeignet, sondern ist auch nützlich zum Anfärben anderen Proben einschließlich peripheren mononukleären Blutzellen und von disaggregierten Gewebe gewonnenen Zellen (zB Tumor). erfolgreiche IntroHerstellung unserer Methode erfordert den Schritten in Labware Herstellung und Programmierung und Ausführung des Verfahrens besondere Aufmerksamkeit. Herstellung der Rohre 2D-Barcode enthält Markierung mit für Menschen lesbaren Etiketten und Überführen der Antikörper an den dafür vorgesehenen Tuben. Um die Einführung von Fehlern zu vermeiden, wird empfohlen, tun wir das mit zwei Personen. Jedes Mal, wenn Tabellen ändern, sollten die Ermittler prüfen, ob das Verfahren korrekt funktioniert. Die Wahl geeigneter Pipettiermethoden während Programmierung sorgt für erfolgreiche Flüssigkeitstransfer. LLS ermöglicht Pipettieren ohne von der Unterseite des Antikörper Rohre gefällte Schmutz immer, für die wir entweder P50 oder P200 leitfähige Spitzen verwenden. LLS kann nicht eine gute Option für P1000 Tipps, wie LLS empfindlicher mit P1000 Tipps und manchmal fälschlicherweise durch die Anwesenheit von Luftblasen ausgelöst. Heights in Laborgeräte Definition sollte für jedes Instrument als suboptimal Flüssigkeitsübertragung auftreten kann, zum Beispiel eingestellt werden, wenn es nicht genug Platz zwischen dem Rand der Tipps istund die Unterseite der Rohre. Wie in 12 gezeigt, wenn der &quot;Basis Cocktail&quot; und / oder &quot;Aktivierung Cocktail&quot; sind nicht gut verwirbelt, kann es zu einer suboptimalen Flecken führen. Wir dachten an gefriergetrockneten Reagenzien für die Zellfärbung als Alternative Ansatz zur Reduzierung der Variabilität im Zusammenhang mit Reagenz 19 zu verzichten. Allerdings Polymer-Konjugate von brillanten violetten Farbstoffen sind bekannt mit einander zu verursachen unspezifische Signale zu interagieren. Als solche Zugabe von mehr als zwei Polymer-Konjugate (zB BV421 und BV650 etc.) in lyophilisierten Reagenzien unspezifische Signalisierung verursachen kann (zum Beispiel, Erhöhung der BV650 Hintergrundsignal in BV421 + Bevölkerung) 20. Darüber hinaus fehlt lyophilisierten Reagenzien Flexibilität für neue Färbung einschließlich. Sie sind in der Regel teurer und erfordern einen Großauftrag. Aus diesen Gründen haben wir uns für den automatisierten Liquid Handler mit den Barcode-Rohre 2D ausgestattet zu verwenden. Obwohl es takes Zeit einzurichten und bringt eine Vorab-Investition, das Instrument zu kaufen, wird auf die Dauer solcher Faktoren für die Steigerung der Produktivität und Reproduzierbarkeit von Tests kompensiert werden. In der Tat, berichtet ein paar Gruppen zuvor die erfolgreiche Integration des automatisierten Liquid Handler in ihren Workflow von Immunphänotypisierung oder ähnliche Anwendungen 21,22. Automatisierte Lösungen für die Durchflusszytometrie-Analyse sind auch im Handel erhältlich (FACS SPA III Automatische Cocktail Vorbereitung Workstation und FlowStainer). Dies zeigt, weiter gibt es einen großen Bedarf an automatisierter Cocktail Vorbereitung für Immunphänotypisierung. Nachdem diese Technik zu beherrschen, stellen wir uns, dass die Entwicklung von vollständig Vollblut Immunophänotypisierung automatisiert wird weiteres Experiment zu Experiment Variabilität reduzieren und könnte Vollblut Immunophänotypisierung möglich sogar in einer multizentrischen klinischen Studie Einstellung 23 machen. Wir haben bereits eine Lyse begonnen Verwendung warh Assistent die Lyse und Waschschritte zu automatisieren. Wir sehen auch, dass automatische Bestimmung des Volumens der Antikörper in den 2D-Barcode-Rohre und die Verfolgung von Reagenzienzugabe stark Inventar von Antikörpern zu verbessern und die Qualität Kontrolle über unsere Methode auf.

Immunphänotypisierung von menschlichen peripheren Blut bestimmt quantitative und qualitative Veränderungen der Immunzelluntergruppen ein. Es gibt einen Einblick in Wirkmechanismen und Widerstand, unterstützt Entdeckung prädiktiver Biomarker, und erleichtert die Entwicklung von Immuntherapien Kombination. Daher ist die Validierung und Standardisierung von Immunophänotypisierung ein Gebiet von großem Interesse für die akademische Forschung, klinische Labors und Industrie. Obwohl Immunphänotypisierung der peripheren Blut durch Durchflusszytometrie-Verfahren ist derzeit für die klinische Behandlung von hämatologischen Malignitäten verwendet 2,3 und Human Immunodeficiency Virus (HIV) 4,5, zuverlässige Immunphänotypisierung der peripheren Blut für die Immuntherapie Anforderungen spezifischen Überlegungen bei der Validierung und Standardisierung, weil es erfordert umfassendere Berichterstattung über Immunzelluntergruppen und die Aktivierung / inhibitorische Rezeptoren 1,6-8. successful Immunophänotypisierung erfordert eine sorgfältige Standardisierung Experiment zu Experiment Variabilität Geräteeinstellung und die Zelle Färbeverfahren 9,10 Bezug zu minimieren. Indem die Standardisierung von Geräteeinstellungen für die Durchflusszytometrie gut etabliert ist die ehemalige Sorge 9,11,12 anzugehen, bleibt es unklar, wie Variabilität Zellfärbung ohne Einschränkung Abdeckung der Immunzelluntergruppen und deren Aktivierungsstatus im Zusammenhang zu minimieren. Da die Anzahl von Antigenen erhöht erkannt werden, tut dies auch die Möglichkeit für Fehler und Variabilität zu suboptimalen Reagenzabgabestation wegen und Kreuzkontamination. Methoden zur phenoptypic Analyse von antikoaguliertem Vollblut wurden in den späten 1980er Jahren für den Einsatz in der klinischen Labortests festgestellt. Dieselben Methoden dienen, die Bedürfnisse des Forschungslabors für die Probenvorbereitung. Wichtig ist, dass die Antikörper-Cocktails im klinischen Labor verwendet typischerweise weniger komplex und Available vorher titriert und vorgemischt vom Hersteller. Nur eine einzige Übertragung von den vorgemischten Antikörper-Cocktail ist nicht erforderlich. In der Forschung Einstellung, sind Antikörper-Cocktails von 10-16 Antikörper typisch. Jeder Cocktail muss für die Stabilität des Labors validiert werden oder frisch zubereitet vor jedem Test. mehrere Antikörper-Cocktails für eine Probe vorbereiten könnte das Pipettieren von 50 bis 80 einzelnen Antikörper mit sich bringen, eine Aufgabe, die sowohl mühsam und fehleranfällig ist. Automation von Cocktail-Zubereitung mehrere Vorteile gegenüber manuellen Cocktail Vorbereitung wie weniger Fehler hat, erhöhte Genauigkeit von Pipettieren, und möglicherweise sogar gesunken Reagenz Verschwendung. Hier berichten wir über die erfolgreiche Einführung eines automatisierten Liquid Handler mit einem zweidimensionalen (2D) Barcode-Leser in die Zelle-Färbeprozess von Immunophänotypisierung Variabilität zu minimieren bezogene Vorbereitung zu probieren.

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>NXp Span-8 Labor-Automatisierungs-Workstation&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31839</td><td>Workstation für Laborautomatisierung</td></tr><tr><td>Einsatz, Röhrchen, 11 mm, weiß, für 1,5 ml Mikrofugenröhrchen (25 Stück)</td><td>Beckman Coulter</td><td>373696</td><td>Zubehör für 24-Positionen-Röhrchengestell zur Aufnahme von Mikrofugenröhrchen.</td></tr><tr><td>LLS-Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>719262</td><td>Befestigen Sie die Unterseite des Decks in der Laborautomatisierungs-Workstation, um die Füllstandsmessung zu ermöglichen</td></tr><tr><td>24-Positionen-Röhrchengestell</td><td>Beckman Coulter</td><td>373661</td><td>Röhrchengestell zur Aufnahme von Mikrofuge-Röhrchen für Antikörper-Cocktails oder Blut</td></tr><tr><td>BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12 x 24 ZOLL RED</td><td>LabMart</td><td>M111416</td><td>Einweg-Autoklavenbeutel für die Laborautomatisierungs-Workstation</td></tr><tr><td>VisionMate Hochgeschwindigkeits-2D-Barcode-Lesegerät</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1850</td><td>2D-Barcode-Lesegerät</td></tr><tr><td>8-Kanal-Handheld-Schraubverschluss-Verschließer/Entdeckeler</td><td>Thermo Scientific</td><td>4105MAT</td><td>Zum Entdeckeln und Verschließen von 2D-Barcode-Röhrchen&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-335</td><td>Zur Herstellung von Cocktails oder zur Zuführung von Blutproben an die Laborautomation</td></tr><tr><td>Workstation CoolRack XT CFT24</td><td>Biokommunikation</td><td>BCS-534</td><td>Zur Aufnahme von Probenröhrchen.</td></tr><tr><td>1,0 ml Matrix-Röhrchen mit Schraubverschluss in Latch-Racks</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741AMB</td><td>2D-Barcode-Röhrchen zur Aufbewahrung von fluoreszierenden Farbstoff-kojugierten Antikörpern</td></tr><tr><td>Biomek Span-8 P1000 Spitzen, leitfähig, vorsteril mit Barriere, 1.025 &; Mikro; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>987925</td><td>Tipps für Laborautomatisierungs-Workstations&nbsp;</td></tr><tr><td>Biomek Span-8 P50 Spitzen, leitfähig, vorsteril mit Barriere, 50 & Mikro; l (Gehäuse mit 10 Racks)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B01091</td><td>Tipps für Laborautomatisierungs-Workstation&nbsp;</td></tr><tr><td>Biomek Span-8 P250 Spitzen, leitfähig, vorsteril mit Barriere (Karton mit 10 Racks)</td><td>Beckman Coulter</td><td>394627 Spitzen für Laborautomations-Workstation&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Lyselösung 10x Konzentrat</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>Erythrozytenlyse</td></tr><tr><td>Falcon Polystyrolröhrchen mit rundem Boden</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-5</td><td>Probenröhrchen</td></tr><tr><td>Anti-CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Basis)</td></tr><tr><td>Anti-CD3 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0038-42</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Basis)</td></tr><tr><td>Anti-CD4 PerCPCy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>341654</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Basis)</td></tr><tr><td>Anti-TCRgd BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>564156</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Basis)</td></tr><tr><td>Anti-TCRab BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>563825</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Basis)</td></tr><tr><td>Anti-CD8 APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Basis)</td></tr><tr><td>Anti-CCR7 PE-CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562381</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Basis)</td></tr><tr><td>Anti-CD45RA PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337167</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Basis)</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562804</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Aktivierung)</td></tr><tr><td>Anti-CD278(ICOS) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557802</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Aktivierung)</td></tr><tr><td>Anti-CD38 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340439</td><td>Effektor-T-Zell-Panel (Aktivierung)</td></tr><tr><td>Anti-CD279(PD1) BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562516</td><td>Effektor-T-Zell-Panel (Aktivierung)</td></tr><tr><td>Anti-CD357(GITR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5875-42</td><td>Effektor-T-Zell-Panel (Aktivierung)</td></tr><tr><td>Anti-CD137(41BB) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550890</td><td>Effektor-T-Zell-Panel (Aktivierung)</td></tr><tr><td>Anti-CD69 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562884</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Aktivierung)</td></tr><tr><td>Anti-CD314(NKG2D) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557940</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Aktivierung)</td></tr><tr><td>Anti-CD134(OX40) APC</td><td>BioLegend</td><td>350008</td><td>Effektor T-Zell-Panel (Aktivierung)</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Blutentnahmeröhrchen aus Kunststoff mit Natrium-Heparin: Konventioneller Stopper</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-689-6</td><td>Zur Blutentnahme</td></tr><tr><td>Albumin, Rinderserum, Fraktion V, RIA und ELISA</td><td>EMD Millipore</td><td>126593</td><td>Für Fließwaschpuffer</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td>Für Fließwaschpuffer</td></tr><tr><td>Heparin, Natriumsalz</td><td>Affimetrix</td><td>16920</td><td>Für Fließwaschpuffer</td></tr><tr><td>Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS), 1x, mit Calcium, Magnesium, ohne Phenolrot</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30588.02</td><td>Für Flow-Wash-Puffer</td></tr></tbody></table>

ein semi-automatisierten ansatz zur vorbereitung antikörper-cocktails für immunphänotypische analyse von menschlichem peripherem blut

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunphänotypisierung von peripheren Blutfluss durch Zytometrie bestimmt Änderungen in der Frequenz und Aktivierungsstatus peripherer Leukozyten während Krankheit und Behandlung. Es hat das Potenzial therapeutische Wirksamkeit vorherzusagen und neue therapeutische Targets zu identifizieren. Vollblut-Färbung verwendet unmanipulierte Blut, die Artefakte minimiert, die während der Probenvorbereitung auftreten können. Allerdings müssen Vollblut Färbung auch auf frisch gesammelte Blut durchgeführt werden, die Integrität der Probe zu gewährleisten. Darüber hinaus ist es am besten, Antikörper-Cocktails am selben Tag zu bereiten potentielle Instabilität von Tandem-Farbstoffe zu vermeiden und Reagenz Interaktion zwischen brillanten violetten Farbstoffe verhindern. Daher erfordert Vollblut-Färbung vorsichtig Standardisierung für Intra- und Inter-experimentellen Variabilität zu steuern. Hier berichten wir Bereitstellung eines automatisierten Liquid Handler mit einem zweidimensionalen (2D) Barcode-Leser in einem Standardprozess Antibod macheny Cocktails für die Durchflusszytometrie. Die Antikörper wurden in Röhrchen mit Barcode 2D in einer 96-Well-Format angeordnet übertragen und deren Inhalte in einer Datenbank zusammengestellt. Das Liquid Handler könnte dann die Quell Antikörper Fläschchen finden, indem Sie in der Datenbank Antikörper Namen referenzieren. Unsere Methode eliminiert langwierige Koordination für die Positionierung der Quelle Antikörper Rohre. Vorgesehen Vielseitigkeit ermöglicht dem Benutzer, auf einfache Weise eine beliebige Anzahl von Details in den Antikörper Abgabevorgang ändern, wie beispielsweise spezifische Antikörper zu verwenden, Volumen und Ziel durch die Datenbank zu modifizieren, ohne für jeden Test die Skript in dem Softwareverfahren neu zu schreiben. Ein Proof of Concept-Experiment erreicht hervorragende inter- und intra Assay-Präzision, demonstriert durch wiederholte Herstellung einer 11-Farben-17-Antikörper Durchflusszytometrie-Assay. Diese Methoden erhöht den Gesamtdurchsatz für die Durchflusszytometrie Assays und täglich Herstellung des Komplexes Antikörper-Cocktails, die für die detaillierte pheno erleichterttypic Charakterisierung von frisch gesammelten antikoaguliertem peripherem Blut.

Die Immunphänotypisierung im Vollblut ist für die Überwachung des menschlichen Immunsystems unverzichtbar. Die Anzahl der erforderlichen Reagenzien und die Instabilität bestimmter Fluorochrome in vorgemischten Cocktails erfordern jedoch eine tägliche Vorbereitung der Reagenzien. Hier zeigen wir, dass die halbautomatische Herstellung von Färbeantikörpercocktails dazu beiträgt, eine zuverlässige Immunphänotypisierung zu etablieren, indem sie die Variabilität bei der Reagenzienabgabe minimiert.

Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Das übergeordnete Ziel dieses halbautomatischen Vorbereitungsprotokolls für Färbe-Antikörper-Cocktails ist es, eine zuverlässige Immunphänotypisierungsmethode zu etablieren, um die Variabilität der Reagenzienabgabe zu minimieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich des Immunmonitorings zu lösen, wie z. B. die Kontrolle der intra- und interexperimentellen Variabilität durch die Abgabe von Reagenzien. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Automatisierung der Cocktailzubereitung die Pipettiergenauigkeit erhöht und gleichzeitig die Fehler bei der manuellen Cocktailzubereitung reduziert. Das Verfahren wird von Iliana Gonzalez, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, bringen Sie menschenlesbare Etiketten auf 2D-Barcode-Röhrchen an. Übertragen Sie anschließend den gesamten Inhalt jedes Fläschchens mit Antikörpern in die entsprechenden 2D-Barcode-Röhrchen, wobei Sie darauf achten müssen, Blasen zu vermeiden. Wenn die Antikörper übertragen wurden, verwenden Sie den 2D-Barcode-Leser, um die Röhrchen zu lesen. Erstellen Sie dann eine Tabelle mit den Antikörpernamen und dem Barcode, der gelesen wird, und speichern Sie die Tabelle als Datei mit kommagetrennten Werten. Starten Sie nun den 2D-Barcode-Leser und dann den automatisierten Liquid Handler. Um die Spritzen des automatisierten Liquid Handlers zu grundieren, wählen Sie unter Instrument die Option Home All Axes.Vergewissern Sie sich, dass keine der Spritzen sichtbare Luftblasen enthält. Wenn die Spritzen vorbereitet sind, öffnen Sie die Methoden zur Herstellung des Basiscocktails und des Aktivierungscocktails in der automatisierten Liquid-Handler-Software. Legen Sie dann die Mikrofuge-Röhrchen in das kleine Röhrchengestell Mikrofuge-Röhrchen für den Basiscocktail und den Aktivierungscocktail, entsprechend der Anzahl der herzustellenden Basis- und Aktivierungscocktails. Verwenden Sie den Schaltplan für die Instrumenteneinrichtung als Referenz für die Platzierung der Röhrengestelle auf dem Deck. Platzieren Sie das Pufferreservoir in den entsprechenden Abschnitt des Decks und verwenden Sie einen Achtkanal-Schraubverschluss-Decapper, um die 2D-Barcode-Röhrchen mit den Antikörpern zu entschließen. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, legen Sie jede Kappe nach dem Entfernen in eine Kappenhalteschale, um die Kappen in der richtigen Reihenfolge zu halten. Platzieren Sie dann die P50 LLS-Filterspitzen, die P200 LLS-Filterspitzen, die P1000-Spitzen und das Matrix 1-ml-Röhrchengestell in den entsprechenden Positionen auf dem Deck. Klicken Sie auf das Startsymbol, um die Methode zu starten. Wenn das Popup-Fenster angezeigt wird, vergewissern Sie sich, dass alle Elemente auf dem Deck mit dem Instrumenteneinrichtungsschema für die Methode übereinstimmen. Wenn alles an seinem Platz ist, klicken Sie auf OK. Der automatisierte Liquid Handler überträgt den Puffer aus dem Reservoir in die Mikrofuge-Röhrchen. Das Matrix 1-ml-Röhrchengestell wird zum 2D-Barcode-Lesegerät weitergeleitet und die Barcodes werden gelesen. Wenn alle Barcodes gelesen wurden, klicken Sie im Popup-Fenster auf OK, um die Antikörperübertragung zu starten. Verwenden Sie nach Abschluss der Übertragung den Achtkanal-Entkapper mit Schraubverschluss, um die 2D-Barcode-Röhrchen wieder zu verschließen, und setzen Sie die Röhrchen wieder auf 4

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt eine Immunoassay-Technik, bei der fluoreszierende magnetische Kügelchen oder Mikrosphären in Verbindung mit verschiedenen Antigenen verwendet werden, um gleichzeitig verschiedene Antikörper-Isotypen in einer Serumprobe nachzuweisen. Der Assay ist hilfreich, um die Serokonversion während einer Infektion oder nach der Impfung zu verstehen.

Multianalyt-Immunobead-Assay: eine flussbasierte Immunoassay-Technik zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antikörper-Subtypen in humanen Serumproben

Dieses Video zeigt die Verwendung des ELISpot-Assays zur Beurteilung der Funktion von Antikörper-sezernierenden B-Zellen, ASCs. Die von den ASCs sezernierten Antikörper interagieren mit den membrangebundenen polyklonalen Antikörperfragmenten, die von den enzymkonjugierten IgG- oder IgM-Antikörpern nachgewiesen werden. Der farbige Fleck, der in jeder Vertiefung produziert wird, zeigt das Vorhandensein des Isotyps des spezifischen Antikörpers an, der mit der sekretorischen Aktivität der B-Zellen...

Funktionelle Bewertung von Antikörper-sezernierenden B-Zellen mittels ELISpot-Assay

Dieses Video demonstriert eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik, bei der zwei Fluorochrome verwendet werden, um CD4+ und CD8+ T-Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und Monozyten in menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) zu identifizieren. Nach der Inkubation der Zellen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen die Oberflächenmarker werden die Zelluntergruppen mit einer optimalen durchflusszytometrischen Gating-Strategie...

Ein Durchflusszytometrie-Assay zur Identifizierung von Immunzelluntergruppen in mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut. Ein ausreichender Menge und Qualität von Nukleinsäuren können aus den Zellen extrahiert werden und in nachfolgenden Assays DNA oder RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Eine einfache aber wirksame Methode, die magnetischen Nanopartikel verwendet antigen-reaktiven B-Zellen für die funktionale und phänotypische Analyse zu erfassen und zu bereichern beschrieben.

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Hier beschreiben wir einen Einzellige Proteomic Ansatz um Immune phänotypische und funktionelle (intrazelluläre Zytokin Induktion) bewerten Veränderungen in peripheren Vollblut Proben, über Masse zytometrie analysiert.

Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Hier beschreiben wir Protokolle für die Analyse und Visualisierung der Struktur und Verfassung des ganzen Antikörper-Repertoire. Dies beinhaltet den Erwerb von riesigen Sequenzen Antikörper RNA Sequenzierung der nächsten Generation mit.

Identifizierung von Maus und humanen Antikörpers Repertoires durch Sequenzierung der nächsten Generation

Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.

Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

Erfahren Sie die semi-automatisierte Vorbereitung von Antikörper-Cocktails für die Immunphänotypisierung von menschlichem peripherem Blut. Diese Methode minimiert die Variabilität bei der Reagenzienzufuhr und erhöht die Pipettiergenauigkeit erheblich.

Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut (Video) | JoVE Journal

Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut

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