Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell
27. März 2016
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer reproduzierbaren Rückenmarkskompressionsverletzung (SCI) bei der neugeborenen Maus. Das Modell bietet eine vorteilhafte Plattform für die Untersuchung von Mechanismen adaptiver Plastizität, die der spontanen funktionellen Erholung zugrunde liegen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine reproduzierbare Rückenmarkskompressionsverletzung bei einer neonatalen Maus durchzuführen. Dies wird erreicht, indem die Maus zunächst tief betäubt wird. Dann wird eine dorsale Laminektomie durchgeführt, um das Rückenmark freizulegen.
Und schließlich, indem man die Kompressionsverletzung macht. Wir haben kürzlich ein neonatales Mausmodell für Rückenmarksverletzungen etabliert und gezeigt, dass neugeborene Mäuse ein erstaunliches Maß an adaptiver Plastizität aufweisen. Die Untersuchung dieses Mechanismus, der der Genesung zugrunde liegt, kann wichtige Erkenntnisse liefern, die bei der Behandlung von Rückenmarksverletzungen genutzt werden könnten.
In diesem Video zeigen wir, wie man eine Rückenmarkskompressionsverletzung bei einer einen Tag alten Maus durchführt. Dieser chirurgische Eingriff umfasst eine Anästhesie, eine Laminektomie und zwei Clip-getriebene Epiduralkompressionen. Vorbereitung auf die Operation.
Die Operation wird unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Legen Sie ein Wärmekissen unter das Mikroskop. Es ist wichtig, den Welpen warm zu halten, um einen plötzlichen Tod während der Operation zu vermeiden.
Legen Sie eine OP-Decke oder ein großes Blatt sauberes, weiches Laborpapier über das Wärmekissen. Bereiten Sie für die präoperative Analgesie eine Insulinspritze vor, 0,3 Milliliter 30 Gauge, gefüllt mit dem Lokalanästhetikum Marcain, verdünnt mit sterilem PBS, auf eine Endkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter. Verwenden Sie für Hautschnitte, Muskelentfernung und Laminektomie ein Mikromesser, eine feine Pinzette und eine feine Iridektomieschere.
Beachten Sie, dass wir auch hier eine Pinzette verwenden, die wir an den Spitzen gebogen haben, um Zähne zu formen. Diese funktionieren besser als handelsübliche Zahnzangen, da die Zähne sehr klein sein müssen. Für die Rückenmarkskompression verwenden Sie einen speziell modifizierten Yasargil Temporary Aneurysma Miniclip, den wir später noch beschreiben werden.
Ein kleines Stück Kunststoff-Kapillarschlauch ist auch erforderlich, um einen Stopfen herzustellen, um ein vollständiges Schließen des Clips zu verhindern, und einen Clip-Applikator zum Platzieren des Clips. Verwenden Sie zum Nähen einen Nadelhalter und eine kleine Schere, um den Faden zu schneiden. Zur Schmerzbehandlung verdünnen Sie Temgesic in sterilem PBS auf 0,03 Milligramm pro Milliliter.
Bei der Rückenmarksverletzung handelt es sich um eine Clip-getriebene Kompression mit einem Yasargil Temporary Aneurysma Miniclip. Vor der Verwendung muss der Clip mechanisch modifiziert werden, indem die Dicke der Klingen mit einem Schleifstein auf 150 Mikrometer gekürzt wird. Schneiden Sie kurz vor der Operation einen kurzen Abschnitt Kunststoffschlauch ab und legen Sie ihn über eine der Scherklingen.
Der Schlauch dient als Stopper, um ein vollständiges Schließen des Clips zu verhindern. Anästhesie und Analgesie. Für die Gasanästhesie verwenden wir einen supranen Verdampfer, der an einen Sauerstofftank angeschlossen ist.
Isofluran ist das Anästhetikum, das in reinem Sauerstoff verdampft wird. Um das Isofluran-Sauerstoff-Gemisch an die Maus zu verteilen, müssen Sie eine Nasenmaske bauen, die an Neugeborene angepasst ist. Neugeborene Mäuse sind so klein, dass die Maske aus der Spitze einer Spritze hergestellt werden kann, die als Einlass für den Kunststoffschlauch dient, der mit dem Auslass des Vaporizers verbunden ist.
Bohren Sie an der Seite der Maske ein kleines Loch, um ein Evakuierungsrohr anzuschließen, das entweder in einer geregelten Vakuumpumpe, mit einer Auffangeinheit oder einfach in einem Abzug endet. Stelle eine Anästhesie-Überlaufkammer mit einer 150 x 25 Milliliter großen Petrischale aus Kunststoff her. Machen Sie auf einer Seite ein Loch, das groß genug für den Kopf der Maus ist.
Auf der gegenüberliegenden Seite machst du zwei kleinere Löcher mit dem Durchmesser des Kunststoffschlauchs. Zum Schluss machst du ein Evakuierungsloch, das kleiner ist als die anderen, auf der Oberseite der Schale. Schneiden Sie die Spitze einer 250-Mikroliter-Pipettenspitze ab und führen Sie sie in dieses letzte Loch ein.
Die Pipettenspitze fungiert als Anschluss für das Evakuierungsrohr, das mit einem Vakuumgerät verbunden ist, das auf einen leichten Unterdruck eingestellt ist. Befestigen Sie die Maske mit Plastilin direkt in dem Loch für den Mauskopf. Befestigen Sie den Kunststoffschlauch mit Klebeband oder Plastilin an der Decke der Kammer und stellen Sie sicher, dass die Schläuche gut in den entsprechenden Löchern positioniert sind.
Legen Sie die Kammer unter das Mikroskop auf die OP-Decke. In diesem Schaltplan ist das gesamte System dargestellt. Ein Dreiwege-Absperrhahn befindet sich am Ausgang des Vaporizers.
Hier ist der Weg zur Schlafkammer frei, während der Weg zur Maske versperrt ist und die Maus in der Schlafkammer platziert werden kann, um die Sedierung einzuleiten. Dreht man den Drei-Wege-Absperrhahn nach rechts, kann das Gas zur Maske strömen und blockiert den Weg in die Schlafkammer. In dieser Konfiguration kann die Maus auf die Maske übertragen werden.
Leckagen von Gas werden durch Vakuum aus der Überströmkammer entfernt. Wählen Sie einen Mäusewelpen aus, der kürzlich Milch getrunken hat, was durch die weiße Farbe auf der Haut sichtbar ist. Setzen Sie den Welpen in die Schlafkammer und führen Sie verdampftes Isofluran in einer Dosis von 4% ein, um eine schnelle Sedierung zu erreichen.
Übertragen Sie den Welpen auf die Maske. Positionieren Sie die Schnauze der Maus vorsichtig gut in der Maske, um eine ausreichende Exposition gegenüber dem Narkosegas zu gewährleisten. Drehen Sie den Dreiwege-Absperrhahn, um das Gas auf die Maske abzuleiten.
Injizieren Sie subkutan 50 Mikroliter Marcain mit 2,5 Milligramm pro Milliliter an der gewünschten Operationsstelle. Achten Sie darauf, nicht zu tief zu injizieren, da Blutgefäße leicht getroffen werden können und das Einführen des Marcains in ein Gefäß tödlich ist. Wischen Sie das überschüssige Marcain mit einer kleinen sterilen Kompresse ab.
Dorsale Laminektomie. Reduzieren Sie die Isofluran-Konzentration auf ein bis zwei Prozent. Nach einigen Minuten stechen Sie mit einem Mikromesser in die Haut und machen eine acht bis neun Millimeter große Übertragungsöffnung, indem Sie vorsichtig in rostraler kaudaler Richtung an der Haut ziehen.
Eine Übertragungsöffnung ist wesentlich bequemer und ermöglicht einen besseren seitlichen Zugang für die Durchführung der Laminektomie. Ziehen Sie die Ränder des Hautschnitts aus dem darunter liegenden Gewebe zurück, indem Sie Stücke von Spongistatin subkutan rostral und kaudal zum Schnitt einführen. Schneiden Sie die prävertebralen Muskeln mit einer dünnen Schere ab, um die Wirbelsäule freizulegen.
Beachten Sie, dass der Wirbelsäulenfortsatz beim Neugeborenen noch nicht vollständig entwickelt ist. Identifizieren Sie die Mittellinie und schneiden Sie die Lamina mit der dünnen Schere quer ein. Achten Sie darauf, nicht zu tief zu schneiden, da dies die Dura und sogar das Rückenmark beschädigen kann.
Platzieren Sie vorsichtig eine Klinge einer dünnen Pinzette zwischen der Lamina und der Dura. Fassen Sie die Lamina, indem Sie die Pinzette schließen, und heben Sie sie vorsichtig an, bis sie sich löst und die Dura in Takt lässt. Wiederholen Sie den Schritt zwei- bis dreimal, um eine Ein- bis Zweisegment-Laminektomie zu erhalten.
Kontrollieren Sie die Blutung mit kleinen Stücken Spongistatin. Mit der dünnen Pinzette als Rongeureur Teile der Facettengelenke beidseitig entfernen, um genügend Platz für die Platzierung des modifizierten Aneurysma-Miniclips im Wirbelkanal zu gewinnen. Dieser Schritt führt häufig zu Blutungen, die mit kleinen Stückchen Spongistatin kontrolliert werden können.
Um die Sicht zu verbessern, ist es manchmal von Vorteil, mit warmem, sterilem PBS, 37 Grad Celsius, zu spülen. Entstehung der Rückenmarkskompressionsverletzung. Öffnen Sie den Clip und platzieren Sie die Klingen auf beiden Seiten des Rückenmarks in den Zwischenräumen zwischen den Facettengelenken und dem Rückenmark.
Stellen Sie sicher, dass die Klingen tief genug eingeführt sind, um den ventralen Teil des Rückenmarks zu umfassen. Schließen Sie den Clip schnell, während Sie den Applikator an Ort und Stelle halten, um ein Verrutschen des Clips nach hinten zu vermeiden. Lassen Sie den Clip nach 15 Sekunden schnell los.
Reinige die Wunde mit Spongistatin. Um eine symmetrische Kompression zu erreichen, drehen Sie die Klingen um und führen Sie eine zweite Kompression für 15 Sekunden in entgegengesetzter Ausrichtung durch. Zunähend. Entfernen Sie die Spongistatinstücke, die zu Beginn der Operation unter die Haut gelegt wurden, und verschließen Sie die Haut mit 6.0 Nähten.
Injizieren Sie 0,05 Milliliter Temgesic in einer Dosis von 0,03 Milligramm pro Milliliter subkutan mit einer 30-Gauge-Insulinspritze und setzen Sie den Welpen für einige Stunden in eine temperaturkontrollierte Umgebung bei 30 Grad Celsius. Um das aggressive Verhalten der Mutter gegenüber dem operierten Welpen in der ersten Nacht nach der Operation zu reduzieren, bereiten Sie eine Lösung von Diazepam vor, verdünnt in sauberem PBS, auf 0,1 Milligramm pro Milliliter für die intraperitoneale Injektion von acht Gramm pro Kilogramm. Befund.
Wie diese Grafik zeigt, sind sechs Stunden nach der Rückenmarkskompression auf niedrigerem Brustniveau die Hintergliedmaßen verletzter Mäuse gelähmt, während die Vordergliedmaßen nicht gelähmt sind. Bei Scheinkontrolltieren, die nur eine Laminektomie erhielten, sind sowohl die Hinter- als auch die Vordergliedmaßen hochbeweglich. Der Abschnitt des Rückenmarks zeigt beim Anblick einer Verletzung Restblut.
Darüber hinaus ist das Gewebe durchscheinend, was auf einen Gewebeverlust hindeutet, der oft mehrere Tage später zur Bildung einer Karies führt. Schlussfolgerung. Nach diesem Video sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Rückenmarkskompressionsverletzung bei einer Neugeborenenmaus erzeugt. Der Vorteil der Verwendung von neugeborenen Mäusen besteht darin, dass wir spezifische Methoden zur Behandlung der adaptiven Plastizität anwenden können, die bei erwachsenen Mäusen nicht angewendet werden können.
Darüber hinaus bietet das Modell eine Plattform, um therapeutische Ansätze, wie z.B. die Stammzelltransplantation, zu testen.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Erzeugung einer reproduzierbaren Kompressionsverletzung des Rückenmarks (SCI) bei neugeborenen Mäusen beschrieben. Dieses Modell bietet Vorteile beim Studium der Mechanismen der adaptiven Plastizität, die der spontanen funktionellen Erholung zugrunde liegen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Neurobiologie
- Verletzungsmodelle
Hintergrund
- Wirbelsäulenverletzungen können zu erheblichen funktionellen Beeinträchtigungen führen.
- Neugeborene Mäuse weisen eine bemerkenswerte Erholungsfähigkeit auf.
- Das Verständnis adaptiver Plastizität ist entscheidend für die Entwicklung von Therapien.
- Dieses Modell ermöglicht kontrollierte Experimente zur spinalen Traumaerforschung (SCI).
Zweck der Studie
- Ein reproduzierbares Modell einer Quetschungverletzung des Rückenmarks zu etablieren.
- Die Mechanismen der Erholung bei neugeborenen Mäusen zu untersuchen.
- Erkenntnisse für potenzielle therapeutische Ansätze zu liefern.
Verwendete Methoden
- Tiefanästhesie von neugeborenen Mäusen.
- Dorsale Laminektomie zur Freilegung des Rückenmarks.
- Kompressionsverletzung unter Verwendung einer modifizierten Yasargil temporären Aneurysma-Miniklammer.
- Postoperative Analgesie zur Schmerzbehandlung.
Hauptergebnisse
- Das Modell induziert erfolgreich eine Quetschung der Spinalkanalverletzung.
- Neugeborene Mäuse zeigen eine signifikante adaptive Plastizität nach der Verletzung.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten zukünftige Behandlungen von Rückenmarkverletzungen beeinflussen.
- Ein detailliertes chirurgisches Protokoll gewährleistet die Reproduzierbarkeit des Modells.
Schlussfolgerungen
- Dieses Modell ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Rückenmarksverletzungen.
- Das Verständnis der Erholungsmechanismen kann zu besseren Therapien führen.
- Zukünftige Forschung kann auf dieser grundlegenden Arbeit aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieses Modell der spinalen Kompression bei neugeborenen Mäusen ermöglicht die mechanistische Untersuchung adaptiver Plastizität bei der Genesung von Verletzungen im frühen Lebensalter und bietet ein krankheitsrelevantes System, um therapeutische Hypothesen hinsichtlich ihres Risikos zu bewerten. Durch die Erfassung spontaner funktioneller Erholungsdynamiken unterstützt das Modell die Zielvalidierung und phänotypische Screening-Verfahren in präklinischen Neurowissenschaftsprogrammen. Seine Relevanz für pädiatrische Rückenmarksverletzungen und das potenzielle translatorische Kontinuum zu Erwachsenenerkrankungen verbessern die entscheidungsbezogene Portfolioentwicklung in der Entdeckung von Neurotherapeutika.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die mit adaptiven Plastizitätsmechanismen bei Rückenmarksverletzungen zusammenhängen.
- Operationaler Wert: Bietet ein biologisch relevantes System zur funktionellen Zielstruktur-Validierung anhand verhaltensbezogener und elektrophysiologischer Messgrößen.
- Predictive Value: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem frühe Plastizitätswegmechanismen mit potenziellen therapeutischen Zielstrukturen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt ein standardisiertes, reproduzierbares Verletzungsmodell, das für die Wirkstoff-Screening- und therapeutische Eingriffstests geeignet ist.
- Quantitative Ausgangsgrößen: Ermöglicht die Messung abhängiger Variablen wie Beweglichkeit der Hintergliedmaßen, synaptische Vernetzung und elektrophysiologische Aktivität.
- Skalierbarkeit: Unterstützt Hochdurchsatz-Optikaufnahmen und ex-vivo-physiologische Analysen für die Entwicklung nachgeschalteter Assays.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert eine pädiatrische Rückenmarksverletzung mit Nachweis akuter Hinterbeinbeeinträchtigung und funktioneller Erholung innerhalb von zwei Wochen.
- Übertragbare Kontinuität: Nutzt gemeinsame Plastizitätsmechanismen zwischen neonatalem und adultem Rückenmark, um altersübergreifende Erkenntnisse zu gewinnen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Bewertung therapeutischer Kandidaten unter Verwendung funktioneller Erholung und synaptischer Wiederverbindung als prädiktive Biomarker.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein, insbesondere für neuroprotektive und neurorestaurative Ansätze.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung hinsichtlich adaptiver Plastizität und Mechanismen der funktionellen Erholung nach Kompression des Rückenmarks.
- Screening: Ermöglicht die Entwicklung von Assays zur Bewertung von Wirkstoffen anhand quantifizierbarer Verhaltens- und physiologischer Endpunkte.
- Analytik: Erzeugt Messungen abhängiger Variablen wie elektrophysiologische Signalübertragung und optische Aufzeichnung der synaptischen Konnektivität.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse zur Plastizität im frühen Lebensabschnitt mit Verletzungen des erwachsenen Rückenmarks über konservierte biologische Mechanismen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die iterative Prüfung therapeutischer Interventionen in den Phasen der Entdeckung und präklinischen Forschung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in den Zielmechanismus, indem er die Mechanismen der spontanen Erholung und adaptiven Plastizität aufklärt.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares chirurgisches Modell mit standardisierten Kompressionsparametern und standardisierter postoperativer Versorgung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Go/No-Go-Entscheidungen, indem es frühe Wirksamkeitssignale in einem Verletzungsmodell mit hoher Plastizität liefert.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Neurotherapeutika basierend auf Biomarkern für funktionelle Erholung und synaptische Reparatur.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit neugeborenen Mäusen, in Mikrochirurgie und elektrophysiologischen Ableittechniken.
- Benötigt spezialisierte Instrumente wie ein Stereomikroskop, einen Aneurysma-Miniklippensystemapplikator und temperaturgesteuerte Reanimationsysteme.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen chirurgischen Teams, um eine konsistente Durchführung der Laminektomie und der Kompressionsverletzung sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung der Ergebnisse von neonatalen auf erwachsene oder menschliche Rückenmarkskontexte.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Spezifität des Modells für frühe postnatale Stadien sowie eine mögliche Variabilität der Verletzungsschwere aufgrund der Platzierung der Klammer.
