Name: Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Erfahren Sie ein reproduzierbares Kompressionsmodell für Rückenmarksverletzungen bei neonatalen Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung adaptiver Plastizität und spontaner funktioneller Erholung nach Verletzung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der regionalen Gesundheitsbehörde Südostnorwegens (JLB, 2014119; JCG, Projektnummern 2015045 und 2012065), vom Norwegischen Forschungsrat (JCG, Projektnummer 23 00 00) und der Universität Oslo.

Dieses experimentelle Protokoll wurde von der National Animal Research Authority in Norwegen (Forsøksdyrutvalget, lokale experimentelle Zulassungsnummer 12,4591) in Übereinstimmung mit der Europäischen Union Tierschutzvorschriften (Federation European Laboratory Animal Science Association) zugelassen. Es wurden Anstrengungen unternommen, die Anzahl der Tiere zu minimieren verwendet und ihr Leiden. In diesem Artikel wird die Prozedur auf die postnatale (P) Tag 1 Wildtyp-ICR (Imprinting Kontrolle Region) Mäuse (Jackson, USA) verwendet wird, beschrieben, aber die gleiche Ansatz kann auch in späteren Phasen verwendet werden. 1. Konstruktion eines Gas Anesthesia System for Neonatal Mice (Abbildung 1) <ol><li> Erstellen Sie eine Nasenmaske von der Spitze einer Spritze. Schließen Sie diese an die 3-Wege - Hahn mit Kunststoffschlauch (Abbildung 1 - rote Schläuche und Abbildung 2A1). </li><li> Bohren Sie ein kleines Loch in der Seite der Nasenmaske und verbinden Sie diesen mit Kunststoffschlauch den Überlauf von Gas aus dem zu entfernen,Maske. Beenden Sie den Schlauch entweder mit einer Vakuumpumpe für einen leichten Unterdruck gesetzt, oder in einer Abzugshaube (Abbildung 1 - hellgrün Schläuche). </li><li> Machen Sie eine Anästhesie Kammer von einer 150 mm x 25 mm Kunststoff - Petrischale (Abbildung 2A2). <ol><li> Auf der einen Seite ein Loch groß genug, um den Kopf der Maus und die Nasenmaske aufzunehmen. </li><li> Auf der gegenüberliegenden Seite, stellen zwei kleinere Löcher , durch welche die Kunststoffrohre zu und von der Nasenmaske (1 - roten und grünen hellen Schlauch bezeichnet) eingesetzt werden kann. </li><li> Machen Sie ein drittes Loch auf der Oberseite des Deckels und heften sich an diese eine dritte Kunststoffrohr , das an der Vakuumpumpe endet (Abbildung 1 - dunkelgrüne Schlauch). Der Zweck dieses dritten Rohr ist, um sicherzustellen, daß überschüssiges Gas, das durch den Auslass aus der Nasenmaske nicht entfernt wird eingefangen hat. </li></ol></li><li> Bauen Sie eine Schlafkammer, die durch ein Loch in der Unterseite jeder Art von Laborschale zu machen, die zu c groß genug ist,ontain der Maus und hat eine glatte und gleichmäßige Rand (die Öffnung der Schale ist mit dem Tisch bündig liegen Leckage von Gas zu verhindern). Schließen Sie das Loch in der Kammer an die 3-Wege - Hahn mit Kunststoffschlauch (Abbildung 1 - braun Schläuche). Platzieren Sie den Schlafraum unter einer Abzugshaube. </li><li> Schließen Sie ein 3-Wege - Hahn mit dem Auslaufrohr aus dem Verdampfer (Abbildung 1 - gelbe Schläuche und Abbildung 2A3). </li><li> Schließen Sie den Einlass des Verdampfers zur Sauerstoffversorgung (Abbildung 1 - blaue Schläuche). </li></ol> 2. Änderung eines Yasargil Temporäre Aneurysma Mini-Clip, um das Kompressionswerkzeug zu erstellen (Abbildung 2 und Tabelle 1) <ol><li> Bringen Sie den Clip fest an einem Ständer mit einer Klemme. Feilen Sie eine Binokularlupe zur visuellen Kontrolle verwenden, werden die Außenfläche der Spitze jedes Clips Klinge auf eine endgültige Dicke von etwa 150 um einen Schleifstein mit montiert auf einem Bohrer (2B und C). </li&gt; <li> Machen Sie einen Anschlag für den Clip durch ein kurzes Stück aus Polyethylen Kapillarschlauch (Tabelle 1) unter einem Stereomikroskop Schneiden eines Mikromesser (Tabelle 1), und legen Sie diese auf einem der Blätter (Abbildung 2A4 und 2B und C). Dies verhindert, dass ein vollständiges Schließen des Clips und schafft standardisierte Kompressions Dimensionen. Wenn der Clip die Zwischenschaufel Abstand geschlossen wird, beträgt etwa 230 &amp; mgr; m. Machen Sie einen neuen Stopper für jedes Experiment als Polyethylenmaterial kann während des Gebrauchs zu komprimieren, die den Zwischenschaufel Raum verändern würde. Hinweis: Die Federspannung des Clips verringert im Laufe der Zeit, so dass die Klammer nicht mehr nach ca. 80 Kompressionen vollständig auf den Stopfen geschlossen, und muss ersetzt werden. </li></ol> 3. Vorbereitung vor der Operation <ol><li> Platzieren Sie die Maus in die Schlafkammer (Abbildung 1) und initiieren Anästhesie mit 4% Isofluran (Abbildung 2A5 </strong&gt;) In reinem Sauerstoff verdampft, einen Verdampfer (Abbildung 2A3 und Tabelle 1). </li><li> Testen Sie den Rückzug Reflex der Maus, indem Sie vorsichtig das Netz der Haut zwischen den Zehen mit einer dünnen Plastikzange einklemmen. Tun Sie dies sorgfältig, wie neugeborene Mäuse leicht verletzt. Kneifen zu hart Ergebnisse in unmittelbarer Quetschungen. Durchführung dieser Prüfung zu Beginn der Sedierung löst den Reflex und liefert einen guten Hinweis auf die Menge an Kraft, die notwendig. </li><li> Sobald der Reflex abgeschafft wird, entfernen Sie die Maus aus dem Schlafraum und legen Sie sie in Bauchlage auf dem OP - Tisch mit der Schnauze in die Nase Maske eingefügt , die in reinem Sauerstoff (Abbildung 1) gemischt , um eine kontinuierliche Versorgung mit 4% Isofluran zur Verfügung stellt. Stellen Sie sicher, dass die Erwärmung Pad eingeschaltet und auf 37-38 ° C als Hypothermie während der Operation kann tödlich sein. </li><li> Zur Erzielung vollständige Analgesie injizieren subkutan 50 &amp; mgr; l des Lokalanästhetikums Bupivacain (2,5 mg / ml, <strong&gt; Abbildung 2A6) an der Stelle der Operation (in den hier gezeigten Experimenten, dies bei thorakalen (T) 9-T11). Verwenden einer Insulinspritze (300 &amp; mgr; l, 30 G, Figur 2A7 und Tabelle 1) , um die Injektion durchzuführen. </li><li> Reduzieren Sie die Isofluran-Konzentration auf die Nasenmaske geliefert 1-2%. </li></ol> 4. dorsale Laminektomie <ol><li> Führen Operation unter mikroskopischer Kontrolle. </li><li> Nach der Reinigung des OP - Bereich mit Chlorhexidingluconat (Tabelle 1 # 19) für mindestens 30 Sekunden, machen Sie eine 1-2 mm Querhautschnitt bei T9-T11 mit einem microknife (Abbildung 2A8). Hinweis: Bei ICR neugeborenen Mäusen die rostralen Teil des Magens, sichtbar , wenn es enthält Milch, ist mit Blick auf die Wirbelstufen T12-T13 (Abbildung 3). Ein weiterer Meilenstein ist die rostralen Teil des Brust subkutanen Fettgewebe Aggregat, das bei etwa T8-9 endet. Dieser Meilenstein ist nur sichtbar nach Hautschnitt. </li><li&gt; Verwenden einer Pinzette (Abbildung 2A9 und A10) , um die Hautöffnung in Querrichtung durch Ziehen der Haut auf 8-9 mm zu verbreitern sanft rostral und kaudal (die Haut reißt leicht, einen glatten und geraden Wunde). Dies sorgt für eine ausreichende seitliche Zugang zur Wirbelsäule. </li><li> Ziehen sich die Ränder der Inzision von darunterliegenden Strukturen durch Einfügen sterile Stücke von hämostatischen Gelatineschwamm (Abbildung 2A11 und Tabelle 1) subkutan rostral und kaudal der Inzision. Dadurch vergrößert sich die Öffnung und verhindert, dass die Haut zurückzieht und den Bereich während der Operation verschleiern. Die hämostatische Gelatineschwamm muss nicht vor der Verwendung in Kochsalzlösung eingeweicht werden. </li><li> Um die Wirbelsäule entlarven, sezieren die paravertebralen Muskeln mit dünnen Schere (Abbildung 2A12 und Tabelle 1). Schneiden Sie die Befestigungen der Muskeln an der Wirbelsäule und setzen die Lamina (4A). Nichte auch, dass das Rücken Prozess in dieser Phase ist wenig entwickelt. </li><li> Identifizieren Sie die Mittellinie und quer geschnitten zwischen den beiden Schichten (die in diesem Stadium knorpeligen ist) mit dünnen Schere (4B). Sorgfältig eine Klinge aus einer dünnen Zange zwischen der Lamina und der Dura (4C) zu platzieren, die Lamina mit der Pinzette greifen und heben vorsichtig nach oben , bis ein Stück weg bricht, intakt die Dura verlassen (4D). Wiederholen Sie diesen Vorgang 2-3 mal 1-2 Segment lange Laminektomie zu erhalten. </li><li> Unter Verwendung der dünnen Zange als rongeurs, entfernen Sie Teile der Facettengelenke bilateral genug Raum zu platzieren Sie den Clip in den Wirbelkanal zu gewinnen. Reinigen Sie den OP-Bereich und steuern mit kleinen Stücken von hämostatischen Gelatineschwamm Blutungen. </li></ol> 5. Spinal Cord Injury Compression <ol><li> Öffnen Sie das modifizierte Aneurysma Mini-Clip in der Clip - Halterung (Abbildung 2A13 und 2B) und Platz the Klingen an jeder Seite des Rückenmarks in den Räumen zwischen den Facetten verbindet und der Schnur. Stellen Sie sicher, dass die Klingen tief genug eingesetzt werden, um die ventrale Teil des Rückenmarks zu beeinflussen. Wenn dies nicht möglich ist, mehrere der Facettengelenke entfernen. </li><li> Lassen Sie die Mini-Clip schnell, es an Ort und Stelle mit dem Klammerhalter halten, damit sie nicht gleiten. Pflegen Sie die Komprimierung für 15 sek. </li><li> Öffnen Sie den Mini-Clip schnell und entfernen. Um eine symmetrische Kompression zu erreichen, kehren die Ausrichtung des Miniclip, und mit Hilfe der leicht Marke durch die hämorrhagische Ödeme von der ersten Kompression als Führung aus gesehen, positionieren Sie den Clip in der umgekehrten Orientierung für eine zweite 15-sec-Kompression (vor Experiment zeigte , dass diese symmetrische histologische und physiologische Defizite erzeugt, während einzelne Kompressionen nicht 1). Die Dura sollte nicht durch die Kompression beschädigt werden. </li><li> Reinigen Sie den Bereich und halten Hämostase mit Stücken von hämostatischen Gelatine Schwamm.</li><li> Entfernen Sie die Stücke von hämostatischen Gelatineschwamm, der unter den Rändern der Hautschnitt zu Beginn der Operation platziert wurden und schließen Sie die Hautschnitt mit sterilem 6,0 Naht und einem Nadelhalter (Abbildung 2A14 und 15). </li><li> Injizieren subkutan 0,75 mg / kg Körpergewicht Buprenorphin (Abbildung 2A16), verdünnt in sterilem PBS unter Verwendung einer Insulinspritze (300 &amp; mgr; l, 30 g). </li></ol> 6. Nachsorge <ol><li> Entfernen Sie die Maus aus der Nase Maske und legen Sie sie in einer temperaturgeregelten Kammersatz bei 30 ° C, bis die Betäubung nachlässt und die Maus wird Alarm (1-3 Stunden ist in der Regel ausreichend). </li><li> Injizieren Diazepam (Abbildung 2B17) intraperitoneal in die Mutter (8 g / kg Körpergewicht). Dies schafft eine torpor, die das Risiko von Kannibalismus in der ersten Nacht abnimmt, wenn dieses Risiko am höchsten ist. </li><li> Bringen Sie den Betrieb der Maus auf den Wurf. </li><li> Wenn der Wurf lARGE (&gt; 12 Welpen), entfernen Sie einige der nicht operierten Welpen, bevorzugt die größeren Tiere, wenn sie in der Größe unterscheiden, Wettbewerb um die Milch zu reduzieren. Betreuung der Mutter der operierten Welpen ist am besten in der ICR-Linie, wenn die Wurfgröße um 9 Welpen ist. </li><li> Zur Schmerzmanagement, verwalten Buprenorphin (0,75 mg / kg Körpergewicht) subkutan einmal täglich während der ersten postoperativen Tag, eine Insulinspritze (300 &amp; mgr; l, 30 G). Ein geeignetes Volumen für die subkutane Injektion beträgt 30-50 ul. In neugeborenen Mäusen Stimmgebung und Agitation sind gute Indikatoren für Schmerzen. </li><li> Führen Sie eine tägliche Untersuchung der verletzten Mäuse ein Notenblatt mit Ernährung zu bewerten, Körpergewicht, Dehydratation, Schmerz, Wundheilung, Harnverhalt und Infektionsstatus. Gemäß der Partitur erhalten werden , bieten besondere Sorgfalt, wie Injektionen einer sterilen pädiatrischen Ernährungslösung (Tabelle 1 # 18) im Falle eines anormalen Ernährung. Das Notenblatt auch0; definiert humane Endpunktkriterien. Eine Mutter, die nicht die verletzten Welpen nicht ablehnen ist der beste Betreuer. </li><li> In dem ungewöhnlichen Fall von Blasenfunktionsstörungen, Blasen Massage zweimal täglich ausführen, bis Funktion wiederhergestellt wird. Dies geschieht, indem Sie die Maus in Rückenlage in einer Hand und massiert den Unterleib sanft in einem rostro-kaudal mit den Fingerspitzen getan. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Artikel werden die Verfahren für einen Clip-generierte SCC Verletzung in P1 Mäusen beschrieben. Die gleichen Verfahren können auch in einem späteren Stadium durchgeführt werden. Kompression Verletzungen wurden erfolgreich auf P5, P7, P9 und P12 ausgeführt (Züchner, et al., Manuskript in Vorbereitung). Bei allen postnatalen Stadien wird eine Vollnarkose mit Isofluran in reinem Sauerstoff verdampft erhalten, aber das Anästhetikum Ergebnis hängt stark vom Alter ab. In ersten Versuchen an P1-P4, bevor örtlicher Betäubung in das Protokoll eingeführt wurde, war es schwierig, eine tiefe und verlängerte Sedierung aufgrund einer engen Dosis-Wirkungs-Fenster zwischen unzureichender Sedierung und Überdosierung zu erhalten. Zusätzlich zu einer neurotoxischen Wirkung von Isofluran bei neugeborenen Tieren wurden 27-30 erhoben Bedenken im Zusammenhang. Eine Kombination von Isofluran und das Lokalanästhetikum Bupivacain führt zu einem tieferen und stabiler Anästhesie, während eine Isofluran Dosisreduktion um den Faktor 2-3 zu ermöglichen. Verschiedene Arten von anesthesia wurden neonatal Nagetieren, einschließlich cryoanesthesia 31,32, aber eine mögliche Unbequemlichkeit cryoanesthesia ist seine neuroprotektive Wirkung (rezensiert von 33,34), beschrieben , die die Erzeugung eines effizienten und reproduzierbaren Verletzungen komplizieren könnte. Barbiturat-basierte Anästhesie wird als eine geringere Effizienz bei neugeborenen Mäusen haben aufgrund der geringeren Mengen an Serumalbumin und Körperfett als bei Erwachsenen 35,36. Obwohl ziemlich invasive und traumatische, sobald das Verfahren während der Operation festgestellt wird, um die Mortalitätsrate ist niedrig. Es gibt jedoch wichtige Schritte während des Verfahrens, die besondere Aufmerksamkeit erfordern die Wiederherstellung und das Überleben der Mäuse betrieben zu verbessern. Eine wichtige Frage ist, Welpen zu wählen, die die beste Chance haben, um die Operation zu überleben. Wenn der Wurf der Ernährungszustand der einzelnen Welpen groß ist unterschiedlich. Zusätzlich zu der unvermeidbaren Blutungen, die während der Operation auftritt, ausgeben betrieben Welpen Stundes von der Mutter weg, und sie oft nicht trinken Milch vor dem nächsten Morgen. Es ist somit ein Vorteil Welpen zu wählen, die bereits eine bestimmte Menge an Milch im Magen haben. Das ist gut sichtbar durch die Bauchhaut von P0 bis P7. In der ersten Nacht ist der Betrieb Welpe mit großem Risiko der von der Mutter ausgeschlachtet werden. Während der anfänglichen Entwicklung dieses Modells mehr als die Hälfte der operierten Mäusen fehlten am nächsten Morgen mit klaren Spuren von Blut in den Käfig. Necrophagy, Kannibalismus und Kindestötung bei Nagetieren sind seit Jahrzehnten 37-40 untersucht. In dieser Studie wurde Zeuge Kannibalismus nur einmal, sondern war eine wahrscheinlichere Erklärung als necrophagy angesehen, da die Welpen, die auf den Käfig waren in der Regel in so guter Form zurückgegeben wurden, dass der Tod durch natürliche Ursachen in der Nacht schien unwahrscheinlich. Dies veranlasste die Idee eines reversiblen pharmakologischen Wirkstoff wie Diazepam Angst und Aggressivität i zu reduzierenn die Mutter (Bewertung von 41). Die intraperitoneale Injektion von Diazepam erheblich verbessert die Situation, fallen die Sterblichkeit in der ersten Nacht von mehr als 60% auf weniger als 20%. Die Reduzierung der Wurfgröße durch die Keulung und stören die Streu so wenig wie möglich nach der Operation Rückkehr sind zusätzliche Elemente, die die operierten Tiere profitieren können. Doch mit der Mutter nur betrieben Welpen verlassen, ist nicht von Vorteil. Die beste Balance der operierten / unbetätigt Welpen kann sich je nach der Linie, aber für ICR und SCID-ICR-Mäuse 4-5 betrieben Welpen (Verletzung oder Schein) zusammen mit 3-4 nicht operierten Jungen verlassen die besten Ergebnisse lieferte. In einem allgemeinen Sinn ist die Hauptbeschränkung dieses neonatal SCI Modell, dass die neonatale unterscheidet Rückenmark in vieler Hinsicht von adulten Rückenmark, und somit nicht experimentellen Ergebnisse liefern können, die denen von Erwachsenen SCI Modellen erhaltenen vergleichbar sind. Solche Unterschiede sind Gesamtgröße undUnterrepräsentation spezifischer Zelltypen Volumen des Rückenmarks, der Zellzahl, wie beispielsweise Oligodendrozyten, unreife Immunantworten und unreife neuronaler Schaltkreise. Schlussfolgerungen aus Experimenten in diesem Modell gezogen muss daher sorgfältig abgewogen werden. Auf der anderen Seite ist das Modell für die relativ weniger untersuchten Szenario von pädiatrischen SCI relevant. Darüber hinaus ist die scheinbare Schwäche gegenüber erwachsenen SCI Modelle auch eine potentielle Festigkeit, da es die Aufklärung der Plastizitätsmechanismen erlauben kann, obwohl die minimal vorhandenen im adulten Rückenmark, ein therapeutisches Substrat, wenn wieder darstellen. Es ist denkbar, dass Wieder neonataler oder auch embryonalen Bedingungen durch die Implantation von weniger entwickelten Zellen oder Gewebe oder durch Behandlung mit Reagenzien, die die adultem Gewebe mit früheren Entwicklungseigenschaften erzeugen umgesetzt werden könnten. Verwendung von Enzymen perineuronal Netze zu beseitigen ist ein Beispiel für den letzteren Ansatz 42,43. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; ein großes Problem, wenn ein Tiermodell für SCI Festlegung ist eine standardisierte Verletzung zu erhalten. Dies ist ein wichtiger Aspekt, der in mehrere SCI - Modellen adressiert wurde, zum Beispiel transection, hemisection, Impaktoren, Ballon - Kompression, Zangen zerdrücken, statische Gewicht Kompression usw. Im Hinblick Geräte beeinflussen, Anstrengungen in dieser Richtung haben in SCI Modelle in Folge erwachsenen Nagetieren , wo mehrere Parameter der Auswirkungen wie Geschwindigkeit, Kraft und Dauer (von 44 überprüft) manipuliert werden. Ein weiterer Ansatz, weniger Ausrüstungen zum Einsatz, verwendet eine Modifikation des Kerr-Lougheed Aneurysma - Clip 45,46. Diese zwei Ansätze ergänzen sich wie der Impaktor eine Prellung Verletzung während die Klammer ahmt ein Kompressionsverletzung mit einem gewissen Grad an gleichzeitigen Ischämie nachahmt. Aufgrund der erheblichen Größenbeschränkungen und eine größere Anfälligkeit von neugeborenen Mäusen, die eine höhere Sterblichkeit bei längeren Operationen verbunden sind, sowie die Kosten für die Entwickwicklungs Ausrüstung kleineren Maßstab wurde gewählt, um einen Clip-generierte Kompression statt Impactor generierten Quetschung Ansatz zu entwickeln. Dies wurde durch einen handelsüblichen Aneurysma Miniclip Anpassung der Größe der Wirbelsäule von neugeborenen Mäusen 1 aufzunehmen. einen Stopper Zugabe gewährleistet eine einheitliche Verdichtungsbreite, und solange die Spannung der Klammer an der Grenze des Stopfens komprimiert, sollte die Kraft der Kompression während der statischen Phase zu minimalen Breite wenig variieren. Was ist nicht genormt ist die Geschwindigkeit der Kompression während der dynamischen Phase, da dies als Clip Spannungsänderungen über seine Lebensdauer variieren. Da die statische Phase der Kompression wesentlich länger als die dynamische Phase dauert, und es gibt wenig dafür, dass das Rückenmarksgewebe viel von einer Gegenkraft gegen die Mini-Clip Klingen ausübt, ist es wahrscheinlich, dass die Schwere der Verletzung ist die meisten abhängig von die statische Phase. Dies bleibt jedoch geprüft werden. VerletzungSchwere wahrscheinlich auf mehreren Faktoren abhängen, einschließlich der statischen Druckkraft und die Dauer, die Geschwindigkeit der Kompression und Dekompression, die Position der Mini-Clip, und der Anzahl von Kompressionen an der gleichen Stelle durchgeführt. Somit kombinatorische Variation dieser Parameter bei der Erzeugung eines Spektrums Verletzungs severities von schwach bis schwerer führen könnte. Trotz des Potenzials für Variabilität in unserer bisher veröffentlichten Studie 1 erhalten wir konsistente Ergebnisse bei histologischen, physiologische und Verhaltensebene, so dass es wenig zu deuten darauf hin , dass eine akzeptable Standardisierung schwer zu erreichen ist . Wir stellen fest , dass in dieser Studie haben wir mehrere Methoden zur Prüfung auf jeder Ebene, einschließlich Verhaltenstests wie Luft-Stepping , wie in Abbildung 5 dargestellt. In diesem Neugeborenen SCI Modell erspart der Verletzung einen gewissen Anteil von Axonen und bietet dadurch eine Situation günstig für die Hervorrufung adaptive Plastizität durch die Wieder modeling verschont Verbindungen und die Bildung neuer Schaltungen. Darüber hinaus gut, da die Neugeborenen-Maus für die Untersuchung von vielen experimentellen Methoden geeignet ist, ist es möglich, dieses Modell zu verwenden, die funktionelle Erholung und adaptive Plastizität mit einem integrativen Ansatz zu untersuchen, einschließlich Verhaltenstests, retrograden und anterograden axonalen Tracing, Immunhistochemie, Elektrophysiologie und hohe -throughput optischen Aufzeichnungs 1. Als Beispiel haben wir die Vorteile dieser integrative Ansatz zur Netzwerk Re-Modellierung auf der Ebene der spezifischen absteigenden Eingänge mit hohem Durchsatz Kalzium - Imaging in ex vivo Wholemount Vorbereitungen des Hirnstamms und verletzte Rückenmark 1 zeigen. Dies kann weiter vorangetrieben werden durch neurooptogenetische und optogenetische Pharmakologie Tools mit dem Umbau der synaptischen Verbindungen zwischen bestimmten Subpopulationen von spinalen Neuronen zu beurteilen.

In den letzten zehn Jahren haben zunehmende Beweise aus verschiedenen Modellen für Rückenmarksverletzungen (SCI) gezeigt, dass sich Wirbelsäulennetzwerke spontan neu organisieren können, um zur funktionellen Wiederherstellung beizutragen1-9. Adaptive Plastizität ist in der Folge zu einem wichtigen Thema in der SCI-Forschung geworden. Es wurde gezeigt, dass Plastizität das Nachwachsen verschonter Axone, das Keimen neuer Axonkollateralen und die Bildung neuer synaptischer Verbindungen umfasst. Ein Großteil dieses Wissens wurde aus Verhaltens- oder anatomischen Studien an erwachsenen Tieren gewonnen. Eine wichtige Einschränkung bei Rückenmarksuntersuchungen bei Erwachsenen ist die Schwierigkeit, eine physiologische Beurteilung mit hohem Durchsatz durchzuführen, die bei Neugeborenenpräparaten einfacher ist1. Ein wesentlicher Unterschied besteht darin, dass wholemounte ex vivo-Präparate des adulten Hirnstamms und des Rückenmarks eine geringe Lebensfähigkeit aufweisen. Eine andere ist, dass erwachsenes Wirbelsäulengewebe lichtundurchsichtiger ist, weil es dicker und myelinisierter ist. Obwohl jüngste Fortschritte in der In-vivo-Bildgebung (siehe z. B. 10-12) diese Probleme teilweise überwinden können, ist die Möglichkeit, eine Hochdurchsatz-Bildgebung in beliebiger dorsoventraler Tiefe an mehreren Stellen entlang einer gegebenen Hirnstamm-Rückenmark-Präparation durchzuführen, derzeit nur bei Neugeborenen möglich. Der unreife Zustand der Axonmyelinisierung im neonatalen Rückenmark ermöglicht eine optische Hochdurchsatz-Ex-vivo-Aufzeichnung und ermöglicht somit eine dynamische Beurteilung der funktionellen synaptischen Verbindungen13-17. In Kombination mit genetisch kodierten Kalziumreportern und optogenetischen Stimulations- und Pharmakologiewerkzeugen können optische Ansätze zu einem tieferen Verständnis der Mechanismen beitragen, die der adaptiven Plastizität zugrunde liegen.
Es wird geschätzt, dass zwischen 1-10% aller Rückenmarksverletzungen Säuglinge und Kinderzwischen 18 und 22 Jahren betreffen. Im Gegensatz zur Rückenmarksverletzung bei Erwachsenen ist die Pathogenese und das Potenzial für eine spontane Genesung bei der pädiatrischen Rückenmarksverletzung weniger untersucht. Die Verwendung eines neonatalen SCI-Modells kann daher einen besseren Einblick in die pädiatrische Querschnittlähmung geben und zu einem besseren Verständnis der beteiligten Pathogenetik- und Genesungsmechanismen beitragen. Darüber hinaus wird angenommen, dass die post-SCI-Plastizität, die die funktionelle Erholung im adulten Rückenmark unterstützt, zumindest teilweise die gleichen Mechanismen umfasst, die die Entwicklung des Zentralnervensystems steuern, wie z. B. Axonwachstum, Verzweigung und Bildung neuer Synapsen23-26. Daher könnte die Verwendung eines neonatalen SCI-Modells wichtige Einblicke in Mechanismen liefern, die auch im adulten Rückenmark wirksam sind oder die möglicherweise im adulten Rückenmark wiederhergestellt werden könnten (z. B. durch Implantation von fötalen Zellen oder Gewebe oder von Gewebe, das de novo aus pluripotenten Stammzellen aufgebaut wurde), um die Genesung zu erleichtern.
Die neugeborene Maus bietet somit eine Plattform für einen integrativen, multimethodischen Ansatz zur Untersuchung der adaptiven Plastizität nach Rückenmarksverletzungen, bei dem eine Kombination aus verhaltensbezogenen, physiologischen, anatomischen, molekularen und genetischen Methoden ohne weiteres eingesetzt werden kann. Die Etablierung standardisierter Verletzungsmodelle für Neugeborene ist ein wichtiger Schritt bei der Durchführung solcher Studien.

<table><tbody><tr><td>Kunststoffspritze (30 oder 50&nbsp; ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale aus Kunststoff (150 x 25&nbsp; mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fortec Isofluran Vaporizer</td><td>Cyprane</td><td></td><td>Wir verwenden ein altes Gerät aus der Produktion, überprüfen Sie den Link für das neuere Gerät</td></tr><tr><td>Yasargil temporäres Aneurysma Mini-Clip</td><td>&AElig; sculap</td><td>FE681K</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch mit feiner Bohrung ID 0.58&nbsp; mm, AD 0,96&nbsp; mm</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Foren)</td><td>Abbott GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marcain (Bupivacain)</td><td>AstraZeneca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin seyringe 0,3&nbsp; ml 30&nbsp; G x 8&nbsp; mm</td><td>VWR</td><td>80086-442</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafeines Mikromesser 5&nbsp; mm Schneide</td><td>Fine Science Tools</td><td>10315-12</td><td></td></tr><tr><td>Extra feine Graefe Pinzette &ndash; 0,5&nbsp; mm Spitze</td><td>Fine Science Tools</td><td>1153-10</td><td>Nicht wirklich notwendig, oft sind die Zähne zu groß</td></tr><tr><td>Pinzette SuperGrip Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td>Zwei Pinzetten sind notwendig</td></tr><tr><td>Spongostan Special 70 x 50 x 1&nbsp; mm</td><td>Ferrosan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere &ndash; 2&nbsp; mm Klingen Gerade</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Vario Clip Applikationszange</td><td>Aesculap</td><td>FE502T</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 6&ndash; 0 (Ethicon)</td><td>Johnson and Johnson</td><td>J105G</td><td></td></tr><tr><td>Diethrich Mikronadelhalter</td><td></td><td>11-510-20</td><td></td></tr><tr><td>Temgesic (Buprenorphin)</td><td>Schering-Plough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stesolid (Diazepam)</td><td>Actavis</td><td></td><td>Auch bekannt als Valium</td></tr><tr><td>Pedamix</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klorhexidinsprit (Chlorhexidingluconat)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>D08A C02</td><td></td></tr></tbody></table>

ein neonatal maus spinal cord injury kompression modell

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Rückenmarksverletzung (SCI) verursacht typischerweise verheerende neurologische Defizite, insbesondere durch Schäden an Fasern vom Gehirn zum Rückenmark absteigender Reihenfolge. Eine wichtige aktuelle Forschungsgebiet ist über die Mechanismen der adaptiven Plastizität konzentriert, die spontane oder induzierte funktionelle Erholung nach SCI zugrunde liegen. Spontane funktionelle Erholung wird berichtet, größer früh im Leben zu sein, die Erhöhung interessante Fragen darüber, wie adaptive Plastizität Veränderungen wie das Rückenmark entwickelt. Zur Erleichterung der Untersuchung dieser Dynamik haben wir ein SCI-Modell in der Neugeborenen-Maus entwickelt. Das Modell hat Relevanz für die pädiatrische SCI, die zu wenig untersucht. Da neuronale Plastizität im adulten einige der gleichen Mechanismen wie neuronale Plastizität im frühen Leben beinhaltet 1 kann dieses Modell möglicherweise eine gewisse Bedeutung haben auch für Erwachsene SCI. Hier haben wir das gesamte Verfahren zur Erzeugung eines reproduzierbaren Kompression des Rückenmarks (SCC) Verletzung in der Neugeborenen-Maus beschreibenBereits nach der Geburt (P) Tag 1. SCC durch die Durchführung einer Laminektomie bei einer gegebenen spinaler Ebene erreicht ist (hier bei Brust-Ebenen 9-11 beschrieben) und dann ein modifiziertes Yasargil Aneurysma Miniclip schnell zum Komprimieren und Dekomprimieren das Rückenmark . Wie bereits beschrieben, kann die verletzte neugeborenen Mäusen für Verhaltensdefizite getestet werden oder 1 für ex vivo physiologische Analyse der synaptischen Konnektivität unter Verwendung von elektrophysiologischen und Hochdurchsatz - optischen Aufzeichnungstechniken geopfert. Frühere und laufende Studien verhaltensmäßigen und physiologischen Beurteilung verwendet haben eine dramatische, akute Beeinträchtigung der hindlimb Motilität nachgewiesen durch eine vollständige funktionelle Wiederherstellung innerhalb von 2 Wochen gefolgt, und die ersten Anzeichen für Veränderungen in der Funktionsschaltung auf der Ebene der identifizierten absteigend synaptischen Verbindungen 1.

Rückenmarkkompression Verletzung und der Verlust der Funktion Wie zuvor beschrieben, durch die präoperativen, chirurgischen und postoperativen Prozeduren Optimierung kann eine reproduzierbare Kompression SCI - Modell in der neonatalen Maus 1 erhalten werden. Das Polyethylen Stopper auf einer Klinge der Klammer platziert (2B und C) verhindert , dass die vollständige Schließung des Clips und hält den Zwischenklingenabstand konstant bei etwa 230 &amp; mgr; m. Umkehren der Ausrichtung der Klammer zwischen den beiden Kompressionen führt zu einer symmetrischen Verletzung, wie durch histologische Folgeerscheinungen beurteilt (5A und 1). Unmittelbar nach dem Mini-Clip-Entfernung, das komprimierte Rückenmarksgewebe wird aufgrund hämorrhagischen Quetschung und Ödeme dunkler. Die Beobachtung der Serienschnitte des verletzten Rückenmarks gefärbt Eosin und Hämatoxylin schon eines Tages einfter Verletzung zeigt allmähliche Verschlechterung des Gewebes , wenn die Läsion Epizentrum (5A) nähert. Das Vorhandensein von Hohlräumen intraspinal oder Blut in die Läsion ist nicht ungewöhnlich. Verhaltensbeurteilung, beispielsweise durch hindlimb Trajektorien unter nicht-Gewicht Tracking Lagerbedingungen ein paar Stunden nach der Operation zeigt eine dramatische Verschlechterung der hindlimb Motilität bei SCC verletzten Mäuse im Vergleich zu Scheinkontrollmäuse , bei denen nur eine Laminektomie durchgeführt wird (5B und 1) . Dieser Test kann wiederholt werden , bis die Maus kann andere Verhaltenstests durchzuführen , die sein Eigengewicht 1 erfordern trägt. Die Mortalität und Genesung nach der Operation Die intraoperative Mortalität ist im Wesentlichen auf Apnoe und Herz durch die hohe Konzentration von Isofluran verursacht Verhaftung benötigt ausreichend anesthesi zu erreichenein. Einführung in das Lokalanästhetikum Bupivacain in das Operationsprotokoll ermöglicht eine Verringerung der Isofluran-Konzentration und damit verringert sich deutlich die Sterblichkeit. In einer aktuellen Versuchsreihe mit mehr als 20 Tieren war die intraoperative Mortalität gleich Null. Im Gegensatz dazu ist die postoperative Überleben vor allem durch die Annahme der operierten Mäuse von ihrer Mutter beeinflusst. Eine deutliche Verbesserung eingetreten , wenn die Angst und Aggressivität durch Abgabe einer einzigen Injektion von Diazepam (ip 8 g / kg Körpergewicht) an die Mutter vor der Rückkehr der operierten Mäuse auf den Wurf 1 reduziert wurde. Akzeptanz und postoperative Erholung der operierten Mäuse können durch die Gegenwart von Milch in den Magen überwacht werden. Der Magen eines P1-P7 Maus , die drunken Milch hat deutlich weiß und sichtbar durch die Bauchhaut (Abbildung 3). Vergleich der Fütterung in Betrieb, Scheinkontrolle und nicht operierten Mäusen ist nützlich für die Beurteilung des Ernährungsstatus von injured Mäusen. Bewertung der das Wachstum von betrieben gegenüber nicht operierten Mäusen zeigt , dass trotz eines kleinen Gewichtsverlust während der ersten postoperativen Tag, die Wachstumskurve der operierten Mäusen schnell danach (Abbildung 6) normalisiert. Die Sterblichkeit an Blasendysfunktion oder Infektionen im Zusammenhang wurde noch nie bei Mäusen beobachtet, so lange wie 7 Wochen untersucht. <table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl in Abb. 2 </td><td> Name </td><td> Hersteller / Anbieter </td><td> Referenz # </td><td colspan="3"> Link </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Kunststoffspritze (30 oder 50 ml) </td><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Kunststoff-Petrischale (150 x 25 mm) </td><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> Fortec Isofluran Verdampfer </td><td> Cyprane </td><td></td><td colspan="3"> http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ </td><td> Wir verwenden und alte Gerät aus der Produktion, überprüfen Sie den Link für neuere Gerät </td></tr><tr><td> 4a </td><td> Yasargil temporäre Aneurysma Mini-Clip </td><td> Aesculap </td><td> FE681K </td><td colspan="3"> http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf </td><td></td></tr><tr><td> 4b </td><td> Feine Bohrung Polyethylen Kapillarschlauchs ID 0,58 mm, AD 0,96 mm </td><td> Smiths Medical </td><td> 800/100/200 </td><td colspan="3"> http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/ </td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td> Isofluran (Forene) </td><td> Abbott GmbH &amp; Co. KG </td><td></td><td colspan="3"> http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> Marcain (Bupivacain) </td><td> Zeneca </td><td></td><td colspan="3"> http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine </td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> Insuline Spritze 0,3 ml 30 G x 8mm </td><td> VWR </td><td> 80086-442 </td><td colspan="3"> https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138 </td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> Ultrafein Micro Messer 5 mm Schneide </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10315-12 </td><td colspan="3"> http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat &amp; suchkatalog = 0019900000 &amp; reloadmenu = 1 </td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td> Extra Fine Graefe Pinzetten - 0,5 mm Spitze </td><td> Fine Science Tools </td><td> 1153-1110 </td><td colspan="3"> http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat &amp; suchkatalog = 0055700000 &amp; reloadmenu = 1 </td><td> Nicht wirklich notwendig, die oft die Zähne sind zu groß </td></tr><tr> &lt;td&gt; 10 </td><td> Pinzetten Supergrip Gerade </td><td> Fine Science Tools </td><td> 00632-11 </td><td colspan="3"> http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat &amp; suchkatalog = 0053500000 &amp; reloadmenu = 1 </td><td> Zwei Zangen sind notwendig </td></tr><tr><td> 11 </td><td> Spongostan Spezielle 70 x 50 x 1 mm </td><td> Ferrosan </td><td></td><td colspan="3"></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> Vannas Frühling Schere - 2 mm-Klingen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-03 </td><td colspan="3"> http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat &amp; suchkatalog = 0012800000 &amp; reloadmenu = 1 </td><td></td></tr><tr><td> 13 </td><td> Vario-Clip-Anlegezange </td><td> Aesculap </td><td> FE502T </td><td colspan="3"> http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf </td><td></td></tr><tr><td> 14 </td><td> Vicryl 6-; 0 (Ethicon) </td><td> Johnson und Johnson </td><td> J105G </td><td colspan="3"></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> Diethrich Mikro Nadelhalter </td><td></td><td> 11-510-20 </td><td colspan="3"> http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html </td><td></td></tr><tr><td> 16 </td><td> Temgesic (Buprenorphin) </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td colspan="3"></td><td></td></tr><tr><td> 17 </td><td> Stesolid (Diazepam) </td><td> Actavis </td><td></td><td colspan="3"></td><td> Auch bekannt als Valium </td></tr><tr><td> 18 </td><td> Pedamix </td><td> Fresenius Kabi </td><td></td><td colspan="3"> http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring </td><td></td></tr><tr><td> 19 </td><td> Klorhexidinsprit (Chlorhexidingluconat) </td><td> Fresenius Kabi </td><td> D08A C02 </td><td colspan="3"> http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Liste der Werkzeuge und Geräte zur Erzeugung eines Clips getriebenen Rückenmarkskompression Verletzung in einem neonatalen Maus. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53498/53498fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Anästhesie - Setup. Dieses Schema stellt die Anästhesie - Setup für die Neugeborenen - Maus entwickelt, mit einem Schlafraum für die anfängliche Anästhesie und einer Nasenmaske Vorrichtung zur Fortsetzung der Anästhesie während der Operation. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53498/53498fig2.jpg" /> Abbildung 2. Haupt Werkzeuge und Kompressionsclip. (A) Werkzeuge während des Verfahrens verwendet. Die Zahlen entsprechen der Anmerkung in Tabelle 1 verwendet wurde . (B und C) eine temporäre Yasargil Aneurysma mini-Clip mit der Spitze jedes Flügels bis etwa 150 &amp; mgr; m Dicke manuell nach unten getrimmt. Ein Stopfen aus einem Stück Polyethylenschlauch (Tabelle 1) auf eine der Klingen platziert vollständigen Schließens des Clips verhindern. Maßstabsbalken: 2 mm. App: Clip-Applikator (# 12 in A); St:. Stopper <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53498/53498fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53498/53498fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53498/53498fig3.jpg" /> Abbildung 3. Zeichen für die präoperative Beurteilung von spinaler Ebene bei der Neugeborenen - ICR - Maus. (A) Seitenansicht eines P1 ICR - Maus mit weißer Milch in den s<html> tomach. Der rostrale Teil des Magens entspricht T12-T13 spinaler Ebene. (B) P1 ICR - Maus unter Anästhesie in Bauchlage. Obwohl schwieriger zu visualisieren, als in (A), der Magen mit Milch gefüllt ist erkennbar. Der rostrale Teil des Magens zeigt T12-T13 spinaler Ebene. Maßstabsbalken: 0,5 cm. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53498/53498fig4.jpg" /> Abbildung 4. dorsale Laminektomie. (A) Dissektion der paravertebralen Muskeln. Beachten Sie, dass das Rücken Prozess unterentwickelt in diesem Alter ist. (B) Transversale Schnitte der Lamina mit dünnen Schere. (C) Einführung einer Schaufel aus einer dünnen Zange zwischen der Lamina und der Dura. Der Eintrittspunkt wird durch die Pfeilspitze gezeigt. (D) Entfernen der Lamina. Maßstabsbalken: 2 mm. files / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Histologische und Verhaltensergebnisse nach Kompression des Rückenmarks Verletzung bei P1. (A) Eosin und Hämatoxylin - Färbung in Rückenmarksschnitten von einem verletzten Maus (1 Tag nach der Verletzung) in unterschiedlichem Abstand von der Verletzung Epizentrum. (B) Repräsentative Spuren von forelimb und hindlimb Trajektorien beobachtet 6 Stunden nach der Verletzung oder nach einer Scheinkontrolle Laminektomie. Spuren auf der Oberseite darstellen Trajektorien aus einer Seitenansicht des Tier betrachtet. Die Spuren am Boden darstellen Trajektorien von der ventralen Seite des Tieres angesehen. Siehe auch 1. Maßstabsbalken: 250 &amp; mgr; m. DH: Hinterhorn; L, links; R: right; SCC: Kompression des Rückenmarks; VH:. Ventralhorn <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53498/53498fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53498/53498fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt = &quot;6&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53498 / 53498fig6.jpg&quot; /&gt; Abbildung 6. Vergleichende Wachstumskurven. Histogramm zeigt die Gewichtszunahme von nicht operierten und SCC verletzten Mäuse von postnatalen Tag 1 bis Tag nach der Geburt 9 zeigt.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer reproduzierbaren Rückenmarkskompressionsverletzung (SCI) bei der neugeborenen Maus. Das Modell bietet eine vorteilhafte Plattform für die Untersuchung von Mechanismen adaptiver Plastizität, die der spontanen funktionellen Erholung zugrunde liegen.

Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine reproduzierbare Kompressionsverletzung des Rückenmarks bei einer neugeborenen Maus durchzuführen. Dies wird erreicht, indem die Maus zunächst tief anästhesiert wird. Anschließend wird eine dorsale Laminektomie durchgeführt, um das Rückenmark freizulegen.Und schließlich durch die Erzeugung der Quetschverletzung. Wir haben kürzlich ein Modell der Spinaltrauma bei neugeborenen Mäusen etabliert und gezeigt, dass neugeborene Mäuse ein erstaunliches Maß an adaptiver Plastizität aufweisen. Die Untersuchung dieses zugrundeliegenden Mechanismus der Erholung könnte wichtige Erkenntnisse liefern, die für die Behandlung von Rückenmarksverletzungen genutzt werden könnten.In diesem Video zeigen wir, wie man eine Kompressionsverletzung des Rückenmarks bei einem einen Tag alten Maus durchführt. Dieses chirurgische Verfahren umfasst Anästhesie, Laminektomie und zwei klippengestützte epidurale Kompressionen. Vorbereitung auf die Operation.Die Operation wird unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Legen Sie eine Wärmematte unter das Mikroskop. Es ist entscheidend, das Jungtier warm zu halten, um einen plötzlichen Tod während der Operation zu vermeiden.Legen Sie eine chirurgische Decke oder ein großes Blatt sauberes, weiches Laborpapier über die Wärmematte. Für die präoperative Analgesie bereiten Sie eine Insulinspritze, 0,3 Milliliter, 30 Gauge, vor, die mit dem Lokalanästhetikum Marcaine, verdünnt mit steriler PBS, auf eine Endkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter gefüllt ist. Für die Hautinzision, Muskelentfernung und Laminektomie verwenden Sie ein Mikromesser, feine Pinzette und feine Iridektomiescheren.Beachten Sie, dass wir hier auch Pinzetten verwenden, deren Spitzen wir zu Zähnen gebogen haben. Diese funktionieren besser als im Handel erhältliche gezahnte Pinzetten, da die Zähne sehr klein sein müssen. Für die Kompression des Rückenmarks verwenden Sie eine speziell modifizierte Yasargil temporäre Aneurysma-Miniklammer, die wir später beschreiben werden.Zur Herstellung eines Stopfens, der einen vollständigen Verschluss der Klammer verhindert, wird außerdem ein kurzes Stück Kunststoffkapillarrohr benötigt, sowie ein Klammerapplikator zum Platzieren der Klammer. Zum Nähen verwenden Sie eine Nadelhalterzange und eine kleine Schere zum Durchtrennen des Fadens. Zur Schmerzbehandlung verdünnen Sie Temgesic in sterilem PBS auf 0,03 Milligramm pro Milliliter.Die Rückenmarksverletzung wird durch eine klemmende Kompression mit einem Yasargil temporären Aneurysma-Miniklemme verursacht. Vor der Anwendung muss die Klemme mechanisch modifiziert werden, indem die Dicke der Klingen mit einem Schleifstein auf 150 Mikrometer reduziert wird. Unmittelbar vor der Operation schneiden Sie ein kurzes Stück Kunststoffschlauch ab und schieben Sie es über einen der Klemmenarme.Der Schlauch wirkt als Stopfen, um ein vollständiges Schließen der Klemme zu verhindern. Anästhesie und Analgesie. Für die Gasanästhesie verwenden wir einen Suprane-Vaporisator, der an einen Sauerstofftank angeschlossen ist.Isolurane ist das Anästhetikum, das in reinem Sauerstoff verdampft wird. Um die Isolurane-Sauerstoff-Mischung an die Maus abzugeben, muss eine auf Neonatmause abgestimmte Nasenmaske gebaut werden. Da neugeborene Mäuse sehr klein sind, kann die Maske aus der Spitze einer Spritze bestehen, die als Einlass für den Kunststoffschlauch dient, der mit dem Auslass des Verdampfers verbunden ist.Bohren Sie an der Seite der Maske ein kleines Loch, um einen Absaugschlauch anzuschließen, der entweder an einer geregelt arbeitenden Vakuumpumpe mit Sammeleinheit oder einfach in einer Abzugshaube endet. Erstellen Sie eine Überlaufkammer für die Anästhesie aus einer 150 mal 25 Milliliter großen, plastischen Petrischale. Bohren Sie an einer Seite ein Loch, das groß genug für den Kopf der Maus ist.Bohren Sie auf der gegenüberliegenden Seite zwei kleinere Löcher mit dem Durchmesser des Kunststoffrohrs. Schlussendlich bohren Sie ein Evakuierungsloch, das kleiner als die anderen ist, an die Oberseite der Schale. Schneiden Sie die Spitze einer 250-Mikroliter-Pipettenspitze ab und führen Sie sie in dieses letzte Loch ein.Die Pipettenspitze fungiert als Anschluss für das Evakuierungsrohr, das mit einer Vakuumeinrichtung verbunden ist, die auf einen geringen Unterdruck eingestellt ist. Befestigen Sie die Maske mit Plastilin knapp innerhalb der Öffnung für den Kopf der Maus. Sichern Sie das Kunststoffrohr mit Klebeband oder Plastilin an der Decke der Kammer, wobei darauf zu achten ist, dass die Schläuche in den entsprechenden Öffnungen gut positioniert sind.Platzieren Sie die Kammer unter dem Mikroskop auf der chirurgischen Unterlage. Das gesamte System ist in diesem Schema dargestellt. Ein Dreiweg-Hahn wird am Ausgang des Verdampfers angebracht.Hier ist der Weg zur Betäubungskammer frei, während der Weg zur Maske blockiert ist, und die Maus kann in die Betäubungskammer platziert werden, um die Sedierung einzuleiten. Durch Drehen des Dreiweghahns nach rechts wird das Gas zur Maske geleitet und der Weg zur Betäubungskammer blockiert. In dieser Konfiguration kann die Maus auf die Maske übertragen werden.Das Austreten von Gas wird durch Vakuum aus der Überlaufkammer entfernt. Wählen Sie ein Mäusejunges aus, das kürzlich Milch getrunken hat, erkennbar an der durch die Haut sichtbaren weißen Färbung. Legen Sie das Jungtier in die Betäubungskammer und führen Sie verdampftes Isofluran mit 4 % zu, um eine schnelle Sedierung zu erreichen.Überführen Sie das Jungtier in die Maske. Positionieren Sie die Schnauze der Maus vorsichtig tief in die Maske, um eine ausreichende Exposition gegenüber dem Anästhetikumgas sicherzustellen. Drehen Sie den Dreiweghahn, um das Gas in Richtung der Maske umzuleiten.Subkutan 50 µL Marcaine mit 2,5 Milligramm pro Milliliter an der gewünschten Operationsstelle injizieren. Vorsicht walten lassen, um nicht zu tief zu injizieren, da Blutgefäße leicht verletzt werden können und die Injektion von Marcaine in ein Gefäß tödlich ist. Überschüssiges Marcaine mit einer kleinen sterilen Kompresse abwischen.Dorsale Laminektomie. Verringern Sie die Isoflurankonzentration auf ein bis zwei Prozent. Nach einigen Minuten durchstechen Sie die Haut mit einem Mikromesser und erzeugen eine acht bis neun Millimeter lange Transversalöffnung, indem Sie vorsichtig in kaudaler Richtung an der Haut ziehen.Ein Transfereschnitt ist viel praktischer und bietet einen besseren seitlichen Zugang zur Durchführung der Laminektomie. Ziehen Sie die Ränder des Hautschnitts von dem darunterliegenden Gewebe weg, indem Sie Stücke von Spongistatin subkutan kranial und kaudal zum Schnitt einbringen. Schneiden Sie die prävertebralen Muskeln mit einer feinen Schere durch, um die Wirbelsäule freizulegen.Beachten Sie, dass der Dornfortsatz beim Neugeborenen noch nicht vollständig ausgebildet ist. Identifizieren Sie die Mittellinie und durchtrennen Sie die Lamine mit der feinen Schere quer. Achten Sie darauf, nicht zu tief zu schneiden, da dies möglicherweise die Dura und sogar das Rückenmark beschädigen kann.Platzieren Sie vorsichtig eine Klinge einer dünnen Pinzette zwischen Lamina und Dura. Greifen Sie die Lamina, indem Sie die Pinzette schließen, und heben Sie sie behutsam an, bis sie sich löst, wobei die Dura intakt bleibt. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei- bis dreimal, um eine ein- bis zweisegmentale Laminektomie durchzuführen.Blutungen mit kleinen Stücken Spongistatin kontrollieren. Mit der dünnen Pinzette als Rongeur Teile der Facettengelenke beidseitig entfernen, um genügend Platz zu schaffen, um die modifizierte Aneurysma-Miniklammer im Wirbelkanal zu platzieren. Dieser Schritt führt häufig zu Blutungen, die mit kleinen Stücken Spongistatin kontrolliert werden können.Zur Verbesserung der Sichtbarkeit kann es vorteilhaft sein, mit warmer steriler PBS bei 37 Grad Celsius zu spülen. Erzeugen der Quetschverletzung des Rückenmarks. Öffnen Sie die Klemme und platzieren Sie die Klingen beidseits des Rückenmarks in den Zwischenräumen zwischen den Gelenkfortsätzen und dem Rückenmark. Stellen Sie sicher, dass die Klingen tief genug eingeführt werden, um den ventralen Teil des Rückenmarks einzuschließen. Schließen Sie die Klammer schnell, während Sie den Applikator an Ort und Stelle halten, um ein Zurückrutschen der Klammer zu vermeiden. Öffnen Sie die Klammer nach 15 Sekunden schnell wieder.Reinigen Sie die Wunde mit Spongistatin. Um eine symmetrische Kompression zu erreichen, drehen Sie die Klingen um und führen Sie eine zweite Kompression für 15 Sekunden in entgegengesetzter Ausrichtung durch. Nähen. Entfernen Sie die Stücke von Spongistatin, die zu Beginn der Operation unter der Haut platziert wurden, und verschließen Sie die Haut mit 6,0-Nähten.Injizieren Sie 0,05 Milliliter Temgesic mit einer Konzentration von 0,03 Milligramm pro Milliliter subkutan mit einer 30-Gauge-Insulinspritze und stellen Sie das Jungtier für einige Stunden in eine temperaturgeregelte Umgebung bei 30 Grad Celsius. Um aggressives mütterliches Verhalten gegenüber dem operierten Jungtier während der ersten Nacht nach der Operation zu reduzieren, bereiten Sie eine Lösung von Diazepam vor, die in sauberem PBS auf 0,1 Milligramm pro Milliliter verdünnt ist, zur intraperitonealen Injektion mit acht Gramm pro Kilogramm. Ergebnisse.Wie dieser Graph zeigt, sind sechs Stunden nach einer Kompression des Rückenmarks auf unterer thorakaler Ebene die Hinterbeine verletzter Mäuse gelähmt, während die Vorderbeine nicht betroffen sind. Bei den sham-kontrollierten Tieren, die lediglich eine Laminektomie erhielten, sind sowohl die Hinter- als auch die Vorderbeine hochgradig beweglich. Im Rückenmarksquerschnitt ist Blutrest an der Verletzungsstelle sichtbar.Außerdem ist das Gewebe durchscheinend, was auf einen Geweateverlust hindeutet, der oft einige Tage später zur Bildung einer Höhle führt. Fazit: Nach diesem Video sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Kompressionsverletzung des Rückenmarks bei einem neugeborenen Maus erzeugt. Der Vorteil der Verwendung neugeborener Mäuse liegt darin, dass wir spezifische Methoden anwenden können, um die adaptive Plastizität zu untersuchen, was bei erwachsenen Mäusen nicht möglich ist.Außerdem bietet das Modell eine Plattform zur Untersuchung therapeutischer Ansätze, wie beispielsweise der Stammzelltransplantation.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Elzat, E. Y. Y., et al., Etablierung eines Modells für Rückenmarksverletzungen bei Mäusen auf der Grundlage einer minimal-invasiven Technik. J. Vis. Exp. (2022). Dieses Video zeigt die Methode zur Induktion einer Prellungsverletzung im Rückenmark T9 in einem Mausmodell unter Verwendung einer koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen. Auf das Rückenmark auf T9-Niveau wird ein Gewicht fallen gelassen, das eine Prellung verursacht, die sofort eine Verfärbung und Schwellung des...

Induktion einer Rückenmarksprellung in einem Mausmodell unter Verwendung einer koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen

Quelle: Lakshman, N., et al. Ein Neurosphären-Assay zur Bewertung der endogenen Aktivierung neuronaler Stammzellen in einem Mausmodell mit minimaler Rückenmarksverletzung. J. Vis. exp. (2018). Dieses Video zeigt die Aktivierung und Migration von neuralen Stammzellen (NSCs) in einem Modell für Rückenmarksverletzungen der Maus. Um das Rückenmark freizulegen, wird einer anästhesierten Maus ein Wirbel aus dem Brustbereich der Wirbelsäule entnommen. In der weißen Substanz des Rückenmarks wird dann...

 Ein Modell für minimale Rückenmarksverletzungen zur Untersuchung der Aktivierung und Migration neuraler Stammzellen

Quelle: Kumar, S., et. al. Mausmodell von Druckgeschwüren nach Rückenmarksverletzung. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt eine detaillierte Induktion von Rückenmarksverletzungen bei Mäusen. Die anästhesierte Maus wird präpariert, um T9-T10-Wirbel freizulegen, und ihre Dornfortsätze werden entfernt. Das freiliegende Rückenmark wird dann durchtrennt, um die Verletzung zuzufügen. Anschließend wird das Operationsgebiet geschlossen und die Maus kann sich erholen.

Generieren eines Mausmodells mit einer Rückenmarksverletzung

Verletzungen des Rückenmarks ist eine traumatische Erkrankung, die schwere Morbidität und hoher Sterblichkeit führt. In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail eine Quetschung Modell der Verletzung des Rückenmarks in Mäusen, gefolgt von einer Transplantation von neuralen Stammzellen.

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Gequetscht Modell von Rückenmarksverletzungen

Modelle für Rückenmarksverletzungen sollten hochgradig reproduzierbar sein. Wir zeigen, dass das kalibrierte Zangenkompressionsmodell der Rückenmarksverletzung eine einfach anzuwendende chirurgische Methode zur Erzeugung reproduzierbarer Verletzungen des murinen Rückenmarks ist.

Calibrated Zange Modell Spinal Cord Injury Compression

Wir führen ein Gewebeverdrängungs-basiertes Continal-Rückenmarksverletzungsmodell ein, das bei erwachsenen Mäusen eine konsistente Verletzung des Rückenmarks verursachen kann.

Ein Tissue Displacement-basierte Contusive Spinal Cord Verletzung Modell in Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine präzise Laminektomie für die Induktion von stabilen Querbandverletzungen im Mausmodell mit minimalen Kollateralschäden für die Rückenmarksverletzungsforschung erstellt wird.

Induktion von vollständiger Transektion-Typ Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Minimalinvasive Techniken und ein einfaches Laborgerät verbessern die Reproduzierbarkeit des Rückenmarksverletzungsmodells, indem sie operative Schäden an den Versuchstieren reduzieren und die Aufrechterhaltung der anatomischen Morphologie ermöglichen. Die Methode lohnt sich, weil die zuverlässigen Ergebnisse und das reproduzierbare Vorgehen die Untersuchung der Mechanismen der Krankheitsheilung erleichtern.

Etablierung eines Maus-Kontusionsmodells für Rückenmarksverletzungen basierend auf einer minimal-invasiven Technik

Das vorliegende Protokoll, das das zentrale Rückenschnursyndrom (CCS) bei Mäusen simuliert, hat die Wiederholbarkeit verbessert und die Operationsschäden der Versuchstiere minimiert, wodurch eine übermäßige Störung der anatomischen Struktur vermieden wurde. Die Strategie in dieser Studie ist vorteilhaft, da sie die Erforschung von Verletzungsmechanismen ermöglicht, indem sie konsistente Ergebnisse liefert.

Etablierung des Modells des Zentralschnursyndroms in der C57BL/6J-Maus

Hier wird ein neuartiges automatisiertes Gerät zur Quetschung von Rückenmarksverletzungen für Mäuse vorgestellt, das Modelle für Rückenmarksverletzungen mit unterschiedlichem Grad genau herstellen kann.

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Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

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